Made available in DSpace on 2016-12-08T16:24:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCA14MA122.pdf: 692452 bytes, checksum: e25e927c8d8beb4236a0bb259e17524a (MD5) Previous issue date: 2014-02-21 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Oxidative stress and premature sperm capacitation, generated during cryopreservation of ram semen, reduces their viability, especially after cervical insemination. The use of seminal plasma (SP) and negative pressure have produced protection and the reversion of such damages. Two experiments evaluated these potential enhancers of cryotolerance, and a third experiment compared 2 methods of cervical AI. In experiment 1 ram semen was subjected to the treatments: (TC) control or negative pressure of 200mBar (P200); 500mBar (P500) and 800mBar (P800). In experiment 2, the PS from rams, stallions and bulls was lyophilized (L) and its protein measured. From each SP 600μg of protein per mL was aded to the freezing diluent used, compounding the experimental groups: control (TC), ovine PS (PSLO), bovine PS (PSLB) and equine PS (PSLE). Experiment 3 evaluated 2 methods of AI, the superficial cervical AI (G1), and deep intrauterine or cervical AI with clamping the vaginal fornix (G2). The in vitro data were subjected to ANOVA and test T, and the pregnancy rate to the chi square test, all with 5% significance level. In the experiment 1 higher progressive motility (PM) was observed in TC (49%) compared to P200 (40.9%), P500 (38.9%) and P800 (38.9%) treatments. In PM during the test the thermal resistance (TTR), MP after percoll (PP), acrosome integrity (IAC), IAPP and membrane integrity (MI), there was no difference between the groups. In cleavage rate P800 (34.5%) was less than P200 (51.2%) and P500 (50.9%) did not differ from the control (44.3%). In conclusion the P500 is the most appropriate for use in ram semen cryopreservation, enabling high rates of cleavage after heterologous IVF, maintain membrane integrity. Experiment 2 evaluated MP, MPPP and cleavage rate after heterologous IVF in all groups, with the best group compared with the control in: CASA system; acrossoma integrity (FITC-PSA), membrane stability (M540), chromatin integrity (acridine orange), apoptosis (annexin) and potential of mitochondria (Mitotracker). Also the PSLE showed higher cleavage rate (71.37%), indicating a greater ability to oocyte penetration. The PSLE showed higher VCL (PC-163.5μm/s, PSLE-186.2μm/s) and ALH (PC9μm PSLE-8.2μm) in CASA evaluation, compared to control. In flow cytometry the annexin test revealed a greater amount of non-apoptotic viable cells in PSLE (38.9%), compared to TC (32.1%). In experiment 3 there was no difference in pregnancy rates after superficial (33.3%) or deep and intrauterine (52.2%) IA, possibly due to the reduced number of animals used / O estresse oxidativo e a precoce capacitação espermática, gerados na criopreservação do sêmen ovino, reduzem sua viabilidade, principalmente na inseminação cervical. O uso de plasma seminal (PS) e a pressão negativa têm produzido a proteção e reversão desses danos. Dois experimentos avaliaram esses potenciais melhoradores da criotolerância, e um terceiro avaliou dois métodos de IA cervical. No experimento 1 o sêmen ovino foi submetido aos tratamentos: controle (TC), pressão de 200mBar (P200); 500mBar (P500) e 800mBar (P800). No experimento 2 o PS de carneiros, garanhões e touros foi liofilizado (L) e sua proteína dosada. De cada PS, o equivalente a 600μg de proteína por mL, foi adicionado ao diluente de congelamento, compondo os grupos experimentais: controle (TC), PS ovino (PSLO), PS bovino (PSLB) e PS equino (PSLE). O experimento 3 avaliou 2 métodos de IA, a cervical superficial (G1) e a cervical profunda com pinçamento do fundo de saco vaginal (G2). Os dados in vitro foram submetidos a análise de variância e teste T, e a taxa de prenhez ao chi-quadrado, todos com significância de 5%. No experimento 1, maior motilidade progressiva (MP) foi observada no TC (49%) frente aos tratamentos P200 (40,9%), P500 (38,9%) e P800 (38,9%). Na MP durante o teste de termo resistência (TTR), MP após percoll (PP), integridade de acrossoma (IAC), IACPP, integridade de membrana (IM) e IMPP, não houve diferença entre os grupos. Na clivagem P800 (34,5%) foi inferior a P200 (51,2%) e P500 (50,9%), não diferindo do controle (44,3%). Conclui-se que a P500 é a mais adequada para uso com sêmen ovino, não reduzindo a viabilidade após o congelamento e proporcionando elevada taxa de clivagem após FIV heteróloga. O experimento 2 avaliou MP, MPPP e clivagem após FIV heteróloga de todos os grupos, sendo o melhor grupo comparado ao controle através de: sistema CASA, integridade de acrossoma (FITC-PSA), estabilidade de membrana (M540); integridade de cromatina (acridina orange); apoptose (anexina) e potencial de mitocôndria (mitotracker). O PSLE apresentou a maior taxa de clivagem (71,37%), evidenciando sua maior capacidade de penetração nos oócitos. Observou-se superioridade do PSLE nosparâmetros VCL (PC-163,5μm/s, PSLE-186,2μm/s) e ALH (PC-9μm, PSLE- 8,2μm) do CASA, em relação ao controle. Na citometria de fluxo, o teste da anexina revelou maior quantidade de células viáveis não apoptóticas com o PSLE (38,9%) em relação ao TC (32,1%). No experimento 3 não houve diferença na prenhez após IA superficial (33,3%) e profunda (G2 52,2%), possivelmente devido ao número reduzido de animais

