Doctora en Ciencias de la Ingeniería, Mención Química / Cada día hay un mayor interés por generar productos con valor agregado a partir de diferentes tipos de residuos. Uno de estos productos es el ácido hialurónico (hyaluronic acid, HA), polímero con variados usos en la medicina y la cosmetología. El HA es sintetizado a partir de una enzima llamada Hialuronan Sintasa o HAS. Esta enzima es una proteína de membrana que sintetiza HA a partir de 2 precursores: Ácido UDP-Glucurónico y UDP-N-Acetilglucosamina, compuestos que se encuentran naturalmente en las bacterias Escherichia coli. El presente trabajo tuvo como objetivo la construcción de una Escherichia coli recombinante capaz de sintetizar HA a partir de xilosa como fuente de carbono alternativa a la glucosa. Este azúcar es uno de los más abundantes en los residuos hemicelulósicos de la industria forestal chilena. Para mejorar el consumo de xilosa por parte de la bacteria nativa E. coli Top10 se usó la técnicade la Evolución Adaptativa de Laboratorio de Palsson (Adaptive Laboratory Evolution, ALE). Este proceso se realizó mediante un cultivo continuo en medio R2 y xilosa como única fuente de carbono. La cepa evolucionada fue transformada con el gen hasA de Streptococcus equisimilis (sehasA) obteniendo la cepa Top10 Evo:pMBAD-sseAB. Para el análisis del cambio generado por la ALE se realizó un Análisis de Balance de Flujos (Flux Balance Analysis, FBA) a partir de un Modelo a Escala Genómica (Genome Scale Model, GSM) del microorganismo. Además, se optimizó el cultivo de la cepa Top10 Evo:pMBAD-sseAB en cuanto a las siguientes condiciones: tiempo de adición de inductor y su concentración concentración, control de pH, temperatura de crecimiento post-inducción y concentración de azúcar suplementada. El ALE realizado tuvo una duración de 48 días. Como resultado se obtuvo que la velocidad especí fica de crecimiento en xilosa de la cepa E. coli Top10 aumentó un 36%: de 0,24 h-1 a 0,33 h-1. Se determinó que un mayor rendimiento de HA se obtiene al hacer 2 adiciones de inductor al cultivo. Anteriormente en la literatura se había observado este fenómeno, pero nunca en una expresión recombinante de proteína asociada a un vector regulado con el promotor PBAD, correspondiente al del presente trabajo. Una temperatura de crecimiento post-inducción de 28,5 °C presentó los mejores rendimientos. Además, se de nió que la adición de xilosa a una concentración de 20 g/L 2 horas después de la inducción, y de 12 g/L a las 24 horas de cultivo (el doble de lo presentado en la literatura) aumenta el rendimiento de HA en cultivos en xilosa. Finalmente, las condiciones de cultivo seleccionadas fueron: inducción con 2 adiciones de 0,05 g/L de L-arabinosa, temperatura de crecimiento post-inducción de 28,5 C y concentración de azúcar suplementada de 20 g/L después de la inducción y 12 de g/L a las 24 horas de cultivo. El rendimiento de HA obtenido en estas condiciones fue de 195,8 mg/g.cel, más del doble que el rendimiento obtenido en condiciones basales, el que fue de 92,6 mg/g.cel. Con el FBA realizado fue posible corroborar que la cepa evolucionada tenía mejoras metabólicas en comparación con la cepa no evolucionada, cambio producido por el ALE. Estas mejoras permitieron que los ujos asociados a las vías de las pentosas fosfato, la glicólisis y el ciclo de ácidos tricarboxílicos fueran mayores en la cepa evolucionada en un 12% y 29% en promedio, durante el consumo de xilosa y manosa, respectivamente. Además, dado que las diferencias observadas entre las cepas evolucionada y no evolucionada se observaron tanto en xilosa como en manosa, y permitieron una mayor producción de HA y de biomasa, se in rió que la ALE impactó alguna enzima de la glicólisis.

Autor no autoriza el acceso a texto completo de su documento hasta el 23/6/2020. / Magíster en Gestión para la Globalización / Este trabajo de Tesis tiene como objetivo desarrollar un plan de negocios que permita evaluar estratégia y económicamente la comercialización de productos basados en el Ácido Hialurónico (AH) dentro del mercado chileno y la posterior internacionalización hacia el mercado colombiano, a través de Cellus Medicina Regenerativa S.A. Este proyecto se ve impulsado por las favorables condiciones que existen en nuestro país para fomentar la innovación a través de los incentivos tributarios a I+D dentro de las empresas privadas y los emprendimientos por medio de programas como Start-Up Chile. En este contexto, Cellus Medicina Regenerativa S.A. identifica la oportunidad de abarcar al mercado de la medicina estética, donde se busca generar un producto escalable y comercializable en el mercado chileno inicialmente, con proyecciones de venta en Colombia. La metodología utilizada para realizar este trabajo consistió en primer lugar, en un análisis y descripción del negocio al cual Cellus S.A. se dedica actualmente, con su respectivo análisis FODA. Luego, se realizó un análisis de factores ambientales en el contexto chileno a través de la herramienta PESTLE, y el análisis estratégico de las cinco fuerzas de PORTER. Esta metodología permitió analizar las fortalezas y debilidades de la organización, así como evaluar cuál es el contexto de nuestro país en el contexto de la biotecnología, el emprendimiento y la innovación. Adicionalmente, se realizó un análisis del mercado de la medicina estética a nivel mundial, revisando a modo de ejemplo el caso particular de Estados Unidos, que es el país que cuenta con mayor documentación estadística en este ámbito. Luego, se analizaron en detalle las actuales opciones de AH existentes en el mercado y las oportunidades y amenazas de este mercado en particular. La estrategia de entrada al mercado se elaboró mediante el desarrollo de un plan de marketing estratégico y táctico. La propuesta de valor del modelo de negocios constituye uno de los puntos centrales de este estudio. Esta propone que mediante la investigación y el desarrollo de esta nueva variedad de AH única en el mercado, se puede crear una ventaja competitiva de largo plazo frente a las empresas competidoras. Además, se elaboraron las proyecciones de ventas de acuerdo a los segmentos analizados y las particularidades del mercado objetivo. Se diseñó un plan de marketing y conjuntamente se evaluó el plan de operaciones con la consiguiente elección de la compañía multinacional y la correspondiente estructura organizacional y los costos asociados a su implementación. Bajo los resultados de los análisis financieros, se arrojó un VAN del flujo de caja de USD $12 MM y una TIR del 11,08%, haciendo rentable el negocio. La recomendación es implementar este plan de negocios, tanto en el mercado chileno como en el colombiano, apuntando a la fidelización de clientes en ambos mercados y a la creación de alianzas estratégicas con los posibles distribuidores. Además, se recomienda la posibilidad de expansión a otros mercados distintos de la medicina estética, como son el oftalmológico, traumatológico u odontológico para poder competir de mejor manera contra las actuales empresas biotecnológicas multinacionales.

