Memoria para optar al título de Ingeniero Civil en Biotecnología / Debido a la alta demanda de combustibles y la creciente alza en el precio del petróleo es primordial buscar nuevas alternativas energéticas para satisfacer las necesidades de la población. Dentro de este escenario, considerando la abundancia de residuos lignocelulósicos forestales y agroindustriales en nuestro país, la posibilidad de producir bioetanol a partir de éstos parece ser una alternativa bastante atractiva en los aspectos estratégicos y ambientales. La hidrólisis de la celulosa es una de las etapas que tiene mayores posibilidades de ser optimizada con el fin de reducir los costos de producción del bioetanol de segunda generación. Ésta se basa en la utilización de una mezcla de celulasas que causan la depolimerización de la celulosa con el fin de generar azúcares simples (glucosa). Considerando lo anterior, el presente Trabajo de Memoria de Título, tuvo como objetivo la identificación de secuencias pertenecientes a nuevas endoglucanasas que puedan ser utilizadas en el proceso de hidrólisis de celulosa. La estrategia utilizada se dividió en tres etapas principales: (i) la realización de un screening de actividad endoglucanasa sobre un conjunto de hongos de pudrición blanca, para identificar cuales poseían enzimas con esta actividad; (ii) la amplificación por PCR desde DNA genómico y cDNA de fragmentos pertenecientes a secuencias que codifican para estas enzimas, utilizando partidores degenerados diseñados a partir de regiones de homología de endoglucanasas de hongos; y (iii) la amplificación de regiones aledañas a las secuencias obtenidas utilizando la estrategia RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends). Mediante la utilización de esta metodología, fue posible obtener fragmentos de secuencias de genes de glicosil hidrolasas, los cuales fueron clonados y analizados in sílico, obteniéndose los siguientes resultados: a partir del cDNA se obtuvieron fragmentos de cuatro endoglucanasas y una exoglucanasa. Una de las secuencias de endoglucanasa pertenece a la familia 5 y procede del hongo Polystictus versicolor; la segunda pertenece a la familia 7 y procede de Fusarium oxysporum; una tercera pertenece a la familia 61 y procede del hongo Ganoderma applanatum, mientras que la cuarta pertenece a la familia 61 y procede del hongo Fusarium oxysporum. Las secuencias se compararon con secuencias de endoglucanasas presentes en las bases de datos, encontrándose que poseen un porcentaje de identidad a nivel de secuencia aminoacídica de 93, 100, 58 y 60 % con respecto al mejor alineamiento observado, respectivamente. La secuencia de exoglucanasa proviene del hongo Polystictus versicolor y se clasifica dentro de la familia 7, con un 80% de identidad aminoacídica con respecto al mejor alineamiento observado. De todas las endoglucanasas identificadas en este trabajo, sólo la proveniente del hongo Fusarium oxysporum se encontraba previamente descrita. A partir de DNA genómico, no fue posible obtener fragmentos con utilidad para el proceso de hidrólisis de celulosa. En conclusión, la estrategia utilizada fue exitosa, siendo posible obtener fragmentos de secuencia de tres endoglucanasas de hongos no descritas, que pueden ser potencialmente útiles en el proceso de hidrólisis de celulosa para la producción de bioetanol de segunda generación.

