Submitted by Isaac Francisco de Souza Dias (isaac.souzadias@ufpe.br) on 2016-04-27T18:47:41Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) TESE Debora Maximo das Neves Luna.pdf: 3149214 bytes, checksum: 948556bb6aaf20df2b076b5191f11142 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-27T18:47:41Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) TESE Debora Maximo das Neves Luna.pdf: 3149214 bytes, checksum: 948556bb6aaf20df2b076b5191f11142 (MD5) Previous issue date: 2015-02-27 / FACEPE / A imobilização de lipídios em substratos sólidos tem sido amplamente utilizada no desenvolvimento de biossensores visando a uma alternativa simples e de baixo custo. Dessa forma, um ambiente favorável à imobilização de proteínas pode ser criado o que viabiliza a utilização destas moléculas como elemento de biorreconhecimento molecular. A finalidade deste estudo consiste em imobilizar a lectina Concanavalina A, em uma plataforma nanostruturada contendo moléculas fosfolipídicas a fim de identificar glicoproteínas presentes no soro contaminado com dengue (DENV-1, DENV-2 e DENV-3). A resposta foi avaliada por técnicas eletroquímica (Espectroscopia de Impedância Eletroquímica [EIE] e Voltametria Cíclica [VC]) e piezoelétrica (Microbalança de Cristal de Quartzo [QCM]). O biossensor eletroquímico apresentou maior resposta para DENV-3 (RCT = 180%) em relação aos DENV-1 (RCT = 60%) e DENV-2 (RCT = 80%). Por outro lado, o biossensor piezoelétrico identificou de forma qualitativa da presença do DENV. Com o objetivo de aumentar a especificidade na identificação do DENV, quatro imunossensores eletroquímicos constituídos por camada auto-organizada de cisteína, nanopartícula de ouro e anticorpo monoclonal (Anti-DENV-1, Anti-DENV-2, Anti-DENV-3 e Anti-DENV-4) foram desenvolvidos e avaliados após exposição ao vírus da dengue DENV-1, DENV-2, DENV-3 e DENV-4. Os imunossensores demonstraram eficácia, linearidade e especificidade para todos os sorotipos analisados. Além disso, técnicas de microscopia de força atômica e microscopia eletrônica de varredura caracterizaram satisfatoriamente a imobilização na superfície de todos os biossensores desenvolvidos. / Immobilization of lipids on solid substrates has been extensively used in the development of biosensors, aiming a simple and low-cost alternative. Thus, a favorable environment for immobilization of proteins can be obtained and these molecules can be used as a molecular element for biorecognition. The purpose of this study is to conduct the immobilization of the Concanavalin A lectin on a nanostrutured platform containing phospholipid molecules with the aim of identify serum infected with dengue virus (DENV-1, DENV-2 and DENV- 3). The response was evaluated by electrochemical technique (Electrochemical Impedance Spectroscopy [EIS] and Cyclic Voltammetry [CV]) and piezoelectric technique (Quartz Crystal Microbalance [QCM]). The electrochemical biosensor showed greater response for DENV-3 (RCT = 180%) compared to DENV-1 (RCT = 60%) and DENV-2 (RCT = 80%). Moreover, piezoelectric technique identified qualitatively the presence of DENV. In order to increase the specificity in the identification of DENV, four electrochemical immunosensors based on self-organized layer of cysteine, gold nanoparticles and monoclonal antibody (Anti- DENV-1, Anti-DENV-2, Anti-DENV-3 e Anti-DENV-4) were developed and evaluated after exposure to dengue virus (DENV- 1, DENV-2, DENV-3 and DENV-4). The immunosensors demonstrated efficacy, linearity and specificity for all serotypes analyzed. In addition, atomic force microscopy and scanning electron microscopy techniques, satisfactorily characterized the immobilization on the surface of all developed biosensors.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:54:13Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo4879_1.pdf: 418798 bytes, checksum: e66fde5c4b3fce381304c6361e623bcf (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2004 / Lectinas são proteínas ou glicoproteínas de origem não imunológica que possuem sítios de ligação para carboidratos e/ou glicoconjugados. Uma lectina do líquen Cladonia verticillaris foi purificada através de cromatografia de exclusão molecular. O líquen triturado foi submetido à extração e uma purificação parcial por fracionamentos utilizando sulfato de amônio. As amostras foram submetidas a ensaios de atividade hemaglutinante (AH) e suas concentrações protéicas foram estimadas. A fração mais ativa, F1 (0-30 %), foi submetida a ensaios de inibição, a ensaios de estabilidade térmica e de dependência de íons divalentes, assim como a ensaios cromatográficos para a purificação e caracterização lectínica. ClaveLL foi isolada através de cromatografia de exclusão molecular de F1, e submetida aos mesmos