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / CHAPTER II: The snake venom is composed by a diversity of biomolecules with many actions on physiological processes. The serine peptidases are a group of proteases present in the constitution of the venom, capable of interfering on several points of hemostasis. Some serine peptidases has thrombin-like activity, what makes them targets on the development of therapeutics agentes on the treatment of many hemostatic disorders. In this study, a recombinant thrombin-like serine peptidase called rBpSP-II was obtained from the cDNA of the venom gland of the snake Bothrops pauloensis and biochemically characterized. The cDNA correspondent to rBpSP-II was cloned on the pPICZαA vector and inserted on the methylotrophic yeast Pichia pastoris KM71H for the heterologous expression. This enzyme showed single band when analised on SDS-PAGE with approximated molecular mass of 44,5 kDa under reducing conditions. The enzyme rBpSP-II showed clotting activity on bovine plasma and proteolytic activity on fibrinogen, cleaving exclusively the Aα chain. The evaluation of rBpSP-II activity on chromogenic substrates showed that the enzyme has thrombin-like activity due to its capacity to hydrolyze the thrombin substrate. / CAPÍTULO II: A peçonha de serpente é composta por uma diversidade de biomoléculas com inúmeras ações sobre os processos fisiológicos. As serinoproteases são um grupo de proteases presentes na constituição da peçonha, capazes de interferir em diversos pontos da hemostasia. Algumas serinoproteases possuem atividade semelhante à trombina, o que as tornam alvos de interesse no desenvolvimento de agentes terapêuticos no tratamento de desordens hemostáticas. Neste estudo, uma serinoprotease thrombin-like recombinante denominada rBpSP-II foi obtida a partir do cDNA da glândula da peçonha da serpente Bothrops pauloensis e caracterizada bioquimicamente. O cDNA correspondente à rBpSP-II foi clonado no vetor pPICZαA e inserido na levedura metilotrófica Pichia pastoris KM71H para a realização da expressão heteróloga. Esta enzima apresentou banda única quando analisada em SDS-PAGE com massa molecular aproximada de 44.5 kDa sob condições redutoras. A rBpSP-II apresentou atividade coagulante sobre plasma bovino e atividade proteolítica sobre o fibrinogênio, clivando preferencialmente a cadeia Aα. A avaliação da atividade da rBpSP-II sobre substratos cromogênicos demonstrou que a enzima possui atividade thrombin-like devido a sua capacidade de hidrolisar o substrato da trombina. / Mestre em Genética e Bioquímica

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:16:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Lorena Cardoso Cintra.pdf: 4143916 bytes, checksum: 422ca8b39c01e66c797228b6083cedf8 (MD5) Previous issue date: 2010-08-27 / The termodimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis is the etiological agent of paracoccidioidomycosis, a human systemic mycosis of high prevalence in Latin America. P. brasiliensis is exposed to oxidative stress (OS) caused by reactive oxygen species (ROS) produced by the defense cells of the human host. When the invasion by pathogens occurs, the host defense system generates ROS to fight the invader. Inside the human host, P. brasiliensis is phagocytosed by macrophages, facing an extremely hostile environment due to nitric oxide and hydrogen peroxide. The Trx1 is an intracellular redox protein, which participates in the maintenance of cell redox homeostasis, both in terms of OS as reducer. It is ubiquitous and is characterized by typical CXXC active site, responsible for oxidation, reduction, or isomerization of proteins disulfide bonds. In a previous work, it was isolated, characterized and cloned into expression vector pGEX-4T-3 cDNA coding for TRX1 of P. brasiliensis (accession number AY376435). The recombinant protein (recPbTRX1) was produced and partially purified and the yeast cells of P. brasiliensis showed increased expression of the gene coding for PbTRX1 in response to OS. This study aimed the heterologous expression of cDNA of a thioredoxin of the fungus P. brasiliensis in Pichia pastoris, in order to obtain it in larger amounts for their subsequent biochemical characterization and application in biotechnological processes. The P. brasiliensis thioredoxin 1 (trx1) cDNA was obtained via PCR using the plasmid pGEX-Trx1 as template and cloned into expression vector pHIL-D2 and pPIC9 (for intracellular and extracellular expression). The insertion of the interested gene in the correct orientation was verified by sequencing and the homology was observed with Trx1 P. brasiliensis. These vectors were used to transform the P. pastoris yeast strain SMD1168 with his4- genotype. The presence of the cassette s expression was confirmed in