Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2013 / Made available in DSpace on 2013-06-26T01:11:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 316504.pdf: 1547020 bytes, checksum: b34d09659e361589831135b8d5198ea5 (MD5) / A pesquisa por novos compostos biologicamente ativos obtidos a partir de produtos naturais, nos últimos anos, tem sido incentivada em todo o mundo, pois são considerados muito importantes na descoberta de novos fármacos para varias doenças. Diversas estratégias, baseadas em diferentes tipos de observações, juntamente com triagens randomizadas, têm sido usadas na investigação da biodiversidade com o intuito de contribuir para o aumento do arsenal terapêutico anti-herpético. As infecções causadas pelos vírus herpéticos são um grave problema de saúde pública, devido à capacidade dos mesmos de causarem infecções agudas e recorrentes, além do aparecimento de cepas resistentes ao aciclovir, fármaco de primeira escolha disponível. Diante deste quadro, o Laboratório de Virologia Aplicada da UFSC avalia, há vários anos, a atividade antiviral de produtos naturais e sintéticos, tendo encontrado resultados promissores para muitas das amostras testadas. Inicialmente, a citotoxicidade (CC50) e a atividade anti-HSV (CI50) foram avaliadas através do ensaio colorimétrico do MTT e do ensaio de redução do número de placas de lise, respectivamente. De acordo com os resultados obtidos através da triagem dos representantes oriundos da biodiversidade terrestre e marinha, três amostras (a fração rica em trissulfato de halistanol: TSH e os compostos TSH-A e TSH-C) foram selecionadas devido aos seus promissores índices de seletividade (IS= CC50/CI50) de 15,33; 2,46 e 1,95 frente ao HSV-1 (cepa KOS). O mecanismo de ação foi avaliado através de uma sequência de ensaios, que visou avaliar a possível interferência destas amostras nas diversas etapas do ciclo de replicação viral. Na avaliação do tempo de adição, estas amostras inibiram significativamente a replicação viral, quando foram adicionadas simultaneamente ou até 3h pós-infecção. As amostras avaliadas apresentaram atividade virucida e inibiram a entrada dos vírus nas células Vero (adsorção e penetração). A análise da expressão proteica viral por Western blotting mostrou que as amostras TSH-A e TSH-C inibiram a expressão das proteínas ? (ICP27) e ? (gB), em diferentes intensidades e a TSH foi a única amostra que inibiu a expressão de todas as proteínas virais. Ao serem combinadas com o aciclovir, elas também demostraram efeito sinérgico, em concentrações equivalentes a 2x seus valores de CI50. O conjunto destes resultados indica a potencialidade destas amostras como compostos antivirais, mas ainda são necessários estudos mais aprofundados.<br> / Asbtract : The search for new biological active compounds derived from natural products in recent years has been stimulated throughout the world, because they are still considered a very important source to find new medicines against some diseases. Several strategies based in different types of observations and randomized screenings have been used to evaluate the biodiversity in order to increase the number of available anti-herpes drugs. The infections caused by herpesvirus are a serious worldwide public health problem, because these viruses are able to cause acute and persistent infections, besides the emergence of strains resistant to acyclovir, the available drug of choice. In this context, the Laboratory of Applied Virology from UFSC has been evaluating, for several years, the antiviral activity of natural and synthetic products, and found promising results for many of the samples tested. Initially, the cytotoxicity (CC50) and anti-HSV activity (IC50) were assessed by MTT and viral plaque number reduction assays, respectively. According to the results obtained through the anti-HSV screening of different taxons from the terrestrial and marine biodiversity, three samples (fraction rich in halistanol trisulphate: TSH and the compounds TSH-A and TSH-C) were selected due to their promising selectivity indices (SI=CC50/IC50) of 15.33, 2.46 and 1.95 against HSV-1 replication (KOS strain). The mechanism of action was evaluated through different methodological strategies, which aimed to detect the possible interference of these samples at various stages of the viral replication cycle. The evaluation of these samples in the addition time assay showed a significant viral replication inhibition when they were added simultaneously or up to 3h post-infection. These samples were virucidal and also inhibited viral entry into Vero cells (adsorption and penetration). In addition, the analysis of viral protein expression by Western blotting showed that the samples TSH-A and TSH-C inhibited the expression of á (ICP27) and ã (gB) proteins, at different levels of intensity and a TSH was the unique sample who inhibited all virus protein expression. When combined with acyclovir, they also demonstrated synergistic effects at concentrations equivalent to 2x their IC50 values. Taken together, these results indicate the potential of these samples as antiviral compounds, but further studies are needed.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. / Made available in DSpace on 2012-10-21T17:12:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 202341.pdf: 549888 bytes, checksum: c1446e37648bb8bbaffad047c703e965 (MD5) / Os compostos fenólicos (CF) são substâncias presentes numa grande variedade de plantas. Eles podem atuar nos vegetais como antioxidantes, antimicrobianos, fotorreceptores, atraentes visuais e repelentes de predadores. Muitos estudos mostraram que os CF possuem inúmeras

Resumo: O vírus Epstein-Barr (EBV) após primoinfecção, estabelece infecção latente em células B de memória. Além da Mononucleose Infecciosa, esse vírus pode estar ligado a linfomas de Hodgkim e não Hodgkim, doença linfoproliferativa póstransplante (PTLD), linfoma de Burkitt, carcinoma de nasofaringe, carcinoma gástrico e outras neoplasias epiteliais. Diversos estudos foram realizados enfatizando a importância da quantificação da carga viral do EBV no seguimento de doenças associadas ao EBV. O objetivo do presente estudo foi melhorar o monitoramento de receptores de células progenitoras com o esenvolvimento e validação de um teste molecular baseado na técnica de PCR em tempo real. Foi realizado um estudo de coorte prospectivo em 601 amostras de plasma, obtidas de 51 pacientes submetidos ao transplante de células-tronco hematopoiéticas (TCTH) alogênico, durante um período aproximado de um ano. Desse total, 69 amostras foram detectáveis para o EBV. Contudo, apenas treze apresentaram carga iral acima de 1.000 cópias/ml. Esse valor é aceito como preditivo para PTLD, embora não tenha sido possível calcular um cut off na população estudada. Para validação da metodologia, contou-se também com um grupo controle saudável de 60 amostras e um grupo controle patológico com 161 amostras. Padronizou-se um ensaio com limite de detecção de 88 cópias/ml. Os resultados de precisão, especificidade e linearidade mostraram-se dentro do esperado. Os dados clínicos dos pacientes fo am obtidos dos prontuários médicos e analisados pelo programa EPI INFO 3.5.1. As doenças de base mais comuns foram anemia aplástica severa, anemia de Fanconi e leucemia mielóide aguda. Com relação à origem das células-tronco, 78.43% eram oriundas da medula ósssea, 15.69% de cordão umbilical e 5.88% do sangue periférico. Os valores de EBV acima do cut off estimado pertenciam a cinco pacientes diferentes. Todos realizaram transplante do tipo alogênico não aparentado quatro deles eram EBV soronegativos antes do procedimento. Isso mostra a importância do monitoramento da carga viral em indivíduos com fatores de risco significativos. O ensaio mostrou ser uma ferramenta útil, embora questões como valor de cut off preditivo e tipo de amostra ideal ainda precisem ser solucionadas em estudos posteriores.