ensaios; foi também avaliada quanto à estabilidade da AH em valores de pH compreendidos de 2 a 12. F1 e ClaveLL foram analisadas em eletroforeses em gel de poliacrilamida (PAGE) para proteínas nativas ácidas e básicas, assim como para proteínas desnaturadas. F1 foi inibida parcialmente por carboidratos (N-acetil-D-glicosamina, xilose, arabinose, ramnose e manose) e glicoproteínas (fetuína, caseína, ovalbumina e peroxidase) ou totalmente (glicoproteínas presentes em soro fetal bovino e em soro de coelho). ClaveLL foi inibida parcialmente por carboidratos (N-acetil-D-glicosamina, galactose, ramnose, manose, glicose e trealose) e ovalbumina, e inibida totalmente por fetuína, asialo-fetuína, caseína, asocaseína e glicoproteínas presentes em colostro, soro de coelho e soro fetal bovino. F1 foi termoestável, mantendo sua AH a 80°C, enquanto ClaveLL foi sensível ao aumento de temperatura. F1 e ClaveLL não foram dependentes de íons, mas MnCl2, BaCl2, CaCl2 e MgCl2 estimularam sua AH. ClaveLL foi mais ativa nos valores de pH ácido (5,5) ou básico (11,0). PAGE contendo SDS resolveu F1 e ClaveLL como única banda polipeptídica (glicosilada) com peso molecular menor que 14 kDa. F1 glicosilada pode ter resíduos glicose/manose uma vez que se ligou à Cramoll 1,4-Sepharose, uma matriz de afinidade com a lectina de semente de Cratylia mollis, isoformas 1 e 4 glicose/manose específica, imobilizada à Sepharose CL-4B. PAGE para proteínas nativas ácidas detectou em ClaveLL uma única banda que migrou junto com a frente de corrida; o mesmo foi observado em PAGE para proteínas nativas básicas. Cromatografia de ClaveLL através de filtração em gel em sistema ÄKTA-FPLC, resolveu três picos distintos com AH, que sugeriram formas de agregados moleculares para a lectina nativa, com pesos moleculares estimados em 170, 110 (pico principal) e 82 kDa. Concluindo, ClaveLL glicosilada altamente purificada é estável a pH e principalmente inibida por glicoproteínas

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:54:23Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo4882_1.pdf: 1485770 bytes, checksum: ace5d1f3e976bd82208a3f3bce5bafc1 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2004 / Lectinas são proteínas ou glicoproteínas de origem não imune cuja ligação reversível e específica a carboidratos resulta em aglutinação celular. Estas proteínas, presentes em plantas, bactérias, invertebrados ou vertebrados, são detectadas por ensaio de hemaglutinação. Crataeva tapia L. pertence à família Capparaceae. Uma lectina de entrecasca de C. tapia, CrataBL, foi purificada à homogeneidade através de fracionamento com sulfato de amônio (Fração 30- 60%), seguida por cromatografia de afinidade (gel de guar) ou troca iônica (CMCelulose). CrataBL foi ativa com eritrócitos de humanos, galinha e coelho (atividade hemaglutinante específica, AHE, 102) e principalmente inibida por glicoproteínas. CrataBL foi termoestável e tratamento com EDTA não afetou a atividade hemaglutinante (AH); atividade não foi alterada após adição de Ca2+, Mn2+, Mg2+. CrataBL migrou como uma única banda após eletroforese para proteínas nativas básicas e duas bandas polipeptídicas de massa molecular 21 e 40.000 Da após SDS-PAGE com ou sem agente redutor; os polipeptídeos foram também detectados sob o gel usando reagente para glicoproteína. A natureza glicoprotéica de CrataBL foi também revelada por sua interação com lectina glicose/manose sob gel de agarose. A massa molecular da lectina por cromatografia de gel filtração foi de 52.000 Da. CrataBL imobilizada em Sepharose CL-4B adsorveu bioseletivamente e purificou caseína, fetuína e ovoalbumina

A epilepsia, doença descrita pela primeira vez em 2000 a.C., tem a crise convulsiva ou epiléptica como fenômeno paroxístico, e a International League Against Epilepsy define a crise epiléptica como \"manifestação excessiva e/ou hipersincrônica, normalmente autolimitada, da atividade dos neurônios no cérebro\". Há 40 anos surgiram os medicamentos antiepilépticos, mas a resistência múltipla a fármacos antiepilépticos (FAEs) é um problema significante que afeta pelo menos 30% dos pacientes portadores dessa doença devastadora. O mecanismo exato da fármaco-resistência desenvolvida em pacientes epilépticos ainda é desconhecido, porém uma possível causa seria a inadequada acumulação intraparenquimal do fármaco antiepiléptico relacionada a expressão aumentada da glicoproteína-P (PgP). Neste contexto, nosso objetivo foi investigar a correlação da expressão da PgP, codificada pelo gene ABCB1, no córtex temporal de 12 pacientes fármaco-resistentes frente aos FAEs fenobarbital, carbamazepina, fenitoína e lamotrigina; comparamos também a expressão da PgP nesse mesmo grupo de pacientes, selecionados no Centro de Cirurgia de Epilepsia (CIREP) frente a um grupo controle composto por indivíduos não epilépticos que evoluíram para óbito examinados no Serviço de Verificação de Óbito do interior (SVOi). Utilizamos a Cromatografia Líquida de Alta Eficiência para determinar as concentrações dos FAEs no plasma e no cérebro, sendo que a metodologia utilizada no tecido cerebral foi desenvolvida e validada especialmente para esse fim. Essas concentrações foram então determinadas e a razão entre as duas medidas foi comparada com a expressão de PgP no tecido cerebral. Analisando os resultados concluímos que não há correlação linear entre a razão dos fármacos estudados e a expressão de PgP no córtex temporal de pacientes com epilepsia refratária. / Epilepsy, desease described for the first time in 2000 B.C., presents the convulsion or epileptic seizure as its paroxysmal event, and the International League Against Epilepsy defines the epileptic seizure as \"excessive and/or hypersynchronous manifestation, usually self-limiting, from brain neurons activity\". Forty years ago the antiepileptic drugs (AEDs) emerged, but multiple resistance to AEDs is a significant problem which affects at least 30% of epileptic patients. The mechanism underlaying pharmacoresistance is still unknown, but a possible cause is the inadequate accumulation of AEDs in the brain tissue related to P-glycoprotein over expression. In this context, our aim was to investigate the correlation between PgP expression, codified by ABCB1 gene, in temporal cortex of 12 pharmacoresistant patients towards AEDs phenobarbital, carbamazepine, phenytoin and lamotrigine; we also compared PgP expression between the same group of patients, selected inside Epilepsy Surgery Center (CIREP), and a control group composed by non-epileptic deceased individuals examined at the Death Verification Service from our Medicine School (SVOi). We used High Performance Liquid Chromatography to determine AEDs concentrations in plasma and brain, and the methodology applied to brain quantification was specially developed for this purpose. These two concentrations were then determined and the ratio between them was compared with PgP expression in brain tissue. Analyzing the results we concluded that there is no linear correlation between the ratio of the AEDs studied and PgP expression in temporal cortex of patients with pharmacoresistant epilepsy.

Made available in DSpace on 2015-11-11T12:13:57Z (GMT). No. of bitstreams: 2 monica_campos_ioc_dout_2014.pdf: 1838588 bytes, checksum: ec217383fd2574c1a377fc8a97dc5507 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015-10-29 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Os tratamentos disponíveis para a doença de Chagas e as leishmanioses não são eficientes e apresentam alta toxicidade. Diversos estudos mostram que há possibilidade de indução de resistência de Trypanosoma cruzi ao Benznidazol (BZ) o que pode interferir na eficácia do tratamento. O mesmo tem sido relatado com relação aos fármacos utilizados para o tratamento das leishmanioses, embora não exista um mecanismo de ação definido para a resistência a drogas nestes protozoários. Neste trabalho foram focalizados dois potenciais mecanismos: 1) atividade da glicoproteína-P (Pgp), uma proteína de membrana que atua como uma bomba de efluxo dependente de energia e associada ao fenótipo de resistência a múltiplas drogas (MDR); 2) a enzima nitrorredutase presente em T. cruzi (TcNTR), reponsável pela redução de nitroderivados, como BZ, para obter o efeito tripanocida. Na busca de novos compostos seletivos contra T. cruzi e Leishmania amazonensis, nosso grupo vem estudando derivados da classe das tiossemicarbazonas. Em estudos prévios foi observado que o derivado 4-N-(2-metoxi-estiril)-tiossemicarbazona (2-MEOTIO) foi o composto mais efetivo sobre diferentes formas de T. cruzi, enquanto 4-N-(4\2019-hidroxi-3\2019-metoxi-estiril)-tiossemicarbazona (3-MEOTIO) se mostrou o mais eficiente contra L. amazonensis O mecanismo de resistência a estes compostos foi avaliado, e nossos resultados mostram a participação da Pgp na resistência a 2-MEOTIO e BZ em T. cruzi, e a 3-MEOTIO em L. amazonensis. Ainda, em T. cruzi a participação da Pgp parece estar associada não somente à membrana plasmática, como também à mitocôndria. Em T. cruzi, a perda da função do gene da TcNTR está relacionada à resistência ao BZ, no entanto, foi possível demonstrar que outros mecanismos de resistência estão atuando em conjunto nestes parasitos, e ainda, que os mecanismos são diferentes entre clones isolados de uma mesma população (B15). Também descrevemos nesta tese, a validação in vitro da expressão da luciferase em diferentes cepas de T. cruzi transfectadas com o gene red-shifted-luciferase, a serem utilizadas em futuros ensaios de