In Saccharomyces cerevisiae, experiments with temperature-sensitive mutants of the PI4-kinase Pik1p revealed that the PI4P pool generated by this enzyme is essential for Golgi morphology and normal secretory function and that the PI4P pool at the Golgi represents a regulatory signal on its own. In order to function as a spatial and temporal regulator of membrane traffic, PI4P synthesis and turnover must be tightly regulated. It remains elusive which factors are involved in the targeting and regulation of Pik1p. Little is also known about PI4P binding proteins mediating the effects of this phosphoinositide on Golgi function. Since it has been shown that multiple pathways leave the Golgi towards the plasma membrane one can ask the question whether Pik1p and its product PI4P specifically control one pathway? Here we demonstrate an interaction of Pik1p with the 14-3-3 proteins Bmh1p and Bmh2p. Interestingly, overexpression of Bmh1p and Bmh2p results in multiple genetic interactions with genes involved in late steps of exocytosis and it affects the forward transport of the general amino acid permease Gap1p. The detected interaction depends on the phosphorylation state of Pik1p and Pik1p phosphorylation accompanies its shuttling out of the nucleus into the cytoplasm where presumably the binding to Bmh1/2p occurs. Therefore, we reason that these interactions might serve the sequestration of Pik1p away from the Golgi. This study reveals that Pik1p shows a strong effect on the delivery of Gap1p to the surface whereas the transport of exocytosis markers implicated in the direct Golgi-to-plasma membrane pathway are not significantly disturbed. Cells carrying a deletion of gga2 also show a strong defect in delivery of Gap1p to the surface. In addition, pik1-101 gga2[delta]double mutants display synthetic genetic and membrane transport phenotypes and recruitment of Gga2 to the TGN partially depends on functional Pik1p. Therefore, our results suggest a role of Pik1p in the TGN to endosome pathway.

Apyrasen (NTPDasen) sind Nukleosidtri- und diphosphat spaltende Enzyme. Bisher konnten Apyrasen in allen untersuchten Pro- und Eukaryonten nachgewiesen werden. Im Gegensatz zu tierischen Organismen, in denen Apyrasen gut untersucht sind und eine Rolle in der Nukleotid-vermittelten Signaltransduktion spielen, ist in Pflanzen weit weniger bekannt. In dem Modellorganismus A. thaliana wurden bisher zwei Apyrasen – AtAPY1 und AtAPY2 – als funktionell beschrieben. Durch Knockoutstudien konnte gezeigt werden, dass beide Apyrasen redundant sind. Der Doppelknockout der AtAPY1 und AtAPY2 ist im Gegensatz zum Einzelknockout einer Apyrase letal. Auf Grund von Vorarbeiten wurde die AtAPY1 extrazellulär im Apoplasten vermutet, wo sie eine Rolle im ATP-Signalweg spielen könnte. In der vorliegenden Arbeit sollte die Apyrase 1 (AtAPY1) biochemisch charakterisiert und subzellulär lokalisiert werden. Die Aufklärung der biochemischen Eigenschaften und der subzellullären Lokalisation der AtAPY1 würde entscheidend mithelfen, die Funktion der Apyrasen in Pflanzen aufzuklären. Für die biochemische Charakterisierung wie der Bestimmung des pH-Optimums und des Substratspektrums der AtAPY1 war die Reinigung einer aktiven AtAPY1 notwendig. Da eine Überexpression einer aktiven AtAPY1 in E. coli nicht möglich war, wurde zur biochemischen Charakterisierung die AtAPY1 mit verschiedenen Systemen in vitro translatiert. Bei Verwendung von Retikulozytenextrakten konnte die AtAPY1 in vitro translatiert werden, zeigte aber in den Aktivitätstests keine Aktivität. Auf Grund ihrer enzymatischen Aktivität und Struktur scheint die AtAPY1 inhibierend auf verschiedene Expressionssysteme zu wirken, was die Gewinnung von aktiver AtAPY1 stark limitiert. In einem weiteren Ansatz wurde die AtAPY1-GFP nativ aus transgenen A. thaliana mittels anti-GFP markierter Matrix gereinigen. Die Reinigung der AtAPY1-GFP aus dem Gesamtproteinextrakt war erfolgreich und die immobilisierte AtAPY1-GFP zeigte eine Apyraseaktivität. Eine anschließende Elution des Proteins von der Matrix war allerdings zu stringent und führte zum vollständigen Aktivitätsverlust. Für die subzelluläre