Ingeniero Civil Químico. Ingeniero Civil en Biotecnología / Se fabricaron electrodos sensibles a la luz ultravioleta con la finalidad de ser utilizados como fotoánodos en celdas fotoelectroquímicas para la hidrólisis del agua. Los fotoánodos consisten en óxidos amorfos de molibdeno electrodepositados sobre un sustrato compuesto por vidrio transparente con una capa de óxido de estaño dopado con flúor por uno de sus lados. El proceso de electrodeposición se efectuó utilizando como electrolito una solución diluida de molibdato (0,01 mol dm−3 ), en presencia y ausencia de citrato (a concentración equimolar), a 25 ºC y pH 8,0. Este último valor fue escogido a partir del análisis de los resultados de un modelo de especiación del molibdeno en los electrolitos ya mencionados. El modelo fue realizado a partir de información termodinámica recopilada desde bibliografía. A través de mediciones de voltametría cíclica sobre el sustrato inmerso en el electrolito, se obtuvo que el ion molibdato, especie predominante de Mo a pH 8,0; presenta un pico de reducción cercano a -1,1 V vs Ag|AgCl, KCl (sat.), tanto en presencia como en ausencia de citrato. Es por lo anteriormente expuesto que se electrodepositó manteniendo dicho potencial durante 90 minutos. Los depósitos formados son transparentes y de color café. Se estimó su grosor en valores comprendidos entre 4 y 8 μm. Se calculó el valor de energía de banda prohibida por métodos ópticos, para los depósitos efectuados a -1,1 V vs Ag|AgCl, KCl (sat.), el cual es de 3,6 eV para transiciones directas y 1,6 eV para indirectas, para muestras efectuadas a partir de soluciones con y sin citrato. A partir de técnicas de espectroscopía de fotoelectrones emitidos por rayos X (XPS) y de fluorescencia por energía dispersiva (EDS) se corrobora que las películas delgadas contienen Mo entre 3 y 6 % en masa, O y C. El estado de oxidación del Mo es intermedio entre +5 y +6 al utilizar electrolito tanto con como sin citrato. Por último, se midió la fotosensibilidad de los depósitos cuantificando el cambio en el potencial de circuito abierto respecto a un electrodo Ag|AgCl, KCl (sat.) bajo condiciones de iluminación con luz UV y oscuridad. En esta última medición se obtuvo un fotovoltaje de 5 mV hacia valores más catódicos en presencia de luz UV, lo que permite señalar que el material semiconductor obtenido es de tipo n. Mediante voltametrías de barrido lineal en luz UV y en oscuridad se reportó la existencia de fotocorriente al polarizar anódicamente electrodos fabricados a partir de electrolito con citrato.

El proceso de desgomado constituye una etapa importante en la producción de aceites de girasol mediante la cual se originan las denominadas borras. Las mismas están formadas principalmente por agua, conteniendo porcentajes menores de fosfolípidos y triglicéridos y cantidades pequeñas de otros componentes como glicolípidos y carbohidratos. El tratamiento de la borras por eliminación del agua, posterior reducción del contenido del aceite y/o fraccionamiento ó modificación, conduce a la obtención de lecitinas de especial aplicación en la industria alimenticia, debido fundamentalmente a sus propiedades emulsificantes. Sin embargo, al tratar directamen-te las borras con enzimas específicas, se puede obtener un producto final de características emulsionantes, estabilizantes y dispersantes propias; agregándole un mayor valor comercial a su uso industrial. El interés por el estudio de la hidrólisis de las borras de girasol radica en la utilización de un producto que es muchas veces descartado, conduciendo a pérdidas económicas en el proceso de refinamiento de los aceites vegetales. La utilización de enzimas como catalizadores de la reacción convierte a este proceso en una forma sencilla, económica y de alto rendimiento en la generación de nuevos productos. La hidrólisis de las borras mediada por lipasas puede suceder sobre las moléculas de triglicéridos y/o fosfolípidos, obteniéndose diferentes productos de reacción como diglicéridos, monoglicéridos, glicerol, ácidos grasos libres y lisofosfolípidos, dependiendo el sustrato en cuestión. Asimis-mo, el tipo de enzimas empleadas, libres ó inmovilizadas en soportes; y la preferencia hacia la posición de ataque, 1,3- específica o inespecíficas son factores que afectan la distribu-ción de los productos de reacción. De esta manera, los usos potenciales de las borras y el valor económico del producto obtenido por tratamiento enzimático dependerá tanto del tipo y las características de la materia prima como del proceso de desgomado, la modificación de las borras y las técnicas de purificación aplicadas. El objetivo general de esta Tesis es sumar conocimiento sobre la hidrólisis enzimática de borras provenientes del desgomado del aceite de girasol, empleando diferentes lipasas comerciales, y determinar mediante titulación ácido-base y cromatografía gaseosa las variaciones en la composición de los productos de reacción y en particular de los ácidos grasos obtenidos. El trabajo fue organizado en diferentes etapas. Se partió de un sustrato artificial, represen-tante de la borra, consistente en una mezcla de aceite de girasol y lecitina de soja; siendo ambos constituyentes estudiados previamente por separado. Luego lipasas seleccio-nadas fueron ensayadas sobre la borra de girasol, variándose diferentes parámetros de reacción. Paralelamente se realizó la caracterización del sustrato mediante diferentes técnicas analíticas. El Capítulo 1 se inicia con una descripción general de las enzimas y de las lipasas empleadas, haciendo referen-cia a distintos aspectos como su comportamiento en la inter-fase y la migración acílica; para finalizar con el proceso de obtención de borras y su modificación a través de la hidrólisis enzimática. En el