L'hydrolyse pepsique de l’hémoglobine bovine purifiée ou à partir d'un coproduit des abattoirs : le cruor, peut être considérée comme une voie importante d'obtention de peptides antibactériens. Une étude cinétique nous a permis de maîtriser cette hydrolyse et de déterminer un modèle mathématique capable de prédire la concentration de chaque peptides antibactériens des deux familles de peptides α 1-32 et α 107-141 et ceux pour un intervalle de température de 15-37°C, de pH de 3,5-5,5 et de rapport enzyme/substrat de 1/5-1/20. Le calcul des énergies d'activation pour les différentes réactions impliquées dans le mécanisme était effectué grâce à l’équation d’Arrhenius qui a permis d’étudier l’effet de la température sur les différents coefficients cinétiques. L’effet du pH et du rapport E/S était également étudié et le modèle trouvé a démontré une augmentation linéaire de la vitesse d’hydrolyse en diminuant le pH (entre 3,5 et 5,5) et une vitesse invariable avec le rapport E/S (1/5-1/20). L'étude de la relation structure-fonction des peptides antibactériens α 1-32 et α 137-141 a été effectuée grâce à un suivie de la cinétique de K+ extracellulaire en présence de Lisrea innocua et le déterminant antibactérien minimal a été déterminé pour le peptide α 137-141. La possibilité de valoriser les peptides antibactérien α 1-32 et α 137-141 dans un emballage bioactif pour la conservation des aliments contre le développement de bactéries pathogènes a été étudiée par l'adsorption de ces peptides en surface d'un film de polyéthylène basse densité, traité avec le plasma froid. / The pepsin hydrolysis of purified bovine hemoglobin or from a co-product of slaughterhouses: cruor, can be considered as an important route for obtaining antibacterial peptides. A kinetic study has allowed us to control the hydrolysis and to determine a mathematical model able to predict the concentration of each antibacterial peptides of two families of peptides α 1-32 and α 107-141 and those of an interval of temperature 15-37°C, of pH 3,5-5,5 and ratio enzyme/substrate of 1/5-1/20 . The calculation of activation energies for the different reactions involved in the mechanism was made by the Arrhenius equation, which was used to study the effect of temperature on the various kinetic coefficients. The effect of pH and ratio E / S was also studied and the model found showed a linear increase in the rate of hydrolysis decreasing the pH ( between 3,5 and 5,5 ) and an invariable speed with the ratio E / S ( 1/5-1/20 ). The study of the structure-function relationship of antibacterial peptides α 1-32 and α 137-141 was carried out thanks to a followed the kinetics of extracellular K + in the presence of Lisrea innocua and the minimal determinant antibacterial was determined for the peptide α 137-141. The possibility to recovery the antibacterial peptides α 1-32 and α 137-141 in to a bioactive food packaging against the growth of pathogenic bacteria has been studied by the adsorption of these peptides on the surface of a low density polyethylene film treated with cold plasma.

Cette étude vise à approfondir les connaissances sur les interactions de trHbN, une hémoglobine tronquée de Mycobacterium tuberculosis (Mtb), avec des membranes lipidiques modèles. Cette protéine est responsable de la détoxification du NO en milieu granulomique chez Mtb et serait vitale à la survie en état stationnaire de la bactérie. Le dichroïsme circulaire, la spectroscopie infrarouge ainsi que la RMN à l’état solide du 31P ont été utilisés pour observer la conformation de trHbN dans les différents milieux ainsi que son effet sur les lipides. Dû à la controverse entourant la conformation et le rôle du segment N-terminal de trHbN, la protéine sauvage ainsi qu’une protéine mutante où le segment n’a pas été exprimé ont été étudiées. Les résultats suggèrent que la protéine serait située à l’interface des bicouches lipidiques et que le segment pré-A pourrait servir « d’ancre », empêchant la protéine sauvage de pénétrer trop profondément dans les membranes.