Lokalisation wurden Apyraseeinzelknockouts in Vorarbeiten mit zwei unabhängigen Konstrukten transformiert: zum einen wurde die Atapy1 C-terminal mit dem SNAP-Tag fusioniert und unter ihrem nativen Promotorbereich exprimiert, zum anderen erfolgte eine Überexpression der AtAPY1-GFP unter dem konstitutiven CaMV 35S-Promotor. Die komplementierten Pflanzen zeigten keine phänotypischen Unterschiede im Vergleich zum Wildtyp. Durch Immunfluoreszenz und in vivo Mikroskopie konnte die AtAPY1 in vesikelartigen Strukturen, jedoch nicht in der Plasmamembran oder extrazellulären Matrix nachgewiesen werden. Um die detektierten Strukturen einem Organell zuzuordnen, wurden Co-Lokalisationsstudien durchgeführt. Für Co-Lokalisation wurden die AtAPY1-GFP Pflanzen mit Markerproteinen transformiert oder mit den entsprechenden transgenen Pflanzen gekreuzt. Zum Nachweis der AtAPY1-GFP im sekretorischen Weg oder endozytotischen Vesikeln wurden transgene AtAPY1-GFP Pflanzen mit RabE1d-YFP transformiert, was jedoch keine Co-Lokalisation zeigte. Anschließend erfolgten Kreuzungen mit transgenen Pflanzen, die die Golgi-Markerproteine Membrin 12, Syntaxin of plants 32 oder Golgi transport protein 1-Homolog exprimierten. Mit allen drei Kreuzungen konnte eine Co-Lokalisation der AtAPY1-GFP mit dem entsprechenden Markerprotein im Golgi gezeigt werden. Durch eine zusätzliche Behandlung der AtAPY1-GFP Pflanzen mit dem Membranfarbstoff FM4-64, welcher das trans-Golgi-Netzwerk aber nicht den Golgi-Apparat anfärbt und dem fungiziden Toxin Brefeldin A, welches zur Bildung von BFA-Kompartimenten durch die Fusion des trans-Golgi-Netzwerks mit Endosomen und Teilen des trans-Golgi-Apparates führt, konnte die AtAPY1-GFP dem Golgi-Apparat zugewiesen werden. Weiterhin wurde untersucht, ob die AtAPY1 löslich oder membrangebunden im Golgi-Apparat vorliegt. Um zwischen löslichen, peripheren und integralen Membranproteinen zu unterscheiden, wurde das mikrosomale Pellet mit verschiedenen Detergenzien und Salzen behandelt. Hohe Salz- (2 M NaCl) und alkalische Bedingungen (0,2 M Na2CO3) führten zur Ablösung peripherer Proteine von der Membran. Harnstoff (4 M) und das anionische Detergenz SDS (0,2 %) führten zur Denaturierung von Proteinen und zum Nachweis integraler Proteine. Es konnte gezeigt werden, dass die AtAPY1-GFP ein integrales Membranprotein ist, da sie ausschließlich in den mit SDS und Harnstoff behandelten Fraktionen im Überstand mittels Western Blot nachgewiesen werden konnte. Die genaue Funktion der AtAPY1 im Golgi-Apparat ist noch ungeklärt, da der Fokus der bisherigen Apyraseforschung von einer Lokalisation der AtAPY1 in der Plasmamembran ausging und frühere Ergebnisse in neuem Kontext diskutiert werden müssen.:ABKÜRZUNGEN 7 1. EINLEITUNG 9 1.1. APYRASEN 9 1.2. APYRASEN IN TIEREN 11 1.2.1. ROLLE DER NTPDASEN BEI DER THROMBOZYTENAGGREGATION 11 1.3. APYRASEN IN PFLANZEN 12 1.3.1. ROLLE EXTRAZELLULÄRER APYRASEN 13 1.3.2. GOLGI LOKALISIERTE APYRASEN 15 1.3.3. KENNTNISSTAND ÜBER APYRASEN IN A. THALIANA 16 1.4. VORARBEITEN 20 1.5. ZIELSTELLUNG 21 2. MATERIAL 22 2.1. GERÄTE 22 2.2. CHEMIKALIEN 23 2.3. HÄUFIG GENUTZTE PUFFER 24 2.4. BESONDERE VERBRAUCHSMATERIALIEN 24 2.5. KITS/STANDARDS 25 2.6. ENZYME 25 2.7. VEKTOREN 26 2.8. ZELLLINIEN 26 2.9. OLIGONUKLEOTIDE 27 2.10. ANTIKÖRPER (AK) 28 2.11. ANTIBIOTIKA/HERBIZIDE 28 2.12. VERWENDETE PFLANZENLINIEN 29 2.13. SCHLÜSSELNUMMERN (ACCESSION CODES) 29 2.14. SPEZIELLE SOFTWARE 30 3. METHODEN 31 3.1. ALLGEMEINE METHODEN 31 3.1.1. PFLANZENKULTIVIERUNG 31 3.1.1.1. Arabidopsis thaliana 31 3.1.1.2. Nicotiana benthamiana 31 3.1.2. KREUZEN VON A. THALIANA 31 3.1.3. TRANSFORMATION 31 3.1.3.1. Bakterien 31 3.1.3.2. Arabidopsis thaliana 32 3.2. MOLEKULARBIOLGISCHE METHODEN 33 3.2.1. PLASMIDPRÄPARATION 33 3.2.2. RNA-EXTRAKTION 33 3.2.3. REVERSE TRANSKRIPTION 33 3.2.4. NACHWEIS DER INTEGRITÄT VON RNA UND CDNA 34 3.2.5. DNA-EXTRAKTION AUS PFLANZEN 34 3.2.6. POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR) 35 3.2.7. AGAROSE-GELELEKTROPHORESE VON DNA 35 3.2.8. REINIGUNG VON DNA-FRAGMENTEN AUS AGAROSEGELEN 36 3.2.9. DNA-FÄLLUNG 36 3.2.10. KLONIERUNG DER ATAPY1-HIS UND SNAP-HIS IN E. COLI 36 3.3.1. KOMPLEMENTATION