Orientador: Michel Georges Albert Vincentz / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-11T18:45:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DelBem_LuizEduardoVieira_M.pdf: 9371325 bytes, checksum: 4720605c3fed6784b51b26b99feff19c (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Introdução: Os xiloglucanos são os polímeros de açúcar mais abundantes na hemicelulose da maioria das espécies de plantas terrestres, em especial nas eudicotiledôneas. Possuem papel estrutural na parede celular vegetal, interagindo com os filamentos de celulose, e podem ser utilizados como reserva em sementes de várias espécies de eudicotiledôneas, como o Jatobá (Hymenaea courbaril), onde correspondem a quase 50% do peso seco da semente. Este polímero é formado por uma cadeia central de ß-glucano com ramificações que contêm xilose, galactose e fucose. O mecanismo de degradação deste polímero é realizado por cinco hidrolases: XTH, ß-Galactosidase, ß-Glucosidase,? a-Xilosidase e? a-Fucosidase. Estas enzimas são codificadas por genes que constituem famílias multigênicas nos genomas de plantas, e sua atividade na degradação seletiva de xiloglucano têm papel central na regulação do crescimento e morfogênese da célula vegetal. O Jatobá (Leguminosae) é uma árvore tropical, nativa do Brasil, que vem sendo utilizada como modelo vegetal para estudos de impacto ambiental por efeito estufa e estresses abióticos oriundos do aquecimento global. Foi observado que mudas de Jatobá, crescidas numa atmosfera com 720 PPM de CO2 (dobro da concentração atual), apresentam até 50% de aumento de biomassa aos 100 dias. O entendimento das respostas transcripcionais desta planta, em resposta a estes estresses, pode levar a conclusões à cerca de como as florestas tropicais responderão ao aumento inexorável na concentração de CO2, num quadro de aquecimento global. Resultados: Construímos bibliotecas de cDNA de folhas, caule, cotilédones e raízes de plântulas de 45 dias de Jatobá. Um seqüenciamento amostral dos ESTs levou à obtenção de 103 seqüências, parciais ou completas, de proteínas de Jatobá. São os primeiros dados de ESTs numa árvore tropical brasileira. Análises filogenéticas das enzimas que constituem o mecanismo de degradação de xiloglucano foram conduzidas ao longo de 13 genomas completos e 27 bancos de ESTs de espécies dos mais diversos grupos no reino Viridiplantae. Isso nos permitiu organizar a diversidade destas cinco famílias multigênicas em possíveis grupos de ortólogos (PoGOs). As XTHs foram divididas em seis grupos de genes homólogos e 19 PoGOs. As ß-Galactosidases foram divididas em dois grupos de genes homólogos e 10 PoGOs. As ß-Glucosidases foram divididas em dois grupos de genes homólogos e dois PoGOs. As? a-Xilosidase foram divididas em três PoGOs e as a-Fucosidase em dois PoGOs não relacionados evolutivamente. Conclusões e Perspectivas: As 103 seqüências peptídicas obtidas de Jatobá foram anotadas por comparação e serão disponibilizadas nos bancos de dados internacionais. A perspectiva de seqüenciar mais clones poderá levar à montagem do transcriptoma do Jatobá, algo inédito para uma árvore tropical. Concluímos, com as análises filogenéticas, que as XTHs, que formam um grupo monofilético de genes em Streptophyta, surgiram antes da conquista do ambiente terrestre. Estes genes foram progressivamente amplificados ao longo da evolução das plantas terrestres, o que sugere um ganho progressivo de complexidade, que teve seu auge nas Angiospermas. Apresentamos evidências que podem unir evolutivamente as XTHs exclusivas de plantas a enzimas transglicosiladoras de cadeias de ß -glucano em fungos, o que sugere uma origem comum do processo de transglicosilação de cadeias de ß-glucano como mecanismo de controle do crescimento e formato celular em eucariotos com parede celular. As ß-Galactosidases formam um grupo monofilético em Embryophytas com nove PoGOs, no entanto sua grande diversificação (seis PoGOs) ocorreu apenas em Angiospermas. As ß -Glucosidases formam um grupo monofilético em Embryophytas, seqüências similares em bactérias fotossintetizantes podem sugerir uma origem no ancestral dos cloroplastos. As a -Xilosidase, que são monofiléticas nas Spermatophytas, derivaram das ?a-Glucosidases que se encontram dispersas entre todos os eucariotos, é um caso de neofuncionalização. Duas linhagens distintas evolutivamente de a-Fucosidases foram encontradas, uma delas é monofilética em Embryophytas e a outra pertence a uma grande família multigênica (GDSL-motif) da qual pouco se sabe. Mostramos que o mecanismo completo (cinco hidrolases) de degradação de xiloglucano existia no ancestral comum das Spermatophytas (plantas com semente). Como perspectivas este trabalho permite a racionalização de estudos funcionais destas hidrolases o que, em longo prazo, pode contribuir com processos biotecnológicos que passem pela modificação seletiva da parede celular vegetal. / Abstract: Introduction: Xyloglucans are the main hemicelulose in most of land plants, especially in eudicots. It is a structural compound of plant cell-wall that interacts with cellulose and can be used as seed's energy storage of many species, like Jatoba (Hymenaea courbaril). Xyloglucan structure is composed of a ß-glucan backbone that it branched with xylose, galactose and fucose. Its degradation machinery is composed by five glycosil hydrolases: XTH, ß-Galactosidase, ß-Glucosidase,?a-Xylosidase and? a- Fucosidase. These enzymes are codified by multigenic families in plant's genomes and it plays a central role in key processes like growth and morphogenesis of plant cells. Jatoba (Leguminosae) is a tropical tree, native of Brazil. It's been used as a model tree in researches of plant's responses to stresses caused by global warming and high atmospheric CO2 concentration. It was observed a 50% increase in biomass of a 100 days Jatoba seedling when grown in a 720 PPM of CO2 atmosphere (two times bigger than today's atmospheric concentration). Understand the transcriptional responses to these stresses can lead to conclusions about how tropical forests will respond to high concentrations of CO2 and global warming. Results: We made cDNA libraries of leaves, stem, cotyledons and roots of 45 days seedlings of Jatoba. A preliminary sequencing of these libraries reveled 103 predict protein sequences (most partial sequences). Phylogenetic analyses of xyloglucan hydrolytic enzymes were conducted using 13 completed