Capítulo 2 se describen los materiales y equipos empleados, la caracterización de los sustratos y las metodologías implementadas para el estudio de la reacción de hidrólisis; desde la toma de muestra hasta la obtención de resultados por titulación y cromatografía gaseosa. En el Capítulo 3 se presentan los resultados obtenidos del estudio de la reacción de hidrólisis enzimática sobre el aceite de girasol. Asimismo se realiza una descripción del sistema de reacción y del ensayo experimental realizado. En el Capítulo 4 se presentan los resultados obtenidos del estudio de la reacción de hidrólisis enzimática sobre la lecitina de soja. Asimismo se realiza una descripción del sistema de reacción y del ensayo experimental realizado. En el Capítulo 5 se presentan los resultados obtenidos del estudio de la reacción de hidrólisis enzimática sobre la mezcla formada por aceite de girasol y lecitina de soja. Asimismo se realiza una descripción del sistema de reacción y del ensayo experimental realizado. En el Capítulo 6 se presentan los resultados obtenidos del estudio de la reacción de hidrólisis enzimática sobre la borra de aceite de girasol. Asimismo se realiza una descripción del sistema de reacción y del ensayo experimental realizado. Entre las variables estudiadas se encuentran la cantidad de catalizador, la temperatura de reacción y la cantidad de solución buffer. El Capítulo 7 resume las conclusiones expuestas en los capítulos 3, 4, 5 y 6 y relata los potenciales trabajos sobre futuras líneas de investigación en el tema. / The degumming process constitutes an important step in the production of sunflower oils in which the called gums are originated. These are formed mainly by water, containing small percentages of phospholipids and triglycerides and little quantities of others components like glycolipids and carbohy-drates. The treatment of the gums by removal of the water, later reduction of the content of the oil and/or their fraction or modification, leads to obtain lecithins with special applica-tion in the food industry, because of its emulsification properties fundamentally. However the direct treatment of the gums with specific enzymes might produce a final product with own emulsification, stabilization and dispersants characteristics; adding a better commercial value to its industrial use. The interest in the study of the hydrolysis of sunflower gums, consists in the utilization of a product which is usually discarded, conducing to economic waste in the process of refining vegetables oils. The employment of enzymes as reaction catalyst, turns this process in a simple, potentially economic and high performance way in the generation of new products. The hydrolysis of the gums through lipases, can take place upon the triglycerides and/or phospholipids molecules, obtaining different reactions products like diglycerides, monoglycerides, glycerol, free fatty acids and lisophospholipids, in relation of the involucrate substrate. Likewise, the type of enzyme employed, free or immobilized in supports; and the position preference, 1,3-specific or unspecific, are factors that affect the distribution of the reaction products. In this way, the potential uses of the gums and the economic value of the obtained product by enzymatic treatment will depend on the type and the characteristics of the raw material as well on the degumming process, the gums modification and the applied purification techniques. The general aim of this Thesis is to sum knowledge about the enzymatic hydrolysis of the gums coming from the degumming of the sunflower oil, employing different commercial lipases and to determine by acid-basic titration and gas chromatography the variations in the compo-sition of the reaction products, in particular the fatty acids obtained. This work was organized in different stages. It began from an artificial substrate, on behalf of the gum, consisting in a mix of sunflower oil and soya lecithin; being both constituents previously individually studied. Then, selected lipases were tested on the sunflower gum, varying different reaction parameters. At the same time the charac-terization of the substrate was made by different analytical techniques. Chapter 1 begins with a general description of the enzymes and the lipases employed, describing different aspects like its interface behavior and the acyl migration; and finalizes with the process to obtain gums and its modification by the enzymatic hydrolysis. In Chapter 2 are described the materials and equipment employed, the substrate characte-rization and the implemented methodologies for the study of the hydrolysis reaction; from getting the sample till obtain the results by titration and gas chromatography. Chapter 3 shows the results obtained by the study of the enzymatic hydrolysis reaction with sunflower oil. Likewise a description of the reaction system and the experimental assay is presented. Chapter 4 shows the results obtained by the study of the enzymatic hydrolysis reaction with soya lecithin. Likewise a description of the reaction system and the experimental assay is presented. Chapter 5 shows the results obtained by the study of the enzymatic hydrolysis reaction with a sunflower oil and soya lecithin mix. Likewise a description of the reaction system and the experimental assay is presented. Chapter 6 shows the results obtained by the study of the enzymatic hydrolysis reaction with sunflower gum. Likewise a description of the reaction system and the experimental assay is presented. The variables studied are: quantity of catalyst, reaction temperature and quantity of buffer solution. Chapter 7 summarizes the expose conclusions in chapters 3, 4, 5 and 6 and relates the potential works about future lines of research in this subject.

