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Clonagem, expressão e caracterização do fator estimulador de colônia de granulócito humano recombinante (rhG-CSF) em Escherichia coli / Cloning, expression and characterization of the colonystimulating factor recombinant human granulocyte (rhG-CSF) in Escherichia coliCarmo, Fillipe Luiz Rosa do 03 September 2014 (has links)
O sistema de expressão em Escherichia coli foi o primeiro a ser utilizado para produzir produtos farmacêuticos recombinantes e tem muitas vantagens quando comparado com sistemas eucarióticos, como o fácil cultivo, baixo custo e alto potencial de produção. O fator estimulador de colônias de granulócito (G-CSF) atua principalmente promovendo a maturação dos neutrófilos e estimulando sua atividade fagocítica e quimiotática, além de estar envolvido com o processo de segmentação nuclear dessas células. O fator estimulador de colônias de granulócitos humano recombinante (rhG-CSF) tem sido produzido por engenharia genética em Escherichia coli, e é usado no tratamento de diversas patologias, sobretudo em neutropenias provocadas pela quimioterapia usada no tratamento de tumores, pela radioterapia e pelo uso de drogas que suprimem a produção de células mieloides. Desse modo, o presente estudo teve como objetivo a expressão da proteína rhGCSF em bactérias Escherichia coli. A clonagem do gene rhG-CSF no vetor de expressão pET-28a(+) foi realizada nos sítios de restrição das enzimas EcoRI e XhoI, e a expressão da proteína recombinante em cepas de bactéria Escherichia coli BL21DE3 foi obtida com sucesso. A proteína rhG-CSF, fundida à cauda de seis histidinas, foi purificada com êxito e identificada pelas técnicas de Western Blotting e por espectrometria de massas. São necessários estudos para avaliar a integridade estrutural e atividade biológica da proteína produzida, que se confirmada, possibilita que esta seja produzida em escala piloto. / The expression system in Escherichia coli was the first to be used to produce recombinant pharmaceuticals and has many advantages compared to eukaryotic systems, such as easy cultivation and high production potential at low costs. The granulocyte colony (G-CSF) stimulating factor acts primarily by promoting the maturation of neutrophils and stimulating their phagocytic and chemotactic activity. G-CSF is also involved with the process of neutrophils nuclear segmentation. The recombinant human granulocyte colonies stimulating factor (rhG-CSF) has been produced by genetic engineering in Escherichia coli, and it is used to treat of several conditions, especially neutropenia caused by chemotherapy used in the treatment of tumors, by radiotherapy and by the use of drugs that suppress the production of myeloid cells. The present study aimed the expression of rhG-CSF protein in Escherichia coli bacteria. The cloning of rhG-CSF gene in the expression vector pET- 28a (+) was carried out on the restriction sites of the EcoRI and XhoI enzymes. Expression of the recombinant protein in Escherichia coli BL21DE3 was successfully achieved. The rhG-CSF protein, fused with a six histidine tag, was obtained and successfully purified and identified by the Western Blotting and by mass spectrometry techniques. Studies are needed to assess the structural integrity and biological activity of the protein produced, which, if confirmed, enables the production on a pilot scale.
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Aspectos jurídicos da inseminação artificial heteróloga / Legal aspects of the heterologue artificial inseminationBarros, Eliane Oliveira 31 October 2007 (has links)
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Previous issue date: 2007-10-31 / The present article deals with the subject related to the Legal aspects of the
heterologue artificial insemination .
The objective of the study was to analyze the main problems related to this kind of
attended reproduction, among them: the probable users of this technique; to
discuss the possibility of attribution of the paternity results of the permission given
by the husband to the wife or by one companion to the other so that she submits
herself to therapeutical procedure; to consider if the child born through the use of
this technique can have access to the identity of the donator; to know if the donator
can be considered the father of the child.
The study is justified due to the scarce normative treatment given to the subject by
the Civil Code.
The article used method of qualitative bibliographical research. It had been
examined some works of reference that had best dealt with the subject among
available ones / A presente dissertação trata do tema relacionado aos Aspectos jurídicos da
inseminação artificial heteróloga .
Os objetivos da dissertação foram o de analisar os principais problemas
relacionados a este tipo de reprodução assistida, entre eles: os prováveis
destinatários dessa técnica; se a atribuição da paternidade pode decorrer do
consentimento dado pelo marido ou convivente para que a mulher ou a
companheira submeta-se ao procedimento terapêutico; se o nascido pela
utilização desta técnica pode obter dados que revelem a identidade do doador;
se o doador pode ser considerado o pai da criança.
Justifica-se o estudo diante do escasso tratamento normativo dado ao tema
pelo Código Civil.