genomes and 27 ESTs assemblies, from a wild range of taxonomic groups in the Viridiplantae kingdom. It allowed us to divide XTH's diversity of genes into six homology groups and 19 possible groups of orthologues (PoGOs). ß-Galactosidases were divided into two groups of homologues and 10 PoGOs. ß -Glucosidases were divided into two groups of homologues and two PoGOs. a-Xylosidase were divided into three PoGOs and a-Fucosidase into two PoGOs evolutionarily unrelated. Conclusions and Perspectives: The 103 protein sequences of Jatoba were annotated by comparison to known proteins and will be deposited in international sequences assemblies. As a perspective, the sequencing of Jatoba ESTs will lead to the assembly of its transcriptome, something never done before in a tropical tree. We concluded that XTHs are monophyletic group o genes in Streptophyta, what means they emerged before lands conquest by plants. These genes were progressively amplified in land plants evolution, especially in Angiosperms, what suggests a progressive gain in complexity. We showed evidences of a possible evolutionary relation between plant's XTHs and fungus hydrolases/transglycosylases enzymes. It suggests a eukaryotic ancestral mechanism to control cell expansion and shape based in ß -glucan transglycosylation and its interaction to cellulose (in plants) or chitin (in fungus). The ß -Galactosidases are a monophyletic group in Embryophytas that were divided into nine PoGOs, six PoGOs only appeared in Angiosperms. The ß -Glucosidases belongs to a monophyletic group in Embryophytas that has sequence similarity to bacterial proteins, especially ones from photosynthetic bacteria species. The a-Xylosidases are a PoGO in Spermatophyta that probably emerged from a-Glucosidases presents in all eukaryotes. It's probably a neofunctionalization process. Two evolutionary distinct lineages of a-Fucosidases where found, one monophyletic in Embryophytas and another that belongs to the poorly understood multigenic family "GDSL-motif proteins". We showed that the complete machinery (all the five hydrolases) of Xyloglucan degradation already exists in Spermatophytas common ancestor. As a perspective, we expect to rationalize the functional characterization works among these multigenic families and to contribute in biotechnology processes that pass through cell-wall modification and selective control. / Mestrado / Genetica Vegetal e Melhoramento / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Orientadores: Glaucia Maria Pastore, Fábio Márcio Squina / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-22T10:16:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_JunioCota_D.pdf: 6755717 bytes, checksum: 8ce3ba1fb6b01179b70462bf26349499 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Atualmente há uma crescente demanda para o desenvolvimento de combustíveis não-fósseis alternativos. Assim, como a biomassa lignocelulósica é uma das fontes de energia mais abundantes na natureza, pode ser estabelecida uma economia verde e sustentável, com o objetivo de processar a grande quantidade de energia estocada nessas matérias-primas. O etanol de cana-de-açúcar é uma das melhores opções em biocombustíveis e sua produção pode mais que dobrar, se os açúcares constituintes da parede celular vegetal forem utililizados. No entanto, o alto custo de produção das enzimas para hidrolisar e processar os materiais lignocelulósicos é um fator altamente limitante para o uso de tecnologias verdes. Este trabalho se propôs a avaliar novos biocatalisadores e construir uma enzima quimérica na tentativa de obter glicosidases com melhor desempenho que as já relatadas. Enzimas despolimerizadoras de ß-1,3-glucanos têm consideráveis aplicações biotecnológicas, incluindo produção de biocombustíveis, insumos químicos e farmacêuticos. No segundo capítulo, mostramos a caracterização funcional e a estrutura de baixa resolução da laminarase hipertermofílica de Thermotoga petrophila (TpLam), além de seu modo de operação por eletroforese capilar de zona, mostrando que ela cliva especificamente ligações ß-1,3-glucosídicas internas. O dicroismo circular (CD) UV-distante demonstrou que TpLam é formada principalmente por elementos estruturais do tipo beta, e a estrutura secundária é preservada após incubação por 16 horas a 90 º C. A forma determinada pelo pequeno espalhamento de raios-X a baixo ângulo revelou uma arquitetura de multi-domínio da enzima, com um arranjo de envelope em forma de V, no qual os dois módulos de ligação de carboidrato estão ligados ao domínio catalítico. A engenharia de enzimas multifuncionais pode melhorar coquetéis enzimáticos para tecnologias emergentes de biocombustíveis. Dinâmica molecular através de modelos baseados em estrutura (SB) é uma ferramenta eficaz para avaliar a disposição tridimensional das enzimas quiméricas, bem como para inferir a viabilidade funcional antes da validação experimental. No terceiro capítulo, descrevemos a montagem computacional de uma quimera bifuncional xilanase-liquenase (XylLich), usando os genes xynA e bglS de Bacillus subtilis. As análises in silico da área de superfície acessível ao solvente (SAS) e da raiz quadrada média das flutuações (RMSF) previram uma quimera completamente funcional, ou seja, uma enzima cujo substrato tem acesso ao seu sítio catalítico com pequenas flutuações e variações ao longo das cadeias polipeptídicas. A quimera preservou as características bioquímicas das enzimas parentais, com exceção de uma pequena variação na temperatura de operação e na eficiência catalítica (kcat / Km). Também foi verificado ausência de mudanças significativas no modo de operação catalítico. Além disso, a produção de enzimas quiméricas pode ser mais rentável do que a produção de uma única enzima separadamente, comparando-se o rendimento da produção de proteína recombinante e a atividade hidrolítica da enzima quimérica com as enzimas parentais. ß-Glicosidases (BGLs) são enzimas muito úteis e com grande potencial para serem empregadas em diversos processos industriais. Entretanto, algumas características são essenciais para tornar viáveis as aplicações, como por exemplo estabilidade à temperatura e ao pH, bem como baixa inibição por íons e outros compostos químicos. Assim, no quarto capítulo buscamos estudar três BGLs dos organismos extremófilos Pyrococcus furiosus e Thermotoga petrophila. Os genes PfBgl1, TpBgl1 and TpBgl3 foram clonados no vetor pET28a e as