En la actualidad existen numerosos fármacos con excelentes propiedades biológicas, capaces de actuar eficientemente una vez que hayan alcanzado el sitio de acción de interés, dando un tratamiento adecuado a la correspondiente patología. Sin embargo, las propiedades fisicoquímicas de muchos de ellos dificultan la vehiculización, direccionamiento y en último término, la biodisponibilidad de la sustancia activa en el sitio de acción, comprometiendo la eficacia y seguridad del tratamiento. La farmacotecnia moderna se enfrenta a una serie de dificultades generalmente relacionadas a la baja solubilidad, inestabilidad, biodisponibilidad errática, irritación o necesidad de altas dosis de fármaco; haciendo necesario el diseño de estrategias de formulación que superen estas propiedades adversas. Una alternativa interesante es el diseño de sistemas portadores de fármacos, que constituyan plataformas capaces de superar muchos de los problemas antes mencionados. La investigación y desarrollo en esta área de las Ciencias Farmacéuticas es un campo de marcado interés científico, tecnológico y económico. En este sentido, las formas farmacéuticas de uso ocular tradicionales, (tales como soluciones, suspensiones y ungüentos) presentan serias limitaciones, las cuales llevan a una disminución de la capacidad terapéutica en un gran número de patologías oculares. Uno de los factores determinantes que interviene en este detrimento es la pérdida rápida y extensiva de la formulación en el área precorneal en virtud del drenaje, el parpadeo y el recambio lagrimal. Por otra parte, las formas farmacéuticas inyectables perioculares como las subconjuntivales y retrobulbares no proporcionan niveles adecuados de fármaco. Finalmente, técnicas de naturaleza más invasiva como las inyecciones intravítreas o intracamerales pueden producir serias complicaciones intraoculares, por lo tanto se reservan para situaciones especiales (retinitis por citomegalovirus, intolerancia al tratamiento endovenoso, retinopatía diabética, degeneración macular húmeda, etc.) Teniendo en cuenta lo anteriormente expuesto, se propuso como alternativa a las terapias tradicionales de uso oftálmico una plataforma bioadhesiva de aplicación tópica ocular obtenida a partir de polímeros de origen natural modificados estructuralmente. Esto permitió encontrar opciones alternativas a las limitaciones que presentan las formas farmacéuticas convencionales para dar respuesta a diversas patologías oftalmológicas en virtud de las características anatomofisiológicas que presenta el ojo. En el presente trabajo de tesis se ha explorado exitosamente la obtención y caracterización de nuevos materiales y sistemas bioadhesivos portadores de fármacos (films y comprimidos), con potencial utilidad como plataformas farmacoterapéuticas. En ese sentido se abarcó la modificación química del material base seleccionado (ácido hialurónico) mediante reacciones de entrecruzamiento con glutaraldehído y polietilenglicol diglicidil éter, para otorgarle propiedades mecánicas y bioadhesivas adecuadas. Posteriormente se caracterizaron los materiales obtenidos en cuanto a sus propiedades fisicomecánicas y biofarmacéuticas, incluyendo liberación de fármacos, estudios de toxicidad y eficacia en cultivos celulares y modelos animales. / Today many drugs capable of acting efficiently once they have reached the site of interest to give adequate treatment to a specific pathology are available. However, the physicochemical properties of some of these drugs difficult their vehiculization affecting the efficiency and safety of the pharmaceutical treatments. Modern pharmacology faces a number of difficulties generally related to the low solubility, instability, erratic bioavailability, irritation or the need of high doses of drugs, requiring the design of formulation strategies to overcome these adverse properties. An interesting alternative is the design drug of carrier platforms capable of overcoming many of the aforementioned problems. Research and development in this area of Pharmaceutical Sciences is a field of important scientific, technological and economic interest. In this sense, traditional dosage forms of ocular use, such as solutions, suspensions and ointments have serious limitations, which lead to a reduction of their therapeutic capacity in a large number of eye disorders. One of the factors involved in this reduction is the rapid and extensive loss of the formulation in the precorneal area due to drainage, blinking and tear replacement. Moreover, periocular injectable dosage forms such as subconjunctival and retrobulbar applications do not release adequate levels of drug. Finally, more invasive techniques such as intravitreal or intracameral injections can cause serious intraocular complications. For this reason they are set aside for special situations (cytomegalovirus retinitis, intolerance to endovenous treatment, diabetic retinopathy, wet macular degeneration, etc.) Considering the limitations of conventional dosage forms to face diverse eye diseases two alternative methods to ophthalmic traditional therapies are proposed in the present thesis. The preparation and characterization of new materials and drug carrier bioadhesive systems in the form of films and tablets with potential utility as pharmacotherapeutic platforms is explored. These platforms are synthesized by crosslinking hyaluronic acid with glutaraldehyde and polyethylene glycol diglycidyl ether in the presence of itaconic acid. New materials with suitable mechanical and bioadhesive properties were obtained and characterized in terms of their physicomechanical and biopharmaceuticals properties including drug delivery capacity, toxicity and efficacy studies in cell culture and animal models.