the yeast s genome. No transformants able to secrete the protein from the building with the vector pPIC9 were detected and the intracellular production was carried from the pHIL-D2 vector. / O fungo termodimórfico Paracoccidioides brasiliensis é agente etiológico da paracoccidioidomicose, uma micose sistêmica humana, com alta prevalência na América Latina. P. brasiliensis está sujeito a estresse oxidativo (EO) causado pelas espécies reativas de oxigênio (EROs), produzidas pelas células de defesa do hospedeiro humano. O sistema de defesa do hospedeiro quando da invasão por patógenos gera EROs para combater este invasor. P. brasiliensis ao penetrar no hospedeiro humano é fagocitado pelos macrófagos, enfrentando um ambiente extremamente hostil devido ao oxido nítrico e peróxido de hidrogênio. A Trx1 é uma proteína redox, intracelular, que participa da manutenção da homeostase redox da célula, tanto em condições de EO quanto redutor. É ubiquitária e caracterizada pelo sítio ativo típico CXXC, responsável pela oxidação, redução, ou isomerização das pontes dissulfeto de proteínas. Em trabalho realizado anteriormente, foi isolado, caracterizado e clonado em vetor de expressão pGEX4T-3 o cDNA codificante para Trx1 de P. brasiliensis (número de acesso AY376435). A proteína recombinante (recPbTRX1) foi produzida e parcialmente purificada e as células leveduriformes de P. brasiliensis apresentaram expressão aumentada do gene codificante para Pbtrx1 em condições de EO. O presente trabalho teve como objetivo a expressão heteróloga de uma tiorredoxina do fungo P. brasiliensis em Pichia pastoris, visando sua obtenção em maior quantidade para sua a posterior caracterização bioquímica e aplicação em processos biotecnológicos. O cDNA do gene da tiorredoxina 1 (trx1) de P. brasiliensis foi obtido via PCR utilizando como molde o plasmídeo pGEX-Trx1 e clonado no vetor de expressão pHIL-D2 e pPIC9 (para expressão intracelular e extracelular). A inserção do gene de interesse na orientação correta foi verificada por seqüenciamento, apresentando homologia com a Trx1 de P. brasiliensis. Estes vetores foram utilizados para transformar a linhagem SMD1168 da levedura P. pastoris com genótipo his4-. A presença do cassete de expressão foi confirmada no genoma da levedura. Não foram detectados transformantes capazes de secretar a proteína a partir da construção com o vetor pPIC9 e a produção intracelular foi realizada a partir do vetor pHIL-D2.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:30:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao maria regilda araujo fernandes.pdf: 889828 bytes, checksum: eeac21e7e2102f6042640b9c030c3870 (MD5) Previous issue date: 2009-02-27 / The pathogenic fungus Paracoccidioides brasiliensis is the etiologic agent of Paracoccidioidomycosis (PCM). The main route of contamination is the inhalation of fungal propagules that convert to yeast in the host tissues. The urease is among the factors of virulence described for dimorphic fungus. It hydrolyzes the urea producing molecules of ammonia and carbamate. Pbure has 3,012 bp, corresponding to a predicted protein of 837 amino acids, predicted molecular mass of 90 kDa and pI 6.0. PbURE has signature to nickel-dependent enzyme for its activity. The phylogenetic relationship between PbURE and urease from other fungi was evaluated. The cDNA that encodes PbURE was inserted into the expression vector pET-32a and recombinant protein of 103 kDa was expressed. Polyclonal antibody were produced against PbUREr and used on Western blot, Far-Western blot and ELISA. The results showed that PbUREr interferes on interaction between P. brasiliensis and pulmonary epithelial cells A549. PbUREr was able to bind to proteins fibronectin and type IV collagen, components of the extracellular matrix (ECM). The interaction between PbURE and calnexin protein was identified by the technique of two-hybrid. / O fungo patogênico humano Paracoccidioides brasiliensis é o agente etiológico da Paracoccidioidomicose (PCM). A principal via de contaminação é a inalação de micélios ou conídios do fungo que se convertem em leveduras no hospedeiro. Dentre os fatores de virulência descritos para fungos dimórficos está a urease, a qual hidrolisa uréia produzindo amônia e carbamato. Pbure possui 3.012 pb, correspondendo a uma proteína predita de 837 aminoácidos, massa molecular predita de 90 kDa e pI 6.0. PbURE possui assinatura de uma enzima dependente de níquel para sua atividade. A relação filogenética entre PbURE e ureases de outros fungos foi avaliada. O cDNA que codifica PbURE foi inserido no vetor de expressão pET-32a e a proteína recombinante de 103 kDa foi expressa. Anticorpo policlonal foi produzido contra PbUREr e utilizados nos ensaios de Western blot, Far-Western blot e ELISA. Os resultados mostram que PbUREr interfere na interação entre P. brasiliensis e células epiteliais pulmonares A549. PbUREr foi capaz de se ligar às proteínas fibronectina e colágeno tipo IV, componentes da matriz extracelular (MEC). A interação entre PbURE e a proteína calnexina foi identificada através da técnica de duplo-híbrido.