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Submitted by Leonardo Freitas (leonardo.hfreitas@ufpe.br) on 2015-04-13T15:45:06Z No. of bitstreams: 2 Doutorado Andreza Correia.pdf: 1148277 bytes, checksum: b3db129be431102c71e74ad4d780400c (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-13T15:45:06Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Doutorado Andreza Correia.pdf: 1148277 bytes, checksum: b3db129be431102c71e74ad4d780400c (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2013-08-28 / A mucosite oral (MO) é um efeito colateral frequente decorrente do tratamento antineoplásico, sendo descrita como uma alteração aguda caracterizada por lesões ulcerativas, com presença de um infiltrado inflamatório crônico persistente, eritema e dor. Avaliar a presença do vírus herpes simples (HSV-1/2) em portadores de carcinoma espinocelular na região de cabeça e pescoço (CEC) e a sua influência no agravamento da mucosite oral após tratamento radioterápico ou radio/quimioterápico. Em um estudo de coorte prospectivo foram avaliados 91 pacientes portadores de CEC de cabeça e pescoço, atendidos no Centro de Radioterapia de Pernambuco (CERAPE) do Hospital de Câncer de Pernambuco, no período de abril de 2010 a setembro de 2012. Foi determinado o status sorológico para IgG anti-HSV1/2 antes do tratamento (TI) e para IgM anti-HSV-1/2 antes (TI) e no 30° dia a partir do início do tratamento (TF), utilizando o ensaio imunoenzimático (ELISA) e os resultados correlacionados à intensidade da MO. A amostra foi composta 69 (75,8%) pacientes do gênero masculino e 22 (24,2%) do gênero feminino, com idades variando entre 22 e 86 anos (média de 59,81 ± 13,38 anos). Quarenta e três pacientes (47,3%) foram tratados com radioterapia e 48 pacientes (52,7%) com radio/quimioterapia. A soroprevalência para o IgG anti-HSV-1/2 foi de 97,8% (89/91). A IgM anti-HSV-1/2 (TI) foi positiva em 18,7% (17/91) e IgM anti-HSV-1/2 (TF) em 20,9% (19/91). Todos os pacientes desenvolveram algum grau de mucosite oral, entretanto não houve correlação estatisticamente significante entre a positividade para IgM anti-HSV-1/2 e o grau de severidade da MO, independentemente do tipo de tratamento ao qual o paciente foi submetido. A soroprevalência do IgG anti-HSV-1/2 foi elevada na população estudada entretanto. A reativação viral, evidenciada pela presença de IgM anti-HSV-1/2, não foi associada à severidade da mucosite oral em pacientes portadores de CEC de cabeça e pescoço submetidos a tratamento antineoplásico.

<p>During Herpes Simplex Virus type 1 (HSV-1) infections, many viral proteins are synthesized and several have proven or suspected roles in regulating viral gene expression. To facilitate the study of the individual activity of one such protein, ICP4, the ICP4 gene was cloned in a plasmid vector, and expresser cell lines containing 5-30% of infected cell levels of ICP4 were established. The ICP4 is functional, correctly processed, and located in the cell nuclei. The endogenous ICP4 gene retained its capacity to respond to viral trans-acting factors, since its expression after superinfection with HSV-2 mimicked that of the viral gene. Although cells infected with lCP4 mutant viruses overproduce ICP4 and other immediate-early proteins, cell lines synthesizing a mutant form of ICP4 did not overproduce this protein, suggesting that autoregulation of the lCP4 gene requires more than 30% of the infected cell level of ICP4 or, alternatively, requires the presence of other viral proteins. After superinfection in the presence of an inhibitor of protein synthesis, the endogenous ICP4 is capable of transactivating viral early genes encoding thymidine kinase, lCP6, ICP8, gB, gD, and gE. In contrast, the early gene for the viral alkaline exonuclease, the early-late gene for VP5 and the late genes for p40 and gC, respond poorly or not at all. This demonstrates that most early genes can be induced by ICP4 in the absence of other viral immediate-early proteins, but that early-late and late genes require supplementary factors.</p> / Doctor of Philosophy (PhD)