A dissertação obedeceu método de pesquisa bibliografica qualitativa. Foram
examinadas algumas obras de referência que melhor trataram do assunto e
que se encontravam disponíveis
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Expressão heteróloga e caracterização bioquímica de uma xilooligossacarídeo oxidase de Thielavia terrestris pertencente à família AA7 / Heterologous expression and biochemical characterization of a xylooligosaccharide oxidase from Thielavia terrestris belonging to AA7 familyLima, Awana da Silva 30 July 2018 (has links)
A biomassa vegetal pode ser uma importante fonte de obtenção de diversos produtos a partir da desestruturação de suas frações por um vasto grupo de enzimas. No entanto, a geração de compostos de alto valor agregado a partir da biomassa lignocelulósica requer o desenvolvimento de novos sistemas enzimáticos. Pensando nisso, a prospecção e a caracterização de novas enzimas que estão presentes no secretoma de fungos degradadores da biomassa lignocelulósica tem sido fonte de pesquisa por pesquisadores do mundo todo. O objetivo deste trabalho foi prospectar, clonar e expressar de maneira heteróloga o gene codificante de uma enzima putativa do fungo termofílico T. terrestris em cepas do fungo filamentoso A. nidulans A773 e promover sua caracterização bioquímica e biofísica. O gene da enzima foi amplificado, clonado e inserido no vetor pEXPYR antes de ser inserido no sistema de expressão do A. nidulans. Os transformantes obtidos foram induzidos em meio mínimo de cultivo contendo 3% (m/v) de maltose e 1% (m/v) de glicose em meio estacionário para a produção, seguido da purificação da enzima. Estudos bioquímicos foram realizados para determinar o pH e a temperatura ótima de reação, bem como, a especificidade aos substratos e a determinação dos parâmetros cinéticos. A termoestabilidade da enzima também foi avaliada por estudo de dicroísmo circular (DC). Além disso, foi avaliado o efeito colaborativo entre uma xilanase GH10 e a enzima em estudo na hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado. A enzima obtida por expressão heteróloga foi caracterizada como uma xilo-oligossacarídeo oxidase (XylO). Por meio da análise filogenética das sequências de aminoácidos entre a enzima expressa e outras enzimas oxidativas, a XylO foi classificada como pertencente a família das flavoproteínas e subfamília das BBE. A enzima TtXylO demonstrou ter especificidade em oligossacarídeos de C5 apresentando boa atividade enzimática em substratos complexos de xilana. A enzima possui pH ótimo de 5,5 e temperatura ótima de 25 ºC. As análises de DC indicaram temperatura de desnaturação de 62,7 ºC, caracterizando esta enzima como termofílica. Contudo, novos estudos ainda são necessários para avaliar os produtos gerados a partir da oxidação dos diferentes xilo-oligossacarídeos pela XylO e seu potencial uso na indústria. / Plant biomass is an important source for generation of several products obtained from enzymatic cleavage of its fractions by a large group of enzymes. However, the generation of high value compounds from lignocellulosic biomass requires the development of new enzymatic systems. Considering that, prospection and characterization of enzymes present in the biomass-degrading fungi secretome has been a source of study by researchers around the world. The aim of this work was to prospect, clone and heterologously express a putative enzyme encoding gene from the thermophilic fungus T. terrestris in A. nidulans A773 strains and to promote its biochemical and biophysical characterization. The gene was amplified, cloned and inserted into the pEXPYR vector before being inserted into A. nidulans expression system. The transformants were induced by culture in minimal médium containing 3% (w/v) maltose and 1% (w/v) glucose by stationary culture for the production, followed by enzyme purification. Biochemical analyses were performed to determine optimum pH and temperature as well as the substrate specificities and kinetic parameters. The enzyme thermostability was also evaluated by circular dichroism (CD). In addition, the collaborative effect between the enzyme and a GH10 on hydrolys of pre-treated sugarcane bagasse was evaluated. The enzyme obtained by heterologous expression was characterized as a xylooligosaccharide oxidase (XylO). Phylogenetic analysis between amino acid sequences of expressed enzyme and other oxidative enzymes classified XylO as belonging to flavoproteins family and subfamily of BBE. TtXylO has been shown to have specificity on C5 oligosaccharides exhibiting good enzymatic activity on complex xylan substrates. The enzyme has an optimum pH of 5.5 and optimum temperature of 25 ºC. DC analyses showed melting temperature of 62.7 ºC, characterizing this enzyme as thermophilic. In general, further studies are still needed to evaluate the products generated from oxidation of xylooligosaccharides by XylO and their potential use in the industry.
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Expressão heteróloga e caracterização funcional da proteína Atx1 em Paracoccidioides spp / Heterologous expression and functional characterization of Atx1 protein in Paracoccidioides sppMorais, Camila Oliveira Barbosa de 13 April 2018 (has links)
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Previous issue date: 2018-04-13 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás - FAPEG / Paracoccidioidomycosis (PCM) is an important mycosis of Latin America, caused by
thermodymorphic fungi of the genus Paracoccidioides. Homeostasis of metals such as
copper, zinc and iron is important for the survival of fungi in the host environment. In
this context, copper is an important cofactor for several enzymes, such as as superoxide
dismutases and cytochrome c oxidase. The excess free copper in the cell promotes
accumulation of reactive oxygen species, causing damage to nucleic acids, lipids and
proteins. Thus, organisms shall to maintain cytoplasmic levels of that micronutrient at
non-toxic levels, just sufficient for cell growth and vital metabolic processes. The
metabolism of that metal is strictly controlled by high and low affinity uptake systems.
The objective of this work is to perform heterologous expression of the Atx1 protein,
described in the literature as a copper chaperone, and to analyze its cellular location, as
well as the protein behavior upon copper deprivation in Paracoccidioides spp.