VON APYRASE DOPPELKNOCKOUT MUTANTEN 37 3.3.2. IMMUNFLUORESZENZ 38 3.3.2.1. Probenpräparation 38 3.3.2.2. Konfokale Mikroskopie 39 3.3.3. IN VIVO MIKROSKOPIE VON ATAPY1-GFP EXPRIMIERENDEN KEIMLINGEN 39 3.3.3.1. FM4-64 und Brefeldin A – Behandlung 39 3.3.3.2. Co-Lokalisation mit RabE1d, MEMB12, GOT1P-Homolog, SYP32 40 3.3.4. PROTOPLASTENISOLATION 40 3.3.5. PH-WECHSEL IM APOPLASTEN VON ATAPY1-GFP-KEIMLINGEN 41 3.4. PROTEIN-BIOCHEMISCHE METHODEN 41 3.4.1. PROTEINISOLATION 41 3.4.2. SOLUBILISIERUNG VON MEMBRANPROTEINEN 41 3.4.3. PROTEINBESTIMMUNG 42 3.4.4. SDS-PAGE 42 3.4.5. WESTERN BLOT 43 3.4.6. COOMASSIE-FÄRBUNG 43 3.4.7. KOLLOIDALE COOMASSIE-FÄRBUNG 44 3.4.8. PONCEAU-S-FÄRBUNG 44 3.4.9. IMMUNDETEKTION 44 3.4.10. PROTEINREINIGUNG MITTELS NI-NTA-SÄULENCHROMATOGRAPHIE 45 3.4.11. ISOLATION UND REINIGUNG DER ATAPY1-GFP AUS A. THALIANA 46 3.4.12. IN-VITRO TRANSLATION (IVT) ATAPY1-GFP UND ATAPY1-SNAP 46 3.4.13. QUANTIFIZIERUNG DES ATAPY1-SNAP-PROTEINS (IVT) 47 3.4.14. AKTIVITÄTSMESSUNG DER ATAPY1 48 3.4.14.1. Eisensulfat-Test 48 3.4.14.2. Malachitgrün-Test 49 4. ERGEBNISSE 50 4.1. SUBZELLULÄRE LOKALISATION DER ATAPY1 50 4.1.1. KOMPLEMENTATION DES LETALEN ATAPY1 UND ATAPY2 DOPPELKNOCKOUTS 50 4.1.2. DIE ATAPY1 IST IM GOLGI-APPARAT LOKALISIERT 55 4.1.2.1. Indirekte Immunfluoreszenz von AtAPY1-SNAP in Vesikeln 55 4.1.2.2. AtAPY1-GFP lokalisiert in Vesikeln 56 4.1.2.3. Keine Lokalisation der AtAPY1 in Plasmamembran und Apoplast 58 4.1.3. CO-LOKALISATIONSSTUDIEN DER ATAPY1-GFP 59 4.1.3.1. Keine Co-Lokalisation in sekretorischen Vesikeln 60 4.1.3.2. AtAPY1 ist Brefeldin A-sensitiv 61 4.1.3.3. AtAPY1 co-lokalisiert nicht mit FM4-64 64 4.1.3.4. Co-Lokalisation mit den Golgimarkerproteinen MEMB12, GOT1P-Homolog und SYP32 65 4.1.4. ATAPY1 IST EIN INTEGRALES MEMBRANPROTEIN 67 4.2. BIOCHEMISCHE CHARAKTERISIERUNG DER ATAPY1 69 4.2.1. EXPRESSION DER ATAPY1 IN E. COLI 69 4.2.2. IN VITRO TRANSLATION DER ATAPY1 71 4.2.3. REINIGUNG DER ATAPY1 AUS A. THALIANA 74 4.2.4. AKTIVITÄTSBESTIMMUNG DER ATAPY1 75 5. DISKUSSION 77 5.1. BEDEUTUNG DER LOKALISATION DER ATAPY1 FÜR DIE APYRASEFORSCHUNG 77 5.2. FUNKTION DER ATAPY1 IM GOLGI-APPARAT 78 5.2.1. AKKUMULATION VON STÄRKEGRANULA IN CHLOROPLASTEN 79 5.2.2. ROLLE DER APYRASEN BEI DER ZELLDIFFERENZIERUNG 81 6. AUSBLICK 86 7. ZUSAMMENFASSUNG 88 8. ABBILDUNGS- UND TABELLENVERZEICHNIS 90 9. LITERATURVERZEICHNIS 92 10. ANHANG 106

In mammalian cells, homeostasis and fate during development relies on the proper transport of membrane-bound cargoes to their designated cellular locations. The hetero-tetrameric adaptor protein complexes (APs) are required for sorting and concentration of cargo at donor membranes, a crucial step during targeted transport. AP2, which functions at the plasma membrane during clathrin-mediated endocytosis, is well characterized. In contrast, AP1 a clathrin adaptor mediating the delivery of lysosomal hydrolases via mannose 6-phosphate receptors (MPRs) and AP3 an adaptor ensuring the proper targeting of lysosomal membrane protein are difficult to study by classic cell biology tools. To gain new insights on these APs, our lab has previously designed an in vitro system. Reconstituted liposomes were modified with small peptides mimicking the cytosolic domains of bona fide cargoes for AP1 and AP3 respectively and thereby enabling the selective recruitment of these APs and the identification of the interacting protein network. In the study at hand we utilize above-described liposomes to generate supported lipid bilayers and Giant Unilamellar Vesicles (GUVs), large-scale membrane systems suited for analysis by fluorescence microscopy. By using cytosol containing fluorescently-tagged subunits, we visualized clathrin coats on artificial membranes under near physiological conditions for the first time. Moreover, we demonstrated clathrin-independent recruitment of AP3 coats on respective GUVs. Presence of active ARF1 was sufficient for the selective assembly of AP1-dependent clathrin coats and AP3 coats on GUVs. By using dye-conjugated ARF1, we show that ARF1 colocalized with AP3 coats on GUVs and that increased association of ARF1 with GUVs coincided with AP1-dependent clathrin