A Doença de Parkinson (DP) é uma doença multifatorial. Seu tratamento é apenas sintomático, o que salienta a importância do estudo de novas terapias. Há evidências de que a excitotoxicidade atribuída ao aumento da atividade glutamatérgica nos núcleos da base seja uma das causas da DP. A guanosina extracelular tem efeitos sobre parâmetros glutamatérgicos e é neuroprotetora: quando administrada oralmente, ela protege ratos contra convulsões induzidas por ácido quinolínico, bem como protege fatias de hipocampo submetidas à combinação de hipóxia e hipoglicemia. O objetivo deste trabalho foi investigar os efeitos do consumo crônico oral de guanosina no modelo animal da DP induzido por 6- hidroxidopamina (6-OHDA). Ratos Wistar machos (250-350g, 100-115 dias de idade) receberam solução de guanosina 0,5mg/ml (n=20) ou água destilada (n=16) para beber durante 4 semanas. Após as duas primeiras semanas de tratamento, receberam infusão de 6-OHDA (5,5 μl, 3 μg/μl) no feixe prosencefálico medial direito. Depois de 2 semanas do término do tratamento, os animais foram submetidos ao Teste de Motricidade sobre Grade (TMG), com duração de 3 minutos e, após uma semana, foram desafiados com metilfenidato (MF) 20 mg/kg, durante 30 minutos, para verificação do grau de lesão dos animais. Imunoistoquímica para TH em células nigrais também foi realizada. Treze de 16 animais do grupo controle apresentaram comportamento rotacional ipsilateral espontâneo no TMG, o que diferiu do grupo tratado, onde apenas nove, dentre os vinte utilizados apresentaram o mesmo comportamento (teste exato de Fisher, p=0,041). Entretanto, não verificamos uma diminuição do número das rotações induzidas por MF 20 mg/kg em animais tratados com guanosina, quando comparado com o grupo controle (teste t para amostras independentes, P = 0,716). Houve tendência a uma menor perda de neurônios positivos para TH na parte compacta da substância nigra no grupo tratado com guanosina (teste t para amostras independentes, p=0,064; grupo controle, n=8, 90%±5, média±E.P.; grupo tratado, n=5, 70%±11). Podemos concluir, a partir desses resultados, que a guanosina previne a expressão comportamental no TMG típica de animais lesionados com 6-OHDA e, talvez, diminua a morte de células nigrais positivas para TH. / Parkinson’s Disease (PD) is a multifactorial disorder and the treatment is only symptomatic, which stresses the importance of studying new therapies. There is some evidences that excitotoxicity attributed to increased glutamatergic activity in the basal ganglia could be one of the causes of PD. Extracellular guanosine has effects on glutamatergic parameters and is neuroprotective: when orally administered, protect against seizures induced by quinolinic acid in rats, and protect brain slices exposed to hypoxia/hypoglycemia. The aim of this work is to investigate the effects of a chronic oral administration of guanosine in the 6-hydroxydopamine (6-OHDA) animal model of PD. Male Wistar rats (250-350 g, 100-115 days old) drank a 0.5 mg/ml guanosine (n=20) or distilled water (n=16) during 4 weeks. After the two first weeks of treatment, they received a stereotaxic infusion of 6-OHDA (16.5 μg, 5.5 μl) into the right medial forebrain bundle (MFB). Two weeks after the end of the treatment, animals were exposed to the footfault apparatus for three minutes; and two weeks after, they were challenged with 20 mg/kg of methylphenidate and were observed for 30 minutes, to verify the degree of lesion. Immunohistochemistry for tyrosine hydroxylase (TH) was also performed. Thirteen of 16 control animals showed spontaneous rotational behavior in the footfault test, which differed from the treated group where only 9 of 20 animals showed the same behavior (Fisher Exact Test, P=0.041). However, the number of rotations induced by MF 20 mg/kg in animals treated with guanosine didn’t change, when compared with the control group (t test for independent samples, P = 0.716). There was a trend towards a smaller decrease of TH-positive nigral neurons in the guanosine-treated animals when compared to controls (independent t test, P=0.064, control group, n=8, 90%+/5. average+/-S.E.M.; treated group, n=5, 70%+/-11) Our results show that guanosine prevents, in some 6-OHDA-lesioned animals, the behavioral pattern of contextinduced rotations in the footfault test. Our preliminary results suggest that guanosine may also have a neuroprotective effect in the 6-OHDA PD model, since we found a trend towards a smaller decrease in the number of TH-positive cells in guanosinetreated animals relative to control animals.