imagem por bioluminescência in vivo. Os mecanismos de resistência a drogas em T. cruzi e L. amazonensis apresentados neste trabalho podem contribuir para a identificação de novos alvos nestes tripanosomatídeos, objetivando o desenho racional de novas drogas para o tratamento da doença de Chagas e leishmanioses / The available drugs for the treatment of Chagas disease and leishmaniasis are not efficient and cause toxic side effects. Several studies show the possibil ity of drug resistance induction to Benznidazol (BZ) in T rypanosoma cruzi, which may interfere with the treatment efficacy . The same has been observed regarding compounds used to treat leishmaniasis, although more studies on drug resistance mechanism are n eed ed . In the present study we focused on two potential drug resistance mechanisms: 1) P - glycoprotein (Pgp) activity, a membrane protein which acts as an efflux pump energy - dependent and is associated with the multidrug resistance fenotype (MDR); 2) the en zyme nitroreductase (TcNTR) found in T. cruzi, which is responsible for the reduction of nitroheterocyclic derivatives, such as Bz and Nifurtimox, generating metabolites with trypanocidal activity . In the search for new selective drugs for the treatment of Chagas disease and leishmaniasis, our group has been studying compounds from the class of the thiosemicarbazone s . Previous studies showed that the 4 - N - (2 - methoxy - styryl) - thiosemicarbazone (2 - MEOTIO) was the most efficient compound on different forms of T. cruzi, whereas 4 - N - (4’ - hidroxy - 3’ - methoxy styryl) - thiosemicarbazone ( 3 - MEOTIO ) was the most active on Leishmania amazonensis . Here we evaluated the drug resistance mechanism to both thiosemicarbazone derivatives, as well as, to BZ which was used as r eference drug for T. cruzi . Our results show the participation of P gp in the resistance to both 2 - MEOTIO and BZ in T. cruzi, as well as in the resistance in L. amazonensis to the compound 3 - MEOTIO . Interestingly, in T. cruzi the participation of Pg p is related to its localization not only in the plasma membrane but also in the mithocondri on . In addition, in T. cruzi , the loss of the TcNTR gene function is involved in BZ - resistance , however i t was also shown that other mechanisms of drug resistan ce a re also involved and that that these mechanisms may be different even among clones obtained from a single population (B15). We also described here the in vitro validation of the expression of luciferase in different T. cruzi strains transfectaded with the red - shifted - luciferase gene , which wil l be further used in bioluminescence imaging assays in vivo . The drug resistance mechanisms in T. cruzi and L. amazonensis shown here may be useful in the identification of parasite targets, aiming the rational design of new drugs to treat for Chagas disease and leishmaniasis

Made available in DSpace on 2016-05-19T13:20:10Z (GMT). No. of bitstreams: 2 ivan_junior_ipec_dout_2013.pdf: 1028310 bytes, checksum: dff45af1d04ca95b16081c45df029842 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / O regime de tratamento com múltiplas drogas é correspondente a uma interação de drogas que pode causar efeitos adversos e falha no tratamento. Essa interação pode gerar modificações funcionais dos transportadores de membrana e por consequência a biodisponibilidade das drogas durante o tratamento. Dentre os transportadores de drogas transmembranares está a glicoproteína-P (P-gp), uma proteína de 170KD, produto do gene MDR1, caracterizada como uma \201CATP Binding cassete\201D (ABC). Seu papel está muito bem definido nas células neoplásicas multirresistentes a drogas, assim como sua relação com as drogas para o tratamento da infecção pelo HIV. Entretanto, pouco tem sido estudado sobre esta bomba de efluxo na tuberculose multirresistente (TBMR). Neste estudo analisamos por citometria de fluxo sua expressão e atividade de efluxo nos monócitos, principal célula relacionada com a tuberculose e também em linfócitos e granulócitos do sangue periférico por meio da citometria de fluxo. A taxa de efluxo foi medida através do uso da Rodamina 123 (Rho123) e a expressão da P-gp através do anticorpo monoclonal anti-CD243 (clone UIC2). A utilização direta do sangue total para a determinação da atividade de efluxo por citometria de fluxo caracterizou a implantação de uma nova ferramenta de análise para a pesquisa A análise contemplou 52% do total de pacientes em tratamento de TBMR no ambulatório do Laboratório de Pesquisa em Micobacterioses do Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas (IPEC). Para as análises foram levadas em consideração a idade, cor da pele, o tempo de tratamento e a quantidade de drogas administradas. O estudo revelou que há correlação