As hialuronidases de peçonhas animais são capazes de clivar o hialuronan presente na matriz extracelular, facilitando a difusão das toxinas no tecido da vítima. Essas enzimas têm sido negligenciadas, devido à instabilidade enzimática e à baixa concentração na peçonha. Assim, a expressão heteróloga das hialuronidases permite a sua obtenção em quantidades que viabilizam seu estudo estrutural e funcional. Associado a isso, o transcriptoma propicia a identificação de novas toxinas e componentes de baixa proporção na peçonha. Portanto, o presente trabalho realizou o transcriptoma da glândula de peçonha do escorpião Tityus serrulatus e a clonagem e expressão heteróloga da hialuronidase. No transcriptoma foram obtidos 558 ESTs, dos quais 61,8% correspondem às toxinas, dentre elas neurotoxinas com ação em canais iônicos, metaloproteinas, hipotensinas, peptídeos antimicrobianos, dentre outros. Foram também identificadas novas toxinas como o neuropeptídeo e Ts16.1, descritos pela primeira vez para o gênero Tityus. Dentre os transcritos obtidos, foi identificado apenas um clone correspondente ao C-terminal incompleto de uma hialuronidase de T. serrulatus. Consequentemente, foi produzido o gene sintético contendo a sequência da TsHyal-1, obtida em bancos de dados, no vetor de expressão pPICZ?A para expressão heteróloga em P. pastoris. A rTsHyal-1 foi expressa em escala laboratorial em meio não suplementado (BMM) em pH 7,0 durante 96 h da indução com alimentação diária de metanol a 0,75%. A rTsHyal-1 foi produzida na sua forma solúvel e ativa (838,31 UTR/mg) e resultou em um rendimento proteico de 250 mg/L de material expresso. O secretoma do meio de expressão mostrou que além da rTsHyal-1, a P. pastoris também secreta proteínas nativas associadas à ligação do ATP, metabolismo de carboidrato e resposta ao estresse oxidativo. A rTsHyal-1 foi parcialmente purificada em troca catiônica fraca e apresentou atividade específica de 1.097,45 UTR/mg. A rTsHyal-1 apresenta massa molecular de 49,5 kDa e o tratamento com PNGase F seguido da análise por espectrometria de massas (MALDI-TOF) indicou que uma possível N-glicosilação de 4,5 kDa. Adicionalmente, o sequenciamento dos digestos trípticos da enzima realizado no MALDI-TOF e pelo Q-Exactive resultaram em 46,8% de cobertura da sequencia da proteína. A rTsHyal-1 apresenta especificidade pelo substrato hialuronan, seguido da condroitina C, A e B e apresentou atividade ótima em pH 6,0 e a 40°C. Adicionalmente, o ensaio do MTT indicou que a enzima recombinante não apresenta citotoxicidade in vitro. Os resultados obtidos determinaram as melhores condições para a expressão heteróloga da rTsHyal-1, que corresponde à primeira hialuronidase recombinante de escorpião expressa em P. pastoris com atividade enzimática preservada / The venom hyaluronidases of animals are able to cleave hyaluronan present in the extracellular matrix, acting as a spreading factor for the toxins into the tissues of the victim. These enzymes have been neglected due to their instability and low concentration in the venom. Thus, heterologous expression of hyaluronidases permits the obtainment of sufficient amount for structural and functional studies. Moreover, the transcriptome allows the identification of new toxins or components with low proportion in the venom. In this way, this study aimed the construction of the transcriptome of Tityus serrulatus venom gland and cloning/heterologous expression of hyaluronidase. In the transcriptome, 558 ESTs were identified and 61.8% corresponded to toxins, such as neurotoxins with action on ion channels, metalloproteins, hypotensins, antimicrobial peptides, among others. In addition, new toxins were identified, comprising one neuropeptide and Ts16.1, described for the first time to the genus Tityus. Among the obtained transcripts, one identified clone corresponded to an incomplete C-terminal of a hyaluronidase. Consequently, a synthetic gene was synthesized containing the sequence of TsHyal-1 (obtained from databases) in the pPICZ?A vector for heterologous expression in P. pastoris. The rTsHyal-1 was expressed at laboratorial scale in unsupplemented medium (BMM) at pH 7.0 for 96 h, after induction time, with daily feeding of 0.75% methanol. The rTsHyal-1 was produced in soluble and active form (838.31 UTR/mg) and resulted in a protein yield of 0,266 mg/mL in final expressed material. Besides, the secretome of the medium showed that P. pastoris also secretes native proteins bound with ATP, proteins related to carbohydrate metabolism and oxidative stress response. The rTsHyal-1 was partially purified in a weak cation exchange and presented specific activity of 1097.45 UTR/mg. The rTsHyal-1 has molecular mass of 49.5 kDa and the treatment with PNGase F and analysis by mass spectrometry (MALDI-TOF) indicated a potential N-glycosylation of 4.5 kDa. Additionally, the sequencing of tryptic digests performed in the MALDI-TOF and Q-Exactive resulted in 46.8% of protein sequence coverage. The rTsHyal-1 presents substrate specificity for hyaluronan followed by chondroitin C, A and B and showed an optimum activity at pH 6.0 and 40°C. Furthermore, the MTT assay indicated that the recombinant enzyme does not display in vitro cytotoxicity. These results validate the biotechnological process of the heterologous expression of rTsHyal-1. This is the first recombinant hyaluronidase from scorpions expressed in P. pastoris system with enzymatic activity preserved.