A Doença de Parkinson (DP) é uma doença multifatorial. Seu tratamento é apenas sintomático, o que salienta a importância do estudo de novas terapias. Há evidências de que a excitotoxicidade atribuída ao aumento da atividade glutamatérgica nos núcleos da base seja uma das causas da DP. A guanosina extracelular tem efeitos sobre parâmetros glutamatérgicos e é neuroprotetora: quando administrada oralmente, ela protege ratos contra convulsões induzidas por ácido quinolínico, bem como protege fatias de hipocampo submetidas à combinação de hipóxia e hipoglicemia. O objetivo deste trabalho foi investigar os efeitos do consumo crônico oral de guanosina no modelo animal da DP induzido por 6- hidroxidopamina (6-OHDA). Ratos Wistar machos (250-350g, 100-115 dias de idade) receberam solução de guanosina 0,5mg/ml (n=20) ou água destilada (n=16) para beber durante 4 semanas. Após as duas primeiras semanas de tratamento, receberam infusão de 6-OHDA (5,5 μl, 3 μg/μl) no feixe prosencefálico medial direito. Depois de 2 semanas do término do tratamento, os animais foram submetidos ao Teste de Motricidade sobre Grade (TMG), com duração de 3 minutos e, após uma semana, foram desafiados com metilfenidato (MF) 20 mg/kg, durante 30 minutos, para verificação do grau de lesão dos animais. Imunoistoquímica para TH em células nigrais também foi realizada. Treze de 16 animais do grupo controle apresentaram comportamento rotacional ipsilateral espontâneo no TMG, o que diferiu do grupo tratado, onde apenas nove, dentre os vinte utilizados apresentaram o mesmo comportamento (teste exato de Fisher, p=0,041). Entretanto, não verificamos uma diminuição do número das rotações induzidas por MF 20 mg/kg em animais tratados com guanosina, quando comparado com o grupo controle (teste t para amostras independentes, P = 0,716). Houve tendência a uma menor perda de neurônios positivos para TH na parte compacta da substância nigra no grupo tratado com guanosina (teste t para amostras independentes, p=0,064; grupo controle, n=8, 90%±5, média±E.P.; grupo tratado, n=5, 70%±11). Podemos concluir, a partir desses resultados, que a guanosina previne a expressão comportamental no TMG típica de animais lesionados com 6-OHDA e, talvez, diminua a morte de células nigrais positivas para TH. / Parkinson’s Disease (PD) is a multifactorial disorder and the treatment is only symptomatic, which stresses the importance of studying new therapies. There is some evidences that excitotoxicity attributed to increased glutamatergic activity in the basal ganglia could be one of the causes of PD. Extracellular guanosine has effects on glutamatergic parameters and is neuroprotective: when orally administered, protect against seizures induced by quinolinic acid in rats, and protect brain slices exposed to hypoxia/hypoglycemia. The aim of this work is to investigate the effects of a chronic oral administration of guanosine in the 6-hydroxydopamine (6-OHDA) animal model of PD. Male Wistar rats (250-350 g, 100-115 days old) drank a 0.5 mg/ml guanosine (n=20) or distilled water (n=16) during 4 weeks. After the two first weeks of treatment, they received a stereotaxic infusion of 6-OHDA (16.5 μg, 5.5 μl) into the right medial forebrain bundle (MFB). Two weeks after the end of the treatment, animals were exposed to the footfault apparatus for three minutes; and two weeks after, they were challenged with 20 mg/kg of methylphenidate and were observed for 30 minutes, to verify the degree of lesion. Immunohistochemistry for tyrosine hydroxylase (TH) was also performed. Thirteen of 16 control animals showed spontaneous rotational behavior in the footfault test, which differed from the treated group where only 9 of 20 animals showed the same behavior (Fisher Exact Test, P=0.041). However, the number of rotations induced by MF 20 mg/kg in animals treated with guanosine didn’t change, when compared with the control group (t test for independent samples, P = 0.716). There was a trend towards a smaller decrease of TH-positive nigral neurons in the guanosine-treated animals when compared to controls (independent t test, P=0.064, control group, n=8, 90%+/5. average+/-S.E.M.; treated group, n=5, 70%+/-11) Our results show that guanosine prevents, in some 6-OHDA-lesioned animals, the behavioral pattern of contextinduced rotations in the footfault test. Our preliminary results suggest that guanosine may also have a neuroprotective effect in the 6-OHDA PD model, since we found a trend towards a smaller decrease in the number of TH-positive cells in guanosinetreated animals relative to control animals.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Neurociências. / Made available in DSpace on 2012-10-23T15:44:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 239614.pdf: 1037726 bytes, checksum: 6ba900140f9987836a0852d2d3d595ad (MD5)