Heterologous expression was performed on electrocompetent cells of Escherichia coli
strain BL21. Identity of the recombinant protein was confirmed by LC-MS / MS. BALB/c
mice were immunized to obtain anti-Atx1 polyclonal antibodies. After performing
immunoblotting the produced antibodies were used in immunofluorescence assays.
Analysis by qRT-PCR allowed us to evaluate the levels of the transcript encoding the
Atx1 protein during copper deprivation in Paracoccidioides spp. / A paracoccidioidomicose (PCM) é uma importante micose da América Latina, causada
por fungos termodimórficos do gênero Paracoccidioides. A homeostase de metais como
cobre, zinco e ferro é importante para a sobrevivência dos fungos no ambiente do
hospedeiro. Nesse contexto, o cobre é um importante cofator para várias enzimas, como
as superóxido dismutases e a citocromo c oxidase. O excesso de cobre livre na célula
promove o acúmulo de espécies reativas de oxigênio, causando danos a ácidos nucléicos,
lipídeos e proteínas. Assim, os organismos devem manter concentrações citoplasmáticas
desses micronutrientes em níveis não tóxicos, apenas suficiente para o crescimento
celular e processos metabólicos vitais. O metabolismo desse metal é rigorosamente
controlado por sistemas de captação de alta e baixa afinidade. O objetivo do trabalho é
realizar a expressão heteróloga da proteína Atx1, descrita na literatura como uma
chaperona citosólica de cobre e analisar a sua localização celular, bem como o
comportamento diante da privação de cobre em Paracoccidioides spp. A expressão
heteróloga foi realizada em células eletrocompetentes de Escherichia coli, cepa BL21. A
identidade da proteína recombinante foi confirmada por LC-MS/MS. Camundongos
BALB/c foram imunizados para obtenção de anticorpos policlonais anti-Atx1. Após
realização de imunoblotting, os anticorpos produzidos foram utilizados para ensaios de
imunofluorescência em células leveduriformes. Análise por qRT-PCR nos permitiram
avaliar os níveis do transcrito codificante da proteína Atx1 durante a privação de cobre
em Paracoccidioides spp.
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Expressão heteróloga e caracterização bioquímica de uma xilooligossacarídeo oxidase de Thielavia terrestris pertencente à família AA7 / Heterologous expression and biochemical characterization of a xylooligosaccharide oxidase from Thielavia terrestris belonging to AA7 familyAwana da Silva Lima 30 July 2018 (has links)
A biomassa vegetal pode ser uma importante fonte de obtenção de diversos produtos a partir da desestruturação de suas frações por um vasto grupo de enzimas. No entanto, a geração de compostos de alto valor agregado a partir da biomassa lignocelulósica requer o desenvolvimento de novos sistemas enzimáticos. Pensando nisso, a prospecção e a caracterização de novas enzimas que estão presentes no secretoma de fungos degradadores da biomassa lignocelulósica tem sido fonte de pesquisa por pesquisadores do mundo todo. O objetivo deste trabalho foi prospectar, clonar e expressar de maneira heteróloga o gene codificante de uma enzima putativa do fungo termofílico T. terrestris em cepas do fungo filamentoso A. nidulans A773 e promover sua caracterização bioquímica e biofísica. O gene da enzima foi amplificado, clonado e inserido no vetor pEXPYR antes de ser inserido no sistema de expressão do A. nidulans. Os transformantes obtidos foram induzidos em meio mínimo de cultivo contendo 3% (m/v) de maltose e 1% (m/v) de glicose em meio estacionário para a produção, seguido da purificação da enzima. Estudos bioquímicos foram realizados para determinar o pH e a temperatura ótima de reação, bem como, a especificidade aos substratos e a determinação dos parâmetros cinéticos. A termoestabilidade da enzima também foi avaliada por estudo de dicroísmo circular (DC). Além disso, foi avaliado o efeito colaborativo entre uma xilanase GH10 e a enzima em estudo na hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado. A enzima obtida por expressão heteróloga foi caracterizada como uma xilo-oligossacarídeo oxidase (XylO). Por meio da análise filogenética das sequências de aminoácidos entre a enzima expressa e outras enzimas oxidativas, a XylO foi classificada como pertencente a família das flavoproteínas e subfamília das BBE. A enzima TtXylO demonstrou ter especificidade em oligossacarídeos de C5 apresentando boa atividade enzimática em substratos complexos de xilana. A enzima possui pH ótimo de 5,5 e temperatura ótima de 25 ºC. As análises de DC indicaram temperatura de desnaturação de 62,7 ºC, caracterizando esta enzima como termofílica. Contudo, novos estudos ainda são necessários para avaliar os produtos gerados a partir da oxidação dos diferentes xilo-oligossacarídeos pela XylO e seu potencial uso na indústria. / Plant biomass is an important source for generation of several products obtained from enzymatic cleavage of its fractions by a large group of enzymes. However, the generation of high value compounds from lignocellulosic biomass requires the development of new enzymatic systems. Considering that, prospection and characterization of enzymes present in the biomass-degrading fungi secretome has been a source of study by researchers around the world. The aim of this work was to prospect, clone and heterologously express a putative enzyme encoding gene from the thermophilic fungus T. terrestris in A. nidulans A773 strains and to promote its biochemical and biophysical characterization. The gene was amplified, cloned and inserted into the pEXPYR vector before being inserted into A. nidulans expression system. The transformants were induced by culture in minimal médium containing 3% (w/v) maltose and 1% (w/v) glucose by stationary culture for the production, followed by enzyme purification. Biochemical analyses were performed to determine optimum pH and temperature as well as the substrate specificities and kinetic parameters. The enzyme thermostability was also evaluated by circular dichroism (CD). In addition, the collaborative effect between the enzyme and a GH10 on hydrolys of pre-treated sugarcane bagasse was evaluated. The enzyme obtained by heterologous expression was characterized as a xylooligosaccharide oxidase (XylO). Phylogenetic analysis between amino acid sequences of expressed enzyme and other oxidative enzymes classified XylO as belonging to flavoproteins family and subfamily of BBE. TtXylO has been shown to have specificity on C5 oligosaccharides exhibiting good enzymatic activity on complex xylan substrates. The enzyme has an optimum pH of 5.5 and optimum temperature of 25 ºC. DC analyses showed melting temperature of 62.7 ºC, characterizing this enzyme as thermophilic. In general, further studies are still needed to evaluate the products generated from oxidation of xylooligosaccharides by XylO and their potential use in the industry.