Submitted by Wendell Amoedo (wendell.amoedo@hotmail.com) on 2018-11-26T14:35:47Z No. of bitstreams: 1 dissertação.kerollen.runa.pinto2017.pdf: 1354749 bytes, checksum: 47321c0e5d660481ffc33d9d3204b2f0 (MD5) / Submitted by Wendell Amoedo (wendell.amoedo@hotmail.com) on 2018-11-28T13:01:00Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) dissertação.kerollen.runa.pinto2017.pdf: 1354749 bytes, checksum: 47321c0e5d660481ffc33d9d3204b2f0 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2018-11-28T13:20:12Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) dissertação.kerollen.runa.pinto2017.pdf: 1354749 bytes, checksum: 47321c0e5d660481ffc33d9d3204b2f0 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-11-28T13:20:12Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) dissertação.kerollen.runa.pinto2017.pdf: 1354749 bytes, checksum: 47321c0e5d660481ffc33d9d3204b2f0 (MD5) Previous issue date: 2017-02-27 / FAPEAM - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas / Enterokinase (EC 3.4.21.9) is a heterodimer serine protease, a natural activator of trypsinogen, capable of cleaving specifically the sequence Asp-Asp-Asp-Asp-Lys. Due to the high specificity of the recognition site, it became a great tool of biotechnological interest. It is usually used to remove affinity tags in vitro, of recombinant proteins. In this work, the molecular cloning strategy resulted in the construction of the pDMK06, capable of programming the regulated expression of a heterologous gene ETK-Trx in E. coli. Through the cleavage process with restriction enzymes NdeI and BamHI, it was possible to obtain the coding sequence of the fusion protein between enterokinase and thioredoxin (ETK-Trx) of approximately 1259 bp from pENTK plasmid. Then, this sequence was subcloned at NdeI and BamHI sites of the expression vector pDM02, originating the recombinant plasmid pDMK06. This vector contains the TH2 promoter, which is efficiently regulated by Lac operator/repressor. E. coli JM110 cells transformed with the recombinant plasmid showed smaller growth in a solid medium when the expression of the heterologous protein was induced by IPTG in comparison with the control; however, this effect was not detected in the liquid medium. Furthermore, the E. coli cells morphology was analyzed through optical microscopy containing the recombinant plasmid pDMK06, when it was observed, all through the growth time, modifications on cell morphology, characterized by the formation of filaments in those induced with IPTG, in comparison with the control. For expression analysis of the recombinant protein ETKTrx, polyacrylamide gel electrophoresis SDS-PAGE was performed with the samples that grew with IPTG induction for eight hours. The results showed that the protein ETK-Trx is about 47 kDa with a high level of expression at the insoluble fraction, probably as an inclusion corpuscle. The high levels of expression of ETK-Trx protein occurred in a perfectly regulated way, showing the functionality of the pDM02 plasmid expression/regulation system. / A enteroquinase (EC 3.4.21.9) é uma serino protease heterodimérica, ativadora natural do tripsinogênio, capaz de clivar especificamente a sequência Asp-Asp-Asp- Asp-Lys. Devido à alta especificidade do sítio de reconhecimento tornou-se uma ferramenta de grande interesse biotecnológico. É comumente utilizada para a remoção in vitro de marcas de afinidade, como etiquetas de fusão (tags) de proteínas recombinantes. No presente trabalho, a estratégia de clonagem molecular resultou na construção do plasmídeo pDMK06, que é capaz de programar a expressão heteróloga regulada do gene ETK-Trx em E.coli. Por meio do processo de clivagem com as enzimas de restrição NdeI e BamHI foi possível obter a sequência codificadora da proteína de fusão entre enteroquinase e tiorredoxina (ETK-Trx) de aproximadamente 1259 pb partir do plasmídeo pENTK, a seguir essa sequência foi subclonada nos sítios de NdeI e BamHI do vetor de expressão pDM02, originando o plasmídeo recombinante pDMK06. Esse vetor contém o promotor TH2 que é regulado eficientemente pelo sistema operador/repressor Lac. Células de E.coliJM110 transformadas com o plasmídeo recombinante mostram menor crescimento em meio sólido quando a expressão da proteína heteróloga era induzida por IPTG em relação ao controle, porém esse efeito não foi detectado em meio líquido. Além disto foi analisado por microscopia ótica a morfologia das células de E.colicom o plasmídeo recombinante pDMK06, onde observou-se no decorrer do tempo de crescimento e indução, alterações na morfologia celular caracterizada de filamentação das células induzidas com IPTG quando comparadas com o controle. Para análise da expressão da proteína recombinante ETK-Trx utilizou-se a eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-PAGE das amostras referentes a 8 horas de crescimento e indução com IPTG. Os resultados obtidos apresentaram a proteína ETK-Trx com tamanho aproximado de 47kDa com alto nível de expressão na fração insolúvel, provavelmente em forma de corpúsculo de inclusão. A expressão em altos níveis das proteínas ETK-Trx ocorreu de forma perfeitamente regulada mostrando a funcionalidade do sistema de expressão/regulação do plasmídeo pDM02.