coats. Our previous study identified members of the septin family together with AP3 coats on liposomes. Here we show on GUVs, that active ARF1 stimulated the assembly of septin7 filaments, which may constrain the size and mobility of AP3 coats on the surface. Subsequent cell biology studies in HeLa cells linked septins to actin fibers on which they may control mobility of AP3-coated endosomes and thus their maturation. An actin nucleation complex, based on CYFIP1 was identified together with AP1 on liposomes before. Here we show on GUVs, that CYFIP1 is recruited on the surface surrounding clathrin coats. Upon supply of ATP, sustained actin polymerization generated a thick shell of actin on the GUV surface. The force generated by actin assembly lead to formation of long tubular protrusions, which projected from the GUV surface and were decorated with clathrin coats. Thereby the GUV model illustrated a possible mechanism for tubular carriers formation. The importance of CYFIP1-reliant actin polymerization for the generation of MPR-positive tubules at the trans-Golgi network (TGN) of HeLa cells was subsequently demonstrated in our lab. The notion that tubulation of artificial membranes could be triggered by actin polymerization allowed us to perform a comparative mass spectrometry screen. By comparing the abundance of proteins on liposomes under conditions promoting or inhibiting actin polymerization, candidates possibly involved in stabilization, elongation or fission of membrane tubules could be identified. Among the proteins enriched under conditions promoting tubulation, we identified type I phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinases. Their presence suggested an involvement of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) in tubule formation. By cell biology studies in HeLa we show, that down regulation of these enzymes altered the dynamics of fluorescently-tagged MPRs, illustrating the importance of locally confined PI(4,5)P2 synthesis during formation of coated carriers at the TGN. Bin–Amphiphysin–Rvs (BAR) domains are known to sense membrane curvature and induce membrane tubulation. Among various BAR domain proteins, Arfaptin2 was enriched under conditions allowing tubulation of liposomes. By microscopy studies on HeLa cells we show, that Arfaptin2 as well as its close paralog Arfaptin1 were present on AP1-coated MPR tubules emerging from the TGN. We further show, that tubule fission occurred at regions were Arfaptin1 is concentrated and that simultaneous down regulation of both Arfaptins lead to increased number and length of MPR tubules. Since fission of coated transport intermediates at the TGN is poorly understood, our findings contribute a valuable component towards a model describing the entire biogenesis of coated post-Golgi carriers. In conclusion, combining artificial membrane systems and cell biology studies allowed us to propose new models for formation as wall as for fission of AP1-coated transport intermediates at the TGN. Further we gained new insights on AP3 coats and the possible involvement of septin filaments in AP3-dependent endosomal maturation.

L'appareil de Golgi est un organite central du réseau des voies de transport intracellulaire des cellules eucaryotes. L'étude de son fonctionnement dynamique complexe nécessite le développement de nouveaux outils. J'ai donc suivi plusieurs stratégies en parallèle pour proposer de nouvelles approches d'étude de l'appareil de Golgi. <br />Tout d'abord, j'ai utilisé la technique d'Interférence ARN, qui permet d'inhiber l'expression d'une protéine d'intérêt, et ainsi révélé la complexité de la régulation du transport golgien par la GTPase Rab6. <br />Ensuite, j'ai suivi une stratégie reposant sur l'imagerie in vivo du désassemblage et du réassemblage de l'appareil de Golgi au cours de la mitose, et ainsi mis en évidence une étape particulière du désassemblage golgien. <br />Enfin, le cœur de ma thèse a consisté en la production d'anticorps recombinants dirigés contre des protéines golgiennes par Phage Display, et le développement de leur utilisation pour tracer le comportement des protéines-cibles in vivo.

