As hialuronidases de peçonhas animais são capazes de clivar o hialuronan presente na matriz extracelular, facilitando a difusão das toxinas no tecido da vítima. Essas enzimas têm sido negligenciadas, devido à instabilidade enzimática e à baixa concentração na peçonha. Assim, a expressão heteróloga das hialuronidases permite a sua obtenção em quantidades que viabilizam seu estudo estrutural e funcional. Associado a isso, o transcriptoma propicia a identificação de novas toxinas e componentes de baixa proporção na peçonha. Portanto, o presente trabalho realizou o transcriptoma da glândula de peçonha do escorpião Tityus serrulatus e a clonagem e expressão heteróloga da hialuronidase. No transcriptoma foram obtidos 558 ESTs, dos quais 61,8% correspondem às toxinas, dentre elas neurotoxinas com ação em canais iônicos, metaloproteinas, hipotensinas, peptídeos antimicrobianos, dentre outros. Foram também identificadas novas toxinas como o neuropeptídeo e Ts16.1, descritos pela primeira vez para o gênero Tityus. Dentre os transcritos obtidos, foi identificado apenas um clone correspondente ao C-terminal incompleto de uma hialuronidase de T. serrulatus. Consequentemente, foi produzido o gene sintético contendo a sequência da TsHyal-1, obtida em bancos de dados, no vetor de expressão pPICZ?A para expressão heteróloga em P. pastoris. A rTsHyal-1 foi expressa em escala laboratorial em meio não suplementado (BMM) em pH 7,0 durante 96 h da indução com alimentação diária de metanol a 0,75%. A rTsHyal-1 foi produzida na sua forma solúvel e ativa (838,31 UTR/mg) e resultou em um rendimento proteico de 250 mg/L de material expresso. O secretoma do meio de expressão mostrou que além da rTsHyal-1, a P. pastoris também secreta proteínas nativas associadas à ligação do ATP, metabolismo de carboidrato e resposta ao estresse oxidativo. A rTsHyal-1 foi parcialmente purificada em troca catiônica fraca e apresentou atividade específica de 1.097,45 UTR/mg. A rTsHyal-1 apresenta massa molecular de 49,5 kDa e o tratamento com PNGase F seguido da análise por espectrometria de massas (MALDI-TOF) indicou que uma possível N-glicosilação de 4,5 kDa. Adicionalmente, o sequenciamento dos digestos trípticos da enzima realizado no MALDI-TOF e pelo Q-Exactive resultaram em 46,8% de cobertura da sequencia da proteína. A rTsHyal-1 apresenta especificidade pelo substrato hialuronan, seguido da condroitina C, A e B e apresentou atividade ótima em pH 6,0 e a 40°C. Adicionalmente, o ensaio do MTT indicou que a enzima recombinante não apresenta citotoxicidade in vitro. Os resultados obtidos determinaram as melhores condições para a expressão heteróloga da rTsHyal-1, que corresponde à primeira hialuronidase recombinante de escorpião expressa em P. pastoris com atividade enzimática preservada / The venom hyaluronidases of animals are able to cleave hyaluronan present in the extracellular matrix, acting as a spreading factor for the toxins into the tissues of the victim. These enzymes have been neglected due to their instability and low concentration in the venom. Thus, heterologous expression of hyaluronidases permits the obtainment of sufficient amount for structural and functional studies. Moreover, the transcriptome allows the identification of new toxins or components with low proportion in the venom. In this way, this study aimed the construction of the transcriptome of Tityus serrulatus venom gland and cloning/heterologous expression of hyaluronidase. In the transcriptome, 558 ESTs were identified and 61.8% corresponded to toxins, such as neurotoxins with action on ion channels, metalloproteins, hypotensins, antimicrobial peptides, among others. In addition, new toxins were identified, comprising one neuropeptide and Ts16.1, described for the first time to the genus Tityus. Among the obtained transcripts, one identified clone corresponded to an incomplete C-terminal of a hyaluronidase. Consequently, a synthetic gene was synthesized containing the sequence of TsHyal-1 (obtained from databases) in the pPICZ?A vector for heterologous expression in P. pastoris. The rTsHyal-1 was expressed at laboratorial scale in unsupplemented medium (BMM) at pH 7.0 for 96 h, after induction time, with daily feeding of 0.75% methanol. The rTsHyal-1 was produced in soluble and active form (838.31 UTR/mg) and resulted in a protein yield of 0,266 mg/mL in final expressed material. Besides, the secretome of the medium showed that P. pastoris also secretes native proteins bound with ATP, proteins related to carbohydrate metabolism and oxidative stress response. The rTsHyal-1 was partially purified in a weak cation exchange and presented specific activity of 1097.45 UTR/mg. The rTsHyal-1 has molecular mass of 49.5 kDa and the treatment with PNGase F and analysis by mass spectrometry (MALDI-TOF) indicated a potential N-glycosylation of 4.5 kDa. Additionally, the sequencing of tryptic digests performed in the MALDI-TOF and Q-Exactive resulted in 46.8% of protein sequence coverage. The rTsHyal-1 presents substrate specificity for hyaluronan followed by chondroitin C, A and B and showed an optimum activity at pH 6.0 and 40°C. Furthermore, the MTT assay indicated that the recombinant enzyme does not display in vitro cytotoxicity. These results validate the biotechnological process of the heterologous expression of rTsHyal-1. This is the first recombinant hyaluronidase from scorpions expressed in P. pastoris system with enzymatic activity preserved.