Magíster en Ciencias de la Ingeniería, Mención Química. Ingeniero Civil en Biotecnología / En la actualidad, se realizan grandes esfuerzos en aplicar nuevos métodos de producción de compuestos novedosos de alto valor agregado. Un ejemplo de esto es el ácido hialurónico, que tiene importantes y nuevos usos, especialmente en el área de la salud, y su demanda se encuentra en alza. El presente trabajo de tesis tiene como objetivo generar una nueva cepa recombinante de Escherichia coli que sea capaz de producir ácido hialurónico a partir de fuentes de carbono novedosos, como es el caso de los carbohidratos de algas pardas. Esto se debe a que estas algas presentan varias ventajas, como su gran abundancia y relativa facilidad de obtención de los azúcares presentes. Este trabajo se enfoca en el uso de los carbohidratos alginato y manitol, principales azúcares presentes en estas macroalgas. Como punto de partida se utilizó la cepa recombinante BAL 1611. Esta cepa tiene incorporados los genes necesarios para el transporte y degradación del alginato, además de estar optimizado para la producción anaeróbica de etanol. A esta cepa se le realizó modificaciones para disminuir la producción de etanol y se le incorporó los genes necesarios para producir ácido hialurónico. En la primera etapa del trabajo se obtuvo una cepa con resistencia al antibiótico cloranfenicol y con la producción de etanol disminuida. Luego, la cepa se transformó con un plasmidio que contiene los genes necesarios para la síntesis de ácido hialurónico. La síntesis de las proteínas codificadas en el vector recombinante se indujo con L-arabinosa para iniciar la producción. Además, en este proyecto se diseñó un método para cuantificar la concentración de ácido hialurónico utilizando la enzima hialuronidasa. Se logró obtener un microorganismo recombinante que produce ácido hialurónico a partir de alginato y manitol con una concentración de 20 [g/l] de azúcares totales, con una proporción de 2:1 en peso. El rendimiento obtenido fue de 3,67 [mg AH/l/gDW]. Finalmente, se introdujo modificaciones a un modelo matemático del metabolismo de E. coli, para introducir las reacciones correspondientes a la degradación de alginato y de la síntesis de ácido hialurónico. Se realizó un análisis de balance de flujo a partir de los datos generados de un cultivo con un medio definido, aplicando variaciones en las condiciones in silico. A partir de este análisis se concluyó que es necesario controlar la cantidad de oxígeno presente en el cultivo. Por otro lado, la presencia de los genes de Z. mobilis no presenta impacto en la producción de biomasa ni de ácido hialurónico. Además, debido al alto costo energético de producir ácido hialurónico y el desbalance de óxido-reducción que produce la metabolización de alginato hace que los rendimientos de AH sean bajos. Esto da pie a implementar nuevas estrategias para optimizar la producción de AH a partir de este carbohidrato.

Memoria para optar el título de Bioquímico / No autorizada por el autor para ser publicada a texto completo en el Portal de Tesis Electrónicas / Las estrategias clínicamente usadas para el tratamiento de lesiones articulares se enfocan en aliviar el dolor y la inflamación, porque el cartílago adulto tiene una mínima capacidad regenerativa. Así, frente a un daño severo el cartílago hialino es remplazado por cartílago fibroso, que se distingue del primero en la composición de su MEC y en consecuencia, en sus propiedades biomecánicas. El objetivo del presente trabajo es desarrollar una estrategia de terapia celular que permita regenerar el cartílago articular. La hipótesis de trabajo es que células troncales mesenquimáticas (MSC) autólogas, embebidas en ácido hialurónico (HA) e implantadas en una lesión condral grave, en presencia de dexametasona como anti-inflamatorio e inductor de diferenciación, regeneran in vivo cartílago hialino y no fibrocartílago. Para evaluar dicha hipótesis, se produjo quirúrgicamente una lesión de 20,25 mm2 x 1,5 mm de profundidad (aproximadamente 30 mm3) en el cartílago patelar de conejos New Zealand. Dos semanas después, en dicha lesión se implantaron 1x106 cMSC, previamente aisladas de la médula ósea del mismo animal, embebidas en HA. A partir de ese momento, se inyectó intra-articularmente 0,25 mg/Kg de dexametasona una vez a la semana. A las 6 semanas post-implante, los conejos fueron sometidos a eutanasia, se disectaron sus cartílagos articulares y se analizaron molecularmente en función de la expresión de col1, col2, vers, agg y gapdh, para discriminar entre cartílago hialino y fibroso. Los resultados obtenidos en este trabajo muestran que es factible obtener MSC a partir de aspirados de médula ósea de conejo, dado que las células adherentes aisladas proliferan en presencia de un medio definido suplementado con suero fetal bovino (SFB) y se diferencian in vitro a adipocitos, osteocitos y condrocitos. Por su parte y como era de esperar, se observó que las lesiones condrales de espesor completo cicatrizan a expensas de tejido fibroso, que expresa altos niveles de col1 y vers y bajos niveles de col2 y agg. En cambio, si a 2 semanas post-lesión, en ella se implantan cMSC embebidas en HA y luego se inyecta intra-articular y post-operatoriamente dexametasona, 6 semanas post-implante se genera un cartílago que expresa altos niveles de col2 y agg y bajos niveles de col1 y vers. Estos resultados sugieren que es posible regenerar cartílago hialino utilizando MSC en presencia de HA y dexametasona en un plazo de 6 semanas. Lo cual debe corroborarse con estudios histológicos y funcionales, para poder afirmar que se dispone de una estrategia terapéutica que garantiza la regeneración del cartílago hialino