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La mucopolysaccharidose de type IIIB (MPSIIIB), ou maladie de Sanfilippo B, est une maladie de surcharge lysosomale caractérisée par des atteintes neurologiques. Cette maladie génétique rare est causée par la déficience en a-N-acétylglucosaminidase (NAGLU), une enzyme nécessaire pour la dégradation des héparanes sulfates (HS). La dégradation incomplète des HS cause l'accumulation de saccharides d'HS dans les lysosomes et à la surface des cellules. Mais la cascade physiopathologique induite par ces saccharides n'est pour l'instant pas connue. D'une part, ces recherches fournissent des preuves que la communication avec l'environnement des cellules neurales déficientes en NAGLU est altérée. En effet, l'intégrine ß1 et ses effecteurs sont suractivés et recrutés au niveau des plaques d'adhérence dans des astrocytes déficients. Les comportements cellulaires dépendants des intégrines, tels que la polarisation et la migration, sont également altérés. Ces phénotypes sont restaurés par l'apport de l'enzyme déficiente. Cette restauration indique que l'accumulation de saccharides d'HS provoque l'activation de la signalisation des intégrines, et perturbe la polarisation et la migration des cellules neurales. L'ajout de saccharides d'HS purifiés sur des cellules neurales normales confirme que les saccharides d'HS extracellulaires activent des composants des plaques d'adhérence. D'autre part, l'étude d'un modèle cellulaire humain, dont l'expression de NAGLU a été inhibée par shRNA, a montré que l'accumulation de vésicules de stockage caractéristiques de la maladie est causée, entre autre, par une déformation de l'appareil de Golgi et la surexpression de GM130. Ces phénotypes sont également observés dans les neurones atteints. Ils s'accompagnent d'une augmentation de la stabilité et de la nucléation des microtubules, au niveau de l'appareil de Golgi. Les défauts de communication entre la cellule malade et son environnement semblent donc modifier la dynamique et la structure cellulaire. Nous présumons que les mécanismes physiopathologiques déchiffrés en culture sont reliés à la neuropathologie de la MPSIIIB. En perturbant la perception de l'environnement cellulaire, la polarité, la migration, et la pousse neuritique, les saccharides d'HS accumulés dans les tissus cérébraux malades, affectent probablement divers mécanismes clefs de la maturation corticale.

Mucopolysaccharidosis type IIIB (MPSIIIB) is a lysosomal storage disease (LSD) characterized by accumulation of heparan sulfate oligosaccharides (HSO), which results in progressive mental retardation, neurodegeneration and premature death in children. The underlying mechanisms are poorly understood. Coming to a better understanding of the pathophysiology of MPSIIIB has become a necessity to assess the efficacy of gene therapy treatment regarding loss of neuronal plasticity, and to define the best conditions for treatment. To address the link between HSO accumulation and downstream pathological events, new cell models of MPSIIIB were created. First, induced pluripotent stem cells (iPSc) were generated from fibroblasts of affected children, followed by differentiation of patient-derived iPSc into a neuronal progeny. Second, a HeLa cell model was created in which expression of shRNAs directed against a-N-acetylglucosaminidase (NAGLU), the deficient enzyme in MPSIIIB, is induced by tetracycline. Success in the isolation of these different models was pointed by the presence of cardinal features of MPSIIIB cell pathology. Studies in these models showed that: I) HSO excreted in the extracellular matrix modifies cell perception of environmental cues, affecting downstream signalling pathways with consequences on the Golgi morphology. II) Accumulation of intracellular storage vesicles, a hallmark of LSDs is due to overexpression of the cis-Golgi protein GM130 and subsequent Golgi alterations. It is likely that these vesicles are abnormal lysosomes formed in the cis- and medial-Golgi which are misrouted at an early step of lysosome biogenesis, giving rise to a dead-end compartment. III) Other cell functions controlled by GM130 are affected, including centrosome morphology and microtubule nucleation. These data point to possible consequences on cell polarization, cell migration and neuritogenesis.

Thesis (Ph. D.) -- University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas, 2005. / Vita. Bibliography: 106-116.