A leptospirose é causada por bactérias do gênero Leptospira e constitui um problema de saúde pública mundial, por acometer humanos e animais. Sua patogênese ainda é pouco esclarecida, especialmente quanto aos processos de invasão, adesão e colonização dos hospedeiros. Recentemente, proteínas secretadas por leptospiras foram identificadas por proteômica e análises in silico, algumas das quais apresentam possível envolvimento no desenvolvimento de quadros hemorrágicos, bem como podem ser possíveis antígenos para diagnóstico. Sendo assim, o presente trabalho propôs a clonagem em vetor de expressão heteróloga bacteriano das sequências codificantes das proteínas Sph2, LipA, ColA e LipL32 de L. interrogans sorovar Copenhageni, caracterização funcional das proteínas recombinantes purificadas e estudo do seu potencial uso no diagnóstico para a leptospirose. Essas proteínas foram escolhidas por possivelmente estarem envolvidas na patogênese de leptospiras. Para tanto, as sequências correspondentes aos genes das proteínas foram clonadas nos vetores de expressão em Brevibacillus choshinensis e Escherichia coli. A produção de soro policlonal e técnicas de ELISA, western-blotting e imuno-histoquímica foram realizadas para avaliar a funcionalidade das proteínas recombinantes purificadas. Também foram realizados testes de comprovação e caracterização da atividade enzimática para proteína LipA, que se apresenta como uma provável lipase na análise in silico. Os resultados obtidos mostraram que o sistema de expressão em Brevibacillus foi eficiente na expressão das proteínas, porém com baixo rendimento na purificação das proteínas Sph2, ColA e LipA. A proteína recombinante LipL32 purificada não apresentou diferença na sua atividade antigênica, em relação aos dois sistemas de expressão utilizados. Experimentos de Western - blotting demonstraram a presença de proteína LipA em diferentes sorovares patogênicos de Leptospira spp. A proteína LipA apresentou atividade lipásica sobre ésteres graxos de p-nitrofenil, sendo uma provável lipase euritérmica. Os dados obtidos com a análise de imuno-histoquímica sugerem que esta proteína possa participar dos eventos que levam a lesões na membrana celular no tecido hepático. Resultados de ELISA com soro de pacientes mostraram que as proteínas ColA e Sph2 são potenciais antígenos para diagnóstico da leptospirose. Apenas a proteína ColA apresentou ação hemorrágica na pele de camundongos. Estes resultados indicam que as proteínas LipA, ColA e Sph2 podem estar envolvidas em mecanismos patogênicos na leptospirose. / Leptospirosis is caused by bacteria of the genus Leptospira and it is a public health problem worldwide, for affecting humans and animals. Its pathogenesis is still unclear, especially regarding the processes of invasion, adhesion and colonization of hosts. Recently, proteins secreted by leptospires were identified by proteomics and in silico analyzes, some of which present possible involvement in the development of hemorrhagic conditions, as well they could be possible antigens for the diagnosis. Thus, the present work proposed the cloning into bacterial heterologous expression vectors of the coding sequences of the Sph2, LipA, ColA and LipL32 proteins of L. interrogans serovar Copenhageni, the functional characterization of the purified recombinant proteins and the study of their potential use in the diagnosis for the Leptospirosis. These proteins were chosen because they may be involved in the pathogenesis of leptospires. To that end, the coding sequences were cloned into the expression vectors in Brevibacillus choshinensis and Escherichia coli. The production of polyclonal serum and ELISA, Western-blotting and immunohistochemistry techniques were performed to evaluate the functionality of the purified recombinant proteins. Also, tests were carried out to prove and characterize the enzymatic activity of LipA protein, which presents as a probable lipase in the in silico analysis. The obtained results showed that the expression in the Brevibacillus system was efficient, but with low yield in the purification of Sph2, ColA and LipA proteins. The purified recombinant LipL32 protein showed no difference in its antigenic activity, in relation to the two expression systems used. Western-blotting experiments demonstrated the presence of LipA protein in different pathogenic serovars of Leptospira spp. The LipA protein showed lipase activity on p-nitrophenyl fatty esters, being a probable eurythermic lipase. The data obtained with the immunohistochemical analysis suggest that this protein can participate in the events that lead to cell membrane lesions in the hepatic tissue. ELISA results using serum from patients showed that ColA and Sph2 proteins are potential antigens for the diagnosis of leptospirosis. Only the ColA protein presented hemorrhagic action on the mice skin. These results indicate that LipA, ColA and Sph2 proteins may be involved in pathogenic mechanisms in leptospirosis.