Submitted by Cássia Santos (cassia.bcufg@gmail.com) on 2017-09-01T13:05:01Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Wanderson Lucas da Costa - 2017.pdf: 3043089 bytes, checksum: 32c1b9c81dae778ab37d939fdba41eb5 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-09-15T13:46:23Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Wanderson Lucas da Costa - 2017.pdf: 3043089 bytes, checksum: 32c1b9c81dae778ab37d939fdba41eb5 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-15T13:46:23Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Wanderson Lucas da Costa - 2017.pdf: 3043089 bytes, checksum: 32c1b9c81dae778ab37d939fdba41eb5 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2017-08-07 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Paracoccidioides spp. are thermodymorphic fungi that when inhaled by humans, these conidia find a favorable environment, changing to the yeast phase and becoming pathogenic causing paracoccidioidomycosis (PCM), one of the most prevalent systemic mycoses in Brazil. Some antifungals are used in the treatment of PCM. Treatment depends on the patient's progression and tolerability of each drug, but their treatment may be for long periods and cause various side effects in the patient. The chiquimate pathway is coordinated by 7 enzymes that perform consecutive steps to convert erythrose-4-phosphate and phosphoenol pyruvate (PEP) into chorismate. In microorganisms, this pathway is involved in the production of the amino acids phenylalanine, tyrosine and tryptophan; These amino acids are essential to the maintenance of these organisms. In this work, pGEX4T3 vector cloning and heterologous expression of Pb18 EPSP synthase belonging to the chiquimate pathway were performed. This protein was expressed in E. coli (DE3) strain and purified. Antibodies were produced for expression analysis of the protein in Western blot. The modeling of EPSP synthase was performed aiming to identify the amino acids involved in the active site. The pull down-GST assay with soluble Pb18 proteins allowed the identification of 40 proteins that interact with EPSP synthase. These proteins belong to different functional categories, which are involved with the availability of phosphoenol pyruvate, the substrate necessary for the functioning of the chiquimate pathway. / Paracoccidioides spp. são fungos termodimórficos que ao serem inalados pelo ser humano, esses conídios encontram um ambiente propício, mudando para a fase de levedura e tornando-se patogênico causando a paracoccidioidomicose (PCM), umas das micoses sistêmicas de maior prevalência no Brasil. Alguns antifúngicos são empregados no tratamento da PCM. O tratamento depende do avanço da doença e da capacidade de tolerância do paciente a cada medicamento, mas o seu tratamento pode ser por longos períodos e causando diversos efeitos colaterais no paciente. A via do chiquimato é coordenada pela ação de 7 enzimas que realizam passos consecutivos para transformar a eritrose-4-fosfato e fosfoenol piruvato (PEP) em corismato. Em micro-organismos, esta via está envolvida com a produção dos aminoácidos fenilalanina, tirosina e triptofano; estes aminoácidos são essenciais à manutenção desses organismos. Neste trabalho foi realizado a clonagem em vetor pGEX4T3 e expressão heteróloga da EPSP–sintase de Pb18 pertencente à via do chiquimato. Essa proteína foi expressa em linhagem E. coli (DE3) e purificada. Os anticorpos foram produzidos para análise da expressão da proteína em Western blot. A modelagem da EPSP-sintase foi realizada visando identificar os aminoácidos envolvidos no sítio ativo. O ensaio de pull down-GST com proteínas solúveis de Pb18 possibilitou a identificação de 40 proteínas que interagem com EPSP-sintase. Essas proteínas pertencem a diferentes categorias funcionais, as quais estão envolvidas com a disponibilidade de fosfoenol piruvato, substrato necessário para o funcionamento da via do chiquimato.