Abstract Skeletal muscle cells (myofibers) are huge multinucleated cells responsible for muscle contraction and hence for the everyday movements of the joints. The structure of these voluminous cells differs greatly from that of the mononucleated cells – the characteristic features of the myofibers include dozens of peripherally located nuclei, tightly packed contractile apparatus and a sophisticatedly organized endomembrane system. The basic physiology involving myofibers is quite well known, but scarce data exist on the membrane biology of the myofibers. The purpose of this study was to examine the localization of mRNA and the site of protein synthesis in the myofibers. The characterization of the membrane dynamics in muscle cells was also performed. In this study we utilized a primary cell culture model obtained from the rat flexor digitorum brevis (FDB) muscle. Also frozen sections from the rat extensor digitorum longus muscle were used. The precursor cells of the myofibers – myoblasts and myotubes – were also utilized in some experiments. Furthermore, methods of immunohistochemistry and molecular biology were applied extensively in this study. We found that in FDB myofibers the mRNA lies just under the plasma membrane. Protein synthesis seemed to be concentrated in the vicinity of nuclei locating beneath the plasma membrane but also in interfibrillar dot-like structures. Protein products moved hundreds of micrometers away from the nuclei of origin. Moreover, there were no barriers for protein movement into the core regions of the myofibers. Movement of proteins was found to be rapid in the cytosol and in the endomembrane system, too. Interestingly, when examining exocytic trafficking we observed that ER-to-Golgi trafficking significantly differed from that of mononucleated cells. Finally, myofibers were found to be able to generate lipid bodies under stress conditions. The dynamics of lipid bodies seemed to deviate from the dynamics found in other cells types. Nowadays not much muscle research with primary myofibers is done worldwide, and therefore dilemmas involving myofibers such as insulin resistance and myotoxicity of statins are mostly unresolved. The knowledge gained from this study may be used in the future to solve clinical problems related to the cell biology of the myofibers. / Tiivistelmä Luurankolihassolut eli myofiiberit ovat jättimäisiä monitumaisia soluja, jotka vastaavat lihassupistuksen aikaansaamisesta ja siten mahdollistavat jokapäiväisen liikkumisemme. Näiden suurten solujen rakenne poikkeaa selkeästi yksitumaisten solujen rakenteesta: myofiiberien tunnusomaisia piirteitä ovat kymmenet solun reunoille sijoittuneet tumat, tiiviisti pakkautunut supistumiskoneisto ja monimutkaisesti järjestynyt solukalvostojärjestelmä. Vaikka myofiiberien perusfysiologia tunnetaankin hyvin, niin tiedetään itse myofiiberien kalvostobiologiasta sangen vähän. Kokonaisuutena tämän tutkimuksen tarkoituksena oli tarkastella mRNA:n ja proteiinisynteesin sijaintia myofiibereissä. Lisäksi selvitimme lihassolujen kalvostodynamiikkaa. Tässä tutkimuksessa käytimme rotan flexor digitorum brevis (FDB) -lihaksesta saatua primääristä soluviljelymallia. Lisäksi hyödynsimme rotan extensor digitorum longus -lihaksesta hankittuja jääleikkeitä. Joissakin kokeissa käytimme myös myofiiberien esiastesoluja (myoblasteja ja myotuubeja). Immunohistokemian ja molekyylibiologian menetelmiä sovellettiin tutkimuksessa laajasti. Havaitsimme, että FDB –myofiibereissä mRNA sijaitsee aivan solukalvon alla. Proteiinisynteesi vaikutti olevan keskittynyt solukalvon alla sijaitsevien tumien ympärille, mutta myös solusisäisiin pistemäisiin rakenteisiin. Proteiinituotteet ylsivät satojen mikrometrien päähän alkuperäisestä tumastaan. Lisäksi proteiineille ei ilmennyt leviämisestettä myofiiberin sisäosiin. Leviämisen havaittiin olevan nopeaa sekä solulimassa että solulimakalvostoissa. Tutkiessamme solun eritystoimintaa huomasimme, että kuljetus ER:stä Golgin laitteeseen eroaa huomattavasti yksitumaisten solujen vastaavasta kuljetuksesta. Lopuksi havaitsimme myofiiberien pystyvän muodostamaan rasvapisaroita rasitusolosuhteissa. Rasvapisaroiden käyttäytyminen näytti myös poikkeavan siitä, mitä muissa soluissa on havaittu. Nykyään lihastutkimusta primäärisoluilla ei juuri tehdä maailmalla, minkä vuoksi myofiibereihin liittyvät lääketieteelliset pulmat kuten insuliiniresistenssi ja statiinien lihashaitat ovat suurelta osin ratkaisematta. Tästä tutkimuksesta saatuja tuloksia voitaneen jatkossa käyttää myofiiberien solubiologiaan liittyvien kliinisten ongelmien selvittämiseen.