Celulases têm atraído muito interesse nos últimos anos devido a sua habilidade na bioconversão de material lignocelulolítico em glucose, a qual pode, então, ser convertida a etanol por fermentação. O complexo celulolítico capaz de degradar a celulose consiste de várias enzimas (principalmente celulases e β-glucosidases) e proteínas auxiliadoras, que atuam em sinergismo para eficientemente hidrolizar a biomassa. Nesse estudo, investigou-se a hidrólise enzimática do bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado utilizando enzimas produzidas por T. harzianum e enzima comerial. O rendimento de hidrólise foi avaliado quanto a diferentes níveis de deslignificação de biomassa, graus de cristalinidade da celulose, composição dos coquetéis enzimáticos e adição de BSA. Estudos de difração de raios-X mostraram que a cristalinidade da lignocelulose não é um fator determinante na recalcitrância ao ataque enzimático. Além disso, a adição de BSA não teve qualquer efeito no rendimento da hidrólise. O mais eficiente coquetel enzimático foi obtido misturando o preparado comercial com o produzido pelo T. harzianum (rendimento acima de 97%). Esse desempenho está, provavelmente, relacionado com níveis adequados de β-glucosidases e xilanases no coquetel. Devido a essa eficiente atividade celulolítica, o fungo T. harzianum tem um grande potencial em aplicação para hidrólise de biomassa. A celobiohidrolase I, uma exoglucanase, é a principal enzima secretada por esse fungo (cerca de 60% do total) e nesse estudo ela foi expressa em bioreator, purificada por cromatografia de troca iônica seguida de gel filtração e caracterizada bioquímica, biofísica e estruturalmente. Conforme confirmado por SAXS, tanto a CBHI inteira quanto seu domínio catalítico, obtido por digestão parcial com papaína, são monoméricos em solução e apresentam distância máxima (DMax) de 110 e 60 Å, e raio de giro (Rg) de 20 e 27 Å, respectivamente. Os resultados indicam que o linker é flexível em solução e confirmam o formato de girino da enzima. A CBHI possui atividade máxima em pH 5.0 e temperatura de 50 °C, com atividade específica contra Avicel &reg e pNPC de 0,28 and 1,53 U/mg, respectivamente. Outras celulases de interesse foram também expressas para caracterização, no entanto, para essas, foi utilizado o sistema de expressão heteróloga em Aspergillus Níger ou Pichia pastoris. O domínio catalítico da endoglucanase I de T. harzianum foi expresso em A. Níger. A proteína tem atividade específica contra CMC de 15,8 U/mg e pH e temperatura ótima de 3 e 50 °C, respectivamente. A proteína é estável nessas condições em até 3 dias de incubação (dados de ensaios de atividade residual). Estudos biofísicos de deslocamento térmico e dicroísmo circular apresentaram alguns parâmetros de estabilidade de estrutura terciária e secundária, respectivamente. A proteína perde estrutura terciária regular, em pH 5, em torno de 30 °C mas sua estrutura secundária é desordenada somente em pH 9 (quando a 25 °C). Experimentos de dicroísmo circular também indicaram a composição de estrutura secundária do domínio catalítico da EGLI de 6% de α-hélice e 42% de folhas- β. / Cellulases have attracted an outstanding interest in the recent years because of its ability in the bioconversion of cellulose-containing raw materials into glucose, which can then be converted into ethanol by fermentation. The cellulase complex able to degrade cellulose consists of several enzymes (mainly cellulases and β-glucosidases) and auxiliary proteins, which act in synergism to efficiently solubilize the biomass. In this study, we investigated the enzymatic hydrolysis of pretreated sugarcane bagasse using crude enzyme extracts produced by Trichoderma harzianum as well as from the extract in combination with a commercial cocktail. The influence of different levels of biomass delignification, degree of crystallinity of lignicellulose, composition of enzymatic activities and BSA on enzymatic hydrolysis yields was evaluated. Our X-ray diffraction studies showed that crystallinity of lignocellulose is not a key determinant of its recalcitrance toward enzymatic hydrolysis. In fact, under the experimental conditions, an increase in crystallinity of lignocellulosic samples resulted in increased glucose release by enzymatic hydrolysis. Furthermore, under the same conditions, the addition of BSA had no significant effect on enzymatic hydrolysis. The most efficient enzyme blends were obtained by mixing a commercial enzymatic cocktail with T. harzianum cellulase preparations (above 97%). Increased hydrolytic efficiencies appeared to correlate with having an adequate level of both β-glucosidase and xylanase activities in the blends. Due to its elevated cellulolytic activity, the filamentous fungus T. harzianum has a considerable potential in biomass hydrolysis applications. The cellobiohydrolase I, an exoglucanase, is the main enzyme secreted by this fungus (about 60% of total) and in this study we have expressed, purified and performed an initial biochemical, biophysical and structural characterization. As confirmed by small angle X-ray scattering (SAXS) both full-length CBHI and its catalytic core domain (CCD), obtained by partial digestion with papain, are monomeric in solution and they have Dmax of 110 and 60 Å, and Rg of 20 and 27 Å, respectively. The results indicate that the linker is flexible in solution and confirmed the tadpole shape of the enzyme. CBHI displays maximum activity at pH 5.0 and temperature of 50 °C, with specific activities against Avicel &reg and pNPC of 0,28 and 1.53 U/mg, respectively. Other celulases were also expressed, however, for them we have used the heterologous expression system in Aspergillus niger and Pichia pastoris. The catalytic domain of endoglucanase I from T. harzianum was expressed in A. niger and partially characterized. The protein has specific activity against CMC of 15.8 U/mg and optimum pH and temperature of 3 and 50 °C, respectively. The protein is stable in these conditions until 3 days of incubation. Biophysical studies of termal shift and circular dichroism (CD) assays have showed some parameters of stability of tertiary and secondary structure of the protein. It loses regulary terciary structure in pH 5 around 30 °C but the secondary structure is desordened only in pH 9 at 25 °C. CD experiments also indicated the secondary structure compsition of the catalytic domain of EGLI: 6% de α-helices and 42% de β-sheet.