entre a expressão da P-gp nos monócitos e a idade dos pacientes (P<0,01). Diferenças entre pacientes brancos e não brancos também foram observadas. Em linfócitos a expressão de P-gp quando aumentada foi diretamente proporcional à atividade de efluxo observada nos monócitos (P< 0,05). Além disso, pacientes submetidos ao tratamento para TBMR por até seis meses apresentaram uma maior expressão de P-gp e, linfócitos quando comparados àqueles que receberam o tratamento por mais de seis meses (P<0,01) / When two or more drugs are administrated, such interactions can cause additive, synergistic or antagonistic effects. The drug transporters may undergo treatments effects and therefore change the dr ugs bioavailability during the treatment and can cause treatment failure. Among the know n drug transporters there is transmembrane P - glycoprotein (P - gp). It is a 170 KDa transmem brane protein w h ich is a product of multidrug resistance MDR1 gene. This protein is a well - characterized ABC transporter ( ATP Binding Cassette ) and is responsible for efflux of the chemotherapeutic agents from resistant cancer cells. There are few studies about this protein in multidrug - resistant tuberculosis (MDR - TB) . In this study, P - gp expression and activity were detect by flow cytometry in monocytes, the main cell related with the M.tuberculosis infection , as well as in lymphocytes and granulocytes from whole peripheral blood . P - gp mediated efflux was determined indirectly by measuring the retention of a fluorescent P - gp substrate, rhodamine 123 ( Rho123) . P - gp expression was assessed using anti - P - gp monoclonal antibody UIC2 (CD243 ). The efflux activ ity with whole blood using flow cytometry technique as a new tool to pharmacogenetic research was developed in this study. We analyzed 52 % of outpatient in MDR - TB treatment from Laboratory Research Mycobacteriosis Institute Evandro Chagas Clinical Researc h (IPEC). We considered variables as age, race, treatment time, amount of drug administered at the time of blood collection and their correlation with P - gp expression and activity. The result revealed a correlation between the P - gp expression in monocytes and ag e ( P < 0 .01). In addition, difference between white and nonwhite patients was observed . Lymphocyte P - gp expression was statistically significant greater in patients w ith increased monocytes efflux activity evidenced by P - gp inhibition with CSA ( P < 0 .0 5 ). P atients undergoing MDR - TB treatment for six months had a higher P - gp expression in lymphocytes compared to those who received the treatment for more than six months ( P < 0 .01).

Orientadora: Profa. Dra. Maria Aparecida Sperança / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2016. / O arbovírus Mayaro (MAYV), pertence ao gênero Alphavirus, família Togaviridae e grupo sorológico A. Como parte do projeto de pesquisa sobre "Arboviroses Emergentes na Amazônia Ocidental", foi isolada uma estirpe de um alphavirus Mayaro a partir de um indivíduo febril de Acrelândia, Acre. O MAYV ocorre no ambiente silvestre ou rural em áreas próximas a florestas e seu ciclo de transmissão envolve a participação de primatas não humanos, aves e mosquito Haemagogus ssp. As características patogênicas do vírus MAY em humanos são pouco compreendidas e o potencial de dispersão desses vírus e a possibilidade de participação de espécies de mosquitos do gênero Aedes em seu ciclo de transmissão fazem desse vírus um importante organismo para estudos biológicos e epidemiológicos. Devido à natureza não específica dos sinais e sintomas de doenças febris agudas causadas por MAYV, o diagnóstico clínico é difícil e pode ser confundido com outras doenças febris, como: a febre da dengue, febre do chikungunya, febre amarela e a malária. Já o diagnóstico laboratorial por isolamento viral é laborioso e depende de infraestrutura e pessoal especializado, disponível em poucos laboratórios brasileiros. O diagnóstico imunoenzimático possui limitações quanto à utilização de partículas virais infecciosas e também por produzirem reações cruzadas com vírus da mesma família. Sendo assim, com o intuito de obter antígeno recombinante específico para detecção de MAYV, este projeto teve por objetivo expressar a glicoproteína E2 do vírus em células de insetos utilizando baculovírus recombinante como vetor. A glicoproteína E2 dos alphavirus tem a função de se ligar a receptores presentes na membrana plasmática da célula alvo para a entrada do vírus através de uma vesícula endossomal. Como resultado, foi obtido o baculovírus recombinante para a glicoproteína E2 de MAYV, e a mesma foi expressa pela primeira vez em células de inseto High-FiveTM. Apesar de utilizar vetor com sinal de exportação da proteína recombinante