Résumé Les hémoglobines tronquées (Hbtrs) sont retrouvées chez plusieurs organismes et leurs fonctions sont encore inconnues pour la plupart. Les Hbtrs du pathogène de plante Agrobacterium tumefaciens C58 ont été inactivées pour vérifier leurs implications dans la production de tumeur chez les plantes. Les expériences ont montré que les souches mutantes pour les Hbtrs AtuHb2 et AtuHb3 étaient capables d'induire la production de tumeur chez la plante Kalanchoe daigremontiana. La protéine recombinante AtuHb2 a été caractérisée par spectroscopie d'absorption et de résonance Raman. L'analyse, par spectroscopie d'absorption, montre que la protéine est hexacoordonnée dans la forme ferrique et ferreuse, qu'il est possible pour AtuHb2 de former des complexes stables avec les ligands CO, CN- et NO, mais pas avec l'O2 et que le complexe formé entre la forme ferreuse et le NO est pentacoordonné. L'analyse par spectroscopie de résonance Raman a montré que le ligand CO est peu stabilisé

Mycobacterium tuberculosis atteint le tiers de la population mondiale et cause plus de 1.5 millions de décès chaque année. L’augmentation des infections chez les patients immuno-compromis et l’émergence d’infections à de nouvelles souches multirésistantes aux antibiotiques somme la communauté scientifique à la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques ainsi qu’au développement de nouveaux antibiotiques, vaccins et thérapies. Parmi les ~ 4000 gènes du génome de Mycobacterium tuberculosis, un d’entre eux, glbN, code pour l’hémoglobine tronquée N. Les hémoglobines sont de petites métalloprotéines qui fixent réversiblement l’oxygène et qui effectuent plusieurs activités catalytiques importantes. Ainsi, nos recherches s’inscrivent dans le cadre d’une approche biochimique qui vise à définir une fonction pour l’hémoglobine tronquée N de Mycobacterium tuberculosis à l’aide de techniques biochimiques modernes et de la spectroscopie à flux-arrêté. Nos recherches nous amènent également à résoudre la structure tridimensionnelle du complexe oxygéné de trHbN, à caractériser les interactions protéines-ligands au site actif de l’hémoglobine et à définir leurs rôles dans l’établissement du potentiel fonctionnel de l’enzyme en utilisant les spectroscopies d’absorption, de résonance Raman et de diffraction des rayons X. Nous avons découvert que l’activité rapide et efficace de détoxication aérobie du •NO de l’hémoglobine tronquée N mesurée chez Mycobacterium bovis BCG pourrait remplir un rôle similaire chez Mycobacterium tuberculosis et permettre la persistance de l’infection tuberculeuse dans l’hôte par la prévention des effets cytotoxiques associés au •NO et à ses dérivés réactifs azotés. De plus, l’architecture et la polarité du site actif de l’hémoglobine tronquée N définissent le potentiel fonctionnel de la protéine et contrôlent la diffusion, la fixation, la stabilisation, l’activation des ligands coordonnées au fer de l’hème et assurent le maintien d’une activité catalytique rapide et efficace. Finalement, nos découvertes suggèrent que l’hémoglobine tronquée N pourrait constituer une nouvelle cible thérapeutique pour le développement éventuel de drogues inhibitrices qui inactiveraient la première ligne de défense du parasite et perturberaient son adaptation métabolique face aux stress oxydatifs. / Mycobacterium tuberculosis infects over one-third of the human population, causing 1.5 millions deaths each year. The increase incidence of infections among immunocompromised patients and the emergence of strains with resistance to multiple antibiotics urge the scientific community to discover new therapeutic targets as well as develop new antibiotics, vaccines and therapies. Among the ~ 4000 genes that compose the genome of Mycobacterium tuberculosis, one of them, glbN, encodes the truncated hemoglobin N. Hemoglobins are small metalloproteins that reversibly bind oxygen and perform a wide array of important catalytic activities. Thus, our research aims at defining a function for Mycobacterium tuberculosis truncated hemoglobin N using modern biochemical techniques and stopped-flow spectroscopy. Our research also leads us to solve the three-dimensional structure of the oxygenated complex of trHbN, characterize the proteins-ligands interactions within the active site