proteínas expressadas em Escherichia coli e posteriormente purificadas em duas etapas cromatográficas. As enzimas purificadas foram avaliadas quanto ao pH e temperatura de atividade, sendo que as BGLs da família GH1 (PfBgl1 e TpBgl1) apresentaram faixas mais largas de pH e temperatura de operação do que a família GH3 (TpBgl3). As BGLs mostraram grande estabilidade ao pH e o maior tempo de meia-vida (a 99 ° C) foi verificado no pH 6, e além disso, não foram significativamente afetadas pela presença de EDTA ou de íons, exceto a TpBgl1 que foi inibida por Hg2+ e Fe2+. As atividades específicas para um conjunto de diferentes substratos sugeriram que TpBgl3 é mais específica que as BGLs GH1. O kcat e kcat / Km em 4-nitrofenol-ß-D-glicopiranosídeo (pNPG) indicam que TpBgl3 é a mais eficiente para hidrólise do substrato, embora seja a enzima que foi inibida com a menor concentração de glicose (30.1 mM). Além disso, as BGLs foram analisadas quanto à influência de seis monossacarídeos na catálise, e demonstraram serem fracamente inibidas pela maioria dos açúcares testados. Os ensaios de CD UV-distante revelaram que a estrutura secundária das BGLs não é afetada pelas variações de pH, e os estudos de desnaturação térmica evidenciaram que as BGLs são proteínas hipertermofílicas / Abstract: There is an increasing demand for the development of alternative non-fossil fuels. Thus, since the lignocellulosic biomass is the most abundant source in nature, it may be settled a green and sustainable economy, aiming to process the great amount of energy stocked in these raw materials. The ethanol from sugarcane is one of the best options concerning biofuels and its productivity could be raised more than double if the use of sugars constituents of plant cell wall is considered. However the high production cost of the enzymes to hydrolyze and process lignocellulose is a great limiting factor for green technologies. In this way, this work proposed to evaluate new enzymes and engineer a chimeric enzyme in the attempt to prospect glycosyl hydrolases with better performance than those reported up to date. 1,3-ß-Glucan depolymerizing enzymes have considerable biotechnological applications including the production of biofuels, feedstock-chemicals and pharmaceuticals. In the first chapter we showed the comprehensive functional characterization and low-resolution structure of hyperthermophilic laminarase from Thermotoga petrophila (TpLam), besides its mode of operation through capillary zone electrophoresis, which specifically cleaves internal ß-1,3-glucosidic bonds. Far-UV circular dichroism demonstrated that LamA is formed mainly by beta structural elements, and the secondary structure is maintained after incubation up to 16 hours at 90ºC. The structure determined by small angle X-ray scattering revealed a multi-domain structural architecture of the enzyme with a V-shape envelope arrangement of the two carbohydrate binding modules in relation to the catalytic domain. Multifunctional enzyme engineering can improve enzyme cocktails for emerging biofuel technology. Molecular dynamics through structure-based models (SB) is an effective tool for assessing the tridimensional disposal of chimeric enzymes as well as for inferring the functional practicability before experimental validation. In the second chapter we describe the computational design of a bifunctional xylanase-lichenase chimera (XylLich) using the xynA and bglS genes from Bacillus subtilis. In silico analysis of the average surface accessible area (SAS) and the root mean square fluctuation (RMSF) predicted a fully functional chimera, i.e. the substrate has access to the catalytic pocket with minor fluctuations and variations along the polypeptide chains. The chimera preserved the biochemical characteristics of the parental enzymes, with the exception of a slight variation in the temperature of operation and the catalytic efficiency (kcat/Km). The absence of substantial shifts in the catalytic mode of operation was also verified. Furthermore, the production of chimeric enzymes could be more profitable than producing a single enzyme separately, based on comparing the recombinant protein production yield and the hydrolytic activity achieved for XylLich with that of the parental enzymes. ß-Glucosidases (BGLs) are very useful enzymes with a great potential to be employed in several industrial processes. However, some features are required to become viable the enzyme applications, such as temperature and pH stability as well, low ions and chemicals inhibition. Thus this work aimed to study three BGLs from the extremophiles organisms Pyrococcus furiosus and Thermotoga petrophila. The genes PfBgl1, TpBgl1 and TpBgl3 were cloned into pET28a vector and the proteins were expressed in Escherichia coli and further purified in two chromatographic steps. The purified enzymes were evaluated for pH and temperature of activity, which showed that BGLs from the glycosyl hydrolases family 1 (PfBgl1, TpBgl1) presented a wider range of pH and temperature operation than BGL from family 3 (TpBgl3). The BGLs showed great stability to a range of pH (4-10) and the highest time of half-life (at 99 °C) was at pH 6, besides they were not significantly affected by the presence of EDTA or ions, except TpBgl1 that was inhibited by Hg2+ and Fe2+. The specific activities in a set of different substrates suggested that TpBgl3 is more specific than GH1 BGLs. The kcat and kcat/Km in pNPG indicate that TpBgl3 is the most efficient among BGLs characterized herein, although this enzyme is inhibited with the lowest glucose concentration (30.1 mM). Furthermore, the BGLs were assayed for influence of six monosaccharides in catalysis, which the results suggested a weak inhibition by the most of those carbohydrates tested. The CD experiments revealed that the secondary structure of BGLs is not affected by the pH variations and the denaturation studies evidenced that the BGLs are indeed hyperthermophilic / Doutorado / Ciência de Alimentos / Doutor em Ciência de Alimentos