Hyaluronic acid (HA) is an essential molecule in the development of many tissues in the organism, as well as in their regeneration. Although, its physicochemical properties greatly limit its use as a cell support material in clinical applications unless its chemical structure is modified or is accompanied by other molecules. In this thesis a tridimensional scaffold has been made consisting of hyaluronic acid and a second material, an acrylic polymer (poly[ethyl acrylate] or PEA) able to be polymerized by free-radical polymerization inside HA after lyophilisation. The resultant interpenetrating polymer network (IPN) has been analyzed in order to measure its properties and compare them to similar scaffolds made from the two separate polymers, with the aim to compare the effects produced by the synthesis technique in the physical and chemical properties of HA. The viability of these materials in cell applications has been tested through in vitro assays using L929 fibroblasts. Additionally, several modifications have been made to the initial synthesis technique in order to obtain different proportions from the two components - HA and PEA - in the materials. The properties of these IPNs have been measured to reveal the effects produced by every step along their synthesis. The biomaterials produced though the techniques described here may offer interesting systems for cell culture and/or cell transplants in future clinical applications that wish to incorporate hyaluronic acid in the shape of a stable tridimensional scaffold. / El ácido hialurónico (HA) es una molécula imprescindible en la formación de muchos tejidos del organismo, así como en la regeneración de los mismos. No obstante, sus propiedades físico-químicas limitan enormemente su uso como material para el soporte de células en aplicaciones clínicas si no se modifica su estructura química o se acompaña de otras moléculas. En esta tesis se ha sintetizado un constructo tridimensional de ácido hialurónico acompañado por un segundo material, un polímero acrílico (el poliacrilato de etilo, o PEA) capaz de polimerizar por vía radical en el interior del HA tras liofilizarlo. La red interpenetrada polimérica (IPN) resultante ha sido analizada para medir sus propiedades y compararlas con constructos semejantes realizados a partir de ambos polímeros por separado, con el objetivo de comprobar los efectos de la técnica de síntesis en las propiedades físico-químicas del HA. La viabilidad de estos materiales en aplicaciones con células ha sido comprobada mediante la realización de ensayos in vitro con fibroblastos L929. De forma adicional, se han llevado a cabo varias modificaciones de la técnica inicial de síntesis para obtener distintas proporciones de ambos componentes - HA y PEA - en los materiales. Las propiedades de esta serie de IPNs han sido medidas y comparadas con su método de síntesis y composición final con tal de dilucidar el efecto que produce cada paso de la síntesis en las mismas. Los biomateriales producidos mediante las técnicas aquí descritas pueden ofrecer sistemas interesantes para el cultivo y/o trasplante de células en futuras aplicaciones clínicas que deseen incorporar el ácido hialurónico en forma de constructo tridimensional estable. / L'àcid hialurònic (HA) és una molècula imprescindible en la formació de molts teixits de l'organisme, així com en la regeneració dels mateixos. D'altra banda, les seves propietats físico-químiques limiten enormement el seu ús com a material per al suport de cèl¿lules en aplicacions clíniques si no se'n modifica l'estructura química o se l'acompanya d'altres molècules. En aquesta tesi s'ha sintetitzat un constructe tridimensional d'àcid hialurònic acompanyat d'un segon material, un polímer acrílic (el poliacrilat d'etil, o PEA) capaç de polimeritzar per via radical a l'interior del HA després de liofilitzar-lo. La xarxa interpenetrada polimèrica (IPN) resultant ha sigut analitzada per mesurar les seves propietats i comparar-les amb constructes semblants realitzats a partir d'ambdós polímers per separat, amb l'objectiu de comprovar els efectes de la tècnica de síntesi en les propietats físiques y químiques del HA. La viabilitat d'aquests materials en aplicacions amb cèl¿lules ha sigut comprovada mitjançant la realització d'assajos in vitro amb fibroblasts L929. Addicionalment, s'han dut a terme vàries modificacions en la tècnica inicial de síntesi per tal d'obtenir diferents proporcions d'ambdós components - HA i PEA - als materials. Les propietats d'aquesta sèrie de IPNs han sigut mesurades per tal de revelar l'efecte que produeix cada pas de la síntesi sobre les mateixes. Els biomaterials produïts mitjançant les tècniques aquí exposades poden oferir sistemes interessants pel cultiu y/o trasplantament de cèl¿lules en futures aplicacions clíniques que desitgin incorporar l'àcid hialurònic en forma de constructe tridimensional estable. / Rodríguez Pérez, E. (2017). Diseño de nuevos biomateriales basados en redes poliméricas interpenetradas de ácido hialurónico y polímeros acrílicos [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/90632 / TESIS

Memoria para optar al Titulo Profesional de Médico Veterinario / La fisiopatología/etiología de la enfermedad degenerativa articular ha demostrado que esta es una patología asociada a estrés oxidativo. No existen antecedentes concluyentes acerca de la capacidad antioxidante del líquido sinovial (LS). Es por ello, que en este trabajo se evaluó el efecto antioxidante de Acido Hialurónico (AH), Condroitín-Sulfato (CS) y LS proveniente de la articulación metacarpo falángica equina normal, con daño crónico y con membrana sinovial congestiva. Este efecto se evaluó en un sistema biológico constituido por una fracción enriquecida en retículo endoplásmico de hígado de rata (microsomas) sometida a estrés oxidativo por Fe+3/ascorbato, que es un sistema generador de especies radicalarias del oxígeno. Los LS de articulación normal y con daño crónico inhibieron significativamente la lipoperoxidación microsómica inducida por Fe+3/ascorbato (40%) (p<0,05), efecto que no fue dependiente de la concentración, aunque los volúmenes ensayados de LS fluctuaron entre 10 y 100 L. El LS de la articulación con membrana sinovial congestiva, produjo un efecto significativamente menor (16%), el que fue observado sólo con el volumen de 100 L. El AH y CS no inhibieron la lipoperoxidación microsómica. Por otro lado, todos LS ensayados presentaron actividad Glutatión transferasa (GSH-T) equivalente aproximadamente al 10% de la actividad total microsómica en los LS provenientes de articulación normal y con daño crónico y al 12%, en el LS de articulación con membrana sinovial congestiva. Más aún, la presencia en los LS, de AH y CS previno el daño oxidativo sobre la GSH-T microsómica inducido por Fe+3/ascorbato. Por otra parte, los LS de articulación normal y con daño crónico no afectaron la disminución de los tioles microsómicos inducida por Fe+3/ascorbato; sin embargo, el LS proveniente de la articulaciones con membrana sinovial congestiva, AH y CS la inhibieron significativamente (p<0,05). Estos resultados indicarían que en los LS existirían diferentes mecanismos antioxidantes, los que estarían asociados a cada condición articular. Así el LS de articulación con membrana sinovial congestiva protegió los grupos tioles y la actividad GSH-T, mientras que los LS de articulación normal y con daño crónico ejercen una mayor acción protectora frente a la lipoperoxidación / Proyecto FIV 2007 Nº 12100101 4602018