[EN] Previous results obtained in the research group where this thesis has been performed shown that the MNSV uses the cellular secretory pathway, through its membrane protein DGBp2 (p7B) to reach the cell periphery. Knowledge about signals/motifs of membrane proteins that facilitate or permit such transport was then rather scarce. In this work we determined the residues involved in the transport of a viral transmembrane protein through the early secretory pathway (DGBp2, MNSV p7B). The residues involved are located in both the Nt (cytosolic) and Ct region (luminal) being one of the first examples in plants of a luminal ER export signal. With this information we have proposed a model in which after insertion and correct folding of the protein in the ER membrane, the luminal Ct of p7B interacts through the K49 residue with a transmembrane adapter associated with the actin cytoskeleton for movement and concentration in the RE-cortical. Nt cytoplasmic seems to be necessary to associate with the COPII vesicle components. Moreover, we have deepened in the study of the interactome of the carmovirus MPs and we have identified through a two-hybrid assay (Y2H), three cellular proteins capable of interacting with three DGBp1 from three different carmovirus (MNSV, TCV and CarMV). These cellular factors are the 60S ribosomal protein P3 (RPP3A), the g subunit of the translation initiation factor 3 (eIF3g) and the transcription factor WRKY36. These interactions were confirmed by BiFC. Furthermore, mutagenesis assays showed that binding domain of these DGBp1 is a FNF conserved domain at the very Ct end. The fact that these three proteins interact with the same host factors suggest a possible mechanism common to most if not all carmoviruses. The unstructured Nt region of MNSV CP, as for other RNA viruses, generally is responsible for viral RNA binding so it is usually called R domain. By using substitution and deletion mutants, we have shown that this R domain (which in MNSV comprising the first 94 residues) is not involved only in the packaging and binding of the viral genome, but is also responsible of CP multifunctionality. By EMSA assays with deletion mutants we could determine that the R domain was essential for binding of RNA. It was further noted that within the R domain there was a conserved region between aa 60 to 91 region, which appears to play a role in both the genomic RNA binding and in vitro encapsidation of subgenomic RNAs. However, in packaging assays, it was observed that the R domain is essential for full genome encapsidation and that the region between residue 31 and 91 is required for both cell to cell and systemic movement. Finally, using PVX as an expression vector, we showed that MNSV CP can act as a suppressor of silencing most likely by sequestering sRNAs. With very few exceptions, plant viruses use the phloem to move from infection sites to distal parts of the plant. In order to know the phloem proteome of infected plants and to identify in the future potential host proteins that facilitate or hinder the systemic transport of viruses, in the last chapter we conducted a comparative proteomic analysis by 2D-DIGE between phloem of MNSV-infected and healthy melon plants. From a total of 1046 spots, 25 were detected having significant abundance changes between the two conditions. After mass spectrometric analysis, 22 spots corresponding to 19 protein, were identified (13 of which were overrepresented and 9 had decreased abundance). Many of the identified proteins were involved in cell death and control of redox homeostasis. Two of these 19 proteins were never described in phloem proteomic assays. / [ES] Resultados previos obtenidos en el grupo de investigación donde se ha realizado la presente Tesis habían puesto de manifiesto que el MNSV utiliza la ruta de secreción celular, a través de su proteína de membrana DGBp2 (p7B), para alcanzar la periferia celular. Hasta el momento de realizar la presente Tesis los conocimientos sobre las señales/motivos de las proteínas de membrana que facilitan o permiten dicho transporte eran más bien escasos. En este trabajo hemos determinado los residuos implicados en la salida de una proteína transmembrana viral en la ruta de secreción temprana (DGBp2, p7B MNSV). Los residuos implicados se encuentran tanto en la región Nt (citosólica) como en la Ct (luminal) siendo éste uno de los primeros ejemplos descritos en plantas de señal luminal de salida de RE. Con todos estos datos se ha propuesto un modelo en el que después de la inserción y correcto plegamiento de la proteína en la membrana del RE, el Ct luminal de p7B interacciona a través del residuo K49 con un adaptador transmembrana asociado al citoesqueleto de actina para su movimiento y concentración en el RE cortical. El motivo Nt citoplasmático sería necesario para el ensamblaje de la vesícula COPII. Por otra parte se ha profundizado en el estudio del interactoma de las MPs de los carmovirus y se han identificado, mediante un ensayo de doble híbrido (Y2H), tres proteínas celulares capaces de interaccionar con tres DGBp1 procedentes de tres carmovirus diferentes (MNSV, TCV y CarMV). Estos factores celulares son la proteína P3 del ribosoma 60S (RPP3A), la subunidad g del factor de iniciación de la traducción 3 (eIF3g) y el factor de transcripción WRKY36. Estas interacciones fueron confirmadas por BiFC. Además, mediante ensayos de mutagénesis se demostró que el dominio de unión de estas DGBp1 es un dominio Ct (FNF) conservado. El hecho de que estas tres proteínas interaccionen con los mismos factores sugiere un posible mecanismo común para todos o la mayor parte de los carmovirus. Las CPs virales constituyen el paradigma de la multifuncionalidad proteica y, además de su obvio papel estructural, intervienen en un gran número de procesos del ciclo viral, incluyendo el transporte del