Submitted by Cássia Santos (cassia.bcufg@gmail.com) on 2017-02-22T10:55:05Z No. of bitstreams: 2 Tese - Carolina Cândida de Queiroz Brito Cunha - 2016.pdf: 2598077 bytes, checksum: fc0189e22f130ec24f122de4f57a3c02 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-02-22T13:08:29Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Carolina Cândida de Queiroz Brito Cunha - 2016.pdf: 2598077 bytes, checksum: fc0189e22f130ec24f122de4f57a3c02 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-22T13:08:29Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese - Carolina Cândida de Queiroz Brito Cunha - 2016.pdf: 2598077 bytes, checksum: fc0189e22f130ec24f122de4f57a3c02 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2016-12-19 / Outro / The xylan-degrading enzymes are responsible for the hydrolysis of xylan and can be produced by a variety of microorganisms such as bacteria and fungi. Bacteria produce an effective xylanolytic system composed of endoxylanase, β-xylosidases, arabinofuronosidases, glucuronidases, acetyl xylan esterase and esterase ferulic acid and have been the target of several studies on the production and application of these enzymes in biotechnological processes such as hydrolysis of different substrates to obtain fermentable sugars. Actinomycetes comprising a phylum Gram positive, aerobic, which generally form branched filaments, often in the form of mycelium. Among the actinomycetes, bacteria of the genus Streptomyces in particular, have been studied due to their important role biotechnology. In the present study, we report the expression, purification and characterization of xylanase (XynBS27) recombinantly in yeast P. pastoris. To achieve high levels of production, the gene was designed and synthesized by optimizing codon usage for P. pastoris. The synthetic gene (xynBS27) was cloned into expression vector containing the AOXI promoter followed by integration into the yeast genome. The increased production of XynBS27 was after 96 h of induction, 2% methanol at 28 °C and 200 rpm (80 U/mL), the enzyme was purified in one chromatography step molecular exclusion obtained specific activity of 8525 U/ mg its highest activity at 75 °C and pH 6, it is thermostable and showed stability at pH 5, 6 and 7. The XynBS27 has a molecular mass of 19 kDa active in zymography. Many ions were tested Al3+, NH4+, Ba2+ and Mg2+ were inducers and Ag+ ions, Hg2+ and Cu2+ inhibited, the sulfides of Mn2+, Zn2+, Fe3+ and denaturing agents EDTA and SDS inhibited XynBS27. The enzyme is tolerant to high concentrations of glucose and xylose. The Km and Vmax values were 12.38 mg/mL, 13.679 mmol/(min.mL), respectively, Ki of 180 mM competitive inhibition. The use of the enzyme in baking has proved very promising in the evaluated parameters, volume, density, reducing sugar, stiffness, consistency, firmness and water retention. / As enzimas xilanolíticas são responsáveis pela hidrólise da xilana e podem ser produzidas por uma variedade de micro-organismos como bactérias e fungos. As bactérias produzem um eficiente sistema xilanolítico composto de endoxilanases, β-xilosidases, arabinofuranosidases, glucuronidases, acetil xilana esterase e ácido ferúlico esterase e tem sido alvo de diversos estudos sobre a produção e aplicação destas enzimas em processos biotecnológicos, como a hidrólise de diferentes substratos para obtenção de açúcares fermentáveis. Entre os actinomicetos, as bactérias do gênero Streptomyces em particular, têm sido estudadas devido ao seu importante papel biotecnológico. No presente estudo, é relatada a expressão do gene, purificação e caracterização da xilanase (XynBS27) recombinante pela levedura P. pastoris. Para alcançar altos níveis de produção, o gene foi desenhado e sintetizado, otimizando o códon usage para P. pastoris. O gene sintético (xynBS27) foi clonado em vetor de expressão contendo o promotor AOXI, seguindo-se da integração no genoma da levedura. A maior produção da XynBS27 foi obtida após 96 h de indução, 2% de metanol, à 28 ºC e 200 r.p.m. (80 U/mL), a enzima foi purificada por de cromatografia de exclusão molecular, apresentando atividade específica de 8525 U/mg, sua maior atividade foi a 75 ºC e pH 6, se mostrou termo estável e apresentou estabilidade em pH 5, 6 e 7. A XynBS27 apresenta massa molecular de 19 kDa é ativa em zimograma. Diversos íons foram testados, sendo o Al3+, NH4+, Ba2+ e o Mg2+ indutores e os íons Ag+, Hg2+ e Cu2+ inibidores, os sulfetos de Mn2+, Zn2+, Fe3+ e os agentes desnaturantes EDTA e SDS também inibiram a XynBS27. A enzima é tolerante à altas concentrações de glicose e xilose. Os valores de Km e Vmáx foram 12,38 mg/mL e 13,679 µmol/(min.mL), respectivamente em xilana, Ki de 180 mM de xilose, indicando inibição competitiva. A utilização da enzima na panificação mostrou-se muito promissora em relação aos parâmetros avaliados, volume, densidade, açúcar redutor, rigidez, consistência, firmeza e retenção de água.