As CDKs 9 e 11 fazem parte da subfamília de CDKs transcricionais, e portanto desempenham papéis de controle na dinâmica atividade de síntese e processamento do RNA mensageiro pela RNA Polimerase II. Devido à sua capacidade de modular individualmente a atividade dos complexos de transcrição da RNAP II, estas quinases assumem uma grande importância para a regulação da expressão gênica em células eucarióticas. Casos de desregulação da atividade de CDKs transcricionais têm sido frequentemente relacionados a diversas patologias humanas graves, incluindo vários tipos de câncer e também a AIDS (em razão do papel essencial desempenhado pela CDK9 na replicação do HIV. O objetivo deste trabalho é a obtenção das CDKs humanas 9 e 11 através da expressão heteróloga em Escherichia coli, buscando o aperfeiçoamento de métodos para produzir estas enzimas em quantidade e pureza suficientes para aplicação em estudos estruturais. A utilização de um sistema bacteriano oferece muitas vantagens práticas, como a simplicidade da técnica, baixo custo, altos níveis de expressão, e elevado rendimento na purificação do produto. No entanto, a obtenção de quinases humanas ativas a partir de E. coli sempre representou um desafio experimental, devido aos problemas comumente associados à expressão heteróloga. Os resultados apresentados aqui demonstram a possibilidade de se obter a CDK9 humana enzimaticamente ativa pelo reenovelamento in vitro da proteína expressa pela bactéria na forma de corpos de inclusão, após etapas de solubilização e purificação em condições desnaturantes. Por outro lado, a CDK11 humana só pôde ser obtida em uma versão encurtada, consistindo apenas no seu domínio quinase, devido à forte inibição que um trecho N-terminal da sequência mostrou exercer sobre a expressão da proteína. Assim, este trabalho fornece exemplos de como é possível superar algumas das adversidades comuns da expressão heteróloga a fim de se obter CDKs humanas ativas empregando o sistema bacteriano. / CDK9 and CDK11 are members of the subfamily of transcriptional CDKs and therefore play central roles in the control of the dynamic activity of messenger RNA synthesis and processing by RNA polymerase II. Because of their ability to individually modulate the activity of RNAP II transcription complexes, these kinases are of great importance for the regulation of gene expression in eukaryotic cells. Several cases of deregulation of the transcriptional CDKs have been linked to important human diseases, including various types of cancer and also AIDS (due to the essential role of CDK9 in HIV replication). The objective of this work is to obtain human CDK9 and CDK11 heterologously expressed in Escherichia coli, seeking improved methods to produce these enzymes in quantity and purity suitable for structural studies. A bacterial system offers many practical advantages to protein production, such as technical simplicity, low costs, high levels of expression and high purification yield. However, it has always been an experimental challenge to obtain active human kinases from E. coli, because of the problems commonly associated with heterologous expression. The results presented here demonstrate the possibility of obtaining the enzymatically active human CDK9 by in vitro refolding of the protein expressed as bacterial inclusion bodies, after its solubilization and purification under denaturing conditions. Human CDK11, on the other hand, could only be obtained in a shortened form consisting just of its kinase domain, due to the strong inhibition that an N-terminal stretch exerts on the protein\'s own expression. Therefore, this work provides examples of how it is possible to overcome some of the common adversities of heterologous expression in order to obtain active human CDKs through the bacterial system.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2017-04-04T11:57:30Z No. of bitstreams: 1 leticiastephantavares.pdf: 1145142 bytes, checksum: 8dd69d31541451cdce69de313d2a2aa6 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2017-04-04T15:35:32Z (GMT) No. of bitstreams: 1 leticiastephantavares.pdf: 1145142 bytes, checksum: 8dd69d31541451cdce69de313d2a2aa6 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-04T15:35:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 leticiastephantavares.pdf: 1145142 bytes, checksum: 8dd69d31541451cdce69de313d2a2aa6 (MD5) Previous issue date: 2009-03-12 / A busca por novos antibióticos de amplo espectro de ação tem aumentado nas últimas décadas devido ao número crescente de bactérias resistentes aos antibióticos convencionais. O peptídeo recombinante Pg-AMP1, expresso em um sistema heterólogo em Escherichia coli, apresentou atividade antibacteriana contra linhagens Gram-positivas e Gram-negativas. A partir da seqüência de aminoácidos do peptídeo isolado de sementes de goiaba (Psidium guajava L.) o gene correspondente ao peptídeo foi modificado utilizando-se o códon preferencial para expressão em E. coli e construído um vetor de expressão. Uma região codificadora para cauda de histidina foi fusionada ao gene pg-amp1 permitindo a purificação por cromatografia de afinidade com íons de níquel imobilizados em coluna de sefarose. Utilizando SDS-PAGE e análise in sílico identificamos a massa molecular do PgAMP1 recombinante de 7,368 kDa e pI 8.93. O peptídeo recombinante foi expresso principalmente na forma insolúvel, agregando-se em corpos de inclusão que foram tratados com agentes desnaturantes obtendo o peptídeo solúvel. Após a purificação pela coluna de níquel obtivemos um rendimento