Herpes simplex viruses 1 and 2 (HSV-1 and HSV-2) infect and establish latency in peripheral neurons, from which they can reactivate to cause recurrent disease throughout the life of the host. Stress is associated with exacerbation of clinical symptoms and induction of recurrences in humans and animal models. The viruses preferentially replicate and establish latency in different subtypes of sensory neurons, as well as in neurons of the autonomic nervous system that are highly responsive to stress hormones. To determine if stress-related hormones modulate productive and latent HSV-1 and HSV-2 infection within sensory and autonomic neurons, we analyzed viral DNA after treatment of primary adult murine neuronal cultures with the stress hormones epinephrine and corticosterone. Both sensory trigeminal (TG) and sympathetic superior cervical ganglia (SCG) neurons expressed adrenergic receptors and glucocorticoid receptor. In productively infected neuronal cultures, epinephrine treatment significantly increased HSV-1 DNA replication and production of viral progeny in SCG neurons, but no significant differences were found in TG neurons. In contrast, corticosterone significantly decreased HSV-2 DNA replication and production of viral progeny in SCG neurons, but not in TG neurons. In quiescently infected neuronal cultures, epinephrine and corticosterone significantly increased HSV-1 reactivation from sympathetic SCG neurons, but not sensory TG neurons. In contrast, corticosterone increased HSV-2 reactivation from both SCG and TG neurons, but epinephrine had no effect. Adrenergic or epinephrine-induced reactivation of HSV-1 in SCG neurons involved activation of several adrenergic receptors, the cyclic AMP response element binding protein (CREB), the transcription factor β-catenin, and the c-Jun N-terminal kinase (JNK). Corticosterone-induced reactivation of HSV-1 in SCG neurons required activation of glucocorticoid receptor (GCR) and transcription factors CREB and JNK. In contrast, corticosterone-induced reactivation of HSV-2 in TG and SCG neurons could utilize either the GCR or mineralocorticoid receptor (MCR) and most likely involves the chromatin remodeling properties of those receptors. Thus, stress-related hormones, epinephrine and corticosterone, selectively modulate productive and quiescent HSV-1 and HSV-2 infections primarily in sympathetic, but not sensory, neurons through different mechanisms. These results have implications for describing a mechanism by which stress-induced reactivation may occur in humans. / Ph. D. / Herpes simplex virus type 1 and 2 (HSV-1 and HSV-2) are major human pathogens, which establish latency in neurons of the peripheral nervous system and reactivate to cause recurrent disease in humans. Physiological stress, which includes the secretion of the stress hormones epinephrine and cortisol, has been associated with increases in severity of clinical signs and increased recurrent disease in humans and animal models of herpetic disease. The mechanism by which physiological stress induces HSV reactivation has been assumed to be through suppression of the immune system. In addition, it has been assumed that sensory neurons harboring latent HSV are the primary source of reactivating virus for recurrent HSV disease. However, my dissertation provides evidence that the stress hormones epinephrine and corticosterone (the rodent equivalent of cortisol) can act on peripheral neurons in which the virus is latent, rather than through immune system suppression. In addition, my dissertation provides evidence that the autonomic nervous system, which modulates the physiological stress response, is an important source of reactivating virus to cause recurrent disease. The molecular pathway by which epinephrine and corticosterone induce HSV reactivation in primary adult murine neurons involves specific receptors, transcription factors, and protein kinases that could potentially be targeted in humans for inhibition of HSV reactivation and prevention of herpetic recurrent disease.