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-04-24T13:45:43Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Andrea Leite Camargo Santana - 2017.pdf: 3114758 bytes, checksum: 4fa4c3e9a2e7062f2940b053f1250619 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-04-24T13:46:06Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Andrea Leite Camargo Santana - 2017.pdf: 3114758 bytes, checksum: 4fa4c3e9a2e7062f2940b053f1250619 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-24T13:46:06Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Andrea Leite Camargo Santana - 2017.pdf: 3114758 bytes, checksum: 4fa4c3e9a2e7062f2940b053f1250619 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2017-03-29 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Paracoccidioides fungi are the causative agents of paracoccidioidomycosis, an endemic disease in Latin America with great socioeconomic importance. Inhalation of spores, the infectious particles of the fungus, is a common way to get the infection. Its treatment is slow and generates long-term side effects making it necessary to study new metabolic pathways that can be potential targets for antifungal development. In this context, stands out the chiquimate pathway in Paracoccidioides spp., related to the production of chorismate and production of aromatic amino acids, and the chorismate synthase involved in the last stage of this pathway. The chorismate synthase from Pb18 was cloned into pGEX-4T3 vector, expressed in pLysS cells and purified on a glutathione-sepharose column. Antibodies were produced from the immunization of mice with the recombinant protein obtained and used in Western blot assay to confirm protein expression. For characterization of the enzyme, its modeling was carried out. Pull-down-GST assay was performed to identify interactions between the chorismate synthase and soluble proteins present in total protein extract of Pb18. The interactions found included proteins of different functional categories related to protein synthesis, related with metabolism of common intermediates such as folate and quinolinate or related with the availability of ATP, phosphoenolpyruvate and erythrose-4-phosphate required in the chiquimate pathway. Unexpected interactions with proteins of the cell cycle and also with regulating proteins of the cell division process were observed. / Fungos do gênero Paracoccidioides são os agentes causadores da paracoccidioidomicose, uma doença endêmica na América Latina de grande importância socioeconômica. A inalação de esporos, partículas infecciosas do fungo, é uma forma comum de adquirir a infecção. O seu tratamento é lento e gera efeitos colaterais tornando necessário o estudo de novas vias metabólicas que sejam potenciais alvos para o desenvolvimento de antifúngicos. Nesse contexto, destaca-se a via do chiquimato em Paracoccidioides spp., relacionada à obtenção de corismato e produção de aminoácidos aromáticos, sendo corismato sintase a enzima envolvida na última etapa dessa via. A corismato sintase proveniente de Pb18 foi clonada em vetor pGEX-4T3, expressa em células pLysS e purificada em coluna de glutationa-sefarose. Anticorpos foram produzidos a partir da imunização de camundongos com a proteína recombinante obtida e utilizados em ensaio de Western blot a fim de confirmar a expressão proteica. A modelagem da corismato sintase foi realizada e os aminoácidos envolvidos no sítio ativo foram identificados. Ensaios de pull-down-GST foram realizados a fim de identificar os complexos de interações entre a corismato sintase e proteínas solúveis presentes em extrato proteico total de Pb18. As interações encontradas incluíram proteínas de diferentes categorias funcionais relacionadas à síntese proteica, ao metabolismo de intermediários comuns como folato e quinolinato ou ainda com a disponibilidade de ATP, fosfoenolpiruvato e eritrose-4-fosfato necessários na via do chiquimato. Interações inesperadas com proteínas do ciclo celular e também com proteínas reguladoras do processo de divisão celular foram observadas.

O sistema de expressão em Escherichia coli foi o primeiro a ser utilizado para produzir produtos farmacêuticos recombinantes e tem muitas vantagens quando comparado com sistemas eucarióticos, como o fácil cultivo, baixo custo e alto potencial de produção. O fator estimulador de colônias de granulócito (G-CSF) atua principalmente promovendo a maturação dos neutrófilos e estimulando sua atividade fagocítica e quimiotática, além de estar envolvido com o processo de segmentação nuclear dessas células. O fator estimulador de colônias de granulócitos humano recombinante (rhG-CSF) tem sido produzido por engenharia genética em Escherichia coli, e é usado no tratamento de diversas patologias, sobretudo em neutropenias provocadas pela quimioterapia usada no tratamento de tumores, pela radioterapia e pelo uso de drogas que suprimem a produção de células mieloides. Desse modo, o presente estudo teve como objetivo a expressão da proteína rhGCSF em bactérias Escherichia coli. A clonagem do gene rhG-CSF no vetor de expressão pET-28a(+) foi realizada nos sítios de restrição das enzimas EcoRI e XhoI, e a expressão da proteína recombinante em cepas de bactéria Escherichia coli BL21DE3 foi obtida com sucesso. A proteína rhG-CSF, fundida à cauda de seis histidinas, foi purificada com êxito e identificada pelas técnicas de Western Blotting e por espectrometria de massas. São necessários estudos para avaliar a integridade estrutural e atividade biológica da proteína produzida, que se confirmada, possibilita que esta seja produzida em escala piloto. / The expression system in Escherichia coli was the first to be used to produce recombinant pharmaceuticals and has many advantages compared to eukaryotic systems, such as easy cultivation and high production potential at low costs. The granulocyte colony (G-CSF) stimulating factor acts primarily by promoting the maturation of neutrophils and stimulating their phagocytic and chemotactic activity. G-CSF is also involved with the process of neutrophils nuclear segmentation. The recombinant human granulocyte colonies stimulating factor (rhG-CSF) has been produced by genetic engineering in Escherichia coli, and it is used to treat of several conditions, especially neutropenia caused by chemotherapy used in the treatment of tumors, by radiotherapy and by the use of drugs that suppress the production of myeloid cells. The present study aimed the expression of rhG-CSF protein in Escherichia coli bacteria. The cloning of rhG-CSF gene in the expression vector pET- 28a (+) was carried out on the restriction sites of the EcoRI and XhoI enzymes. Expression of the recombinant protein in Escherichia coli BL21DE3 was successfully achieved. The rhG-CSF protein, fused with a six histidine tag, was obtained and successfully purified and identified by the Western Blotting and by mass spectrometry techniques. Studies are needed to assess the structural integrity and biological activity of the protein produced, which, if confirmed, enables the production on a pilot scale.