de 13 mg por litro de meio de cultura. O peptídeo Pg-AMP1 recombinante apresentou atividade contra as bactérias Gram-negativas Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa e contra as Grampositivas Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermides. O peptídeo recombinante Pg-AMP1 não mostrou atividade contra os fungos fitopatogênicos testados. Devido a sua ação contra estas cepas de bactérias patogênicas humanas, o Pg-AMP1 recombinante torna-se um promissor antimicrobiano a ser utilizado no desenvolvimento de novos antibióticos contra cepas resistentes aos fármacos comumente usados. / The search for new antibiotics of broad spectrum of activity has increased in recent decades due to the increasing number of bacteria resistant to conventional antibiotics. The Pg-AMP1 recombinant peptide expressed in a heterologous system in Escherichia coli, strains showed antibacterial activity against Gram-positive and Gram-negative. From the sequence of amino acid peptide isolated from the seeds of guava (Psidium guajava L.) peptide corresponding to the gene was modified using the preferred codon for expression in E. coli and constructed a vector for expression. A region coding for the histidine tail was merged the gene-pg amp1 allowing purification by affinity chromatography with nickel ions immobilized on the column sepharose. Using SDS-PAGE and in silico analysis identified the molecular weight of Pg-AMP1 recombinant with 7.368 kDa and pI 8.93. The recombinant peptide was expressed mostly as insoluble form, adding up in inclusion bodies, which were treated with denaturants agents to solubilize the peptide. The purification of peptide by nickel sepharose column yielded 13 mg per liter of culture medium. The Pg-AMP1 recombinant peptide showed activity against Gram-negative bacteria Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa and against gram-positive Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis. The recombinant peptide Pg-AMP1 showed no activity against the phytopathogenic fungi tested. Due to its action against these strains of human pathogenic bacteria, the recombinant Pg-AMP1 is a promising antimicrobial for use in developing new antibiotics against strains resistant to commonly used drugs.

Orientadores: Francisco Maugeri Filho, Gonçalo Amarante Guimarães Pereira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-25T00:15:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Andrade_CristianeContePaimde_D.pdf: 8118229 bytes, checksum: e37327c8c0a8a32ecfc89552e46cbd0d (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Xilanases são enzimas que hidrolisam as ligações glicosídicas entre as unidades de xilose que compõem a xilana, o principal constituinte hemicelulósico. Devido à grande disponibilidade desse tipo de material na natureza, as xilanases podem ser empregadas em diversos ramos, como nas indústrias têxtil, de alimentos e de rações, na bioconversão de resíduos lignocelulósicos, no clareamento de papel e polpa, e no tratamento de resíduos. Visando descrever novas enzimas para futuras aplicações, este trabalho teve como objetivo purificar e caracterizar a xilanase produzida pelo basidiomiceto Cryptococcus sp. LEB-AY10, uma levedura previamente isolada da Mata Atlântica e selecionada pela produção de enzima termoestável. Para tanto, o micro-organismo foi inicialmente identificado em nível de espécie e depositado como C. flavescens LEB-AY10 (CCT 7725); em sequência, foi estudada a produção da enzima utilizando, como substrato, bagaço de cana-de-açúcar, pré-tratado por explosão a vapor em três diferentes condições, bem como suas respectivas frações solúveis, e suplementados com melaço ou componentes sintéticos. Tendo sido definida a metodologia de tratamento do bagaço, técnicas de planejamento experimental foram utilizadas para estudar a influência das variáveis de cultivo e aumentar a atividade da xilanase produzida. Nas condições otimizadas, obteve-se aumento de 5,6 vezes na atividade em relação aos testes iniciais, atingindo 4,67 U/mL (a 50°C) ou 8,33 U/mL (a 80°C) em 96 h de incubação. Posteriormente, realizou-se a purificação da xilanase em duas etapas cromatográficas (troca iônica e permeação em gel), sendo possível recuperar 45% da atividade inicial. A massa molecular média foi estimada em 48 kDa. A enzima apresentou atividade ótima a 77,5°C e maior estabilidade em pH próximo a 5,3. Neste pH, as meias-vidas desta enzima foram estimadas em 9,2 minutos a 77,5°C e 33,74 h a 67°C. Os parâmetros cinéticos Km e vmax utilizando xilana de bétula (birchwood) como substrato foram 4,13 g/L e 2,32 U/mL, respectivamente. A xilanase purificada apresentou baixas atividades de ?-xilosidase em 4-nitrofenil-?-D-xilopiranosídeo (0,02 U/mg) e de celulase em carboximetilcelulose (0,99 U/mg). Os produtos de hidrólise da xilana de faia (beechwood) pela xilanase de C. flavescens LEB-AY10 foram, principalmente, xilobiose e xilotriose. Para identificação do gene responsável pela produção da xilanase, foram utilizadas três estratégias: amplificação com primers degenerados, identificação de peptídeos por espectrometria de massas e sequenciamento do genoma da levedura. Um único gene (1265 pb) denominado Xyn10Cf foi identificado e o correspondente cDNA (1035 pb) foi clonado em Escherichia coli DH10B. O gene é interrompido por 6 íntrons, codifica um peptídeo sinal composto por 13 aminoácidos e a proteína madura é formada por 331 aminoácidos, tendo sua massa molecular estimada em 37,1 kDa (podendo conter cerca de 11 kDa de glicosilação). Com base na sequência de