A resistência das paredes celulares vegetais à hidrólise enzimática é um dos grandes gargalos tecnológicos para a obtenção do etanol celulósico. Acredita-se que as modificações nas paredes celulares em processos como a mobilização de reservas, formação de aerênquima, amadurecimento de frutos e senescência, por exemplo, envolvam a ativação de módulos funcionais que culminam em alterações nas paredes celulares. Estes módulos são: 1) recepção de um sinal para início do processo; 2) Morte Celular Programada (PCD); 3) separação celular; 4) expansão celular; 5) hidrólise de hemiceluloses e 6) hidrólise de celulose. No caso da formação de aerênquimas lisígenos o processo que se inicia com a PCD e é seguido pela liberação de glicosil hidrolases que atuam a na degradação e/ou modificação da parede celular, formando espaços de ar no córtex radicular. A formação de aerênquima nas raízes de cana de açúcar é constitutiva e pouco se sabe sobre os mecanismos de modificação que ocorrem na parede celular durante este processo. Este estudo buscou compreender os padrões de variação expressão gênica, proteínas e de atividades enzimáticas associados à formação do aerênquima em raízes de cana de açúcar, com ênfase no papel das hidrolases de parede celular e em algumas proteínas relacionadas à PCD. Foram utilizados 5 segmentos de raízes de 1 cm cada, a partir do ápice radicular. No material coletado observou-se a formação gradual de aerênquima. Foram realizadas análises transcricional, proteômica e atividade enzimática das glicosil hidrolases e outras proteínas que atuam na modificação da parede celular, os quais foram identificados e quantificados ao longo da formação do aerênquima. As glicosil hidrolases pertencentes às famílias Cazy GH1, GH3, GH17, GH18 bem como expansinas, celulose sintase, lacase, calreticulina, calmodulina e proteínas relacionadas a degradação de pectinas, foram encontradas ao longo dos segmentos, principalmente após o segmento 2. De acordo com a atividade transcricional e dados da proteômica, sugere-se que os polissacarídeos seriam atacados por enzimas nos estágios iniciais da formação do aerênquima (seg 2 e 3). O ataque ocorre principalmente sobre as pectinas e o β-glucano. Contudo, os dados apontam para a deposição de xiloglucano, xilanos e celulose (após seg 3), que formam um compósito ao redor dos espaços de ar. Isto sugere que parte dos polissacarídeos das paredes não sejam degradados ao longo do processo, embora enzimas específicas detectadas possam atuar na modificação dos mesmos, como verificado para algumas pectinases e membros de GH17. Além disso, nos pré-tratamentos com água foi possível observar que há maior sacarificação da parede nos seg. 1 e 2. Contudo quando retira-se a maior parte das pectinas e hemiceluloses após pré-tratamento com NaOH, a sacarificação é maior nos segmentos 2, 3 e 4, devido ao maior acesso e a maior quantidade de celulose. As glicosil hidrolases encontradas neste trabalho sugerem que estas atacam a parede de um específico conjunto de células do córtex que dá origem ao aerênquima. Já no fim do processo, quando há lise celular, algumas paredes de células remanescentes são recalcitrante à hidrólise, provavelmente devido a sua arquitetura e composição. Este trabalho traz informações para o desenvolvimento de futuras tecnologias para a produção do etanol do etanol celulósico de cana-de-açúcar / The resistance of plant cell walls to enzymatic hydrolysis is one of the main bottlenecks of the development of technology of production of cellulosic ethanol. It is believed that the modifications in cell walls related to processes of storage mobilization, aerenchyma formation, fruit ripening and senescence, for instance, involve the activation of functional moduli that culminate in alterations of cell walls. These moduli are: 1) signal perception to start the process; 2) Programmed Cell Death (PCD); 3) cell separation; 4) cell expansion; 5) hydrolysis of hemicelluloses and 6) hydrolysis of cellulose. In the case of the formation of lysigenous aerenchyma, the process starts with PCD and is followed by the release of glycosil hydrolases that act on the degradation and/or cell wall modifications, forming air spaces in the cortex of the root. The formation of aerenchyma in the roots of sugarcane is a constitutive phenomenon and little is known about the mechanisms of modification that occur in cell walls during its development. Thus, the present study focused on the visualization of the patterns of variation of gene expression, proteins and enzyme activities associated to the formation of aerenchyma in roots of sugarcane in order to understand the role of the cell wall hydrolases and some proteins related to PCD in cell wall modifications along the process. Five root segments of 1cm each, starting from root apex, were used. A gradual centripetal formation of aerenchyma was recorded in the cortex of developing roots. Analyses of the transcriptional, proteomic and enzyme activity profiles during the process revealed that several enzymes act on cell wall modifications. The glycosil hydrolases belonging to the Cazy families GH1. GH3, GH17, GH18, as well as expansins, cellulose synthase, laccase, calreticulin, calmodulin and other proteins related to pectin degradation have been found along the segments, mainly after segment 2. According to the data on transcriptomics and proteomics, it is suggested that enzymes attack polysaccharides during the initial stages of aerenchyma formation (seg. 2 and 3). The attack of the enzymes occurs mainly on pectins and β-glucan. Conversely, the data point out to the deposition (or maintenance) of xyloglucan, xylan and cellulose (after seg. 3), which form a composite that surrounds the air spaces. This suggests that part of the polysaccharides present in cell walls are not degraded during the process, although specific enzymes have been detected that could act on polysaccharide mobilization, such as the GH17 family. Further, under pretreatment with water, it has been observed that cell wall saccharification was higher at segments 1 and 2. On the other hand, when most of the pectins and hemicelluloses are retrieved by pretreatment with NaOH, saccharification is higher of segments 2, 3 and 4, probably due to the higher access to the wall and also to the higher proportion of cellulose. The profiles related to the glycosil hydrolases found in this work, suggest that these enzymes attack the cell wall. Initially, they are probably kept within a group of cells that will originate the aerenchyma. At the end of the process, when there is cell lysis, the remaining walls of some cells are recalcitrant to hydrolysis probably due to changes in their architecture and composition. Our findings bring promising information that could be used in the future to improve efficiency of hydrolysis for cellulosic ethanol production from sugarcane