RNA viral. La región Nt desestructurada de la CP del MNSV, al igual que para otros virus de RNA, generalmente es la encargada de unir el RNA viral por lo que se le suele llamar dominio R. Mediante mutantes de deleción y sustitución se ha demostrado que este dominio R (que en el MNSV comprende los primeros 94 residuos) no interviene solo en la encapsidación y unión del genoma viral, sino que es la responsable de la multifuncionalidad de la CP. Mediante EMSAs con mutantes de deleción se pudo determinar que la región R es esencial para la unión del RNA. Además se observó que dentro del dominio R se encuentra una región conservada entre los aa 60 al 91, que parece desempeñar un papel tanto en la unión de RNA genómico in vitro como en la encapsidación de RNAs subgenómicos. Sin embargo, en ensayos de encapsidación se observó que todo el dominio R es esencial para la encapsidación del genoma completo y que la región comprendida entre el residuo 31 y el 91 es necesaria para el movimiento tanto célula a célula como sistémico. Finalmente, utilizando PVX como vector de expresión, se demostró que la CP del MNSV puede actuar como un supresor del silenciamiento mediante la unión a los sRNAs. Con objeto de conocer el proteoma del floema de plantas infectadas y poder en el futuro identificar posibles proteínas del huésped que faciliten o dificulten el transporte sistémico de los virus, en el último capítulo se llevó a cabo un análisis proteómico comparativo, mediante 2D-DIGE, entre floemas de plantas de melón infectadas con MNSV y plantas sanas. Se detectaron 1046 spots de los cuales 2 poseían cambios significativos entre las dos condiciones Dos de estas 19 proteínas no habían sido descritas previamente en ens / [CAT] Resultats previs obtinguts en el grup de recerca on s'ha realitzat la present Tesi havien posat de manifest que el MNSV utilitza la ruta de secreció cel·lular, a través de la seva proteïna de membrana DGBp2 (p7B), per arribar-hi a la perifèria cel·lular. Fins al moment de realitzar la present Tesi els coneixements sobre els senyals/motius de les proteïnes de membrana que faciliten o permeten aquest transport eren més aviat escassos. En aquest treball hem determinat els residus implicats en el transport d'una proteïna transmembrana viral a través de la ruta de secreció primerenca (DGBp2, p7B MNSV). Els residus implicats es troben tant a la regió Nt (citosòlica) com en la Ct (luminal) sent aquest un dels primers exemples descrits en plantes de senyal luminal de sortida de RE. Amb totes aquestes dades s'ha proposat un model en el qual després de la inserció i correcte plegament de la proteïna en la membrana del RE, el Ct luminal de p7B interacciona a través del residu K49 amb un adaptador transmembrana associat al citoesquelet d'actina per al seu moviment i concentració en el RE cortical. El motiu Nt citoplasmàtic caldria per a l'acoblament de la vesícula COPII. D'altra banda s'ha aprofundit en l'estudi del interactoma de les MPs dels carmovirus i s'han identificat, mitjançant un assaig de doble híbrid (Y2H), tres proteïnes cel·lulars capaces d'interaccionar amb tres DGBp1 procedents de tres Carmovirus diferents (MNSV, TCV i CarMV). Aquests factors cel·lulars són la proteïna P3 del ribosoma 60S (RPP3A), la subunitat g del factor d'iniciació de la traducció 3 (eIF3g) i el factor de transcripció WRKY36. Aquestes interaccions van ser confirmades per BiFC. A més, mitjançant assajos de mutagènesi es va demostrar que el domini d'unió d'aquestes DGBp1 és un domini Ct (FNF) conservat. El fet que aquestes tres proteïnes interaccionen amb els mateixos factors suggereix un possible mecanisme comú per a tots o la major part dels carmovirus. Les CPs virals constitueixen el paradigma de la multifuncionalitat proteica i, a més del seu obvi paper estructural, intervenen en un gran nombre de processos del cicle viral, incloent el transport de l'RNA viral. La regió Nt desestructurada de la CP del MNSV, igual que per altres virus de RNA, generalment és l'encarregada d'unir l'RNA viral pel que se li sol cridar domini R. Mitjançant mutants de deleció i substitució s'ha demostrat que aquest domini R (que en el MNSV comprèn els primers 94 residus) no intervé només a la encapsidación i unió del genoma viral, sinó que és la responsable de la multifuncionalitat de la CP. Mitjançant EMSAs amb mutants de deleció es va poder determinar que el domini R essencial per a la unió de l'RNA. A més es va observar que dins del domini R es troba una regió conservada entre els aa 60 al 91, que sembla tenir un paper tant en la unió de RNA genòmic in vitro com en l'encapsidació de RNAs subgenómicos. No obstant això, en assajos d'encapsidació es va observar que tot el domini R és essencial per a l'encapsidació del genoma complet i que la regió compresa entre el residu 31 i el 91 és essencial per al moviment tant cèl·lula a cèl·lula com sistèmic. Finalment, utilitzant PVX com a vector d'expressió, es va demostrar que la CP del MNSV pot actuar com un supressor de silenciament mitjançant la unió als sRNAs. Amb l'objecte de conèixer el proteoma del floema de plantes infectades i poder en el futur identificar possibles proteïnes de l'hoste que facilitin o dificultin el transport sistèmic dels virus, en l'últim capítol es va dur a terme una anàlisi proteòmic comparatiu, mitjançant 2D-DIGE, entre floemas de plantes de meló infectades amb MNSV i plantes sanes. Es van detectar 1046 espots dels quals 25 tenien canvis significatius entre les dues condicions. Després de sotmetre les proteïnes a una anàlisi d'espectrometria de masses , es van identificar 19 proteïnes que corresponien a 22 espots Dues / Serra Soriano, M. (2016). Relación estructura-función de las proteínas virales implicadas en el movimiento de los carmovirus y su interacción con factores celulares [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/61634 / TESIS