Submitted by Marcos Anselmo (marcos.anselmo@unipampa.edu.br) on 2016-09-22T19:30:32Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) JESSICA BRANDAO REOLON.pdf: 405938 bytes, checksum: 02d1f792d3137ced3fc728e0e11dcb3e (MD5) / Approved for entry into archive by Marcos Anselmo (marcos.anselmo@unipampa.edu.br) on 2016-09-22T19:34:00Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) JESSICA BRANDAO REOLON.pdf: 405938 bytes, checksum: 02d1f792d3137ced3fc728e0e11dcb3e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-22T19:34:01Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) JESSICA BRANDAO REOLON.pdf: 405938 bytes, checksum: 02d1f792d3137ced3fc728e0e11dcb3e (MD5) Previous issue date: 2016 / O herpesvírus simples (HSV) é um importante problema de saúde pública em vários países provocando ulceração genital. Dentre o arsenal terapêutico para o tratamento da infecção por HSV destaca-se o aciclovir (ACV). No entanto, este apresenta limitações no seu uso como um tempo de meia-vida curto e uma baixa solubilidade aquosa. A curcumina (CUR) é um composto natural que vem demonstrando diversas atividades terapêuticas, dentre estas a atividade antiviral, porém o seu uso por via oral também é comprometido pela baixa solubilidade em água. A encapsulação em micropartículas poliméricas (MPs) é uma abordagem farmacotécnica que podem superar as dificuldades do uso terapêutico destes dois compostos. Em vista disto, o presente trabalho visou desenvolver e caracterizar MPs pelo método de aspersão compostas por HPMC e Eudragit® RS100 como materiais poliméricos, além de manitol como adjuvante de secagem. Os resultados demonstraram que o método de preparo por aspersão (spray drying) apresentou um rendimento em torno de 50% para todas as formulações desenvolvidas, mostrando um fluxo tecnológico mais vantajoso para as partículas sem manitol. O doseamento demonstrou teores de 82 a 99% e de 81 a 94%, para ACV e CUR, respectivamente. A análise granulométrica mostrou micropartículas de tamanho micrométrico entre 8,7 e 15,3 μm. A análise morfológica evidenciou o formato esférico e confirmou o resultado das análises de tamanho. A espectroscopia na região do infravermelho mostrou uma sobreposição dos espectros obtidos pelos componentes isolados indicando boa compatibilidade entre os materiais. O perfil de liberação in vitro permitiu observar que as MPs foram capazes de controlar a liberação e melhorar a solubilidade dos compostos, destacando-se, neste quesito, as MPs compostas por HPMC. A avaliação preliminar da atividade antiviral in vitro demonstrou que a associação de ACV e CUR possui um efeito sinérgico frente ao vírus BoVH-1, sendo que as MPs foram capazes de potencializar este efeito. Neste contexto, as MPs mostraram-se sistemas promissores para a veiculação de ACV e CUR por via oral, com elevado potencial para constituir um tratamento alternativo para o herpes viral. / The herpes simplex virus (HSV), also known as human herpes virus, infects humans causing mainly genital and labial ulcerations. Among the drugs available for the treatment of HSV infection the acyclovir (ACV) is an effective antiviral drug. However this drug presents limitations in its use due to the short half-life and low water solubility. Curcumin (CUR) has demonstrated several therapeutic activities, including antiviral activity, but the oral administration of this natural compound is also compromised by low solubility. The polymeric microparticles (MP) are a pharmacotechnical approach that modifies the pharmacokinetics of the compounds and offers a possibility to overcome the difficulties of the therapeutic use. In view of this, this study aimed to develop MPs by spray drying method composed of HPMC and Eudragit® RS100 as polymeric materials, and mannitol as drying material. The results showed a yield around 50% for all developed formulations and a better technological flow rate for the particles without mannitol. The assay showed levels 82-99 and 81% to 94%, to ACV and CUR, respectively. The particle size analysis showed microparticles micrometric size between 8.7 and 15.3 micrometers. Morphological analysis showed the spherical shape and confirmed the results of size analysis. Spectroscopy in the infrared showed an overlap of the spectra obtained by the individual components indicating good compatibility between the materials. The in vitro release profile observed that the PMs were able to control the release and improved the solubility of the compounds, especially when composed of HPMC. Besides, an in vitro preliminary assessment of antiviral activity demonstrated that the combination of ACV and CUR presented a synergistic effect against BoVH-1 virus, and the MPs were able to enhance this effect. The MPs showed to be promising systems for the oral administration of ACV and CUR and could be an improved alternative treatment for viral herpes.