Els hidrats de carboni presenten una elevada variabilitat estereoquímica i els organismes s'aprofiten d'aquesta elevada variabilitat utilitzant oligosacàrids i polisacàrids per a una multitud de diferents funcions biològiques. A part de les típiques funcions estructurals i d'emmagatzematge energètic, tenen important rellevància en altres funcions molt més específiques, com per exemple en senyalització cel·lular. Aquesta funcionalitat desperta l'interès de multitud d'aplicacions biotecnològiques, que són el fruit d'un nombre creixent d'estudis en glicobiologia.L'enllaç glicosidic, en especial entre dues unitats de glucosa, és un dels enllaços més estables que es troben en biopolímers naturals. El temps de vida mitja de la hidròlisi espontània d'aquest enllaç en cel·lulosa i en midó és de l'ordre dels 5 milions d'anys. Les glicosil hidrolases son els enzims responsables de la hidròlisi enzimàtica d'aquests biopolímers. Aquests enzims aconsegueixen portar a terme la hidròlisi en escales de temps de l'ordre de 1000 cicles per segon. Donada aquesta elevada activitat, les glicosil hidrolases són considerades un dels catalitzadors biològics més eficients.La present tesi centra el seu principal interès en l'estudi de la formació del complex de Michaelis entre una glicosil hidrolasa de la família 16 (la 1,3-1,4-β-glucanasa) i el seu corresponent substrat. Entendre el procés en el que el substrat s'uneix a l'enzim és un punt clau de cara a raonar les següents etapes de qualsevol mecanisme enzimàtic. Sovint aquest procés ja porta associats canvis conformacionals tant a nivell d'enzim com de substrat que contribueixen a la catàlisi, fent variar les diferències energètiques en el pas de reactius a productes. Per a les β-glicosil hidrolases, existeixen diferents evidències experimentals que recolzen aquest fet. Així, s'observen estructures distorsionades a nivell de substrat respecte les que correspondrien a les estructures més estables en solució. De totes maneres, es desconeixen els factors que determinen que el substrat prefereixi unir-se a l'enzim en una conformació o una altra, i les implicacions mecanístiques que això té. La present tesi tracta de donar resposta a algunes d'aquestes qüestions emprant diferents tècniques de dinàmica molecular (clàssica i de primers principis) en combinació amb mètodes que permeten l'acceleració d'esdeveniments al llarg d'una simulació.La present tesi està estructurada en tres grans blocs: un bloc introductori (capítols I i II) on s'introdueix la família d'enzims a la qual pertany la 1,3-1,4-β-glucanasa i s'estableixen els objectius generals del present estudi; al capítol II es resumeixen els fonaments de la metodologia computacional emprada. En un segon bloc (capítols III a VII) es descriuen les simulacions portades a terme per tal de donar resposta a les preguntes obertes plantejades al bloc introductori. Els resultats són analitzats i discutits en cinc capítols diferents: al capítol III s'analitza l'estructura del complex de Michaelis de la 1,3-1,4-β-glucanasa amb un substrat tipus metilumbeliferil-tetrasacàrid; al capítol IV s'avalua i es descriu el mapa d'energia lliure conformacional de l'anell de β-D-glucopiranosa, i s'analitzen les propietats estructurals i electròniques de cada conformació per tal de trobar una correlació amb les distorsions presents en diferents glucosidases; al capítol V s'avalua i es descriu el mapa d'energia lliure conformacional del substrat un cop unit a la 1,3-1,4-β-glucanasa, i s'analitza l'efecte de diferents mutacions puntuals del substrat; al capítol VI es porta a terme una simulació del primer pas de la reacció enzimàtica de la 1,3-1,4-β-glucanasa i s'analitza l'itinerari conformacional seguit pel substrat; al capítol VII es porta a terme una simulació del procés d'entrada del substrat a la cavitat enzimàtica i s'analitzen les reorganitzacions a nivell de substrat i de proteïna que tenen lloc al llarg del procés. Cada capítol conté una breu introducció específica de cada cas concret, informació sobre els detalls computacionals emprats, i la descripció i discussió dels resultats obtinguts. Finalment al darrer bloc (capítol VIII) es resumeixen els resultats més rellevants obtinguts en la present tesi i s'enumeren les principals conclusions. Addicionalment, s'han adjuntat tres annexes que complementen la informació dels diferents capítols. / Carbohydrates exhibit a high stereo chemical diversity. Living organisms take benefit of it by using oligosaccharides and polysaccharides for a large number of biological functions. In addition to the typical structural and energetic functions, carbohydrates play an important role in other more specific functions such as cellular signalling. This functionality is of special interest in different biotechnological applications as a result of an increasing number of studies in glycobiology.The glycosidic bond, specially the one between two glucose units, is one of the most stable bonds found in natural biopolymers. The half life time for the spontaneous hydrolysis of this bond in cellulose and starch is of the order of 5 million years. Glycosil hydrolases (GHs) are the enzymes responsible for the enzymatic hydrolysis of these biopolymers. GHs are able to hydrolyze the glycosidic bond in a time scale of the order of 1000 cycles per second. Due to this extremely high activity, GHs are considered some of the most efficient biological catalysts. This thesis is focused on the formation of the Michaelis complex in 1,3-1,4-β-glucanase, a family 16 glycosil hydrolase. Understanding the substrate binding process is a key point to rationalize the subsequent steps of any enzymatic process. Usually, this process involves conformational changes of both the enzyme and the substrate. These changes contribute to the catalysis by changing the relative energies of reactants and products. Recent experiments on β-glycosil hydrolases give evidence of a distorted structure of the substrate with respect to its structure in solution. However, the factors that dictate the preference of the substrate to be bound to the enzyme in one or another conformation remain unknown, as well as their mechanistic implications. This thesis tries to answer some of these questions using different techniques based on molecular dynamics (both classical and first principles) in combination with methods aimed to accelerate the simulation of rare events.