Orientador: Marcos Roberto de Mattos Fontes / Resumo: As fosfolipases A2-like (PLA2s-like) estão entre os principais componentes de peçonhas de serpentes envolvidas no processo de envenenamento, particularmente em serpentes do gênero Bothrops. Essas toxinas promovem efeitos miotóxicos que não são neutralizados pela soroterapia convencional e podem levar até a perda do membro afetado. Os estudos estruturais, em especial a técnica de cristalografia, são uma ferramenta poderosa na compreensão da relação estrutura-função de moléculas. O presente trabalho teve por objetivo estudar estruturalmente por diferentes técnicas biofísicas (dicroísmo circular, espalhamento de luz dinâmico, Espectroscopia de fluorescência, termoforese de microescala, cristalização, coleta de dados de difração de raios-X, elucidação e análise estrutural) uma Lys-49-PLA2 da peçonha de Bothrops pauloensis, denominada BnSP-7, em suas formas nativa e complexadas com o ácido cinâmico e seus derivados, ácido cafeico e ácido p-cumárico. Adicionalmente, a mesma proteína foi estudada em sua forma recombinante. A ORF referente à BnSP-7 foi inserida no vetor a partir dos sítios de restrição EcoRI (3’ DNA) e NotI (5’ DNA). Esse inserto foi inserido em um vetor pPicZA, transformado em Pichia pastoris e induzida a expressão. Após purificação da proteína expressa, foram realizados ensaios de cristalização. Nas estruturas da BnSP-7 obtida a partir do veneno de B. pauloensis, foram encontrados ligantes na região MDoS nos três complexos elucidados, bem como a análise dos túnei... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-06-23T11:41:54Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 388479 bytes, checksum: 3f6213e3987bc7cbece94deab1128175 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-23T11:41:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 388479 bytes, checksum: 3f6213e3987bc7cbece94deab1128175 (MD5) Previous issue date: 2001-03-15 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A região codificadora do gene LAC4, que codifica a β-galactosidase de Kluyveromyces marxianus var. lactis, foi isolada do plasmídeo pLAC4-12, por meio da técnica de reação de polimerização em cadeia (PCR) com oligonucleotídeos iniciadores, que amplificam um fragmento de aproximadamente 3.000 pb. Com os objetivos de expressar e secretar a β- galactosidase, este fragmento foi clonado em um vetor de expressão e secreção pPIC9 do sistema de expressão de Pichia pastoris. A região codificadora LAC4 intacta e uma versão truncada foram fundidas em fase com a seqüência sinal de secreção do fator-α, sob controle do promotor AOX1. A hidrólise dos DNAs recombinantes obtidos com as enzimas de restrição apropriadas confirmou a clonagem da região codificadora LAC4 intacta nas orientações anti-senso e senso e da versão truncada no vetor pPIC9. Os clones foram linearizados e usados para transformar células eletrocompetentes de Pichia pastoris GS115 (His - e Mut + ). Colônias recombinantes foram isoladas e as inserções da região codificadora LAC4 intacta e truncada no genoma da levedura foram confirmadas por “PCR” com iniciadores específicos. Colônias recombinantes positivas foram cultivadas em glicerol e a expressão dos genes recombinantes foi induzida com metanol. Amostras foram coletadas periodicamente e o meio extracelular e a massa de células analisados quanto à atividade de β -galactosidase. Nenhum aumento na atividade de β - galactosidase foi observado perante o controle. Espera-se que a transformação de linhagens da levedura Mut - com os clones obtidos possa resultar na produção de uma proteína funcional. / The codins Kluyveromyces region marxianus of var. the lactis β-galactosidase was isolated LAC4 from gene, pLAC4-12, from by polimerase chain reaction (PCR) technique with primers that amplify a fragment of approximately 3.000 bp. Expression and secretion vector to expresse and secrete β-galactosidase, the intact and truncated LAC4 coding regions were fused in phase with the factor-α secretion signal sequence in the Pichia pastoris pPIC9. Appropriate restriction enzyme hydrolates confirmed the insertion of the intact LAC4 coding region in sense and antisense orientations, as well as its truncated version in to the pPIC9 vector. The clones were linearized and used to transform electrocompetent Pichia pastoris GS115 (His - e Mut + ) cells. Recombinant cells were isolated and the insertions of intact and truncated LAC4 coding regions in the yeast genome were confirmed by PCR with specific primers. Positive recombinant colonies were grown in glycerol and the expression of the heterologous genes was induced with methanol. Samples were periodically collected and the extracellular medium and cell mass were analyzed for β-galactosidase activity. No increase in β-galactosidase activity was observed over the control. The transformation of Mut - yeast cell lines with the clones is expectial to result in the production of a functional protein. / Dissertação importada do Alexandria

MEDEIROS, Suelen Carneiro de. Expressão heteróloga de uma glicosil hidrolase da Família 18 (cv2736) de Chromobacterium violaceum em Pichia pastoris com potencial antibacteriano. 2012. 122 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2012. / Submitted by Eric Santiago (erichhcl@gmail.com) on 2016-07-11T13:31:54Z No. of bitstreams: 1 2012_dis_scmedeiros.pdf: 2847279 bytes, checksum: c0e6c68e1b479acad3f4108642933a87 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-08-02T20:21:01Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_dis_scmedeiros.pdf: 2847279 bytes, checksum: c0e6c68e1b479acad3f4108642933a87 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-02T20:21:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_dis_scmedeiros.pdf: 2847279 bytes, checksum: c0e6c68e1b479acad3f4108642933a87 (MD5) Previous issue date: 2012 / Chitinases are enzymes capable of hydrolyzing chitin, a polysaccharide composed of units of N-acetyl-D- glucosamine, which is abundant in nature. The genome sequence of C. violaceum ATCC 12472 has revealed some genes encoding proteins with potential applications in agriculture and medicine, such as those encoding chitinases. This study aimed to express the protein CV2736 in Pichia pastoris KM71H and to evaluate its antimicrobial potential against microorganism of medical importance. To this purpose, the full ORF (encoding rCV2736 PS+) and a partial sequence of it, encoding a truncated protein without its putative signal peptide (rCV2736PS‒), were cloned into the vector pPICZ α A for expression in P. pastoris. The protein rCV2736 PS+ was detected in the cell-free culture medium of P. pastoris cells harboring the corre sponding expression cassete. The recombinant CV2736PS+ was produced in a heterogeneous manner, and when analyzed by SDS-PAGE, three protein bands with apparent molecular masses of 41. 3, 38.1 and 36. 