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Modulação da atividade dos canais de sódio dependentes de voltagem e de canais TRPV1 por (-)-CarvonaGonçalves, Juan Carlos Ramos 14 December 2011 (has links)
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Previous issue date: 2011-12-14 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Among the natural products with experimentally proven analgesic properties, the
monoterpernes are of great importance, recognized as the main chemical
constituents of essential oils from aromatic plants. ( )-Carvone is an example of
monoterpene with antinociceptive properties, founded as the main active constituent
of oils from some species of the genus Mentha. Since the peripheral antinociceptive
mechanism of ( )-carvone is not well established, this study aimed to better
characterize it. Initially, it was performed a structure-activity study by which was
possible to demonstrate the importance of the carbonyl group into the molecule of
( )-carvone, during its blocking effect in the rat peripheral nervous excitability, as also
that the replacement of that group for a hydroxyl enhanceed this effect. After shown
that ( )-carvone had low cytotoxicity, we investigated the effects of this monoterpene
in the voltage-gated sodium channels of (Nav) and the transient receptor potential
vanilloid 1 (TRPV1), involved in peripheral nociception, using neurons from the dorsal
root ganglion (DRG) of rats. With the technique of Whole-cell Patch-clamp it was
demonstrated that ( )-carvone (1 mM) was able to reduce Na+ influx from 8.7±1.6 nA
(control) to 5.3±1.1 nA (p <0.05). Later, by fluorescence microscopy assays, we
observed that ( )-carvone increased the Ca2+ levels in DRG neurons, possibly via
TRPV1 channels. The involvement of these channels was further confirmed by
specific antagonism and heterologous expression in HEK 293 by transfecting these
cells with TRPV1-cDNA of Rattus novergicus. Then we demonstrated that
( )-carvone acts in the TRPV1 channel in a concentration-dependent manner,
promoting its desensitization. Additionally, it was discarded the participation of
another TRP channel involved in pain, the TRPM2, during the effect of ( )-carvone.
Therefore, this study showed that the replacement of a carbonyl by a hydroxyl group
in the molecule of ( )-carvone could increase the efficiency of this monoterpene in
reducing the peripheral nerve excitability. Such effect was demonstrated as being a
result of the Nav channel blockade, as well as the activation and subsequent
desensitization of TRPV1 channels, indicating the great potential of this monoterpene
as a peripheral antinociceptive molecule or prototype of a novel analgesic drug. / Dentre os produtos de origem natural com propriedades analgésicas comprovadas
experimentalmente, destacam-se os monoterpernos, tidos como os principais
constituintes químicos dos óleos essenciais de plantas aromáticas. A ( )-carvona é
um exemplo de monoterpeno com propriedades antinociceptivas, encontrada como
o principal constituinte ativo dos óleos de algumas espécies do gênero Mentha. Uma
vez que o mecanismo antinociceptivo periférico de ( )-carvona não está
estabelecido, o presente trabalho se propõe a melhor caracterizá-lo. Inicialmente
realizou-se um estudo estrutura-atividade, onde foi possível demonstrar a
importância do grupo carbonila ligado à molécula de ( )-carvona, durante o seu
efeito bloqueador da excitabilidade nervosa periférica de rato, e ainda, que a
substituição desse grupo por uma hidroxila potencializou esse efeito. Após
demonstrarmos que ( )-carvona possuía baixa citotoxicidade, investigou-se os
efeitos desse monoterpeno sobre o canais de sódio dependentes de voltagem (Nav)
e nos canais receptores de potencial transiente vanilóides 1 (TRPV1), envolvidos na
nocicepção periférica, utilizando-se neurônios do gânglio da raiz dorsal (DRG) de
rato. Por meio da técnica de Whole-cell Patch-clamp foi possível demonstrar que
( )-carvona (1 mM) foi capaz de reduzir o influxo de Na+ de 8,7±1,6 nA (controle)
para 5,3±1,1 nA (p< 0,05). Posteriormente, através de ensaios de microscopia de
fluorescência, observou-se que ( )-carvona aumentou os níveis de Ca2+ em
neurônios DRG, possivelmente via canais TRPV1. O envolvimento desses canais foi
posteriormente confirmado por antagonismo específico e por expressão heteróloga
em HEK 293, por transfecção dessas células com cDNA-TRPV1 de Rattus
novergicus. Em seguida, demonstrou-se que ( )-carvona atua sobre o canal TRPV1,
de modo dependente de concentração, promovendo a sua dessensibilização.