Submitted by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2017-05-18T19:09:17Z No. of bitstreams: 2 Tese - Marcela Suriani Ribeiro - 2017.pdf: 1795199 bytes, checksum: fb63e9f789cfefb42f31cba029a29f4f (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-05-19T10:43:53Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Marcela Suriani Ribeiro - 2017.pdf: 1795199 bytes, checksum: fb63e9f789cfefb42f31cba029a29f4f (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-19T10:43:53Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese - Marcela Suriani Ribeiro - 2017.pdf: 1795199 bytes, checksum: fb63e9f789cfefb42f31cba029a29f4f (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2017-04-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The genus Trichoderma includes species that have the ability to antagonize plant pathogens in a complex process ranging from antibiosis, competition for nutrients, mycoparasitism and induction of defense mechanisms in plants or a combination of these. Trichoderma species are known for their ability to produce lytic enzymes such as exoglucanases, endoglucanases, chitinases, and proteases that is essential for phytopathogen cell wall degradation. In the development and differentiation processes of Trichoderma, β-glucanases contributes significantly to the morphogenetic-morphological process that lead to the presence of β-glucans as the main component of fungi wall. In this work, we studied the functional role of the gluc31 gene that encodes an endo β-1,3-glucanase of the GH16 family of Trichoderma harzianum ALL42 through the deletion of this gene. This study demonstrated that the absence of Δgluc31 gene did not affect the in vivo mycoparasitism ability of the mutant T. harzianum ALL42, however the involvement of this gene in cell wall remodeling and synthesis were demonstrated. In the absence of the gluc31 gene, a higher deposition of chitin polymers on the cell wall of the mutant hyphae was observed. The absence of the gluc31 gene in T. harzianum also demonstrated an effect on the expression of other genes belonging to the family 16 of glycosyl hydrolases, due to the function redundancy found among the glucanases. / O gênero Trichoderma inclui espécies que possuem habilidade de antagonizar patógenos de plantas em um processo complexo que vão desde antibiose, competição por nutrientes, micoparasitismo, indução de mecanismos de defesa em plantas ou ainda uma combinação desses. Espécies de Trichoderma são conhecidas por sua capacidade de produzir enzimas líticas tais como exoglucanases, endoglucanases, quitinases e proteases que desempenham papéis importantes na degradação da parede de fitopatógenos. Nos processos de desenvolvimento e diferenciação de Trichoderma, as β-glucanases contribuem de forma significativa no processo morfogenéticomorfolítico uma vez que a β-glucanas é o componente principal da sua parede. Nesse trabalho, realizou-se o estudo do papel funcional do gene gluc31 que codifica uma endo β-1,3-glucanase da família GH16 de Trichoderma harzianum ALL42, através da deleção deste gene. Observamos que a ausência do gene gluc31 não afetou a capacidade de micoparasitismo, in vitro, da espécie mutante de T. harzianum ALL42, entretanto, o envolvimento deste gene na síntese e remodelamento da parede celular foi demonstrado. Na ausência do gene gluc31, uma maior quantidade de polímero de quitina na parede celular das hifas da linhagem mutante Δgluc31 foi observado. A ausência do gene gluc31 em T. harzianum demonstrou ainda um efeito sobre a expressão dos outros genes pertencentes à família 16 de glicosil hidrolases em ensaios de RT-qPCR, devido a redundância de função entre as glucanases.

Orientadores: Everson Alves Miranda, Sindélia Freitas Azzoni / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química / Made available in DSpace on 2018-08-25T03:57:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 MarinoBohorquez_MayraAlejandra_M.pdf: 2274078 bytes, checksum: b43b1a849020cc996eb872607460441e (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: O crescente interesse pelo aproveitamento da matéria-prima renovável vem demandando novas tecnologias eficientes na produção de etanol de segunda geração a fim de reduzir os altos custos associados com as enzimas envolvidas na sacarificação. Este estudo teve como objetivo principal concentrar, através de precipitação com etanol, glicosil hidrolases responsáveis pelas atividades de endoglucanase, ?-glicosidase, FPase e xilanase produzidas por Trichoderma harzianum P49P11. As variáveis de precipitação testadas foram temperatura, concentração de etanol e pH do fermentado. O etanol demonstrou potencial para recuperar ao redor de 98% da atividade de xilanase correspondente a 17,6 U/mL através de precipitações com 90% de etanol (v/v) em todas as temperaturas testadas (5,0, 15 e 25°C) e pH 5,0. Sob estas mesmas condições de precipitação, 90% de etanol (v/v) e pH 5,0, porém a 5°C, foi obtida a máxima recuperação da atividade de celulase (FPase) sendo 77% correspondente a 0,08 U/mg. Esta última formulação causou precipitação instantânea. Desta forma, a precipitação com etanol pode ser considerada uma técnica eficiente para concentrar xilanase e, em certa medida, para o complexo de celulase / Abstract: Growing interest in the use of renewable raw materials for the production of second generation ethanol has led to the need of new efficient technologies to reduce the high costs associated with saccharification enzymes. This study aimed to concentrate by ethanol precipitation glycosil hydrolases responsible for FPase, ?-glicosidase, endoglucanase and xylanase activities produced by Trichoderma harzianum P49P11. The precipitation variables tested were temperature, ethanol concentration and pH of the fermentation broth. The results showed that the precipitation by ethanol recovered more than 98% of the total xylanase activity using ethanol at concentration of 90% (v/v) at all temperatures tested (5.0, 15 e 25°C) and pH 5.0. The maximum recovery of cellulose activity as FPase was 77% by precipitation carried out at this same ethanol concentration and pH (90% v/v and pH 5.0) but at 5.0°C. This last set of conditions caused almost instantaneous precipitation. Therefore, ethanol precipitation can be considered an efficient technique for xylanase concentration and, to a certain extent, for the cellulase complex / Mestrado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Mestra em Engenharia Química