2 kDa were detected. The protein band with the highest molecular mass (41.3 kDa) was stained with the Periodic acid - Schiff’s reagent, thus showing that this band corresponds to N-glycosylated rCV2736PS+. Furthermore, tryptic peptides identified by mass spectrometry (ESI-MS) confirmed the identity of the expressed protein. The recombinant protein produced without the first 22 amino acids(rCV2736PS‒) showed higher chitinase activity than that found for th e fraction containing rCV2736PS+, despite not being detected by SDS-PAGE. The recombinant protein CV2736PS+, present in the fraction F0/95 from the culture medium of induced cells, was active after heat treatment at 50 °C and its maximum chitinolytic activity was recorded at pH 3.0. This fraction was also able to degrade the synthetic substrates 4-nitrophenyl N,N'-diacetyl -β-D-chitobioside and 4-nitrophenyl N,N',N''-triacet yl chitotrioside, which characterizes an endochitinase activity. Abinitio molecular modeling demonstrated that the polypeptide of CV2736 likely folds as a(β/α)8 barrel (also known as TIM barrel), which is typical of the GH18 family proteins. The fraction F0/95 showed antimicrobial activity against Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Staphylococcus aureus and growth inhibition against Salmonella cholera-suis. The same fraction were evaluated against the yeast Candida albicans, but was not detectable inhibition of this microorganism in the assay. These results suggest that rCV2736 should be further studied as a new anti-bacterial agent. / Quitinases são enzimas capazes de hidrolisar quitina, um polissacarídeo formado por unidades de N-acetil-β-D-glucosamina, que é extremamente abundante na natureza. Após o sequenciamento do genoma de C. violaceum ATCC 12472, alguns genes referentes a proteínas com potencial biotecnológico foram encontrados, dentre eles os que codificam para quitinases. Este trabalho teve como objetivos expressar a proteína CV2736 de C. violaceum ATCC 12472 de forma recombinante em células de Pichia pastoris KM71H e avaliar seu potencial antimicrobiano frente a microrganismos de importância médica. Para isto, a sequencia completa da ORF (CV2736PS+), bem como uma sequencia parcial, codificando uma proteína truncada, sem um possível peptídeo sinal N-terminal (CV2736PS‒), foram clonadas no vetor de expressão pPICZαA, para expressão em P. pastoris KM71H. A proteína completa (rCV2736PS+) foi detectada em uma fração proteica, contendo as proteínas secretadas para o meio de cultura, por células de P. pastoris transformadas com o respectivo cassete de expressão recombinante. A rCV2736PS+ apresentou-se de forma heterogênea, quando analisada por SDS-PAGE, exibindo três bandas com massas moleculares aparentes de 41,3, 38,1 e 36,2 kDa, respectivamente, sendo uma delas (41,3 kDa) maior do que se poderia deduzir a partir da sequencia de aminoácidos. Após coloração com reagente de Schiff para revelação de glicoproteínas, constatou-se que essa banda (41,3 kDa) correspondia a rCV2736PS+ na sua forma N-glicosilada. Além disso, rCV2736PS+ teve seus peptídeos identificados por espectrometria de massas, na fração F0/95 do meio de cultura livre de células. A proteína recombinante produzida sem os 22 aminoácidos iniciais (rCV2736PS‒) apresentou atividade quitinásica maior que a encontrada para a fração contendo rCV2736PS+, apesar de não ter sido detectada por SDS-PAGE. A fração F0/95 do meio de cultura contendo rCV2736PS+ mostrou-se termoestável até 50°C e com pico de atividade quitinolítica em pH 3,0. A mesma fração apresentou maior atividade endoquitinásica e ativa contra os substratos sintéticos 4-nitrofenil N,N’–diacetil-β-D-quitobiosídeo e 4-nitrofenil N,N’,N’’–triacetilquitotriose. A modelagem molecular evidenciou o dobramento na forma de barril (β/α)8 (barril TIM), típico das proteínas da família GH18. Do mesmo modo, a fração F0/95 foi testada contra seis espécies de bactérias, apresentando atividade microbicida contra Pseudomona aeruginosa, Escherichia coli e Staphylococcus aureus, e foi capaz de inibir o crescimento de Salmonella choleraesuis. A mesma fração foi testada contra a levedura Candida albicans, mas não foi detectada inibição do crescimento contra este microrganismo no ensaio. Portanto, a proteína recombinante rCV2736 pode, assim, ser considerada uma molécula com potencial antibacteriano. Palavras-chave: Quitinase; Pichia pastoris; antimicrobiano; Expressão heteróloga.

CORREIA, Tuana Oliveira. Quitinase de Classe I de feijão-de-corda (Vigna unguiculata): Estudo preliminar da expressão do gene, clonagem, expressão e purificação em Escherichia coli BL21(λ)DE3 e determinação da estrutura através da modelagem por homologia. 2007. 90 f.Dissertação (Mestrado em Bioquímica)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2007. / Submitted by Eric Santiago (erichhcl@gmail.com) on 2016-07-13T14:28:51Z No. of bitstreams: 1 2007_dis_tocorreia.pdf: 4501880 bytes, checksum: 7e0762a6def00c394cbdb56fc9fe2389 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-07-13T23:35:08Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2007_dis_tocorreia.pdf: 4501880 bytes, checksum: 7e0762a6def00c394cbdb56fc9fe2389 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-13T23:35:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2007_dis_tocorreia.pdf: 4501880 bytes, checksum: 7e0762a6def00c394cbdb56fc9fe2389 (MD5) Previous issue date: 2007 / In this work we have made a preliminary study on the expression of a class I chitinase gene from cowpea (Vigna unguiculata L.Walp), cloning and expression of this gene in Escherichia coli BL21(λ)DE3 cells and, through homology modeling, we determined the three­ dimensional structure of this protein. The expression of the class I quitinase gene from cowpea was performed by RT­PCR from the total RNA, with specific primers, from seeds and pods in distinct stages of development (2, 4, 6, 8 , 10, 12, 14, 16 and 18 days), belonging to two contrasting genotypes regarding to infection by Callosobruchus maculatus, IT81D­1053 (resistant) e TE97­419­07F (susceptible). The gene expression in leaves, roots, epicotyls and hipocotyls from two contrasting genotypes considering the infection by the nematoid Meloidogyne incongnita, CE­31(resistant) e TE97­411­1F (susceptible). The VuChiI gene cloning was accomplished from the amplified product on RT­PCR with IT81D­1053 seeds, and the amplified product from the genomic DNA of MONTEIRO. Eleven clones were obtained, from which nine were sequenced. The cloning of R7 clone was accomplished in pET15b vector and the expression of the recombinant protein was induced in the presence of IPTG 1mM. The protein, with 30 kDa, was visualized through a SDS­PAGE. The protein purified through an affinity chromatography in Sepharose column with immobilized Nickel did not had a significative hydrolytic activity. The models generated for the clones and for the native chitinase, have indicated that mutations that occurred did not changed the molecule's active sites. Thus, the class I chitinase gene from feijão­ de­ corda seems to present constitutive expression in all parts of the plant. The recombinant chitinase obtained was inactive. The specific mutations in the resulting clones suggests the occurrence of isoforms of this protein, what should be elucidated in the future. / No presente trabalho, foi realizado um estudo preliminar sobre a expressão de um gene de quitinase de classe I de feijão-de-corda (Vigna unguiculata L.Walp), a clonagem e expressão desse gene em células de Escherichia coli BL21(λ)DE3 e a determinação via modelagem por homologia da estrutura tridimensional dessa proteína. A expressão do gene da quitinase de classe I de feijão-de-corda foi