nucleotídeos e na caracterização da enzima purificada, a proteína foi classificada como membro da família GH10. Por fim, para comprovar a funcionalidade do gene identificado Xyn10Cf foi realizada a expressão na linhagem de Pichia pastoris GS115 sob o controle dos promotores álcool oxidase 1 (AOX1) ou gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH), atingindo 5,66 U/mL e 7,67 U/mL, respectivamente, para 84 h de indução em frascos agitados / Abstract: Xylanases are enzymes that hydrolyze the glycosidic bonds between the xylose units of xylan, the main hemicellulosic compound. Due to the high availability in nature of this kind of material, the xylanases may be used in a wide range of industrial plants, including: textile, food and feed industries, bioconversion of lignocellulosic wastes, biobleaching of paper and pulp, and waste treatment. In order to describe novel enzymes for future applications, the goal of this work is to purify and characterize the xylanase produced by the basidiomycete Cryptococcus sp. LEB-AY10, a yeast previously isolated in the Atlantic Forest and selected by the production of a thermostable enzyme. First, the microorganism was identified at the species level and deposited as C. flavescens LEB-AY10 (CCT 7725); then, enzyme production was studied using the substrate sugarcane bagasse, pretreated by steam explosion in three different conditions, as well their corresponding soluble fractions, and supplemented with molasses or synthetic compounds. After selection of the treatment, experimental design techniques were used to assess the influence of cultivation variables and to increase the activity of produced xylanase. At optimized conditions, it was possible to increase activity by 5.6 times from initial assays, reaching 4.67 U/mL (at 50°C) or 8.33 U/mL (at 80°C) after 96 h of incubation. Later, the purification of the xylanase was performed in two chromatographic steps (ion exchange and gel permeation), in which it was possible to recover 45% of initial activity. The average molecular weight was estimated at 48 kDa. The enzyme showed optimal activity at 77.5°C and it was most stable at pH values near 5.3. At this pH, the half-lives of this enzyme were 9.2 min at 77.5°C and 33.74 h at 67°C. The kinetic parameters Km and vmax for Birchwood xylan were 4.13 g/L and 2.32 U/mL, respectively. The purified xylanase showed low activity of ?-xylosidase on 4-nitrophenyl-?-D-xilopiranosídeo (0.02 U/mg) and also showed some cellulase activity on carboxymethylcellulose (0.99 U/mg). The hydrolysis products of Beechwood xylan by the xylanase from C. flavescens LEB-AY10 were mainly xylobiose and xylotriose. For identification of the gene responsible for xylanase production, three strategies were used: amplification of degenerated primers, identification of peptides by mass spectrometry and yeast genome sequencing. A single gene (1265 pb) named Xyn10Cf was identified and the corresponding cDNA (1035 pb) was cloned into Escherichia coli DH10B. The gene is interrupted by 6 introns, it codifies a signal peptide of 13 amino acids and the mature protein is composed by 331 amino acids, with an estimated molecular mass of 37.1 kDa (it may contain around 11 kDa of glycosilation). Based on nucleotide sequencing and on characterization of the purified enzyme, the protein was classified as a member of GH10 family. Finally, to prove the functionality of the identified gene Xyn10Cf, the expression in Pichia pastoris GS115 strain was performed under the control of alcohol oxidase 1 (AOX1) and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) promoters, reaching 5.66 U/mL and 7.67 U/mL, respectively, after 84 h of incubation in shaker flasks / Doutorado / Engenharia de Alimentos / Doutora em Engenharia de Alimentos

Orientador: Marcelo Brocchi / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-20T14:46:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Milanez_GuilhermePaier_M.pdf: 1651986 bytes, checksum: 4681c88f937b4fe6f4d915fce0eb3f20 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A Salmonelose e a malária são duas doenças infecciosas negligenciadas de grande prevalência no mundo, mas acometendo particularmente populações humanas que vivem em regiões e países subdesenvolvidos ou em desenvolvimento. Apesar dos esforços ainda não existem formulações vacinais totalmente efetivas no controle destas enfermidades. Desta forma, nosso grupo tem buscado aprimorar a expressão do Domínio M2 do antígeno MAEBL de Plasmodium yoelii, que apresenta similaridade com a proteína de Plasmodium falciparum, em linhagens de Salmonella enterica Typhimurium, atenuadas para virulência. Em estudos prévios constatou-se que a expressão em níveis baixos não seria suficiente para a indução de uma resposta imune protetora. Com isso, ficou clara a necessidade de se aprimorar os níveis de expressão deste antígeno nas linhagens a serem testadas. Para tanto, o vetor de expressão anteriormente utilizado foi modificado, os codons da seqüência a ser expressa foram otimizados para expressão em salmonela e um sinal de secreção periplasmática foi adicionado no início da seqüência a ser expressa. Adicionalmente, modificamos novas linhagens atenuadas de S. enterica desenvolvidas por nosso grupo de tal forma a utiliza-las na expressão de antígenos heterólogos, empregando um sistema letal balanceado (Asd) de estabilização da expressão gênica. Apesar do sucesso na construção dos novos vetores, e da otimização de codons para a expressão, constatamos um possível efeito deletério do domínio M2 quando