Hyaluronic acid, HA, and poly (ethyl acrylate), PEA, are two polymers widely used in biomedical applications, especially in tissue engineering, because of their excellent biocompatible and bioactive properties. HA is a highly hydrophilic biopolymer and the PEA, on the other hand, is hydrophobic. In addition, each one of them has certain shortcomings that limit the potential of its application, so that being able to combine them in a viable way in one biomaterial is of great interest and in turn is a very promising and attractive challenge for the development of new biomaterials. In this thesis, several HA-PEA combined systems are developed, making the two phases compatible in non-crosslinked state, using formic acid, FA, as a common solvent for the two polymers. The effect of formic acid on the materials is previously evaluated, ruling out chemical modification, degradation or generation of cytotoxicity. The combined systems have been developed with different geometries and architectures, in the form of two-dimensional films or blends, spun membranes and three-dimensional porous scaffolds, using solvent casting, electrospinning and freeze-extraction techniques. The physicochemical properties reveal a certain mutual reinforcement produced by both phases, and the biological characterization highlights the potential of the system as biomaterial. Additionally, other systems are made by copolymerizing PEA with ethyl 2-carboxy acrylate, CEA, in either cross-linked or non-crosslinked state. As they are new products, we proceed to their complete physico-chemical and biological characterization, confirming their aptitude as biomaterials. Also studied is the the possibility of combining these copolymers with hyaluronic acid to obtain materials with better properties than those already achieved in the HA-PEA systems. / El ácido hialurónico, HA, y el poli(acrilato de etilo), PEA, son dos polímeros ampliamente utilizados en aplicaciones biomédicas, especialmente en la ingeniería tisular, debido a sus excelentes propiedades biocompatibles y bioactivas. El HA es un biopolímero altamente hidrofílico y el PEA, por lo contrario, es hidrofóbico. Además, cada uno por separado tiene ciertas deficiencias que limitan la potencial de su aplicación, por lo que el poder combinarlos de forma viable en un biomaterial resulta de gran interés y a su vez es un reto muy prometedor y atractivo para el desarrollo de nuevos biomateriales. En esta tesis se desarrollan varios sistemas combinados HA-PEA consiguiendo compatibilizar las dos fases en estado no entrecruzado, empleando el ácido fórmico, FA, como un solvente común para los dos polímeros. Se evalúa previamente el efecto que tiene el ácido fórmico sobre los materiales, descartando modificación química, degradación o generación de citotoxicidad. Los sistemas combinados han sido desarrollados con diferentes geometrías y arquitecturas, en forma de films bidimensionales o mezclas (blends), membranas hiladas y scaffolds porosos tridimensionales, utilizando las técnicas de evaporación de solvente (solvent casting), electrospinning y freeze-extraction. Las propiedades físico-químicas revelan un cierto refuerzo mutuo producido por ambas fases, y la caracterización biológica destaca el potencial del sistema como biomaterial. Adicionalmente, se elaboran otros sistemas copolimerizando PEA con 2-carboxi acrilato de etilo, CEA, en estado tanto entrecruzado como no entrecruzado. Como se trata de productos novedosos, se procede a su caracterización completa físico-química y biológica, confirmando su aptitud como biomateriales. Asimismo, se estudia la posibilidad de producción a base de ellos de sistemas combinados con el ácido hialurónico que poseerían las propiedades mejores que las ya conseguidas en los sistemas HA-PEA. / L'àcid hialurònic, HA, i el poliacrilat d'etil, PEA, són dos polímers amplament utilitzats en aplicacions biomèdiques, especialment en l'enginyeria tissular, per les seues excel·lents propietats biocompatibles i bioactives. L'HA és un biopolímer altament hidrofílic i el PEA, pel contrari, és hidrofòbic. A més, cada un per separat té certes deficiències que limiten el potencial de la seva aplicació, de manera que poder combinar-los de manera viable en un biomaterial resulta de gran interés i és un repte molt prometedor i atractiu per al desenvolupament de nous biomaterials. En aquesta tesi es desenvolupen diversos sistemes combinats HA-PEA aconseguint compatibilitzar les dues fases en estat no entrecreuat, emprant l'àcid fòrmic, FA, com un solvent comú per als dos polímers. S'avalua prèviament l'efecte que té l'àcid fòrmic sobre els materials, descartant modificació química, degradació o generació de citotoxicitat. Els sistemes combinats han estat desenvolupats amb diferents geometries i arquitectures, en forma de films bidimensionals o barreges (blends), membranes filades i scaffolds porosos tridimensionals, utilitzant les tècniques d'evaporació de solvent (solvent casting), electrospinning i freeze-extraction. Les propietats fisicoquímiques revelen un cert reforç mutu produït per les dues fases, i la caracterització biològica destaca el potencial del sistema com a biomaterial. Addicionalment, s'han elaborat altres sistemes copolimeritzant PEA amb 2-carboxi acrilat d'etil, CEA, en estat tant entrecreuat com no entrecreuat. Com es tracta de productes nous, es procedeix a la seua caracterització completa fisicoquímica i biològica, confirmant la seva aptitud com a biomaterials. Així mateix, s'estudia la possibilitat de producció amb d'ells de sistemes combinats amb l'àcid hialurònic, que posseirien millors propietats que les ja aconseguides en els sistemes HA-PEA. / Ivashchenko, S. (2017). Sistemas combinados de ácido hialurónico y polímeros acrílicos como biomateriales para ingeniería tisular [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/90649 / TESIS