obtida a partir de RT-PCR com oligonucleotídeos iniciadores específicos. Nessas reações, foram usadas amostras de RNA total de sementes e vagens em diferentes estágios de crescimento (2, 4, 6, 8 , 10, 12, 14, 16 e 18 dias), pertencentes a dois genótipos contrastantes quanto a infecção pelo Callosobruchus maculatus, IT81D-1053 (resistente) e TE97-419-07F (suscetível). A expressão foi avaliada também em folhas, raízes, epicótilo e hipocótilo de dois genótipos contrastantes quanto a infecção pelo nematóide das galhas Meloidogyne incongnita, CE-31 (resistente) e TE97-411-1F (suscetível). A clonagem do gene VuChiI foi realizada a partir do produto amplificado da RT-PCR de sementes de IT81D-1053, e do produto amplificado a partir do DNA genômico de MONTEIRO. Foram obtidos 11 clones confirmados, dos quais 9 foram seqüenciados. A subclonagem do clone R7 foi realizada em pET15b e a expressão da proteína recombinante foi induzida na presença de IPTG 1mM. A proteína recombinante, com aproximadamente 30 kDa, foi visualizada através de um SDS-PAGE. A proteína purificada através de uma cromatografia de afinidade em coluna de Sepharose com Níquel imobilizado não apresentou atividade quitinásica significativa. Os modelos gerados para os clones obtidos e para a quitinase nativa, indicam que as mutações ocorridas não alteram os sítios ativos das moléculas. Dessa forma, a quitinase de classe I do feijão-de-corda parece apresentar expressão constitutiva em todas as partes da planta. A quitinase recombinante obtida foi pouco ativa. As mutações pontuais nos clones obtidos sugerem a ocorrência de isoformas dessa proteína, o que ainda deve ser elucidado no futuro.

NASCIMENTO, Camila Tauane Monteiro do. Expressão heteróloga de uma osmotina laticífera e desenvolvimento de protocolos para extração da proteína recombinante a partir de corpos de inclusão. 2016. 93 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2016. / Submitted by Eric Santiago (erichhcl@gmail.com) on 2016-07-19T15:11:48Z No. of bitstreams: 1 2016_dis_ctmnascimento.pdf: 2987876 bytes, checksum: d61b36bc9503e63cca6a1c604887ad09 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-08-02T20:31:41Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_dis_ctmnascimento.pdf: 2987876 bytes, checksum: d61b36bc9503e63cca6a1c604887ad09 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-02T20:31:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_dis_ctmnascimento.pdf: 2987876 bytes, checksum: d61b36bc9503e63cca6a1c604887ad09 (MD5) Previous issue date: 2016 / In the previous step to this work, a protein identified as osmotin (CpOsm) was purified from Calotropis procera latex which showed strong antifungal activity. The protein was expressed in prokaryotic and eukaryotic systems, but a suitable protocol for purification has not been achieved. In the present work, from inclusion bodies (IB) obtained from Escherichia coli BL21 (DE3) proceeded to a survey by different solubilization protocols of proteins in an attempt to obtain the recombinant protein (rCpOsm) soluble, and then evaluates it as its activity and finally, exploring new methods for purification. The bacterial culture was induced at different conditions of temperature and time of induction. IB were subjected to chemical treatments with surfactants (CTAB; Cetrimide; ARG-12, a derivative surfactant Argenine) and a denaturing agent (guanidine hydrochloride); physical treatment by sonication and the enzymatic treatment with protease native C. procera latex. Electrophoresis assays suggested that two chemical surfactants were effective in solubilizing rCpOsm while not ARG-12. Although these cationic compounds solubilized rCpOsm more than other proteins of IB, while the sonication process samples produced with a greater variety of soluble proteins including rCpOsm. The enzymatic treatment showed that IB proteins are, in some range, digested while rCpOsm did not. All samples were evaluated for action on Colletotrichum gloeosporiodes after dialysis and lyophilization and showed inhibitory activity of spore germination and mycelial growth. However, it was shown that the activity could be related to the solubilising agents. Insoluble proteins obtained from E. coli containing the plasmid integrity, taken as a negative control showed no activity in these assays. The rCpOsm solubilized by CTAB was subjected to chromatography on Ni ++ column (Ni Sepharose 6 Fast Flow) pH 7.0; in hydrophobic media (FenilSepharose CL-4B) and ion exchange (Resource-S). None of the applied protocols resulted in the purification of rCpOsm and these data repeated what was observed previously for rCpOsm purified from Pichia pastoris. / Em etapa anterior a este trabalho, uma proteína identificada como osmotina (CpOsm) foi purificada do látex de Calotropis procera a qual apresentou forte atividade antifúngica. A proteína foi expressa em sistemas procarionte e eucarionte, mas um protocolo adequado para sua purificação não foi alcançado. No presente trabalho, partindo de corpos de inclusão (CI), obtidos de E. coli BL21(DE3) procedeu-se uma prospecção por diferentes protocolos de solubilização de suas proteínas, na tentativa de obter a proteína recombinante (rCpOsm) solúvel, para então avaliá-la quanto a sua atividade e por fim, prospectar novos métodos para sua purificação. A cultura bacteriana foi induzida em diferentes condições de temperatura e tempo de indução. Após 3 horas de indução a 37 °C, 180 rpm, os CI foram lisados e submetidos a tratamentos químicos com surfactantes (CTAB; Cetrimida; ARG-12: um surfactante derivado de argenina) e um agente desnaturante (Cloridrato de Guanidina); tratamento físico por sonicação (4 ciclos de 2,5 min. cada a 50% de potência) e tratamento enzimático com protease nativa do látex de C. procera. Ensaios de eletroforese sugeriram que os dois surfactantes químicos foram eficientes na solubilização de rCpOsm enquanto que ARG-12 não. Ainda, estes compostos catiônicos solubilizaram rCpOsm mais do que as demais proteínas dos CI, enquanto que o processo de sonicação produziu amostras com maior diversidade de proteínas solúveis, incluindo rCpOsm. O tratamento enzimático mostrou que proteínas de CI são, em algum alcance, digeridas enquanto que rCpOsm não. O efeito do tratamento dos CI com protease foi analisado por imagens de microscopia de força atômica e as diferenças de estrutura entre os CI tratados e não tratados documentados. Todas as amostras foram avaliadas quanto à ação sobre Colletotrichum gloeosporiodes após diálise e liofilização. Os produtos dos tratamentos com surfactantes apresentaram atividade antifúngica, demonstrando atividade inibitória de germinação de esporos e crescimento micelial. Entretanto, foi demonstrado que a atividade poderia estar relacionada aos agentes solubilizantes. Proteínas insolúveis obtidas de E. coli contendo o plasmídeo íntegro, tomadas como controle negativo, não apresentaram atividade nestes ensaios. A rCpOsm solubilizada com CTAB foi submetida a cromatografia em coluna de Ni++ (Ni Sepharose 6 Fast Flow) pH 7,0; em meio hidrofóbico (FenilSepharose CL-4B) e troca iônica (Resource-S). Nenhum dos protocolos aplicados resultou na purificação de rCpOsm e estes dados repetem o que foi observado previamente para a rCpOsm purificada a partir de Pichia pastoris.