of the hemoglobin and define their roles in establishing the functional potential of the enzyme using absorption, resonance Raman and x-rays diffraction spectroscopies. We discovered that the fast and efficient •NO detoxification activity of truncated hemoglobin N measured in Mycobacterium bovis BCG could fulfill a similar role in Mycobacterium tuberculosis and allow the persistence of the tuberculous infection in the host by preventing the cytotoxic effects associated with •NO and its reactive nitrogen derivatives. Moreover, the architecture and polarity of truncated hemoglobin N active site define the functional potential of the protein and control the diffusion, binding, stabilization, and activation of the heme-iron coordinated ligands and ensure the maintenance of a fast and efficient catalytic activity. Finally, our discoveries suggest that truncated hemoglobin N could constitute a new therapeutic target for the development of inhibitors that would inactivate the first line of defence of the parasite and disturb its metabolic adaptation to nitrosative stresses.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les substituts sanguins à base d’hémoglobine (HBOC) en cours de développement et d’évaluation, sont susceptibles, selon leur formulation et le protocole d’évaluation envisagé, d’induire des modifications du comportement des cellules endothéliales (CE). Nous avons développé des protocoles visant à évaluer le rôle de trois paramètres : les contraintes de cisaillement, l’hypoxie et la présence d’HBOC au contact des CE. Plusieurs facteurs, comme le stress oxydatif, la vasomotricité et l’inflammation ont été étudiés par qPCR, RPE, cytométrie en flux et dosage des métabolites. Dans un premier temps, nous avons observé l’action simultanée des contraintes de cisaillement et des HBOC (Hb-Dex-BTC, Oxyglobin®, aa-Hb) sur le comportement des CE. Nos résultats montrent combien le cisaillement influence la réponse des CE en présence d’HBOC. Pour se rapprocher de la situation clinique d’un usage potentiel d’HBOC, nous avons élaboré un protocole d’hypoxie/réoxygénation des CE par ces Hb. Au travers des deux protocoles d’hypoxie développés (brève et chronique), nous avons montré des mécanismes différents de réponse cellulaire : après 4 h, la réoxygénation avec les substituts induit une diminution de l’inflammation engendrée par l’hypoxie. Alors qu’après 24 h, nous constatons son induction quel que soit le substitut utilisé. D’une façon générale, la présence de dextran dans l’Hb-Dex-BTC rend celle-ci plus furtive vis-à-vis des mécanismes de détection de la présence d’Hb par les CE. Dans une dernière partie, nous avons effectué des tests de cytotoxicité sur des Hb de nouvelle génération (PEG-Hb et Hb octamérique produite par génie génétique) par mesure de la viabilité cellulaire et du taux d’apoptose-nécrose, Ces résultats encourageants confirment l’intérêt de poursuivre les évaluations. / Hemoglobin based oxygen carriers (HBOC), under development and evaluation, are potentially able to induce modifications of endothelial cells (EC) behaviour. We developed protocols to evaluate the role of three different parameters, like shear stress, hypoxia and HBOC presence on EC. Several factors, like oxidative stress, vasomotion and inflammation were studied using qPCR, EPR, flow cytometry and metabolites quantification. At first, we observed simultaneously the action of shear stress and HBOC (Dex-BTC Hb, Oxyglobin®, aa-Hb) on EC behaviour. Our results show how shear stress influences EC response face to HBOC. Then, we elaborated a hypoxia/reoxygenation protocol with HBOC. Using two different protocols of hypoxia (brief and chronic) we demonstrated that different mechanisms drive cell response. After 4 h of hypoxia, reoxygénation with blood substitutes induces a diminution of the inflammation engender by hypoxia. However, after 24 h of hypoxia, we observed an over inflammation whatever was the blood substitute used. In conclusion, among the three HBOC tested, we highlighted that the presence of dextran in Dex-BTC-Hb solutions makes Hb furtive for EC Hb detection mechanisms. Finally, we developed cytotoxicity tests on new Hb generation (PEG-Hb, octameric Hb) based on cellular viability and apoptosis-necrosis. These tests were encouraging for both Hb.