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina. Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Neurociências. / Made available in DSpace on 2012-10-24T00:31:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 261771.pdf: 644460 bytes, checksum: ce51f9efb3b756e93d92c9fa17b593bb (MD5) / Os derivados da guanina têm sido implicados em vários efeitos extracelulares, como a modulação do sistema glutamatérgico e neuroproteção frente a diferentes danos excitotóxicos. Eles são liberados para o meio extracelular em situação fisiológica ou hipóxica e participam da comunicação intercelular. O objetivo deste trabalho foi avaliar participação dos canais de potássio e da via da PI3-K no mecanismo de neuroproteção promovido pela guanosina (GUO) em fatias de hipocampo de ratos submetidas à privação de glicose e oxigênio (PGO). A adição de GUO (100µM) no período de 2 horas de reperfusão após os 15 min de PGO previne a diminuição de viabilidade celular induzida pela PGO. A utilização dos bloqueadores de canais de K+ glibenclamida (20µM) e apamina (300nM) demonstrou que o mecanismo de neuroproteção da GUO não depende dos canais de K+ sensíveis ao ATP e canais de K+ de baixa condutância ativados por Ca2+, respectivamente. A utilização de caribdotoxina (100 nM), bloqueador de canal de K+ de alta condutância ativado por Ca2+ (BK) reverteu o efeito neuroprotetor da GUO. As fatias de hipocampo submetidas à PGO e reperfusão apresentam uma significativa diminuição na captação de glutamato. A adição de GUO no período de reperfusão reverte a diminuição da captação de glutamato. O aumento da captação de glutamato promovido pela GUO é revertido quando as fatias são pré-incubadas com caribdotoxina (100 nM), bloqueador de canal BK e com o inibidor da via da PI3-K (wortmanina). GUO também promoveu aumento da fosforilação da proteína AKT, o que é revertido na presença de caribdotoxina. Concluindo, GUO promove neuroproteção através do aumento da captação de glutamato, o qual é modulado por canais de K+ de alta condutância ativados por Ca+2 e ativação da via da PI3-K, aumentando a expressão da proteína fosto-AKT e resultando em proteção celular.

A Doença de Parkinson (DP) é uma doença multifatorial. Seu tratamento é apenas sintomático, o que salienta a importância do estudo de novas terapias. Há evidências de que a excitotoxicidade atribuída ao aumento da atividade glutamatérgica nos núcleos da base seja uma das causas da DP. A guanosina extracelular tem efeitos sobre parâmetros glutamatérgicos e é neuroprotetora: quando administrada oralmente, ela protege ratos contra convulsões induzidas por ácido quinolínico, bem como protege fatias de hipocampo submetidas à combinação de hipóxia e hipoglicemia. O objetivo deste trabalho foi investigar os efeitos do consumo crônico oral de guanosina no modelo animal da DP induzido por 6- hidroxidopamina (6-OHDA). Ratos Wistar machos (250-350g, 100-115 dias de idade) receberam solução de guanosina 0,5mg/ml (n=20) ou água destilada (n=16) para beber durante 4 semanas. Após as duas primeiras semanas de tratamento, receberam infusão de 6-OHDA (5,5 μl, 3 μg/μl) no feixe prosencefálico medial direito. Depois de 2 semanas do término do tratamento, os animais foram submetidos ao Teste de Motricidade sobre Grade (TMG), com duração de 3 minutos e, após uma semana, foram desafiados com metilfenidato (MF) 20 mg/kg, durante 30 minutos, para verificação do grau de lesão dos animais. Imunoistoquímica para TH em células nigrais também foi realizada. Treze de 16 animais do grupo controle apresentaram comportamento rotacional ipsilateral espontâneo no TMG, o que diferiu do grupo tratado, onde apenas nove, dentre os vinte utilizados apresentaram o mesmo comportamento (teste exato de Fisher, p=0,041). Entretanto, não verificamos uma diminuição do número das rotações induzidas por MF 20 mg/kg em animais tratados com guanosina, quando comparado com o grupo controle (teste t para amostras independentes, P = 0,716). Houve tendência a uma menor perda de neurônios positivos para TH na parte compacta da substância nigra no grupo tratado com guanosina (teste t para amostras independentes, p=0,064; grupo controle, n=8, 90%±5, média±E.P.; grupo tratado, n=5, 70%±11). Podemos concluir, a partir desses resultados, que a guanosina previne a expressão comportamental no TMG típica de animais lesionados com 6-OHDA e, talvez, diminua a morte de células nigrais positivas para TH. / Parkinson’s Disease (PD) is a multifactorial disorder and the treatment is only symptomatic, which stresses the importance of studying new therapies. There is some evidences that excitotoxicity attributed to increased glutamatergic activity in the basal ganglia could be one of the causes of PD. Extracellular guanosine has effects on glutamatergic parameters and is neuroprotective: when orally administered, protect against seizures induced by quinolinic acid in rats, and protect brain slices exposed to hypoxia/hypoglycemia. The aim of this work is to investigate the effects of a chronic oral administration of guanosine in the 6-hydroxydopamine (6-OHDA) animal model of PD. Male Wistar rats (250-350 g, 100-115 days old) drank a 0.5 mg/ml guanosine (n=20) or