expresso em grande quantidade, o que impossibilitou a obtenção de algumas construções planejadas. Entretanto, os resultados obtidos na estabilização de plasmídios em novas linhagens vacinais significam um avanço no teste e uso de tais linhagens no desenvolvimento de vacinas multifatoriais / Abstract: Salmonellosis and malaria are two infectious diseases of high prevalence in the world, particularly affecting human populations living in underdeveloped regions and countries or developing countries. Despite several efforts, there is not a vaccinal formulation totally effective to control these diseases. This way, our group has sought to enhance the expression of M2 MAEBL's antigen Domain of Plasmodium yoelii, which is quite similar to same protein of P. falciparum, in attenuated strains of Salmonella enterica Typhimurium. In previous studies we found that the expression at low levels was not sufficient to induce a protective immune response. Thus, there was a clear need to improve M2 expression levels in the new strains to be tested. The expression vector previously used was modified, the m2 sequence was codon-optimized for expression in Salmonella, and a periplasmic secretion signal was added at the beginning of the sequence to be expressed. Additionally, new attenuated S. enterica strains developed by our group were modified in a way to use them in the expression of heterologous antigens, employing a balanced lethal system (ASD) for expression plasmid stabilization. Despite of the new vectors successfully built as well as codon optimization for m2 expression, we found a possible deleterious effect of the M2 domain when expressed in large quantities, making it impossible to obtain some planned constructs. However, the results obtained on stabilization of expression vectors in the new vaccine strains are an important advance for the use of such strains as multifactorial vaccines / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Made available in DSpace on 2014-06-12T18:04:40Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo6203_1.pdf: 1326366 bytes, checksum: 5cd77ce2de56aff15acaf6fb51f8cd1f (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2007 / Os papilomavírus constituem um grupo de pequenos vírus de DNA de dupla fita caracterizados por induzirem a formação de lesões que são em geral benignas, podendo regredir naturalmente ou se transformar em tumores malignos. Dentre eles se encontra o papilomavírus bovino (BPV). Até o momento são bem caracterizados seis diferentes tipos de BPV (BPV de 1-6) e recentemente outros dois novos tipos (BPVs 7 e 8) foram descritos. Na região Nordeste do Brasil, em especial no Estado de Pernambuco (região da Zona da Mata), a incidência de papilomatose bovina é muito alta provocando grandes perdas econômicas para os criadores. No momento não há tratamento com eficácia comprovada. A proteção contra infecção é conferida por anticorpos neutralizantes direcionados proteína estrutural L1. Estes anticorpos podem ser eficientemente induzidos por imunização com virus-like particles (VLP), que se formam espontaneamente após a expressão de L1 em vetores recombinantes. A levedura metilotrófica Pichia pastoris emergiu como um sistema heterólogo, eficiente e de baixo custo para a produção de proteínas. Neste trabalho foi avaliada a produção da proteína L1 de BPV-4 por células de P. pastoris. O gene L1 foi amplificado e clonado no vetor de expressão pPICZA (Invitrogen). As células de P. pastoris foram transformadas com pPICZAL1B4. Os transformantes de P. pastoris obtidos foram analisados para expressão do gene L1 por RT-PCR e Dot blot. Os transformantes analisados mostraram transcrição do gene L1 e conseqüente produção da proteína

Orientador: Luciana Gonzaga de Oliveira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química / Made available in DSpace on 2018-08-22T05:28:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rampasio_RaquelRodrigues_M.pdf: 2052024 bytes, checksum: 07f4cd2fcba87af264e6efceab06d527 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Epóxidos enantiopuros e dióis vicinais têm sido utilizados na síntese de inúeras moléculas bioativas. Dessa forma, as epóxido-hidrolases microbianas capazes de hidrolisar enantioseletivamente epóxidos racêmicos emergiram como uma alternativa promissora na obtenção destes compostos. Recentemente, a linhagem P. stipitis CCT 2617 foi selecionada por apresentar atividade hidrolítica frente a epóxidos terminais e teve seu genoma completo publicado. Assim, esta levedura foi selecionada para o trabalho de clonagem e expressão de sua epóxido hidrolase. Neste trabalho, a clonagem do gene SEH1, que codifica para a epóxido hidrolase de P. stipitis, foi efetuada com sucesso em P. pastoris, tanto no vetor pPICZa A, quanto no vetor pPICZ B. A clonagem da proteína com a cauda de histidina deve auxiliar na detecção da expressão. A detecção de uma banda, referente a uma proteína de 46 kDa, no gel de eletroforese foi um indício de que a expressão da enzima SEH (contendo o fator a) ocorreu, porém, não conseguimos reproduzir este resultado posteriormente. Além disso, buscamos melhores alternativas para a detecção da atividade enzimática, como o teste de adrenalina e o ensaio baseado em substrato fluorogênico, que devem ser aperfeiçoados para a utilização com células íntegras. A modelagem computacional da estrutura tridimensional da PSEH resultou em um modelo contendo 40% de hélices a e 12% de folhas b. Determinamos que os resíduos que devem fazer parte do sítio ativo são Tyr319, Asp209, Asp352 e His383 