L'ennoyage est un phénomène courant qui se répercute sur les végétaux en diminuant leur croissance, leur développement et leur régénération. Il entraîne une forte diminution du taux d'oxygène (hypoxie) dans le compartiment racinaire résultat de l'excès d'eau dans le sol. Face à ce stress, certaines plantes sont capables intensifier leur métabolisme anaérobie et développer des adaptations morphologiques (lenticelles hypertrophiées, aérenchymes, racines adventives). Le chêne sessile (Quercus petraea Matt L.) et le chêne pédonculé (Quercus robur L.) présentent une différence de tolérance à l'ennoyage du sol mais sont génétiquement proches. Cependant, il existe peu de connaissances sur les processus physiologiques mis en place par ces deux espèces durant ce stress. La croissance ainsi que certains changements morphologiques, anatomiques et physiologiques étudiés chez les deux espèces en réponse à un ennoyage, ont confirmé que le chêne sessile était davantage sensible à ce stress. Le chêne pédonculé, espèce plus tolérante, parvient à maintenir son statut hydrique de même que son activité photosynthétique plus longtemps et à des niveaux moins critiques que le sessile. L'hémoglobine non-symbiotique améliore la survie des plantes en conditions d'hypoxie en interagissant avec le monoxyde d'azote (NO). Le clonage d'une hémoglobine non-symbiotique chez le chêne sessile a permis d'isoler le gène QpHb1 codant pour une protéine de 161 acides aminés et présentant toutes les caractéristiques communes aux hémoglobines non-symbiotiques de classe 1. Chez les deux espèces, QpHb1 est davantage exprimé dans les racines que dans la tige ou les feuilles, suggérant un rôle particulier dans ce tissu. L'expression de QpHb1 analysée par Northern blotting a montré une chute d'expression dans les racines dès les premières heures de stress chez le chêne sessile qui se poursuit durant toute la durée de l'expérience (28 jours). Alors que chez le chêne pédonculé, l'expression de QpHb1 suit un schéma plus complexe : on observe un pic d'expression après 1h d'ennoyage suivi d'une forte inhibition après 3h. Cette régulation pourrait être synonyme d'une implication de l'hémoglobine non-symbiotique dans la signalisation rapide du stress et par conséquent dans la mise en place de la tolérance. D'ailleurs sa localisation par hybridation in situ au niveau racinaire a montré que QpHb1 se situait au niveau des cellules du protoderme, pouvant suggérer un rôle dans la détection des modifications de la rhizosphère mais aussi au niveau du protoxylème qui pourrait lui permettre de participer à la signalisation entre l'appareil racinaire et l'appareil aérien via la S-nitrosylation. Dans la réponse à un ennoyage de plusieurs semaines, le chêne pédonculé met en place des adaptations (aérenchymes, lenticelles hypertrophiées et racines adventives) et exprime davantage QpHb1 que le chêne sessile notamment dans les racines adventives. La régulation spatio-temporelle de QpHb1 pourrait être impliquée dans la capacité de tolérance ainsi que dans la cascade de signalisation menant au développement de ces adaptations.

Les hémorphines représentent une classe de peptides cryptiques bioactifs issus de la protéolyse de la chaîne ß de l'hémoglobine dont la présence in vivo a souvent été associée à des conditions physiologiques ou pathologiques particulières, comme les cancers. De ce fait, l'hypothèse d'utiliser ces peptides comme marqueur de pathologies avaient déjà été posé. Des études récentes au laboratoire ont montré que leur concentration sérique des hémorphines était diminuée chez les patients diabétiques. Nous avons travaillé sur une cohorte de 120 patients atteints de diabète de type 1 et 2 et nous avons étudié les différentes hypothèses permettant d'expliquer cette diminution : métabolisme des hémorphines, impact de la glycation de l'hémoglobine sur la libération des peptides. De plus, nous avons cherché à connaître le rôle de LVVH7 dans la signalisation insulinique. Les résultats obtenus suggèrent que la diminution de la concentration sérique des hémorphines de type 7 est spécifique du diabète mais que la glycation de l'hémoglobine n'a pas d'impact sur la libération des hémorphines. Parallèlement à cette étude, nous avons caractérisé les hémorphines de type 7 dans le microenvironnement du cancer broncho-pulmonaire. La cathepsine D, enzyme impliquée dans la libération de LVVH7 et VVH7 ainsi que dans le microenvironnement tumoral, a été étudié dans des cultures de lignées de cancers broncho-pulmonaires acidifiée et donc propice à la progression tumorale. Les résultats ont permis de confirmer la présence de la cathepsine D dans le surnageant de cultures des cellules cancéreuses. De plus, nous avons montré la libération d'hémorphines de type 7 dans des milieux de culture acidifiés.