TEIXEIRA, C. S. Expressão de uma quitinase de Chromobacterium Violaceum em Pichia Pastoris: purificação e caracterização parcial da proteína recombinante. 2011. 110 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2011. / Submitted by Francisco Lacerda (lacerda@ufc.br) on 2014-11-10T18:58:20Z No. of bitstreams: 1 2011_dis_csteixeira.pdf: 2266830 bytes, checksum: cf710a23bf6fe474186662c855e584ee (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa(jairo@ufc.br) on 2015-01-20T16:54:04Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_dis_csteixeira.pdf: 2266830 bytes, checksum: cf710a23bf6fe474186662c855e584ee (MD5) / Made available in DSpace on 2015-01-20T16:54:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_dis_csteixeira.pdf: 2266830 bytes, checksum: cf710a23bf6fe474186662c855e584ee (MD5) Previous issue date: 2011 / Microorganisms are a valuable tool for the expression of proteins from a variety of sources, including plants, animals and other microorganisms. Thus, chitinases, a group of glycosil hydrolases capable to hydrolize chitin, have already been expressed and purified from different systems including bacteria and yeast. Chitin, a linear polymer of N-acetyl-β-D-glucosamine (GlcNAc), is an important structural component found in the crustacean shells, in the peritrophic membrane of insect guts as well as in the fungi cell walls. The aim of this work was to express a chitinase (encoded by the ORF CV3316) from Chromobacterium violaceum ATCC 12472, using the methylotrophic yeast Pichia pastoris strains GS115 and KM71H. Furthermore, purification and partial characterization of the recombinant protein were also achieved. The GS115 strain carrying the expression cassette pPICZαA-CV3316 was selected due to its higher expression level as compared to KM71H strain. Immobilized metal ion affinity chromatography was employed to purify the recombinant chitinase which was eluted as a single peak at 0.04 M imidazol. The homogeneity of the purified protein was confirmed as judged by polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). In these conditions, the recombinant chitinase migrated as a single protein band with an apparent molecular mass of about 87 kDa. Thus, a chitinase from C. violaceum ATCC 12472 was successfully expressed in P. pastoris and the soluble recombinant protein purified. The content of secondary structure was investigated by circular dichroism (CD) spectroscopy. At 24 oC the CD spectrum revealed secondary structure contents of 37% (alpha helix), 26% (beta sheet) and 38% (random coil). The CD spectra obtained in the temperature range 10-50 oC were characteristic of beta sheet. In contrast, the CD spectra generated in the range 60-90 oC were characteristic of alpha helix. The midpoint temperature of this conformational transition was 59.6 1.2 oC as calculated from the CD experimental data. Fluorescence spectroscopy was carried out with excitation at 280 and 290 nm, producing emission spectra in which the wavelengths of maximum emission were 339 and 342 nm, respectively. This behavior is characteristic of tryptophan residues in limited contact with water. Chitinolytic activity against several substrates and the pH dependency of the enzymatic activity of the pure protein were all accessed. The purified enzyme showed hydrolytic activity on the following substrates: colloidal chitin (1,189.4 U.mgP-1), 4-nitrophenyl N-N’-diacetyl--D-chitobioside (30,411.0 U.mgP-1) and 4-nitrophenyl β-D-N-N’-N”-triacetylchitotriose (13,150.0 U.mgP-1); and, respectively. In contrast, no activity was detected using 4-nitrophenyl N-acetyl-β-D-glucosaminide as substrate. The enzyme presented an optimal chitinolytic activity at pH 5.0 using colloidal chitin as a substrate. Additionally, the antifungal activity against the phytopathogenic fungi, Fusarium solani, Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani and Penicillium herquei was investigated. The recombinant chitinase did not inhibit the spore germination and the mycelium growth of the tested fungi, at the 0.63 mgP.ml-1 concentration. Further studies should be carried out in order to discover potential applications of this protein as a biotechnological tool in the control of other phytopathogenic fungi as well as economically important pests. / A utilização de microrganismos como sistemas heterólogos de expressão de proteínas tem se mostrado uma estratégia alternativa e/ou complementar aos passos tradicionais utilizados no processo de purificação de proteínas. Diante deste contexto, quitinases (EC 3.2.1.14), enzimas hidrolíticas capazes de degradar quitina, têm sido expressas em diferentes sistemas heterólogos, incluindo bactérias e leveduras. Quitina é um polímero linear composto de resíduos de N-acetil-β-D-glucosamina (GlcNAc), sendo um importante constituinte estrutural da carapaça de crustáceos e membrana peritrófica de insetos e, ainda, da parede celular de fungos. Este trabalho teve por objetivo expressar uma quitinase, codificada pela ORF cv3316, de Chromobacterium violaceum ATCC 12472 na levedura metilotrófica Pichia pastoris, estirpes GS115 e KM71H, além de purificar e caracterizar a proteína recombinante (rCHI3316). A estirpe GS115, portando a construção (pPICZαA-CV3316), foi selecionada para os experimentos posteriores, pois apresentou um maior nível de expressão quando comparada à cepa KM71H. Cromatografia de afinidade em coluna de níquel imobilizado foi utilizada para purificar a quitinase recombinante (rCHI3316), que foi eluída como um único pico com imidazol 0,04 M. A proteína purificada se mostrou homogênea quando submetida à eletroforese em gel de poliacrilamida 15% em presença