distilled water (n=16) during 4 weeks. After the two first weeks of treatment, they received a stereotaxic infusion of 6-OHDA (16.5 μg, 5.5 μl) into the right medial forebrain bundle (MFB). Two weeks after the end of the treatment, animals were exposed to the footfault apparatus for three minutes; and two weeks after, they were challenged with 20 mg/kg of methylphenidate and were observed for 30 minutes, to verify the degree of lesion. Immunohistochemistry for tyrosine hydroxylase (TH) was also performed. Thirteen of 16 control animals showed spontaneous rotational behavior in the footfault test, which differed from the treated group where only 9 of 20 animals showed the same behavior (Fisher Exact Test, P=0.041). However, the number of rotations induced by MF 20 mg/kg in animals treated with guanosine didn’t change, when compared with the control group (t test for independent samples, P = 0.716). There was a trend towards a smaller decrease of TH-positive nigral neurons in the guanosine-treated animals when compared to controls (independent t test, P=0.064, control group, n=8, 90%+/5. average+/-S.E.M.; treated group, n=5, 70%+/-11) Our results show that guanosine prevents, in some 6-OHDA-lesioned animals, the behavioral pattern of contextinduced rotations in the footfault test. Our preliminary results suggest that guanosine may also have a neuroprotective effect in the 6-OHDA PD model, since we found a trend towards a smaller decrease in the number of TH-positive cells in guanosinetreated animals relative to control animals.

Os objetivos da presente tese de doutorado foram os de investigar o papel das purinas, em especial da guanina, da inosina e da guanosina, na nocicepção e compreender os mecanismos responsáveis pelos efeitos extracelulares desses compostos. Os resultados estão divididos em três partes, de acordo com sua natureza, em revisão da literatura (parte um), experimental, em animais e em humanos (parte dois) e discussão (parte três). Para o desenvolvimento da primeira parte, uma extensa revisão da literatura em relação ao papel extracelular das purinas na nocicepção foi realizada. Na segunda parte desta tese, procedimentos experimentais em animais demonstraram que a guanina e a inosina administradas por via intratecal, são antinociceptivas em diversos modelos de dor, além da guanosina administrada via intraperitoneal com seu efeito antinociceptivo em modelo de dor neuropática em camundongos. A administração intratecal de guanina e inosina causou um aumento significativo nos níveis de inosina e oxipurinas no líquido cefalorraquiano (LCR). Os níveis de guanina no LCR não foram detectados de forma acurada através da presente metodologia cromatográfica. Diversos testes comportamentais demonstraram o baixo potencial de toxicidade apresentado pelas purinas administradas por via intratecal. A seguir, os mecanismos de ação envolvidos nos efeitos antinociceptivos da guanina e da inosina foram investigados através de métodos farmacológicos, demonstrando que ambos parecem compartilhar mecanismos semelhantes, envolvendo a ativação de receptores adenosinérgicos Também demonstramos que o alopurinol, um derivado das purinas e inibidor da xantina oxidase normalmente utilizado para o tratamento de hiperuricemia, também produziu efeito analgésico em pacientes em pós-operatório imediato de histerectomia abdominal, além de apresentarem aumento de xantina e diminuição de ácido úrico no LCR. Apesar da utilização clínica das purinas ser demasiadamente precoce, podemos inferir que a utilização de alopurinol poderia ser uma excelente estratégia para testar nossas hipóteses, pois demonstra a vantagem de estar aprovado para uso comercial, apresentar boa tolerabilidade e baixo custo. Os resultados apresentados nesta tese ratificam o papel das purinas nos mecanismos de transmissão da dor e um novo papel para a guanina, a inosina e a guanosina é proposto: a modulação da dor. Diversos derivados purinérgicos são alvos para desenvolvimento de novos fármacos e podem ser úteis no tratamento de dor relacionada a hiperestimulação do sistema adenosinérgico e glutamatérgico. / The aim of this thesis was to investigate the role of purines, especially guanine, inosine and guanosine, against the nociception and to understand the mechanisms responsible for the extracellular effects of these compounds. The results are divided into three parts, according to their nature, in review of the literature (part one), experimental, in animals and humans (part two) and discussion (part three). For the development of the first part, an extensive review of the literature regarding the extracellular role of purines in the nociception was performed. In the second part of this thesis, experimental procedures in animals demonstrated that guanine and inosine administered intrathecally are antinociceptive in several models of pain. Additionally, guanosine, administered intraperitoneally, produced antinociceptive effects in a model of neuropathic pain in mice. Intrathecal administration