[ES] El mieloma múltiple es una neoplasia hematológica caracterizada por una expansión descontrolada de células plasmáticas monoclonales (mPCs) en medula ósea que producen, en la mayoría de los casos, un componente monoclonal secretado en el suero y/o en orina. En la actualidad, se sigue considerando una enfermedad incurable con la constante aparición de recaídas en los pacientes. Una de las causas que condicionan esta situación, radica en la generación de resistencia frente a fármacos por parte de las mPCs. Este mecanismo de resistencia a fármacos (DR) se ha visto que no solo depende de factores intracelulares, sino que la propia interacción de las mPCs con el microambiente medular juega un papel fundamental para su supervivencia, crecimiento y desarrollo de DR. Entre los componentes del microambiente tumoral, destaca la adhesión de las mPCs a componentes de la matriz extracelular (ECM) que se ha visto relacionada con la generación de DR. Por este motivo el desarrollo de esta tesis doctoral consistió en la elaboración y validación de una plataforma de cultivo 3D basado en la síntesis de un microgel. Este sistema estará constituido por microesferas funcionalizadas con componentes de la ECM como son la fibronectina (FN), colágeno tipo I (COL), heparina (Hep), heparan sulfato (HS) y ácido hialurónico (HA), generando un entorno 3D biomimético con la capacidad de poder analizar la respuesta celular desencadenada por la interacción de las mPCs con los componentes de la ECM, así como la DR generada por la adhesión de las mPCs a estas biomoléculas. El primer estudio consistió en la realización y puesta a punto de varios protocolos para la síntesis de distintos microgeles; un primer sistema se produjo mediante la polimerización por vía radical en bloque de co-polímeros de poliacrilato de etilo (EA) y polimetacrilato de etilo (EMA) o bien por EA, EMA y ácido acrílico (AAc). Mediante una emulsión del tipo aceite en agua se consiguió producir con estos copolímeros, microesferas de un tamaño próximo al de las mPCs. Un segundo sistema se basó en microesferas de alginato. Estas microesferas se obtuvieron en un dispositivo de microfluidica produciéndose la gelificación externa de las micro-gotas con la incorporación de iones de calcio consiguiendo microesferas de un tamaño medio de 177 µm. Debido a la gran variedad de microesferas sintetizadas con diferentes grupos químicos en sus superficies, se consiguió establecer protocolos de funcionalización similares a los establecidos en la literatura, teniendo en cuenta la estabilidad de la biomolécula a lo largo del tiempo del cultivo celular. Este enfoque, permitió la funcionalización con una gran variedad de biomoléculas disponiendo así de microgeles funcionalizados con FN, COL, Hep, HS y HA. Una vez desarrollados los microgeles, en un segundo estudio se procedió a evaluar la respuesta celular en un entorno 3D basado en microgel, valorando la interacción con los componentes de la ECM. Entre los resultados observados se pudo determinar como el tamaño de las microesferas afecta al crecimiento celular incluso en ausencia de cualquier funcionalización. Con los microgeles constituidos por microesferas de un tamaño próximo al de las mPCs se obtuvo un mayor crecimiento celular que con los microgeles formados por partículas de mayor tamaño, y en ambos el crecimiento fue superior al del cultivo en suspensión. Se plantea la hipótesis de que la presencia de las microesferas favorece en gran medida que se produzca un mayor contacto célula-célula que se ve incrementado cuanto mayor es la superficie específica del microgel. Entre los componentes de la ECM estudiados, mientras que el COL no genera ninguna respuesta celular diferente al control (microgel no funcionalizado), el HA favorece la proliferación celular. La adhesión de las mPCs a la FN condiciona el bloqueo de las células en la fase G0-G1 del ciclo celular. Esta adhesión está mediada / [CA] El mieloma múltiple és una neoplàsia hematològica caracteritzada per una expansió descontrolada de cèl·lules plasmàtiques monoclonals (mPCs) en medul·la òssia que produeixen, en la majoria dels casos, un component monoclonal secretat en el sèrum i/o en orina. En l'actualitat, es continua considerant una malaltia incurable, amb la constant aparició de recaigudes en els pacients. Una de les causes que condicionen aquesta situació, radica en la generació de resistència enfront de fàrmacs per part de les mPCs. Aquest mecanisme de resistència a fàrmacs (DR) s'ha vist que no sols depèn de factors intracel·lulars, sinó que la mateixa interacció de les mPCs amb el microambient medul·lar juga un paper fonamental per a la seua supervivència, creixement i desenvolupament de DR. Entre els components del microambient tumoral, destaca l'adhesió de les mPCs a components de la matriu extracel·lular (ECM) que s'ha vist relacionada amb la generació de DR. Per aquest motiu, el desenvolupament d'aquesta tesi doctoral va consistir en l'elaboració i validació d'una plataforma de cultiu 3D basada en la síntesi d'un microgel. Aquest sistema estarà constituït per microesferes funcionalitzades amb components de l'ECM com són la fibronectina (FN), col·lagen tipus I (COL), heparina (Hep), heparan sulfat (HS) i àcid hialurònic (HA), generant un entorn 3D biomimètic amb la capacitat de poder analitzar la resposta cel·lular desencadenada per la interacció de les mPCs amb els components de la ECM, així com la DR generada per l'adhesió de les mPCs a aquestes biomolècules. El primer estudi va consistir en la realització i posada a punt de diversos protocols per a la síntesi de diferents microgels; un primer sistema es va produir mitjançant la polimerització per via radical en bloc de copolímers de poliacrilat d'etil (EA) i polimetacrilat d'etil (EMA), o bé per EA, EMA i àcid acrílic (AAc). Mitjançant una emulsió del tipus oli en aigua es va aconseguir produir amb aquests copolímers, microesferes d'una