para o meio extracelular, a glicoproteína recombinante E2 de MAYV não foi exportada, permanecendo na fração celular da cultura. Análises da estrutura tridimensional da E2 homóloga de alphavirus indicaram que esta glicoproteína apresenta um domínio transmembrana, o que justifica sua permanência na bicamada fosfolípidica da célula hospedeira. / The arbovirus Mayaro (MAYV), belongs to the genus Alphavirus, family Togaviridae and serological group A. As part of the research project on "Emerging Arboviroses in the Western Amazon", a strain of Mayaro alphavirus was isolated from a febrile individual of Acrelândia, Acre. MAYV occurs in the wild or rural environment, in areas near to forests and its life cycle includes the participation of non-human primates, birds and mosquito Haemagogus ssp. The pathogenic characteristics of MAYV in humans are poorly understood and the dispersal potential of these viruses and the possibility of participation of species of Aedes mosquitos in its transmission cycle make this virus an important organism for biological and epidemiological studies. Because of the nonspecific nature of the signs and symptoms of acute febrile illness caused by MAYV, clinical diagnosis is difficult and can be confused with other infectious diseases, such as dengue fever, chikungunya fever, yellow fever and malaria. Moreover laboratory diagnosis by viral isolation is laborious and depends on infrastructure and trained personnel available in a few Brazilian laboratories. The enzyme immunoassay diagnosis has limitations on the use of infectious viral particles and also for producing cross-reactions with other virus from the same group. Thus, in order to obtain recombinant antigen for specific detection of MAYV, this project aimed to express the MAYV E2 glycoprotein in insect cells using recombinant baculovirus as vector. The E2 glycoprotein of the alphaviruses has the function of binding to receptors in the plasma membrane of the target cell for viral entry through an endosomal vesicle. The recombinant baculovirus was obtained for the MAYV E2 glycoprotein, and this protein was expressed for the first time in High- FiveTM insect cells. Despite using a vector with signal to exportation of the recombinant protein to the extracellular medium, the MAYV E2 glycoprotein was not exported, remaining in the cell fraction of the culture. Structural analyses of alphavirus E2 homologous protein indicated that the glycoprotein has a transmembrane domain, which justifies its permanence in the host cell phospholipid bilayer.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:46Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-07-21Bitstream added on 2014-06-13T18:51:20Z : No. of bitstreams: 1 calado_amc_me_jabo.pdf: 1098325 bytes, checksum: e69e94e5c8654a5cdbae32a66649fbe3 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A leishmaniose visceral canina (LVC) é uma doença sistêmica e imunomediada. É provocada pelo protozoário da espécie Leishmania (L.) chagasi, que é transmitido ao homem e aos animais através da picada do vetor infectado, o flebotomíneo Lutzomyia longipalpis. Até o momento não há tratamento que leve a cura parasitológica dos cães e o arsenal de fármacos leishmanicidas é limitado. A resistência aos medicamentos constitui um impedimento importante para o controle de enfermidades e a manifestação de resistência a vários medicamentos é conhecida como MDR (“multidrug resistance”). Um desses mecanismos de resistência a múltiplas drogas é o aumento da expressão da glicoproteína-P (gp-P), um sistema de efluxo de xenobióticos codificadas pelo gene MDR1. Na presente pesquisa, buscou-se avaliar a possibilidade do fenômeno de resistência a múltiplas drogas em cães naturalmente parasitados por Leishmania (L.) chagasi . Foram objetivos do estudo avaliar a expressão da glicoproteína-P (gp-P) e da proteína de resistência a múltiplas drogas (MRP) por meio da imuno-histoquímica, em amostras fígado, adrenais, rins, baço e pele de cães portadores da LV. Os resultados mostraram que o fígado, rins e adrenais expressam significativamente (p<0,001) mais gp-P do que a pele e o baço; também que as adrenais expressam significativamente (p<0,001) mais MRP do que a pele e o baço e que este ultimo expressa significativamente (p<0,001) mais MRP do que a pele. Quando se comparou os dois anticorpos verificou-se que o fígado, rins e adrenais expressam porcentagens semelhantes de células imunomarcadas e que o MRP é significativamente (p<0,01) mais reativo na pele que a gp-P. Esses resultados poderiam justificar a redução da carga parasitária na pele que se acompanha durante o tratamento. Todavia, a não obtenção da cura parasitológica poderia ser devido a alta expressão... / Canine visceral leishmaniasis (LVC) is a