A resistência das paredes celulares vegetais à hidrólise enzimática é um dos grandes gargalos tecnológicos para a obtenção do etanol celulósico. Acredita-se que as modificações nas paredes celulares em processos como a mobilização de reservas, formação de aerênquima, amadurecimento de frutos e senescência, por exemplo, envolvam a ativação de módulos funcionais que culminam em alterações nas paredes celulares. Estes módulos são: 1) recepção de um sinal para início do processo; 2) Morte Celular Programada (PCD); 3) separação celular; 4) expansão celular; 5) hidrólise de hemiceluloses e 6) hidrólise de celulose. No caso da formação de aerênquimas lisígenos o processo que se inicia com a PCD e é seguido pela liberação de glicosil hidrolases que atuam a na degradação e/ou modificação da parede celular, formando espaços de ar no córtex radicular. A formação de aerênquima nas raízes de cana de açúcar é constitutiva e pouco se sabe sobre os mecanismos de modificação que ocorrem na parede celular durante este processo. Este estudo buscou compreender os padrões de variação expressão gênica, proteínas e de atividades enzimáticas associados à formação do aerênquima em raízes de cana de açúcar, com ênfase no papel das hidrolases de parede celular e em algumas proteínas relacionadas à PCD. Foram utilizados 5 segmentos de raízes de 1 cm cada, a partir do ápice radicular. No material coletado observou-se a formação gradual de aerênquima. Foram realizadas análises transcricional, proteômica e atividade enzimática das glicosil hidrolases e outras proteínas que atuam na modificação da parede celular, os quais foram identificados e quantificados ao longo da formação do aerênquima. As glicosil hidrolases pertencentes às famílias Cazy GH1, GH3, GH17, GH18 bem como expansinas, celulose sintase, lacase, calreticulina, calmodulina e proteínas relacionadas a degradação de pectinas, foram encontradas ao longo dos segmentos, principalmente após o segmento 2. De acordo com a atividade transcricional e dados da proteômica, sugere-se que os polissacarídeos seriam atacados por enzimas nos estágios iniciais da formação do aerênquima (seg 2 e 3). O ataque ocorre principalmente sobre as pectinas e o β-glucano. Contudo, os dados apontam para a deposição de xiloglucano, xilanos e celulose (após seg 3), que formam um compósito ao redor dos espaços de ar. Isto sugere que parte dos polissacarídeos das paredes não sejam degradados ao longo do processo, embora enzimas específicas detectadas possam atuar na modificação dos mesmos, como verificado para algumas pectinases e membros de GH17. Além disso, nos pré-tratamentos com água foi possível observar que há maior sacarificação da parede nos seg. 1 e 2. Contudo quando retira-se a maior parte das pectinas e hemiceluloses após pré-tratamento com NaOH, a sacarificação é maior nos segmentos 2, 3 e 4, devido ao maior acesso e a maior quantidade de celulose. As glicosil hidrolases encontradas neste trabalho sugerem que estas atacam a parede de um específico conjunto de células do córtex que dá origem ao aerênquima. Já no fim do processo, quando há lise celular, algumas paredes de células remanescentes são recalcitrante à hidrólise, provavelmente devido a sua arquitetura e composição. Este trabalho traz informações para o desenvolvimento de futuras tecnologias para a produção do etanol do etanol celulósico de cana-de-açúcar / The resistance of plant cell walls to enzymatic hydrolysis is one of the main bottlenecks of the development of technology of production of cellulosic ethanol. It is believed that the modifications in cell walls related to processes of storage mobilization, aerenchyma formation, fruit ripening and senescence, for instance, involve the activation of functional moduli that culminate in alterations of cell walls. These moduli are: 1) signal perception to start the process; 2) Programmed Cell Death (PCD); 3) cell separation; 4) cell expansion; 5) hydrolysis of hemicelluloses and 6) hydrolysis of cellulose. In the case of the formation of lysigenous aerenchyma, the process starts with PCD and is followed by the release of glycosil hydrolases that act on the degradation and/or cell wall modifications, forming air spaces in the cortex of the root. The formation of aerenchyma in the roots of sugarcane is a constitutive phenomenon and little is known about the mechanisms of modification that occur in cell walls during its development. Thus, the present study focused on the visualization of the patterns of variation of gene expression, proteins and enzyme activities associated to the formation of aerenchyma in roots of sugarcane in order to understand the role of the cell wall hydrolases and some proteins related to PCD in cell wall modifications along the process. Five root segments of 1cm each, starting from root apex, were used. A gradual centripetal formation of aerenchyma was recorded in the cortex of developing roots. Analyses of the transcriptional, proteomic and enzyme activity profiles during the process revealed that several enzymes act on cell wall modifications. The glycosil hydrolases belonging to the Cazy families GH1. GH3, GH17, GH18, as well as expansins, cellulose synthase, laccase, calreticulin, calmodulin and other proteins related to pectin degradation have been found along the segments, mainly after segment 2. According to the data on transcriptomics and proteomics, it is suggested that enzymes attack polysaccharides during the initial stages of aerenchyma formation (seg. 2 and 3). The attack of the enzymes occurs mainly on pectins and β-glucan. Conversely, the data point out to the deposition (or maintenance) of xyloglucan, xylan and cellulose (after seg. 3), which form a composite that surrounds the air