Adicionalmente, foi descartada a participação de outro canal TRP envolvido na dor,
como o TRPM2, durante o efeito de ( )-carvona. Portanto, o presente estudo
evidenciou que a substituição do grupamento carbonila por uma hidroxila na
molécula de ( )-carvona poderia aumentar a eficiência desse monoterpeno na
redução da excitabilidade nervosa periférica. Este efeito foi demonstrado como
sendo resultante do bloqueio de canais Nav, bem como pela ativação e posterior
dessensibilização de canais TRPV1, indicando a grande potencialidade deste
monoterpeno como uma molécula antinociceptiva periférica ou protótipo de nova
droga analgésica.
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Obtenção e caracterização bioquímica de xilanases nativas e recombinante do fungo Leucoagaricus gongylophorus / Obtention and biochemical characterization of native and recombinant xylanases from Leucoagaricus gongylophorus fungusMoreira, Ariele Cristina 30 August 2013 (has links)
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Previous issue date: 2013-08-30 / Universidade Federal de Minas Gerais / Xylanases are enzymes which randomly cleave the main chain of xylan, the most abundant non-cellulosic polysaccharide of plants cell wall. Xylanases are commonly produced by a wide range of organisms including bacteria, algae, fungi, protozoa, and certain herbivorous insects and crustaceans also produce xylanases. Leucoagaricus gongylophorus, a mutualistic fungus of leafcutting ant Atta sexdens, secretes enzymes with xylanolytic activity and the gene encoding a xylanase was recently identified. In this work the xylanolytic profile of L. gongylophorus was studied and two enzymes with xylanolytic activity (XyLg1 and XyLg2) were isolated, purified and characterized. XyLg1 has a molecular mass of about 38kDa and pI greater than 4.8. For beechwood xylan substrate XyLg1 showed optimum temperature of 40 °C, optimum pH between 8.5 to 10.5 and Km =14, 7 ± 7.6 mg.ml-1. Due to these features XyLg1 may be used in processes such as bio-bleaching pulp. XyLg1 was also analyzed by mass spectrometry technique being associated with a polygalacturonase of the same fungus. Kinetic studies of the XyLg1 using polygalacturonic acid as substrate were developed (optimum pH= 5.5, optimum temperature between 50 and 60 ° C and Km= 2.2 ± 0.5 mg.ml-1). XyLg2 has molecular weight of about 24kDa and pI less than 4.8, and thus it is an acid protein. Parameter such as optimum temperature (70 °C) and pH (4.0) as well as the kinetic parameters (Km 7.4 ± 2.0 mg.ml-1) using beechwood xylan as substrate were determined for XyLg2. This enzyme exhibits desirable characteristics for improving animal feed, for example. LgXyn2 shows no activity with polygalacturonic acid. For the purpose of producing larger amount of xylanase from the L. gongylophorus the gene sequence encoding a xylanase (LgXyn1, GenBank: EF208066.1) was used to synthesize forward and reverse primers and was possible to amplify a different gene (xyl) that encodes the synthesis of a new xylanase called here LgXyn2. The gene was cloned into pETSUMO vector and the recombinant expressed in E.coli has no activity even when histidine tail (fusion) is removed with Sumo protease. These results suggest that the glycosylation is an important factor for xylanolitic activity. Then the xyl gene was cloned into pPICZalphaA vector and LgXyn2 was expressed in P. pastoris, secreted into the extracellular medium and the enzyme has xylanolitic activity. This result showed that the new gene (xyl) encodes a functional enzyme and that P. pastoris is a efficient system to obtain the active enzyme. / Xilanases são enzimas que, randomicamente, clivam a cadeia principal da xilana, o polissacarídeo não celulósico mais abundante da parede celular de plantas. As xilanases são comumente produzidas por uma grande gama de organismo incluindo bactérias, algas, fungos, protozoários, sendo que alguns insetos herbívoros e crustáceos também produzem xilanases. Leucoagaricus gongylophorus, é um fungo mutualístico da formiga saúva Atta sexdens, que secreta enzimas com atividade xilanolítica e o gene que codifica para uma xilanase foi recentemente identificado. Neste trabalho o perfil xilanolítico do fungo L. gongylophorus foi estudado e duas enzimas nativas com atividade xilanolítica (XyLg1 e XyLg2) foram isoladas, purificadas e caracterizadas. XyLg1 apresenta massa molecular aproximado de 38kDa e pI maior do que 4,8. Para o substrato xilana de faia a enzima apresentou temperatura ótima de 40°C, pH ótimo entre 8,5 a 10,5 e Km14,7 ± 7,6 mg.ml- 1. Devido a essas características a XyLg1 poderá ser utilizada