Made available in DSpace on 2014-08-13T14:50:49Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-06-17Bitstream added on 2014-08-13T18:00:23Z : No. of bitstreams: 1 000760131_20150710.pdf: 238404 bytes, checksum: d603c88625d587b452adf4dd0eb7962f (MD5) Bitstreams deleted on 2015-08-03T12:21:13Z: 000760131_20150710.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-03T12:22:26Z : No. of bitstreams: 1 000760131.pdf: 2193129 bytes, checksum: 28172a25b2901b04864665b4d4b50f8b (MD5) / O herpesvírus canino (HVC-1) causa doença infecto-contagiosa que acomete cães em todo o mundo. É considerado o responsável por causar problemas reprodutivos, respiratórios, oculares, alterações neurológicas podendo levar à morte neonatos e adultos imunossuprimidos. Assim, o presente trabalho teve como objetivos isolar o HVC-1 a partir de amostras biológicas, padronizar uma técnica diagnóstica para detecção do herpesvírus canino, verificar a presença de cães infectados no estado de São Paulo e comparar 3 modificações na técnica de diluição limitante em relação à quantificação molecular pela qPCR (quantitative Polymerase Chain Reaction). Para isso, foram coletadas 139 amostras sangue, fragmentos de órgãos de 12 neonatos que foram a óbito e 5 amostras de suabes de secreção genital, de animais provenientes de canis e domicílios. Após a obtenção do DNA das amostras colhidas, foram submetidas à qPCR e snPCR (seminested Polymerase Chain Reaction) para o teste de detecção do HVC-1. Foi encontrada positividade em nove foram amostras de sangue e em fragmentos de órgãos de um animal, as amostras de secreções genitais foram todas negativas. O isolamento viral foi realizado a partir de fragmento de rim. As células infectadas apresentaram efeitos citopáticos compatíveis com as do HVC-1. As amostras positivas foram sequenciadas apresentando identidade de 100% com o HVC-1 (Genbank ™: X75765). As técnicas moleculares para a detecção do agente mostraram-se sensíveis e específicas, tanto a snPCR como a qPCR. Nessas técnicas foi possível detectar até 15,35 cópias/ μL de DNA de amostras de sangue e 1,15 cópias/μg de tecido. O uso de técnicas moleculares possibilitou a detecção de infecções ativas por HVC-1 com ótimo limiar de detecção. No entanto, mais estudos são necessários para conhecer a epidemiologia da infecção do HVC-1 na população canina no Brasil / The canine herpesvirus (CHV-1) causes contagious disease affecting dogs worldwide. It is considered the responsible for cause reproductive problems, respiratory, eyes, neurologic changes may lead to death newborns and immunocompromised adults. Therefore, our study aimed to isolate CHV-1 from biological samples, standardize a diagnostic techniques for the detection of canine herpesvirus, verify the presence of infected dogs in São Paulo state and compare three modifications in the technique of limiting dilution in relation to molecular quantification to qPCR (by quantitative PCR to determine the viral titer). Thus, we collected 139 blood samples, organ´s fragments from 12 neonates death and 5 genital secretions samples with swabs of animals from kennels and households. After obtaining the DNA from samples were accomplished the qPCR (quantitative PCR) and snPCR (seminested PCR) assay for detection of CHV-1. It was found positivity in nine blood sample and organ´s fragments of an animal, the genital secretions samples were all negative. The viral isolation was performed from kidney. The infected cells showed cytopathic effects compatible with the CHV-1. Positive samples were sequenced showed 100% identity with the CHV-1 (Genbank™: X75765). The molecular techniques for detection agent were sensitive and specific, both the snPCR as the qPCR. In these techniques was enabled to detect DNA 15.35 copies/mL of blood samples and 1.15 copies/μg of tissue. The use of molecular techniques allowed the detection active infections of of HCV-1 with optimal detection limit. More studies are needed to understand the infection epidemiology of CHV-1 in the canine population in Brazil

The recent discovery that T cells recognize different sets of herpes simplex virus type 1 and type 2 epitopes from seropositive symptomatic and asymptomatic individuals might lead to a fundamental immunologic advance in vaccine development against herpes infection and diseases. The newly introduced needle-free mucosal (i.e., topical ocular and intravaginal) lipopeptide vaccines provide a novel strategy that might target ocular and genital herpes and possibly provide 'heterologous protection' from HIV-1. Indeed, mucosal self-adjuvanting lipopeptide vaccines are easy to manufacture, simple to characterize, extremely pure, cost-effective, highly immunogenic and safe. In this review, we bring together recent published and unpublished data that illuminates the status of epitope-based herpes vaccine development and present an overview of our recent approach to an 'asymptomatic epitope'-based lipopeptide vaccine.