spaces. This suggests that part of the polysaccharides present in cell walls are not degraded during the process, although specific enzymes have been detected that could act on polysaccharide mobilization, such as the GH17 family. Further, under pretreatment with water, it has been observed that cell wall saccharification was higher at segments 1 and 2. On the other hand, when most of the pectins and hemicelluloses are retrieved by pretreatment with NaOH, saccharification is higher of segments 2, 3 and 4, probably due to the higher access to the wall and also to the higher proportion of cellulose. The profiles related to the glycosil hydrolases found in this work, suggest that these enzymes attack the cell wall. Initially, they are probably kept within a group of cells that will originate the aerenchyma. At the end of the process, when there is cell lysis, the remaining walls of some cells are recalcitrant to hydrolysis probably due to changes in their architecture and composition. Our findings bring promising information that could be used in the future to improve efficiency of hydrolysis for cellulosic ethanol production from sugarcane

Submitted by Aelson Maciera (aelsoncm@terra.com.br) on 2017-05-25T18:55:01Z No. of bitstreams: 1 DissAFB.pdf: 2608429 bytes, checksum: 95d0acfb93ac8153ab8599ee86111dff (MD5) / Approved for entry into archive by Ronildo Prado (ronisp@ufscar.br) on 2017-05-30T12:35:23Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissAFB.pdf: 2608429 bytes, checksum: 95d0acfb93ac8153ab8599ee86111dff (MD5) / Approved for entry into archive by Ronildo Prado (ronisp@ufscar.br) on 2017-05-30T12:35:43Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissAFB.pdf: 2608429 bytes, checksum: 95d0acfb93ac8153ab8599ee86111dff (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-30T12:40:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissAFB.pdf: 2608429 bytes, checksum: 95d0acfb93ac8153ab8599ee86111dff (MD5) Previous issue date: 2017-02-15 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Metagenomics studies allow the direct analysis of a genetic material in an environmental sample and when linked to bioinformatics it gives a powerful tool to explore the role of new genes and proteins not studied before. Constant decreases in the quantity of fossil fuels and their effects in the global economy and natural environment has accelerated researches in alternative fuels such as the second generation ethanol, which can be produced by vegetation biomass. However, this process demands previous hydrolysis of the lignocellulolytic material by hydrolytic enzymes to provide fermentable sugar. β-glucosidases are enzymes which plays an important role at the final step of cellulose breakdown to glucose, thus being considered the rate limiting enzyme in this process of biomass degradation. Many β-glucosidases are already known, however there is an interest to find new enzymes which are tolerant to glucose inhibition and which exhibits high activity at lower temperatures. In this study we searched for β-glucosidases (GH1) using sequences from a metagenomics database from rivers and lakes in the Amazon region developed in our laboratory. We found 3 complete open reading frames (ORFs) related to β-glucosidases and one of them was selected to be produced in E.coli in a heterologous way and to be biochemically characterized. The coding sequence of the protein named AmBgl1-LP was cloned in the plasmid pET-28a and produced an enzyme which has a molecular mass of 53,7 kDa. The enzymatic assays showed that the enzyme was active with an optimum pH of 5.5, optimum temperature of 35 °C and had a Ki for glucose of 23 mM. The enzyme does not apparently perform transgycosylation, according to the assays for pNPβGlu substrate. Supposedly, AmBgl1-LP suffers inhibition by pNPβGlu on concentrations higher than 10 mM. The enzyme showed to be capable of hydrolyzing cellobiose, pNPβGal and pNPβFuc. Thus, the enzyme is promising for use in cocktails for degradation of biomass. / A metagenômica permite estudar diretamente o material genético presente em uma amostra ambiental e quando aliada à bioinformática possibilita explorar o papel de novos genes e proteínas. A constante diminuição na quantidade de combustíveis fósseis e seus efeitos na economia global e no meio ambiente têm acelerado as pesquisas sobre combustíveis alternativos como, por exemplo, o etanol de segunda geração, o qual pode ser obtido a partir de biomassa vegetal. No entanto, o processo necessita que o material lignocelulolítico seja hidrolisado previamente por enzimas, para o fornecimento de açúcares fermentescíveis. As β-glicosidases são enzimas que participam da etapa final de degradação de celulose em glicose e são, portanto, consideradas passo limitante no processo. Muitas β-glicosidases já foram descritas, entretanto ainda há o interesse em encontrar enzimas que sejam resistentes à inibição por glicose e que exerçam sua atividade em temperaturas mais baixas. Neste sentido, o presente trabalho tratou da busca por β-glicosidases da família GH1 utilizando sequências obtidas a partir de um estudo metagenômico de rios e lagos da Amazônia, realizado em nosso laboratório. Foram encontradas 3 fases abertas de leitura (ORFs) correspondentes à esta classe de enzimas e uma delas foi selecionada para ser produzida em E.coli de forma recombinante e ser caracterizada bioquimicamente. A sequência que codifica a proteína denominada AmBgl1-LP foi clonada em vetor pET-28a e expressa em E.coli, rendendo uma enzima com massa molecular de 53,7 kDa. Os ensaios de atividade enzimática revelaram que a enzima é ativa em pH ótimo de 5,5 e temperatura ótima de 35 °C. Além disso, a enzima possui um Ki para glicose de 23 mM. A enzima aparentemente não realiza transglicosilação, frente aos ensaios com o substrato pNPβGli. Aparentemente a enzima sofre inibição por este substrato em concentrações maiores que 10 mM. A AmBgl1-LP mostrou-se capaz de hidrolisar celobiose, além de pNPβGal e pNPβFuc. Desta forma, a enzima mostra-se promissora para utilização em coquetéis para degradação de biomassa.