grandària pròxima al de les mPCs. Un segon sistema es va basar en microesferes d'alginat. Aquestes microesferes es van obtenir en un dispositiu de microfluidica produint-se la gelificació externa de les microgotes amb la incorporació d'ions de calci aconseguint microesferes d'una grandària mitjana de 177 ¿m. A causa de la gran varietat de microesferes sintetitzades amb diferents grups químics en les seues superfícies, es va aconseguir establir protocols de funcionalització similars als establerts en la literatura, tenint en compte l'estabilitat de la biomolècula al llarg del temps del cultiu cel·lular. Aquest enfocament va permetre la funcionalització amb una gran varietat de biomolècules disposant així de microgels funcionalitzats amb FN, COL, Hep, HS y HA. Una vegada desenvolupats els microgels, en un segon estudi es va procedir a avaluar la resposta cel·lular en un entorn 3D basat en microgel, valorant la interacció amb els components de l'ECM. Entre els resultats observats es va poder determinar com la grandària de les microesferes afecta el creixement cel·lular fins i tot en absència de qualsevol funcionalització. Amb els microgels constituïts per microesferes d'una grandària pròxima al de les mPCs es va obtenir un major creixement cel·lular que amb els microgels formats per partícules de major grandària, i en tots dos el creixement va ser superior al del cultiu en suspensió. Es planteja la hipòtesi que la presència de les microesferes afavoreix en gran manera que es produïsca un major contacte cèl·lula-cèl·lula que es veu incrementat com més gran és la superfície específica del microgel. Entre els components de l'ECM estudiats, mentre que el COL no genera cap resposta cel·lular diferent del control (microgel no funcionalitzat), l'HA afavoreix la proliferació cel·lular. L'adhesió de les mPCs a la FN condiciona el bloqueig de les cèl·lules en la fase G0-G1 del cic / [EN] Multiple myeloma is a haematological neoplasm characterized by an uncontrolled expansion of monoclonal plasma cells (mPCs) in bone marrow that produce, in most cases, a monoclonal component secreted in serum and/or urine. At present, it is still considered an incurable disease with the constant appearance of relapses in patients. One of the causes that condition this situation lies in the generation of drug resistance by the mPCs. This mechanism of drug resistance (DR) has been seen to depend not only on intracellular factors, but the very interaction of mPCs with the medullary microenvironment plays a fundamental role in their survival, growth and development of DR. Among the components of the tumor microenvironment, the adhesion of the mPCs to components of the extracellular matrix (ECM) stands out, which has been related to the generation of DR. For this reason, the development of this doctoral thesis consisted in the elaboration and validation of a 3D culture platform based on the synthesis of a microgel. This system will be made up of micropsheres functionalized with the components of the ECM such as fibronectin (FN), collagen type I (COL), heparin (Hep), heparan sulphate (HS) and hyaluronic acid (HA), generating a 3D biomimetic environment with the ability to analyse the cellular response triggered by the interaction of mPCs with the ECM components, as well as the DR generated by the adhesion of the mPCs to these biomolecules. The first study consisted in the realization and development of several protocols for the synthesis of different microgels. A first system was produced by the radical block polymerization of polyethylene acrylate (EA) and polymethacrylate (EMA) co-polymers or by EA, EMA and acrylic acid (AAc). By means of an oil-in-water emulsion technique, it was possible to produce, with these copolymers, microspheres of a size close to that of the mPCs. A second system was based on alginate microspheres. These microspheres were obtained in a microfluidic device producing the external gelification of the micro-drops with the incorporation of calcium ions, obtaining microspheres with an average size of 177 µm. Due to the great variety of microspheres synthesized with different chemical groups on their surfaces, it was possible to establish functionalization protocols similar to those established in the literature, taking into account the stability of the biomolecule along with the time of cell culture. This approach allowed for functionalization with a great variety of biomolecules, having in this way functionalized microgels with FN, COL, Hep, HS and HA. Once the microgels were developed, a second study was carried out to evaluate the cell response in a 3D microgel-based environment, assessing the interaction with the components of the ECM. Among the results observed, it was possible to determine how the size of the microspheres affects cell growth even in the absence of any functionalization. With the microgels constituted by microspheres close to the size of the mPCs, a greater cellular growth was obtained than with the microgels formed by larger particles, and in both the growth was higher than in suspended culture. It is hypothesized that the presence of microspheres greatly favours a greater cell-cell contact, which is increased the larger the specific surface area of the microgel. Among the components of the ECM studied, while the COL does not generate any cellular response different from the control (non-functionalized microgel), HA favours cell proliferation. The adhesion of mPCs to FN conditions the blocking of cells in the G0-G1 phase of the cell cycle. This adhesion is mediated by the integrin ¿4ß1. / La presente tesis doctoral no se podría haber realizado sin la financiación del proyecto PROMETEO/2016/063, trabajo que también estuvo parcialmente financiado con fondos FEDER (CIBERONC (CB16/12/00284)). La iniciativa CIBER-BBN está financiada por el proyecto VI National R&D&I Plan 2008-2011, Iniciativa Ingenio 2010, Consolider Program. Las acciones CIBER están financiadas por el Instituto de Salud Carlos III con ayuda del Fondo Europeo de Desarrollo Regional. / Marin Paya, JC. (2021). 3D Culture o Multiple Myeloma Cell Line Using Microgel Environments [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/167427 / TESIS