of guanine and inosine caused a significant increase in inosine and oxypurine levels in the cerebrospinal fluid (CSF). The levels of guanine in the CSF were not accurately detected by the present chromatographic methodology. Several behavioral tests have demonstrated the low toxicity potential of intrathecal purines. Furthermore, the mechanisms of action involved in the antinociceptive effects of guanine and inosine have been investigated through pharmacological methods, demonstrating that both seem to share similar mechanisms, involving the activation of adenosinergic receptors We also demonstrated that allopurinol, a purine derivative and xanthine oxidase inhibitor commonly used for the treatment of hyperuricemia, also produced an analgesic effect in patients in the immediate postoperative period of abdominal hysterectomy, in addition to increased xanthine and decreased uric acid in the CSF. Although the clinical use of purines is too premature, we can infer that the use of allopurinol could be an excellent strategy to test our hypotheses, since it demonstrates the advantage of being approved for commercial use, presenting good tolerability and low cost. The results presented in this thesis confirm the role of purines in pain transmission mechanisms and a new role for guanine, inosine and guanosine is proposed: pain modulation. A number of purinergic derivatives are targets for the development of novel drugs and may be useful in the treatment of pain related to hyperstimulation of the adenosinergic and glutamatergic system.

Durante as últimas décadas os estudos do sistema purinérgico concentraram seu foco de atenção nas ações dos derivados da adenina (como adenosina e o ATP). Seus efeitos, receptores, agonistas e antagonistas encontram-se muito bem estabelecidos dentro do sistema nervoso central. Os resultados obtidos com os diversos estudos dos derivados da guanina trazem uma nova perspectiva para o estudo do sistema purinérgico. Os nucleotídeos derivados da guanina são classicamente associados ao sistema de transmissão de sinal transmembrana via proteínas G. Além disto, suas ações extracelulares sobre o sistema nervoso central, especificamente sobre o sistema glutamatérgico, têm tornado essa classe de moléculas uma nova fronteira no estudo da neuroproteção. Estas moléculas também são capazes de promover processos trófico e mitóticos nas células do SNC, promover a liberação de fatores de crescimento e estimular o influxo de cálcio nos astrócitos. Entretanto, suas ações sobre o sistema glutamatérgico são o alvo principal deste trabalho. Os derivados da guanina, especialmente a guanosina, são capazes de estimular a captação de glutamato em cultura de células astrocitárias e em fatias de tecido cerebral. Atuam como anticonvulsivantes pelas mais diversas vias de administração, e ainda possuem efeito amnésico. O aumento provocado na captação de glutamato parece ser realizado especificamente pela guanosina, uma vez que os nucleotídeos necessitam ser hidrolisados para exercerem tais efeitos. Assim a guanosina acaba assumindo um papel importante na neuroproteção contra os efeitos de concentrações extracelulares tóxicas de glutamato no SNC. Nosso trabalho demonstra que a guanosina também é a real efetora do efeito anticonvulsivante apresentado pelo GMP, uma vez que o uso de inibidores da conversão de GMP para guanosina leva a uma diminuição do seu efeito. Ainda, a guanosina aumenta a Vmax da captação de glutamato em fatias, o que indicaria um maior contingente de transportadores presentes na membrana da célula ou uma menor taxa de turnover dos mesmos. Esse efeito nos transportadores parece permanecer mesmo depois que a guanosina é retirada do meio de incubação. Os efeitos demonstrados pela guanosina in vitro foram confirmados em experimentos ex vivo. Além disso, a concentração de purinas no liquor dos ratos tratada não demonstrou aumentos significativos após a administração i.c.v. de guanosina ou GMP. Essa ação pode indicar que a guanosina dispara algum mecanismo que aumente o tônus glutamatérgico por um período maior do que o tempo de exposição a ela. Essas ações da guanosina devem ser desempenhadas através de seu receptor. Nossos resultados apontam para um novo receptor no sistema purinérgico, sensível à guanosina e adenosina, mas não antagonizado por cafeína e ATP. Esse receptor parece ter proteínas G acopladas, uma vez que o GTP-N foi capaz de inibir a união de guanosina ao receptor. Esse receptor deve responder de acordo com a purina que estiver ligada a ele, pois a adenosina e a guanosina têm ações diversas e muitas vezes contrárias no SNC. O sitio de união parece ser preferencialmente astrocitário, o que ajudaria a explicar as ações encontradas para a guanosina na captação de glutamato. Somando-se todas as ações já descobertas para a guanosina e as suas mais variadas formas de proteger o cérebro de excesso de glutamato extracelular, é impossível tratar a guanosina apenas como uma molécula coadjuvante no sistema purinérgico.