e, tendo em vista que a PSEH deve se apresentar na forma de um homodímero com sítio ativo similar ao das EHs de P. aeruginosa, A. radiobacter e A. niger, nossa hipótese é que esta enzima deve hidrolisar epóxidos pouco volumosos e aromáticos com algum nível de enantiosseletividade / Abstract: Enantiopure epoxides and vicinal diols have been used to prepare a number of bioactive molecules. Thus, the microbial epoxide hydrolases able to enantioselectivity hydrolyze racemic epoxides emerged as a promising alternative in the synthesis of these compounds. Recently, the P. stipitis CCT2617 strain was selected due to the presence of hydrolytic activity against terminal epoxides and had its genome completely described. Therefore, this yeast was selected for cloning and expression of the gene SEH1, which was annoted as epoxide hydrolase. In this work, the cloning of SEH1 gene, codifying for the epoxide hydrolase of P. stipitis, was done with success in P. pastoris, both in pPICZa A and pPICZ B vectors. The cloning of the protein with a histidine tag should help in the detection of expression. The detection of a protein with 46 kDa evidenced that the expression of SEH enzyme (containing the a factor) is occurring, however, this result was not reproducible due to the sample degradation. Furthermore, better alternatives for the detection of enzyme activity were performed, as adrenaline test and fluorogenic assay, which must be optimized for application with whole cells. The 3D structure computational modeling of PSEH resulted in a model that contains 40% of a helices and 12% of b sheets. Our hypothesis is that the residues that make part of the active site are Tyr319, Asp209, Asp352 and His 383. And, considering that the PSEH should be in the homodimeric form with an active site similar to that of the EHs of P. aeruginosa, A. radiobacter and A. niger, this enzyme should hydrolyze small and aromatic epoxides probably with some enantioselectivity / Mestrado / Quimica Organica / Mestre em Química

Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2017-07-12T15:56:43Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) Dissertação_Anna_Jessica_PPGG.pdf: 2035458 bytes, checksum: 6a4bc578c9eaea104302f33af03c3f21 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-12T15:56:43Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) Dissertação_Anna_Jessica_PPGG.pdf: 2035458 bytes, checksum: 6a4bc578c9eaea104302f33af03c3f21 (MD5) Previous issue date: 2016-03-04 / CNPQ / A infecção pelo Papilomavírus Humano, além de representar uma doença sexualmente transmissível altamente disseminada, é responsável por 5% dos cânceres em humanos, destacando o câncer cervical com altos índices de incidência e mortalidade. Embora comprovadamente eficazes, as vacinas vigentes não combatem infecções já estabelecidas e apresentam um elevado custo de produção. Esse cenário revela a necessidade de estratégias vacinais alternativas. O presente trabalho propõe a expressão de diferentes genes recombinantes em Escherichia coli, uma plataforma biotecnológica econômica, de fácil manipulação e de alto rendimento. Os genes recombinantes utilizados foram: L1 de HPV16 e construções quiméricas basedas na substituição de epítopos da oncoproteína E5 na alça h4 e na região C-terminal de L1, com potencial para geração de antígenos profiláticoterapêuticos e na substituição de epítopos da proteína L2 na região da alça h4 para avaliação de possível neutralização cruzada. Após subclonagem em pGEM-T, esses genes foram clonados em vetor de expressão pAE e linhagens de Escherichia coli BL21 e Rosetta foram transformadas com os vetores de expressão gerados. A confirmação da produção das proteínas se deu por Western blot, a partir de extratos de culturas induzidas com IPTG. Otimizações nos protocolos de indução, lise e preparo das amostras foram realizadas ao longo dos experimentos. Os resultados obtidos demonstraram a produção dos antígenos recombinantes, e deverão ser validados em futuros ensaios imunológicos quanto à capacidade de induzir respostas imunes em animais desafiados. / Human papillomavirus infection, besides to represent a widespread sexually transmitted disease, is responsible for 5% of cancers in humans, highlighting cervical cancer with high rates of incidence and mortality. Although proven effective, the existing vaccines do not eliminate infections already established and have a high cost of production. This scenario shows the need for alternative vaccine strategies. This study proposes the expression of different recombinant genes in Escherichia coli, an economic, easy handling and high performance biotechnology platform. Recombinant genes used were: L1 of HPV16 and chimeric basedas constructions in replacement E5 oncoprotein epitopes on h4 loop and L1 C-terminal region, with the potential to generate prophylactic-therapeutic antigens and replacing L2 protein epitopes in loop region h4 for evaluation of possible cross-neutralization. After subcloning in pGEM-T, these genes were cloned into vector pAE expression and Escherichia coli BL21 and Rosetta were transformed with the expression vectors generated. Confirmation of protein production was performed by Western blot from extracts of cultures induced with IPTG. Optimizations in the induction protocols, lysis and preparation of the samples were carried out throughout the experiments. The results demonstrated the production of recombinant antigens and should be validated in future immunological assays for the ability to induce immune responses in challenged animals.