em processos como o biobranqueamento da celulose. XyLg1 também foi analisada por espectrometria de massas sendo relacionada com uma poligalacturonase do mesmo fungo. Estudos cinéticos da XyLg1 utilizando ácido poligalacturônico como substrato foram realizados (pHótimo= 5,5, temperatura ótima entre 50 e 60°C, Km 2,2 ± 0,5 mg.ml-1). A XyLg2 apresenta massa molecular aproximada de 24kDa e pI menor que 4,8, sendo assim uma proteína ácida. Parâmetros ótimos de temperatura (70°C) e pH (4,0), assim como o parâmetro cinético (Km 7,4 ± 2,0 mg.ml-1) utilizando xilana de faia como substrato foram determinados para a XyLg2. Esta enzima apresenta características desejáveis para melhoramento da alimentação animal, por exemplo. A LgXyn2 não apresenta atividade frente ao ácido poligalacturônico. Com o propósito de produzir elevados níveis de xilanases do L. gongylophorus, a sequência que codifica para a xilanase (LgXyn1, GenBank: EF208066.1) foi utilizada para a síntese de oligonucleotídeos foward e reverse e foi possível amplificar um gene diferente (xyl) que codifica a síntese de uma nova xilanase denominada aqui LgXyn2. O gene foi clonado no vetor pETSUMO e a enzima recombinante expressa em E. coli não apresenta atividade mesmo quando a cauda de histidina (fusão) é removida com Sumo protease. Então o gene xyl foi clonado no vetor pPICZα-A e a LgXyn2 foi expressa em P. pastoris, secretada para o meio extracelular e a enzima apresenta atividade xilanolítica. Este resultado mostra que o gene (xyl) codifica para uma enzima funcional e que a P. pastoris é um sistema eficiente para obter esta xilanase.
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Clonagem, expressão heteróloga e caracterização parcial da trealase periplasmática de Xanthomonas citri subsp. citri e do seu envolvimento com a fitopatogenicidadeAlexandrino, André Vessoni 03 March 2015 (has links)
Submitted by Livia Mello (liviacmello@yahoo.com.br) on 2016-09-22T12:11:52Z
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Previous issue date: 2015-03-03 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Citrus canker imposes damages to citriculture by causing drop in productivity and fruit
quality and the absence of effective control and cure. Thus, the economic potential of citrus is limited in part by this disease mainly caused by the bacterium Xanthomonas citri subsp. citri (XAC) that presents the greatest virulence and broad spectrum of citrus hosts, compared to bacteria Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii types B (XauB) and C (XauC). In a proteomic analysis previously performed by our research group, periplasmic trehalase was identified as a protein which expression differed between XAC e XauC in an in vitro induction of pathogenicity. Trehalase is an enzyme that catalyzes hydrolysis reaction of trehalose, a disaccharide composed of two glucose units, which role in the plant-pathogen interaction is poorly understood. One of the objectives of the study was to obtain this enzyme in purified form using an IPTG-inducible heterologous expression system in E. coli, for purposes of partial characterization of its structure and activity. The recombinant XAC periplasmic trehalase is a monomer bearing wide pH stability and showed Michaelian kinetics. The Michaelis-Menten constant (Km) for trehalose was 0,124 ± 0,015 mM and Vmax 17,319 ± 0,035 μMol glucose.min-1.mg protein-1 . Circular dichroism spectroscopy indicated the following composition of secondary structures: 42.7% α-helices and 13% β-sheets. A gene knockout method based on double homologous recombination between the genomic DNA and suicide vector pNPTS138 has made possible to obtain a strain deleted in the gene encoding
the periplasmic trehalase (XACΔ0604), which enabled to evaluate the relationship between this gene and the XAC pathogenicity in Citrus aurantifolia. Infiltrated leaves with
XACΔ0604 showed drenching and necrosis of plant tissue and intense brownish pustules
compared with wild XAC, suggesting greater virulence of the mutant strain. The periplasmic trehalase activity was compared in XAC and XauC cell extracts from two culture mediums, non-pathogenicity-inducing (CN) and pathogenicity-inducing (XAM-M). Interestingly, XauC has showed higher enzyme activity compared to XAC in XAM-M. Thus, the noticeable higher XACΔ0604 pathogenicity and the greater activity of XauC periplasmic trehalase compared to XAC are indicatives that trehalose may promote pathogenicity. / O cancro cítrico impõe prejuízos ao setor citricultor por ocasionar queda na
produtividade e qualidade dos frutos e pela ausência de medidas eficazes de controle e cura.