Os objetivos da presente tese de doutorado foram os de investigar o papel das purinas, em especial da guanina, da inosina e da guanosina, na nocicepção e compreender os mecanismos responsáveis pelos efeitos extracelulares desses compostos. Os resultados estão divididos em três partes, de acordo com sua natureza, em revisão da literatura (parte um), experimental, em animais e em humanos (parte dois) e discussão (parte três). Para o desenvolvimento da primeira parte, uma extensa revisão da literatura em relação ao papel extracelular das purinas na nocicepção foi realizada. Na segunda parte desta tese, procedimentos experimentais em animais demonstraram que a guanina e a inosina administradas por via intratecal, são antinociceptivas em diversos modelos de dor, além da guanosina administrada via intraperitoneal com seu efeito antinociceptivo em modelo de dor neuropática em camundongos. A administração intratecal de guanina e inosina causou um aumento significativo nos níveis de inosina e oxipurinas no líquido cefalorraquiano (LCR). Os níveis de guanina no LCR não foram detectados de forma acurada através da presente metodologia cromatográfica. Diversos testes comportamentais demonstraram o baixo potencial de toxicidade apresentado pelas purinas administradas por via intratecal. A seguir, os mecanismos de ação envolvidos nos efeitos antinociceptivos da guanina e da inosina foram investigados através de métodos farmacológicos, demonstrando que ambos parecem compartilhar mecanismos semelhantes, envolvendo a ativação de receptores adenosinérgicos Também demonstramos que o alopurinol, um derivado das purinas e inibidor da xantina oxidase normalmente utilizado para o tratamento de hiperuricemia, também produziu efeito analgésico em pacientes em pós-operatório imediato de histerectomia abdominal, além de apresentarem aumento de xantina e diminuição de ácido úrico no LCR. Apesar da utilização clínica das purinas ser demasiadamente precoce, podemos inferir que a utilização de alopurinol poderia ser uma excelente estratégia para testar nossas hipóteses, pois demonstra a vantagem de estar aprovado para uso comercial, apresentar boa tolerabilidade e baixo custo. Os resultados apresentados nesta tese ratificam o papel das purinas nos mecanismos de transmissão da dor e um novo papel para a guanina, a inosina e a guanosina é proposto: a modulação da dor. Diversos derivados purinérgicos são alvos para desenvolvimento de novos fármacos e podem ser úteis no tratamento de dor relacionada a hiperestimulação do sistema adenosinérgico e glutamatérgico. / The aim of this thesis was to investigate the role of purines, especially guanine, inosine and guanosine, against the nociception and to understand the mechanisms responsible for the extracellular effects of these compounds. The results are divided into three parts, according to their nature, in review of the literature (part one), experimental, in animals and humans (part two) and discussion (part three). For the development of the first part, an extensive review of the literature regarding the extracellular role of purines in the nociception was performed. In the second part of this thesis, experimental procedures in animals demonstrated that guanine and inosine administered intrathecally are antinociceptive in several models of pain. Additionally, guanosine, administered intraperitoneally, produced antinociceptive effects in a model of neuropathic pain in mice. Intrathecal administration of guanine and inosine caused a significant increase in inosine and oxypurine levels in the cerebrospinal fluid (CSF). The levels of guanine in the CSF were not accurately detected by the present chromatographic methodology. Several behavioral tests have demonstrated the low toxicity potential of intrathecal purines. Furthermore, the mechanisms of action involved in the antinociceptive effects of guanine and inosine have been investigated through pharmacological methods, demonstrating that both seem to share similar mechanisms, involving the activation of adenosinergic receptors We also demonstrated that allopurinol, a purine derivative and xanthine oxidase inhibitor commonly used for the treatment of hyperuricemia, also produced an analgesic effect in patients in the immediate postoperative period of abdominal hysterectomy, in addition to increased xanthine and decreased uric acid in the CSF. Although the clinical use of purines is too premature, we can infer that the use of allopurinol could be an excellent strategy to test our hypotheses, since it demonstrates the advantage of being approved for commercial use, presenting good tolerability and low cost. The results presented in this thesis confirm the role of purines in pain transmission mechanisms and a new role for guanine, inosine and guanosine is proposed: pain modulation. A number of purinergic derivatives are targets for the development of novel drugs and may be useful in the treatment of pain related to hyperstimulation of the adenosinergic and glutamatergic system.