El complejo aceitero argentino es uno de los sectores de la industria alimentaria que ha evidenciado mayor crecimiento durante los últimos años. Localmente se manifiesta una creciente necesidad de producir materiales elaborados con mayor valor agregado, tanto para consumo interno como para exportación. Argentina es uno de los principales productores y exportadores de aceite de girasol (Helianthus annuus L.) y la industria local se destaca por su avanzada tecnología y alta competitividad. Los fosfolípidos (PLs) son componentes naturales de las semillas oleaginosas que pasan al aceite durante el proceso de extracción. Estos compuestos deben ser removidos, ya que pueden depositarse durante el transporte o almacenamiento del aceite crudo como así también afectar su estabilidad y características sensoriales. Las gomas, producto del desgomado acuoso de aceites vegetales, constituidas fundamentalmente por agua, PLs y aceite, podrían ser procesadas secas (lecitina cruda) o desaceitadas para obtener productos con un mayor valor agregado adecuados para ser usados como aditivos alimenticios. En la presente tesis se propone estudiar la modificación de lecitinas vegetales mediante la hidrólisis enzimática de lecitinas crudas utilizando fosfolipasas libres para dar lugar a nuevos productos de interés industrial. La tesis se estructura en ocho capítulos, en los Capítulos 1, y 2 se presenta una introducción teórica que incluye una revisión bibliográfica suministrando al lector los conocimientos básicos sobre el área. En el Capítulo 3 se detallan los materiales utilizados y la metodología experimental llevada a cabo para las reacciones de hidrólisis y las técnicas analíticas para cuantificación e identificación de los compuestos presentes en el sustrato y los productos. En el Capítulo 4 se describe el diseño experimental para la hidrólisis enzimática de lecitina cruda de girasol utilizando Lecitase® Ultra como catalizador, se presenta un estudio de las condiciones óptimas o recomendables para la reacción, y se muestran los resultados obtenidos para la caracterización de la materia prima y los productos de hidrólisis, hallándose que no era posible identificar ni cuantificar todas las especies de PLs con las metodologías tradicionales. En el Capítulo 5 se presenta el desarrollo de una técnica analítica para determinación de PLs y sus formas hidrolizadas mediante espectroscopía de resonancia magnética nuclear de fósforo (31P-NMR), junto con una revisión de las distintas técnicas analíticas normalmente utilizadas encontradas en bibliografía. En el Capítulo 6 se reportan los resultados de la cuantificación de PLs por este método, realizando el seguimiento a diferentes tiempos de hidrólisis. Luego en el Capítulo 7 se presentan los estudios realizados para evaluar las propiedades estabilizantes de las lecitinas modificadas en un caso específico (emulsiones lácteas) y se analiza cómo varían las propiedades observadas según los distintos grados de hidrólisis y por ende según la composición de las lecitinas. Finalmente en el Capítulo 8 se presentan las conclusiones de los estudios realizados en esta tesis, junto con sugerencias de trabajos futuros para su continuación y/o profundización en los temas tratados. / In Argentina, the edible oil processing is one of the food industry areas with highest growing levels in the last years. Locally, an increasing demand has arisen for the production of manufactured materials with higher added value, both for internal market and for export. Argentina is one of the major producers and exporters of sunflower oil (Helianthus annuus L.), and the local industry is characterized for its advanced technology and high competitiveness. Phospholipids (PLs) are natural components of oily seeds which are extracted along with the oil in the extraction process and must be removed from the oil in order to prevent their settling during crude oil shipping or storing. They also affect oil stability and sensorial properties. Gums, which are by-products from the aqueous degumming of vegetable oils and are constituted mainly by water, PLs and oil, might be processed dried (crude lecithin) or deoiled, in order to obtain products with higher added value, suitable for applications as food additives. In this thesis, a study concerning the modification of sunflower lecithin by means of enzymatic hydrolysis of crude lecithin using free phospholipases is proposed in order to obtain new products of interest for industrial applications. The thesis is divided in eight chapters. In