systemic immunomediated disease. It is caused by the protozoary from the Leishmania (L.) chagasi species, wich is transmitted to man and animals through the infected vector bite, the phlebotomine sand fly Lutzomyia longipalpis. Until present, there is no treatment leading to a parasitologic cure for dogs and the leishmanicide medicine arsenal is limited. Drug resistance is one of the important impediments for infirmity control and the resistance manifestation to multiple drugs is known as MDR. One of those multiple drugs resistance mechanisms is the increase of the glycoprotein-P (gp-P) expression, a xenobiotic efflux system encoded by the MDR1 gene. At the present research, it aimed to evaluate the possibility of resistance phenomenon the multiple drugs in dogs naturally parasited by Leishmania (L.) chagasi. The objectives of this study was to evaluate glycoprotein-P (gp-P) and multiple drugs resistance protein (MRP) immunohistochemical expressions in LVC infected dogs’ liver, adrenals, kidneys, spleen and skin samples. Results showed that liver, kidneys and adrenals express significantly (p<0,001) more gp-P than skin and spleen; also, adrenals express significantly (p<0,001) more MRP than skin and spleen and that spleen express significantly (p<0,001) more MRP than skin. When the two antibodies were compared, it was verified that liver, kidneys and adrenals express similar percentages of immunomarked cells and that MRP is significantly more reactive in skin than gp-P. These results could justify the parasitary load reduction in skin during treatment. Nevertheless, the lack of parasitologic cure could be due to the high pg-P and MRP1 expressions in liver, adrenals and kidneys, which could increase the pharmac efflux at these organs

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:56:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 1835.pdf: 1426469 bytes, checksum: f474e4a11463f269c448f21cb7cd2ed6 (MD5) Previous issue date: 2008-03-14 / Universidade Federal de Sao Carlos / The increment of the expression of complex correctly processed recombinant proteins, like the ones produced by animal cells, is essential for the development of an efficient large scale bioprocess. The manipulation of culture conditions plays a very important role in the controlled and optimized expression of these proteins in bioreactors. The response of mammalian and insect cells to temperature effect has been studied by several researchers as a potential strategy to enhance production of recombinant proteins. The present study evaluated the influence of the temperature in the culture of recombinant Drosophila melanogaster S2 cells in Sf-900 II medium supplemented with aminoacids with the aim of enhancing the production of the rabies virus glycoprotein (RVGP). The cultures were carried out in Schott flasks (in shaker) as well as in a bubble-free stirred tank bioreactor. Five temperatures were tested in Schott flasks cultures: 16, 20, 24, 28 and 34ºC. The results obtained in cultures at those temperatures in terms of maximum specific growth rate (µmax) and maximum RVGP concentration (CGPV max) were, respectively: 0.009, 0.020, 0.039, 0.036 and 0.022 h-1, and 0.075, 2.973, 0.480, 1.404 and 0.013 mg.mL-1. The best temperature for RVGP production (20oC) was chosen to be evaluated in the bioreactor operated in batch and feed-batch mode, keeping 28oC as control. The results of µmax and CGPV max in batch mode were: 0,061 h-1 and 0,149 mg.mL-1 at 28oC and 0,027 h-1 and 0.354 mg.mL-1 at 20oC. A batch experiment with stepwise temperature decrease from 20ºC to 16ºC presented a µmax ranging from 0.024 to 0.012 h-1 and a final CGPV max of 0.567 mg.mL-1. On the other hand, at 20ºC in feed-batch mode, µmax was 0.024 h-1 and CGPV max 1.155 mg.mL-1. The larger production of RVGP observed in Schott flasks can be a consequence of a more favorable condition for the expression of the protein at low values of dissolved oxygen concentrations that are seen in flasks but not in controlled bioreactor cultures at 50% DO. Overall, these results show an increase of recombinant protein expression at lower temperatures, especially when µmax is kept fairly low. The largest production of RVGP was obtained in the culture at 20°C in Schott flask when CGPV max was 2.973 mg.mL-1, while the production obtained at the control temperature of 28ºC was only of 1.404 mg.mL-1. Thus, the use of reduced culture temperatures, around 20°C, seems to be the best strategy for the optimization of RVGP production. / aumento da expressão de proteínas recombinantes complexas corretamente processadas como as produzidas por células animais é essencial para o desenvolvimento de um bioprocesso eficiente em larga escala. A manipulação das condições de cultivo desempenha um