Durante as últimas décadas os estudos do sistema purinérgico concentraram seu foco de atenção nas ações dos derivados da adenina (como adenosina e o ATP). Seus efeitos, receptores, agonistas e antagonistas encontram-se muito bem estabelecidos dentro do sistema nervoso central. Os resultados obtidos com os diversos estudos dos derivados da guanina trazem uma nova perspectiva para o estudo do sistema purinérgico. Os nucleotídeos derivados da guanina são classicamente associados ao sistema de transmissão de sinal transmembrana via proteínas G. Além disto, suas ações extracelulares sobre o sistema nervoso central, especificamente sobre o sistema glutamatérgico, têm tornado essa classe de moléculas uma nova fronteira no estudo da neuroproteção. Estas moléculas também são capazes de promover processos trófico e mitóticos nas células do SNC, promover a liberação de fatores de crescimento e estimular o influxo de cálcio nos astrócitos. Entretanto, suas ações sobre o sistema glutamatérgico são o alvo principal deste trabalho. Os derivados da guanina, especialmente a guanosina, são capazes de estimular a captação de glutamato em cultura de células astrocitárias e em fatias de tecido cerebral. Atuam como anticonvulsivantes pelas mais diversas vias de administração, e ainda possuem efeito amnésico. O aumento provocado na captação de glutamato parece ser realizado especificamente pela guanosina, uma vez que os nucleotídeos necessitam ser hidrolisados para exercerem tais efeitos. Assim a guanosina acaba assumindo um papel importante na neuroproteção contra os efeitos de concentrações extracelulares tóxicas de glutamato no SNC. Nosso trabalho demonstra que a guanosina também é a real efetora do efeito anticonvulsivante apresentado pelo GMP, uma vez que o uso de inibidores da conversão de GMP para guanosina leva a uma diminuição do seu efeito. Ainda, a guanosina aumenta a Vmax da captação de glutamato em fatias, o que indicaria um maior contingente de transportadores presentes na membrana da célula ou uma menor taxa de turnover dos mesmos. Esse efeito nos transportadores parece permanecer mesmo depois que a guanosina é retirada do meio de incubação. Os efeitos demonstrados pela guanosina in vitro foram confirmados em experimentos ex vivo. Além disso, a concentração de purinas no liquor dos ratos tratada não demonstrou aumentos significativos após a administração i.c.v. de guanosina ou GMP. Essa ação pode indicar que a guanosina dispara algum mecanismo que aumente o tônus glutamatérgico por um período maior do que o tempo de exposição a ela. Essas ações da guanosina devem ser desempenhadas através de seu receptor. Nossos resultados apontam para um novo receptor no sistema purinérgico, sensível à guanosina e adenosina, mas não antagonizado por cafeína e ATP. Esse receptor parece ter proteínas G acopladas, uma vez que o GTP-N foi capaz de inibir a união de guanosina ao receptor. Esse receptor deve responder de acordo com a purina que estiver ligada a ele, pois a adenosina e a guanosina têm ações diversas e muitas vezes contrárias no SNC. O sitio de união parece ser preferencialmente astrocitário, o que ajudaria a explicar as ações encontradas para a guanosina na captação de glutamato. Somando-se todas as ações já descobertas para a guanosina e as suas mais variadas formas de proteger o cérebro de excesso de glutamato extracelular, é impossível tratar a guanosina apenas como uma molécula coadjuvante no sistema purinérgico.