Assim, o potencial econômico dos citros é limitado, em parte, por essa doença causada
principalmente pela bactéria Xanthomonas citri subsp. citri (XAC), que apresenta maior
virulência e largo espectro de hospedeiros cítricos, comparativamente às bactérias
Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii tipos B (XauB) e C (XauC). Em um trabalho de
análise proteômica anteriormente realizado por nosso grupo de pesquisa, a trealase
periplasmática foi identificada como uma proteína cuja expressão foi diferencial entre XAC e
XauC, em condição de indução da patogenicidade in vitro. A trealase é uma enzima que
catalisa a reação de hidrólise da trealose, um dissacarídeo formado por duas unidades de
glicose, cujo papel na interação planta-patógeno é ainda pouco compreendido. Um dos
objetivos do trabalho foi obter esta enzima purificada, utilizando um sistema de expressão
heteróloga induzível por IPTG (isopropil-β-D-tiogalactosídeo) em E. coli, para fins de
caracterização parcial da sua estrutura e atividade. A trealase periplasmática de XAC de
origem heteróloga apresentou-se como um monômero relativamente estável em relação ao
pH, e de cinética Michaeliana,. A constante de Michaelis-Menten (Km) da enzima para a
trealose foi de 0,124 ± 0,015 mM e a Vmáx 17,319 ± 0,035 μMol de glicose.min-1.mg de
proteína-1. Análise de dicroísmo circular resultou na seguinte composição de estruturas
secundárias: 42,7 % de α-hélices e 13 % de folhas-β. Uma metodologia de nocaute gênico
baseada na dupla recombinação homóloga entre o DNA genômico e o vetor suicida
pNPTS138 viabilizou a obtenção de uma linhagem mutante deletada no gene que codifica a
trealase periplasmática (XAC∆0604), o que possibilitou avaliar a relação entre tal gene e a
patogenicidade de XAC em Citrus aurantifolia. Folhas infiltradas com a suspensão de
XAC∆0604 apresentaram maior encharcamento e necrose do tecido vegetal, além de intensas
pústulas acastanhadas quando comparadas com as folhas infiltradas com XAC selvagem,
sugerindo maior virulência da linhagem mutante. A atividade da trealase periplasmática foi
comparada em extratos celulares brutos provenientes de cultivos de XAC e XauC em dois
meios de cultura, não-indutor de patogenicidade (CN) e indutor de patogenicidade (XAM-
M). A bactéria XauC apresentou maior atividade enzimática de trealase em relação à XAC em
XAM-M. Sendo assim, a acentuada patogenicidade de XAC∆0604 em relação à linhagem
selvagem XAC e a maior atividade da trealase periplasmática de XauC em relação à XAC
reforçam os recentes trabalhos que indicam a trealose como promotora da patogenicidade em
fitopatógenos.
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Identificação, caracterização e validação de sequências microssatélites no genoma do mico-leão-preto (Leontopithecus chrysopygus)Pardo, Priscilla Pina 28 August 2015 (has links)
Submitted by Luciana Sebin (lusebin@ufscar.br) on 2016-10-07T18:32:03Z
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Previous issue date: 2015-08-28 / The black lion tamarin (Leontopithecus chrysopygus) is one of the most endangered neotropical
primates and the historical causes that led them to the brink of extinction are closely related to the
history of the Atlantic Rainforest. Among its main threats are the fragmentation of their habitat, the
small number of his surviving populations and the isolation of them, which directly affect the genetic
structure of these populations. The use of genetic analysis and molecular markers for the wildlife
conservation have been growing over the past few years with the advent of genetic and molecular
technologies and bioinformatics, allowing the establishment of rapid diagnosis of diseases and many
genetic and ecological parameters such as migration rate, population size, genetic diversity, kinship
relations. Among the main molecular markers are microsatellite that consist of short DNA sequences
tandemly repeated composed of 1 to 6 bases pairs widely distributed in eukaryotic and prokaryotic
genomes. Characteristics like codominance and high level of polymorphism make microsatellites an
important tool to measure the loss of genetic diversity and recent changes in genetic structure of
populations, and for use in forensic investigations. Among the methods used for the isolation of such
markers, is the in silico mining for species with available genetic data. In the present study, we
identified 60 tetranucleotide microsatellite loci have been identified in the genome of common marmoset (Callithrix jacchus) through data mining conducted in the genome of this species. Primer pairs were designed and tested in black lion tamarin, since this kind does not have any genomic data available. Of the 60 loci tested, 87% had successful amplification of DNA samples from 10 captive animals. PCR products were analyzed on agarose gel and 13 loci were genotyped in automatic sequencer ABI3730XL. The Geneious version 8.1.6 software was used for genotyping. Only four loci showed polymorphism, observed two alleles per locus. This low polymorphism may be associated with the origin of the captive colonies. / O mico-leão-preto (Leontopithecus chrysopygus) é um dos mais ameaçados primatas neotropicais e as causas históricas que o levaram à beira da extinção estão intimamente relacionadas à história da Mata Atlântica. Entre suas principais ameaças estão a fragmentação de seu habitat, o número reduzido de suas populações sobreviventes e o isolamento das mesmas, as quais afetam diretamente a estrutura genética dessas populações. O uso de análises genéticas e marcadores moleculares a favor da conservação da vida silvestre vêm crescendo ao longo dos últimos anos com o surgimento das tecnologias genéticas, moleculares e da bioinformática, possibilitando o estabelecimento do rápido diagnóstico de doenças e de muitos parâmetros genéticos e ecológicos, como taxa de migração, tamanho populacional, diversidade genética, relações de parentesco. Dentre os principais marcadoes estão os microssatélites que consistem em pequenas sequências de DNA
repetidas em tandem compostas de 1 a 6 pares de base amplamente distribuídas nos genomas eucarióticos e procarióticos. Suas características de codominância e alto nível de polimorfismos fazem desses marcadores ferramentas importantes para estimativas de perda de variabilidade e de mudanças recentes na estruturação genética de populações, além do uso em investigações forenses. Dentre os métodos utilizados para o isolamento de tais marcadores, está a mineração in silico para
espécies com dados genéticos disponíveis. No presente estudo, identificamos 60 microssatélites tetranucleotídicos no genoma do saguí-de-tufo-branco (Callithrix jacchus) através de Data Mining realizados no genoma desta espécie. Pares de primers foram desenhados e testados em Leontopithecus chrysopygus, uma vez que esta espécie não possui dados genômicos disponíveis. Dos 60 locos testados, 87% tiveram sucesso de amplificação em amostras de DNA provenientes de 10 animais de cativeiro. Os produtos de PCR foram analisados em gel de agarose e 13 locos foram genotipados em
sequenciador automático ABI3730XL. O programa Geneious versão 8.1.6 foi utilizado para genotipagem. Somente quatro locos demonstraram polimorfismo, sendo observados dois alelos por loco. Esse baixo polimorfismo pode estar associado à origem das colônias de cativeiro.