papel muito importante na expressão otimizada e controlada dessas proteínas em biorreatores. A resposta de células de mamíferos e de insetos quando submetidas ao efeito da temperatura vem sendo estudada por vários pesquisadores como estratégia potencial para o aumento de expressão de proteínas recombinantes. No presente trabalho propõe-se avaliar a influência da temperatura no cultivo celular com o propósito de intensificar a produção da glicoproteína do vírus da raiva (GPV) em cultivo de células de Drosophila melanogaster S2 recombinante em meio de cultura Sf900-II suplementado com aminoácidos, em frascos Schott (em shaker) e em biorreator de tanque agitado livre de bolhas. Para tal, foram avaliadas cinco temperaturas de cultivo em frasco Schott: 16, 20, 24, 28 e 34ºC. Os resultados obtidos de velocidade específica de crescimento máxima (µmax) nesses cultivos foram, respectivamente: 0,009, 0,020, 0,039, 0,036 e 0,022 h-1, e de concentração máxima de GPV (CGPV max): 0,075, 2,973, 0,480, 1,404 e 0,013 mg.mL-1. A melhor temperatura para produção de GPV (20oC) foi escolhida para ser testada em biorreator operado em batelada e batelada alimentada, mantendo 28oC como controle. Os resultados de µmax e CGPV max em batelada foram: 0,061 h-1 e 0,149 mg.mL-1 a 28oC e 0,027 h-1 e 0,354 mg.mL-1 a 20oC. Um experimento em batelada com temperatura decrescente em etapas de 20ºC a 16oC apresentou um µmax variando de 0,024 a 0,012 h-1 e uma CGPV max final de 0,567 mg.mL-1. Por outro lado, a 20ºC em batelada alimentada, µmax foi de 0,024 h-1 e CGPV max de 1,155 mg.mL-1. A maior produção de GPV observada em frascos Schott pode ser conseqüência de uma condição mais favorável para expressão da proteína em condições de baixa concentração de oxigênio dissolvido como as usuais em frascos Schott mas não em cultivos em biorreator com oxigênio dissolvido controlado a 50%. Em geral, estes resultados mostram uma maior expressão da proteína recombinante nas temperaturas mais baixas, especialmente quando µmax é mantido razoavelmente baixa. A maior produção de GPV foi obtida no cultivo realizado a 20ºC em frasco Schott quando CGPV max=2,973 mg.mL-1 em comparação a 1,404 mg.mL-1 obtida no cultivo controle a 28ºC. Assim, a utilização de temperaturas de cultivo mais baixas, próximas de 20ºC, pode ser considerada a melhor estratégia na otimização da produção de GPV.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:49:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2008 / Uma nova proteína de semente de soja (Glycine max), denominada ApcSP (antiplatelet and anticoagulant soybean protein) foi isolada, purificada e caracterizada bioquimicamente. A partir de extratos brutos destas sementes, foi realizado um fracionamento com sulfato de amônio, obtendo-se a fração F0-60%, com posterior submissão à cromatografia de afinidade em coluna de Cramoll 1,4-Sepharose. As proteínas adsorvidas eluídas com NaCl 1,0 M em tampão fosfato de sódio 0,1 M, pH 7,0 foram submetidas à cromatografia de fase reversa HPLC. SDS-PAGE na presença de &#946;-mercaptoetanol revelou uma banda polipeptídica de 51 kDa. Coloração com o reagente de Schiff revelou a natureza glicoprotéica de ApcSP. A seqüência do N-terminal obtido pela degradação de Edman foi EGQFGPMIQS (10 resíduos), que apresenta 20% de homologia com a proteína albumina 2S tipo 3. O espectro de dicroísmo circular foi característico de uma proteína predominantemente &#945;-hélice, e este foi utilizado para estimar as contribuições das frações de estruturas secundárias presentes em ApcSP. Desconvolução usando o programa CDPro indicou a presença de 35% de alfa hélice, 17% de folhas-beta, 22 % de volta-beta e 26% de desordenada. O espectro de Fluorescência de ApcSP revelou uma emissão máxima em torno de 339 nm. A proteína da soja foi excitada em 280 nm e 295 nm, e os espectros de emissão foram monitorados na faixa de 290-450 nm e de 305-450 nm. Atividade peroxidásica foi detectada utilizando guaiacol e diaminobenzidina como substratos. Biologicamente, houve uma inibição da agregação plaquetária induzida por colágeno (100% de amplitude e 98% de slope), trombina (79% de amplitude e 77% de slope) e ADP (62% de amplitude e 58% de slope) na concentração de 2 &#956;M de ApcSP em relação ao controle. Foi também avaliado o efeito da proteína de soja purificada nos tempos de coagulação, afetando as vias extrínseca e intrínseca da coagulação. O tempo de tromboplastina parcialmente ativada (TTPa) foi bloqueado na concentração de 3 e 4 &#956;M, apresentando um R (Relação do tempo de coagulação com o tempo controle de coagulação) > 7,5. Estes resultados evidenciam que ApcSP com as atividades antiagregação plaquetária e anticoagulante pode ser de grande importância para a terapia anti-trombótica e anticoagulante