A biologia da reprodução sexual de plantas é um campo de pesquisa de grande importância, já que a maioria dos alimentos consumidos pelo homem é composta de partes reprodutivas das plantas (frutos e sementes), oriundas do desenvolvimento de partes do pistilo fertilizado. Em Nicotiana tabacum, identificou-se um gene específico de estigma/estilete, SCI1 (Stigma/style Cell-cycle Inhibitor 1), que atua na inibição da proliferação celular (DePaoli et al., 2011). Através de ensaios de pull-down, verificou-se a interação da proteína SCI1 com uma proteína quinase dependente de ciclina (CDK) (Strini, dados não publicados). Este trabalho visou à caracterização dessa nova CDK, ortóloga da CDKG;2 de Arabidopsis. A sequência correspondente de N. tabacum (NtCDKG;2) foi amplificada por PCR, a partir de cDNAs de estigmas/estiletes, clonada e sequenciada, o que permitiu a confirmação de sua identidade. A expressão de NtCDKG;2 foi analisada nos diferentes órgãos vegetativos e reprodutivos, por qRT-PCR, o que evidenciou um perfil de expressão ubíqua. Ao estudar o perfil de expressão desse gene nos estigmas/estiletes dos doze estádios de desenvolvimento floral de N. tabacum, observa-se que NtCDKG;2 é mais expresso nos estádios tardios do desenvolvimento em direção à antese, indicando uma função importante de sua proteína ao final do desenvolvimento do pistilo. Análises de expressão de NtCDKG;2 em estigmas/estiletes, de plantas de N. tabacum com produção aumentada do hormônio auxina no pistilo, sugerem que NtCDKG;2 é regulado transcricionalmente por esse hormônio. A expressão transiente da proteína de fusão NtCDKG;2-GFP, em folhas de N. tabacum, evidenciou a localização nuclear da proteína em estudo. Também foram geradas plantas transgênicas estáveis com superexpressão e com silenciamento por RNAi de NtCDKG;2. Apesar dos altos níveis de transcritos de NtCDKG;2 nas plantas de superexpressão e dos baixos níveis nas plantas silenciadas, não foram observadas alterações fenotípicas macroscópicas nessas plantas. Adicionalmente, obteve-se a expressão da proteína NtCDKG;2, fusionada a uma tag de histidina em sua porção N-terminal, em células de Escherichia coliBL21(DE3)CodonPlusRP. Através dos estudos realizados neste trabalho e análises conjuntas da literatura, é possível propor que NtCDKG;2 codifique uma proteína que está envolvida no controle do ciclo celular nos estigmas/estiletes de N. tabacum. / The biology of plant sexual reproduction is a research field of great importance, since most of the food consumed by humans is composed of plant reproductive parts (fruits and seeds), originated by the development of fertilized pistil parts. In Nicotiana tabacum, it was identified a stigma/style-specific gene, SCI1 (Stigma/style Cell-cycle Inhibitor 1), which acts in the inhibition of cell proliferation (DePaoli et al., 2011). Through pull down assays, the interaction of the SCI1 protein with a cyclin-dependent protein kinase (CDK) was verified (Strini, unpublished). This work aimed the characterization of this new CDK, orthologous to the Arabidopsis CDKG;2. The N. tabacum corresponding sequence (NtCDKG;2) was PCR amplified, from stigmas/styles cDNAs, cloned and sequenced, which allowed the confirmation of its identity. The NtCDKG;2 expression was analyzed in the different vegetative and reproductive organs, by qRT-PCR, evidentiating an ubiquitous expression pattern. Studying the expression pattern of this gene in stigmas/styles of the twelve stages of N. tabacum flower development, it was observed that NtCDKG;2 is more expressed at the later developmental stages towards anthesis, indicating an important function of its protein in the end of pistil development. NtCDKG;2 expression analyses in stigmas/styles of N. tabacum plants with an enhanced auxin production in the pistil suggest that NtCDKG;2 is transcriptionally regulated by this hormone. The transient expression of the fusion protein NtCDKG;2-GFP, in N. tabacum leaves, evidentiated the nuclear localization of the studied protein. Stable transgenic plants overexpressing and silencing NtCDKG;2 by RNAi were also generated. Despite the high transcript levels in the plants overexpressing NtCDKG;2 and the low transcript levels in the silencing plants, macroscopic phenotypic alterations were not observed on these plants. Additionally, the expression of the NtCDKG;2 protein, with a histidine tag fused in its N-terminal, was obtained in Escherichia coli BL21(DE3)CodonPlusRP cells. Through studies performed on this work and literature analyses, it is possible to propose that NtCDKG;2 encodes a protein that is involved in the control of cell cycle at the N. tabacum stigmas/styles.