Os objetivos da presente tese de doutorado foram os de investigar o papel das purinas, em especial da guanina, da inosina e da guanosina, na nocicepção e compreender os mecanismos responsáveis pelos efeitos extracelulares desses compostos. Os resultados estão divididos em três partes, de acordo com sua natureza, em revisão da literatura (parte um), experimental, em animais e em humanos (parte dois) e discussão (parte três). Para o desenvolvimento da primeira parte, uma extensa revisão da literatura em relação ao papel extracelular das purinas na nocicepção foi realizada. Na segunda parte desta tese, procedimentos experimentais em animais demonstraram que a guanina e a inosina administradas por via intratecal, são antinociceptivas em diversos modelos de dor, além da guanosina administrada via intraperitoneal com seu efeito antinociceptivo em modelo de dor neuropática em camundongos. A administração intratecal de guanina e inosina causou um aumento significativo nos níveis de inosina e oxipurinas no líquido cefalorraquiano (LCR). Os níveis de guanina no LCR não foram detectados de forma acurada através da presente metodologia cromatográfica. Diversos testes comportamentais demonstraram o baixo potencial de toxicidade apresentado pelas purinas administradas por via intratecal. A seguir, os mecanismos de ação envolvidos nos efeitos antinociceptivos da guanina e da inosina foram investigados através de métodos farmacológicos, demonstrando que ambos parecem compartilhar mecanismos semelhantes, envolvendo a ativação de receptores adenosinérgicos Também demonstramos que o alopurinol, um derivado das purinas e inibidor da xantina oxidase normalmente utilizado para o tratamento de hiperuricemia, também produziu efeito analgésico em pacientes em pós-operatório imediato de histerectomia abdominal, além de apresentarem aumento de xantina e diminuição de ácido úrico no LCR. Apesar da utilização clínica das purinas ser demasiadamente precoce, podemos inferir que a utilização de alopurinol poderia ser uma excelente estratégia para testar nossas hipóteses, pois demonstra a vantagem de estar aprovado para uso comercial, apresentar boa tolerabilidade e baixo custo. Os resultados apresentados nesta tese ratificam o papel das purinas nos mecanismos de transmissão da dor e um novo papel para a guanina, a inosina e a guanosina é proposto: a modulação da dor. Diversos derivados purinérgicos são alvos para desenvolvimento de novos fármacos e podem ser úteis no tratamento de dor relacionada a hiperestimulação do sistema adenosinérgico e glutamatérgico. / The aim of this thesis was to investigate the role of purines, especially guanine, inosine and guanosine, against the nociception and to understand the mechanisms responsible for the extracellular effects of these compounds. The results are divided into three parts, according to their nature, in review of the literature (part one), experimental, in animals and humans (part two) and discussion (part three). For the development of the first part, an extensive review of the literature regarding the extracellular role of purines in the nociception was performed. In the second part of this thesis, experimental procedures in animals demonstrated that guanine and inosine administered intrathecally are antinociceptive in several models of pain. Additionally, guanosine, administered intraperitoneally, produced antinociceptive effects in a model of neuropathic pain in mice. Intrathecal administration of guanine and inosine caused a significant increase in inosine and oxypurine levels in the cerebrospinal fluid (CSF). The levels of guanine in the CSF were not accurately detected by the present chromatographic methodology. Several behavioral tests have demonstrated the low toxicity potential of intrathecal purines. Furthermore, the mechanisms of action involved in the antinociceptive effects of guanine and inosine have been investigated through pharmacological methods, demonstrating that both seem to share similar mechanisms, involving the activation of adenosinergic receptors We also demonstrated that allopurinol, a purine derivative and xanthine oxidase inhibitor commonly used for the treatment of hyperuricemia, also produced an analgesic effect in patients in the immediate postoperative period of abdominal hysterectomy, in addition to increased xanthine and decreased uric acid in the CSF. Although the clinical use of purines is too premature, we can infer that the use of allopurinol could be an excellent strategy to test our hypotheses, since it demonstrates the advantage of being approved for commercial use, presenting good tolerability and low cost. The results presented in this thesis confirm the role of purines in pain transmission mechanisms and a new role for guanine, inosine and guanosine is proposed: pain modulation. A number of purinergic derivatives are targets for the development of novel drugs and may be useful in the treatment of pain related to hyperstimulation of the adenosinergic and glutamatergic system.