Les nanomatériaux posent de nouvelles questions en termes de toxicologie humaine et environnementale et représentent une nouvelle interface avec le milieu biologique aux propriétés spécifiques. De nombreuses inconnues demeurent, en particulier à l'échelle moléculaire, pour permettre d'expliquer certains mécanismes de toxicité. Lorsqu'elles entrent en contact avec le milieu biologique, les nanoparticules se couvrent d'une couche de protéines adsorbées. Celle-ci leur confère une nouvelle " identité biologique " qui contrôle la réponse cellulaire et leur devenir au sein de l'organisme. Nous avons étudié l'adsorption de protéines modèles sur la silice nanostructurée. Après avoir caractérisé la silice nanoporeuse et les nanoparticules de silice utilisées, l'adsorption de la myoglobine, de l'hémoglobine et des protéines d'un extrait cellulaire de levure a été étudiée afin de déterminer les paramètres physico-chimiques et thermodynamiques de l'adsorption des protéines sur la silice. Un enrichissement en résidus basiques, regroupés en clusters de charge, favorise l'adsorption des protéines grâce à la formation d'interactions électrostatiques avec la surface chargée de la silice, indépendamment de la charge globale de la protéine. A l'inverse, un enrichissement en résidus aromatiques est défavorable à l'adsorption car ces résidus forment des interactions π-π qui rigidifient la structure de la protéine. L'identification des protéines adsorbées et non adsorbées à partir d'un milieu complexe pourrait également être utilisée pour les études de toxicité cellulaire. A partir de l'étude de la structure, de la dynamique et de l'activité de la myoglobine et de l'hémoglobine adsorbées sur les nanoparticules de silice, nous avons cherché à définir l'état d'une protéine adsorbée. L'étude de la structure, réalisée par dichroïsme circulaire, spectroscopie UV-visible, d'absorption X, infrarouge, fluorescence et microcalorimétrie, montre une perte partielle de structure importante des protéines adsorbées associée à une grande hétérogénéité de conformations, sans modification majeure de la structure de l'hème. Deux sites potentiels d'interaction entre myoglobine et nanoparticules de silice ont été identifiés à l'aide d'une technique de cartographie de surface par irradiation. L'étude de la dynamique de la myoglobine adsorbée par diffusion élastique et inélastique de neutrons a permis de montrer que l'adsorption s'accompagnait d'une diminution importante de la flexibilité de la protéine. Malgré la perte de structure, la metmyoglobine adsorbée conserve une activité de fixation de ligands très proche de celle de la protéine libre. L'hémoglobine adsorbée présente de façon inattendue une augmentation de son affinité pour l'oxygène et une diminution de sa coopérativité, sans dissociation du tétramère. Cet effet est reproductible lors de l'adsorption de l'hémoglobine humaine, de l'hémoglobine pontée DCL et de l'hémoglobine mutée S. Deux effecteurs permettent par ailleurs de moduler l'affinité de l'hémoglobine adsorbée. Aussi importantes soient-elles, les modifications de structure et d'activité observées sont entièrement réversibles après désorption dans des conditions douces. L'adsorption des hémoprotéines sur les nanoparticules de silice représente véritablement un nouveau type de stress avec résilience pour les protéines en termes de relations entre structure, dynamique et activité.