de SDS e -mercaptoetanol (SDS-PAGE). Nessas condições, uma única banda com massa molecular aparente de aproximadamente 87 kDa foi observada. A quitinase rCHI3316 de C. violaceum foi expressa de forma solúvel utilizando o sistema de expressão P. pastoris e, além disso, sua purificação foi realizada de forma satisfatória. O conteúdo de estrutura secundária foi estimado por espectroscopia de dicroísmo circular (CD), com a proteína submetida a diferentes temperaturas (10-90 °C). Na temperatura de 24 °C, o espectro de CD revelou a predominância do conteúdo de hélice alfa (38%), folha beta (26 %) e estrutura randômica (37%). Entre as temperaturas de 10-50 °C, rCHI3316 exibiu um espectro característico de folha beta. A partir de 60 °C até 90 °C, rCHI3316 adquiriu uma conformação característica de hélice alfa. A temperatura média para essa transição conformacional foi calculada como sendo 59,6  1,21 °C. Experimentos de espectroscopia de fluorescência, com excitação a 280 e 290 nm, produziram espectros de emissão com comprimentos de onda máximos iguais a 339 e 342 nm, respectivamente. Esses valores são característicos de resíduos de triptofano parcialmente expostos ao solvente. Atividade quitinolítica contra vários substratos e dependência de pH da atividade enzimática da proteína pura foram avaliados. A rCHI3316 exibiu atividade hidrolítica sobre os substratos quitina coloidal (1.189,40 U/mgP), 4-nitrofenil N-N’-diacetil-β-D-quitobiosídeo (30.411,0 U/mgP) e 4-nitrofenil N-N’-N’’-triacetilquitotriose (13.150,0 U/mgP); entretanto, nenhuma atividade enzimática da rCHI3316 foi detectada frente a 4-nitofenil N-acetil-β-D-glucosaminídeo. A enzima exibiu atividade quitinolítica ótima (100%) em pH 5,0; quando quitina coloidal foi utilizada como substrato. Em adição, a atividade antifúngica contra fungos fitopatogênicos, Fusarium solani, Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani e Penicillium herquei foi investigada. rCHI3316 não inibiu a germinação e o crescimento micelial dos esporos dos fungos testados, na concentração de 0,63 mgP.ml-1. Estudos subseqüentes deverão ser realizados na intenção de descobrir potenciais aplicações desta proteína como uma ferramenta biológica no controle de outros fungos fitopatogênicos bem como insetos considerados pragas.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:20:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseEMC.pdf: 2324718 bytes, checksum: 03bf0e57dab75b9f8e1c149ff3e678cd (MD5) Previous issue date: 2004-01-27 / Down syndrome is the most frequent cause of mental retardation affecting millions of people worldwide and results from full or partial trisomy of chromosome 21 (HC21). Rare cases of partial trisomy allowed the identification of a small region in HC21 common to all carriers called Down Syndrome Critical Region. The genes DCRA and DSCR8, mapped to this region, encode two proteins of unknown function. With the aim of contributing to a better characterization of these proteins, DSCR8 was subcloned and expressed in fusion with thiorredoxin in Escherichia coli Rosetta (DE3). Recombinant Trx-DSCR8, observed in the soluble fraction, was subjected to the initial purification assays by affinity chromatography in a Ni-NTA column. The gene DCRA was cloned and expressed in fusion with the proteins thiorredoxin and GFP allowing the partial purification of the protein and the achievement of crystallization and immunological assays. The amino acid sequence of DCRA showed 57% and 49% of identity to a protein of unknown function from Anopheles gambiae and Drosophila melanogaster respectively. Also, in silico analyses revealed that DCRA contains a putative Vps26 domain. Subcellular localization of DCRA in fusion with GFP was observed preferentially in the cytoplasm of the cell lines tested. These results contribute to a better characterization of DCRA and DSCR8 and open up possibilities towards the understanding of the cellular role of these proteins and their relationship with the Down syndrome. / A síndrome de Down é a causa mais freqüente de retardo mental que afeta milhões de pessoas em todo o mundo e resulta de uma trissomia completa ou parcial do cromossomo 21 (HC21). Casos raros de trissomia parcial permitiram identificar uma pequena região do HC21 comum a todos os portadores denominada de Região Crítica da Síndrome de Down. Os genes DCRA e DSCR8 foram mapeados nesta região e codificam proteínas de função desconhecida. Com o objetivo de contribuir para a caracterização destas proteínas DSCR8 foi expresso em fusão com seqüência codificadora da tiorredoxina na linhagem de Escherichia coli Rosetta (DE3) o que possibilitou a obtenção de Trx- DSCR8 na fração solúvel em quantidade suficiente para os ensaios iniciais de purificação em cromatografia de afinidade Ni-NTA. O DCRA foi clonado em fase com seqüências codificadores da tiorredoxina e GFP o que permitiu que a solução protéica fosse parcialmente purificada e que ensaios de cristalização e imunização pudessem ser realizados. A seqüência de aminoácidos da proteína DCRA possui 57% e 49 % de identidade respectivamente com proteínas de Anopheles gambiae e de Drosophila melanogaster, ambas de função desconhecida. Análises in silico da seqüência de aminoácidos demonstram que DCRA possui um provável domínio de Vps26. A localização subcelular da DCRA em fusão com a GFP foi observada preferencialmente no compartimento citoplasmático em todas as linhagens celulares analisadas. Esses resultados contribuem para melhor conhecimento da DCRA e da DSCR8 e estimulam futuras análises para o entendimento da função celular destas proteínas, bem como suas implicações na síndrome de Down.