[EN] Since a considerable number of factors limit or prevent the autonomous regeneration of injured or degenerated tracts in the nervous system, its effective restoration is a rare phenomenon. Therefore, conventional medicine has only succeeded in therapies aimed at treating the symptoms and effects of the damage. In order to revert them and to restore the functionality of a neuronal network, tissue engineering is currently researching about the synergic use of cells, bioactive molecules and three-dimensional biocompatible supports. More precisely, the regeneration of nervous system damaged structures is being studied through strategies like the so-called neural conduits. In this thesis, a channeled porous scaffold based on hyaluronic acid, a hydrophilic natural polymer, has been designed, developed and characterized, both physicochemically and biologically. By chemically crosslinking this polymer through divinyl sulfone and next lyophilizing it, a degradable and millimeter-size conduit has been obtained, soft but stable in physiological medium. The conduit wall has a singular three-layer distribution, able to avoid glial cells migration through it, but entirely permeable to nutrients and proteins. Furthermore, if Schwann cells are cultured for 10 days within the conduit's lumen, they create a cell tube-like structure with several hundreds of microns in diameter, thin but dense, similar to those of nerve fascicles. The ability of the conduits, the Schwann cells macrosheath and a bundle of 30 um poly-L-lactic acid fibers to guide the growth of neurons in dorsal root ganglia explants has been evaluated as well. Only the biohybrid system, composed by the conduit, the stretched fibers within and the cells macrosheath, is a beneficial enough context to permit neurons grow at a similar rate to other promising strategies in tissue engineering of the nervous system. / [ES] La regeneración de tractos dañados o degenerados del sistema nervioso de manera autónoma es un fenómeno infrecuente, ya que están implicados una considerable cantidad de factores que la limitan u obstaculizan. Por ello, la medicina convencional tan solo ha logrado limitados éxitos a este respecto, tratando únicamente los síntomas y los efectos del daño. Para intentar revertirlo y lograr la reconexión funcional de neuronas, en la actualidad la ingeniería tisular está investigando acerca de la aplicación sinérgica de células, moléculas bioactivas y soportes tridimensionales biocompatibles. Concretamente, para regenerar estructuras del sistema nervioso se trabaja en la estrategia conocida como conductos neurales. En esta tesis se ha diseñado, desarrollado y caracterizado tanto fisicoquímica como biológicamente un andamiaje acanalado poroso basado en ácido hialurónico, un polímero hidrófilo natural. Mediante el entrecruzamiento químico de este mediante divinil sulfona y su posterior liofilización, se ha logrado obtener un conducto milimétrico degradable, blando pero estable en medio fisiológico que, además, posee una pared con una singular distribución en tres capas capaz de evitar la migración de células de glía a su través, pero totalmente permeable a nutrientes y proteínas. Asimismo, las células de Schwann cultivadas en el interior del conducto proliferan confinadamente hasta formar al cabo de 10 días una estructura celular tubular de varios cientos de micras de diámetro, delgada pero densa, similar a las estructuras fasciculares de los nervios. Se ha evaluado, además, la capacidad tanto de los conductos acanalados como de la macrovaina de células de Schwann y de un haz de fibras de ácido poli-L-láctico de unos 30 um de diámetro para guiar el crecimiento de neuronas de explantes de ganglios de la raíz dorsal in vitro. Tan solo el sistema biohíbrido formado por el conjunto del conducto, las fibras estiradas en su interior y la vaina de células es capaz de aportar un contexto amigable tal para permitir a las neuronas crecer a tasas del mismo orden que en otras estrategias prometedoras en ingeniería tisular del sistema nervioso. / [CAT] La regeneració autònoma de tractes del sistema nerviós danyats o degenerats és un fenomen infreqüent, en tant que hi son implicats una considerable quantitat de factors que la limiten o obstaculitzen. Per aquesta causa, la medicina convencional tan sols ha assolit èxits limitats a aquest respecte, tractant únicament els símptomes i els efectes del dany. Per tractar de revertir-ho i aconseguir la reconnexió funcional de neurones, en l'actualitat l'enginyeria tissular està investigant sobre l'aplicació sinèrgica de cèl·lules, molècules bioactives i suports tridimensionals biocompatibles. Més concretament, per a regenerar estructures del sistema nerviós es treballa amb l'estratègia coneguda com conductes neurals. A aquesta tesi s'ha dissenyat, desenvolupat i caracteritzat, tant fisicoquímica com biològicament, una bastida acanalada porosa basada en àcid hialurònic, un polímer hidròfil natural. Mitjançant el seu entrecreuament químic amb divinil sulfona i la seua posterior liofilització, s'ha aconseguit obtenir un conducte mil·limètric degradable, tou però estable en medi fisiològic que, a més a més, posseeix una paret amb una singular distribució en tres capes capaç d'evitar la migració de cèl·lules glials al seu través, però totalment permeable a nutrients i proteïnes. Tanmateix, les cèl·lules de Schwann cultivades en l'interior del conducte proliferen confinades fins que formen, als 10 dies, una estructura cel·lular tubular de centenars de micres de diàmetre, prima però densa, semblant a les estructures fasciculars dels nervis. S'ha avaluat, a més, la capacitat dels conductes acanalats, de la baina de cèl·lules de Schwann i d'un feix de fibres d'àcid poli-L-làctic d'uns 30 um de diàmetre, per guiar el creixement in vitro de neurones d'explants de ganglis de l'arrel dorsal. Només el sistema biohíbrid format pel conjunt del conducte, les fibres estirades en el seu interior i la baina de cèl·lules aporta un context amigable tal que permet a les neurones créixer a taxes del mateix ordre que altres estratègies prometedores en enginyeria tissular del sistema nerviós. / Vilariño Feltrer, G. (2015). Conductos de ácido hialurónico para el crecimiento axonal guiado [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/58778 / TESIS