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_natalia_camacho.pdf: 752258 bytes, checksum: 4db6bde27e4ad1a1adedd5d44779d4aa (MD5) Previous issue date: 2007-06-01 / Lectins are proteins or glicoproteins of non-immune origin with binding specificities for carbohidrates, that interact with glicocomponents present in plant and animal cells, bacteria and viruses. This property makes lectins remarkable markers used in histochemical and biochemical studies, and for characterization and differentiation of cells. Leguminous plants are the major source of lectins, proteins that possess important biological activities, like insecticidal and antiproliferative against cancer cell lines. Thus, the aim of this work was to develop a heterologous expression system for a recombinant lectin from Bauhinia forficata, a leguminous plant popularly known as pata-de-vaca , in E. coli, to study its characteristics and biological activities. The lectin gene bfl was amplified by PCR from genomic DNA, and cloned to expression vectors pQE30 e pET32a(+). Recombinant BFL was expressed in E. coli in insoluble form by using the vector pET32a(+)/bfl. The lectin was purified by Ni +2 -Sepharose affinity chromatography, with a yield of 40 mg.L -1 . The sequence and carbohidrate specificity of rBFL is similar to other related lectins. The rBFL lectin presents in monomer and dimer forms, with aparent molecular mass of 44 and 94 kDa, respectively, shows biological activity in hemagglutination assay in the presence of divalent metal cations (Ca +2 and Mn +2 ) and antiproliferative effect on human cancer cell lines MCF-7 (breast cancer), HT-29 (colon cancer) and HL-60 (leukemia) according as the concentration used. The rBFL lectin showed dose-dependent inhibition in HT-29 cells, stimulatory effect on proliferation of MCF-7 cells in higher concentrations, and no induction of cell death was observed in any cancer cell line. The results obtained in this work, about rBFL lectin, never before isolated or produced in heterologous system, motivates the performance of new characterization assays to elucidate possible applications. / Lectinas são proteínas ou glicoproteínas de origem não imune com propriedade de ligação especifíca a carboidratos, capazes de interagir com glicocomponentes presentes em células de plantas, animais, bactérias e vírus. Essa propriedade faz das lectinas notáveis marcadores utilizados em estudos histoquímicos, bioquímicos e na caracterização e diferenciação de células. Plantas leguminosas constituem-se na maior fonte de lectinas, que possuem atividades biológicas importantes, como atividade inseticida e antiproliferativa sobre células tumorais. Diante disto, o objetivo deste trabalho foi desenvolver um sistema de expressão heteróloga para uma lectina de Bauhinia forficata (rBFL), popularmente conhecida como pata-de-vaca , em E. coli, com o intuito de elucidar suas características e atividades biológicas. O gene bfl da lectina foi amplificado por PCR a partir do DNA genômico, e clonado nos vetores de expressão pQE30 e pET32a(+). A lectina rBFL foi expressa em larga escala pelo vetor pET32a(+)/bfl em E. coli, na forma insolúvel. A purificação foi realizada por cromatografia de afinidade em coluna de Ni +2 -Sepharose, com rendimento de 40 mg.L -1 . A seqüência da lectina rBFL e sua especificidade por carboidrato é similar a de lectinas relacionadas. A lectina rBFL apresenta-se na forma de monômeros e dímeros, com massa molecular aparente de 44 e 94 kDa, respectivamente, possui atividade biológica em ensaio de hemaglutinação na presença de cátions divalentes (Ca +2 and Mn +2 ) e demonstra efeito antiproliferativo sobre as linhagens tumorais humanas MCF-7 (câncer de mama), HT-29 (câncer de cólon) e HL-60 (leucêmica), dependendo da concentração utilizada. A rBFL demonstrou efeito inibitório dose-dependente sobre HT-29, e efeito estimulatório sobre a proliferação da linhagem MCF-7 em altas concentrações, não induzindo morte celular em nenhuma das linhagens. Os resultados obtidos neste trabalho acerca da rBFL, nunca antes isolada ou produzida em sistema heterólogo, motivam a realização de novos ensaios de caracterização visando possíveis aplicações.