As hidrolases, principalmente as peptidases e lipases, são responsáveis pelo alto faturamento no mercado mundial e pelos diversos empregos industriais e biotecnológicos. A obtenção destas proteínas ocorre pela aplicação dos microrganismos a bioprocessos, tanto de forma selvagem quanto por expressão heteróloga. Neste contexto, existe uma busca incessante por enzimas mais estáveis e com maior atividade catalítica, e algumas técnicas têm sido utilizadas para o melhoramento destes parâmetros. A obtenção da peptidase e lipase pelo fungo Fusarium oxysporum foi realizada por bioprocesso submerso, gerando picos de 165 U/mL em 72 horas e 633 U/mL em 48 horas, respectivamente. A peptidase foi purificada utilizando a resina Sephadex G-50 de exclusão de massa e caracterizada utilizando um substrato peptídico com supressão intramolecular de fluorescência. A classe da proteína foi determinada como serino peptidase e demonstrou características neutra e estável quanto ao pH em uma faixa ampla. A temperatura ótima foi de e 50 °C e a partir dos ensaios de estabilidade térmica foi evidenciado a manutenção da atividade proteolítica de 60-90% até 60 °C no período de uma hora. Quanto à eficiência catalítica, os subsítios S1, S2 e S\'1 tem certa especificidade, pois não demonstram eficiência catalítica quando há a presença dos seguintes aminoácidos nas respectivas posições dos substratos P1 (ácido aspártico, prolina e isoleucina), P2 (ácido aspártico, histidina, lisina, asparagina e triptofano) e P\'1 (ácido aspártico, ácido glutâmico e prolina), ao contrário dos subsítios S3, S\'2 e S\'3, onde todos aminoácidos apresentaram eficiência catalítica. A lipase foi purificada utilizado resina iônica e apresentou características básica e estabilidade em pH neutro, sua temperatura ótima foi de 35 °C e manutenção da atividade catalítica em pelo mens 50% após 1 hora de exposição a 25 a 40 °C. A produção da quimera deu-se pela busca de uma peptidase e uma lipase provenientes do fungo F. oxysporum no banco de dados, elas foram então fusionadas utilizando um linker composto por cinco aminoácidos (GGAGG) nas regiões C-terminal da peptidase e N-terminal da lipase. Ambas atividades foram detectadas na quimera, tornando-a funcional. A aplicação biotecnológica de ambas enzimas selvagens e recombinante é um passo importante para inovação, e de acordo com as características apresentadas cada enzima pode ser aplicada a diversos processos industriais, desde detergentes a biorremediação / proteins is wild-type microorganisms by bioprocesses or by heterologous expression. In this context, there is an incessant search for more stable enzymes with higher catalytic activity, and some techniques have been used to improve these parameters. Obtainment of peptidase and lipase by the fungus Fusarium oxysporum was performed by submerged bioprocess, generating peaks of 165 U / mL in 72 hours and 633 U / mL in 48 hours, respectively. Peptidase was purified using the Sephadex G-50 size exclusion resin and characterized using a peptide substrate with intramolecular fluorescence suppression. The enzyme class was determined as serine peptidase and demonstrated neutral and stable characteristics in a wide range of pH. The optimum temperature was 50 ° C and the thermal stability assays showed the maintenance of the proteolytic activity from 60 to 90% up to 60 ° C within one hour of exposure. As for catalytic efficiency, the S1, S2 and S\'1 subsites have a certain specificity, since they do not demonstrate catalytic efficiency when the following amino acids are present in the respective positions of the substrates P1 (aspartic acid, proline and isoleucine), P2 (aspartic acid, Histidine, lysine, asparagine and tryptophan) and P\'1 (aspartic acid, glutamic acid and proline), unlike subsites S3, S\'2 and S\'3, where all amino acids showed catalytic efficiency. The lipase was purified using ionic resin and presented basic characteristics and stability at neutral pH, its optimum temperature was 35 ° C and maintenance of the catalytic activity by 50% after 1 hour of exposure at 25 to 40 ° C. Production of the chimera was done by the search of a peptidase and a lipase from the fungus F. oxysporum in the database, they were then fused using a linker composed of five amino acids (GGAGG) in the C-terminal regions of the peptidase and N- Terminal portion of the lipase. Both activities were detected in the chimera, making it functional. The biotechnological application of both wild and recombinant enzymes is an important step for innovation, and according to the characteristics presented each enzyme can be applied to several industrial processes.