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Conversão de uma histidina amônia liase para fenilalanina amônia liase por meio de biologia sintéticaSantos Júnior, Célio Dias 24 February 2016 (has links)
Submitted by Luciana Sebin (lusebin@ufscar.br) on 2016-10-11T18:07:04Z
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Previous issue date: 2016-02-24 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Phenylalanine ammonia lyase (PAL) catalyzes the non-oxidative deamination of L-Phe. It is an important enzyme in the production of enantio-pure mixtures of phenylalanine. Besides being important in plant secondary metabolism, PAL has also been used both for industrial applications as in the treatment of leukemia and phenylketonuria. The PAL have high similarity with histidine ammonia lyase (HAL) and it is believed that the PAL originated from HAL. Use of HAL termini sequences, previously obtained from
the metagenome of Poraquê Lake (03°57' S, 63°10' W) to produce an engineered enzyme. The HAL assembled from them had its catalytic core exchanged by one which was designed from the previously described PAL sequences. Thus, We aim to shift the HAL activity making it active in the presence of phenylalanine through an easy protocol. Our phylogenetic analysis shows a clear division between plant and fungal PALs, and showed that recombination played a key role in the separation of these
groups. In addition, We also observed that PAL catalytic core is conserved despite positive selection operating in protein termini. The recombinant enzyme, mPAL_c1, was produced in insoluble form and was refolded in vitro. mPAL_c1, when using L-Phe as substrate, has a TOPT. of 30°C (at pH 7.5 with 2mM MnCl2), KM of 55μM and Kcat/KM of 0.01633 mM-1s-1. The activity of mPAL_c1 showed about 30% of activity of commercial PAL from Rhodotorula toruloides at 2 mM L-Phe. Activation of mPAL_c1
was tested through substrate concentration rising from 2 mM to 5 mM of L-Phe, and its activity was almost 5 times higher. The results still suggest a histidine ammonia lyase remnant activity. The low catalytic rates are justified due to protein aggregation and misfolding, detected by size exclusion chromatography and by circular dichroism. In summary, our protocol has proved to be useful in protein design. / A fenilalanina amônia liase (PAL) catalisa a desaminação não oxidativa de L-Phe. Ela é uma enzima importante na produção de misturas enântio-puras de fenilalanina. Além de ser importante no metabolismo secundário vegetal, a PAL também tem sido utilizada tanto para aplicações industriais quanto no tratamento de leucemia e fenilcetonúria. As PAL apresentam alta similaridade com as histidina amônia liases (HAL) e acredita-se que as PAL se originaram das HAL. Utilizamos sequências das extremidades de uma HAL, previamente obtidas do metagenoma do Lago Poraquê (03°57' S e 63°10' W) para produção de uma enzima engenheirada. A HAL montada a partir delas teve seu núcleo catalítico trocado por um que foi desenhado a partir de sequências de PAL previamente descritas. Desta forma visamos deslocar as atividades da HAL tornando-a ativa em
presença de fenilalanina por meio de um protocolo simplificado. As nossas análises filogenéticas revelam uma divisão clara entre PALs vegetais e fúngicas, e mostram que a recombinação teve um papel fundamental na separação destes grupos. Além disto, também observamos que o núcleo catalítico da enzima é conservado, com relação às extremidades. A enzima recombinante, mPAL_c1, foi produzida sob forma insolúvel e reenovelada in vitro. A mPAL_c1 tendo como substrato a L-Phe, possui uma Topt. de 30°C num pH de 7,5 com 2mM de MnCl2 e um KM de 55μM, VMáx de 15mU e Kcat/KM de 0,01633 mM-1s-1. A atividade da mPAL_c1 se mostrou cerca de 30% da atividade da PAL comercial de Rhodotorula toruloides a 2 mM de L-Phe. A ativação pelo substrato foi de quase 5 vezes quando a concentração de L-Phe foi elevada de 2mM até 5mM. Os
resultados sugerem um resquício de atividade de histidina amônia-liase. As baixas taxas catalíticas se justificam devido à agregação e misfolding proteicos, detectados pela cromatografia de exclusão molecular e pelo dicroísmo circular. Por fim, o protocolo estabelecido neste estudo se mostrou útil para a engenharia de proteínas.
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