Chapters 1 and 2 a theoretical introduction is presented, including a literature review to provide the reader with the basic concepts on the topic. In Chapter 3 the materials and experimental methodology used for the hydrolysis reactions, as well as the analytical techniques for the quantitation and identification of the compounds present in the substrate and reaction products are described in detail. In Chapter 4 the experimental design for the enzymatic hydrolysis of crude sunflower lecithin using Lecitase® Ultra as catalyst is described, presenting a study of the optimal or recommended reaction conditions. Raw material and hydrolysis products characterization results are shown, concluding that it is not possible to identify and quantify all the PLs species with the traditional methodologies. In Chapter 5 the development of an analytical technique for the determination of PLs and their hydrolyzed forms by phosphorus nuclear magnetic resonance spectroscopy (31P-NMR) is presented, together with a review of different analytical techniques usually found in the literature. In Chapter 6 the PLs quantification results using this method are reported for different hydrolysis times. In Chapter 7 the evaluation of the stabilizing properties of modified lecithins in a specific application (dairy emulsions) is presented, as well as an analysis of the variation of the observed properties for different hydrolysis degrees and therefore for different lecithin composition. Finally, in Chapter 8 the conclusions of the thesis are summarized, together with future work suggestions for the continuation and/or deepening of the studied topics.

Los objetivos del presente trabajo fueron: • Producir Ramnosidasa alcalina de Verticillum tenerum en medios con harina de soja y triptona como fuente de carbono y energía y fuente de nitrógeno respectivamente. • Buscar condiciones de cultivo que maximicen la producción de enzima. • Purificar parcialmente la enzima a partir del sobrenadante de los cultivos. • Determinar parámetros de la enzima tales como pH óptimo, estabilidad térmica, etc.

Ingeniera Civil en Biotecnología / En las últimas décadas se han estudiado y utilizado las energías renovables no convencionales como una alternativa a los combustibles fósiles. Dentro de éstas se encuentra el bioetanol de segunda generación, producido a partir de residuos lignocelulósicos, siendo la hidrólisis de celulosa una de las etapas claves en el proceso productivo. Uno de los métodos de hidrólisis, es el uso de enzimas producidas por hongos de pudrición que degradan naturalmente la madera. Bajo este marco se define el objetivo general de este trabajo, que es estudiar la producción de proteínas hidrolíticas para la degradación de lignocelulosa por el hongo de pudrición blanca Trametes versicolor. La metodología se dividió en dos ejes principales: definir las condiciones de cultivo de T. versicolor que induzcan la producción de proteínas hidrolíticas, y caracterizar tales proteínas mediante ensayos de actividad de celulasas y ligninasas, utilizando sustratos puros y paja de trigo. El cultivo del hongo se realizó a 28ºC, 50 rpm de agitación y en oscuridad. El medio elegido fue adaptado del artículo de Suwannarangsee et al. (2012), y contenía además 1% p/v de paja de trigo. Este cultivo se inoculó con el hongo en una preparación líquida, y se incubó por 11 días, alcanzando una actividad celulasa de 0,5 [IU/ml] (promedio de los 6 matraces) al cabo de este periodo. La separación de proteínas obtenidas del cultivo se hizo mediante cromatografía de filtración en gel en columna Sephacryl S-100. En esta etapa se recuperó un 18% de proteínas totales, y se logró un enriquecimiento enzimático de 35,96 [IU/mg proteína], triplicando el valor obtenido por el extracto proteico que fue cargado en la columna. Estas proteínas fraccionadas se sometieron a ensayos de celulasas y ligninasas, en los cuales se obtuvo que los mayores valores de actividad estaban entre las fracciones 23 a 28, coincidentes con el peak de absorbancia a 280 nm. Además, se pudo constatar un alto enriquecimiento de xilanasas con 32,9 [IU/mg prot.], versus el extracto proteico con 3,1 [IU/mg prot.]. Por otro lado, se realizó una hidrólisis con paja de trigo, para comparar la acción enzimática de las fracciones proteicas con respecto a Celluclast. Se pudo concluir que no existe sinergia entre ambos componentes, pero si hay una contribución a la acción de la enzima comercial por parte de las proteínas de T. versicolor. Esto se evidenció principalmente en la medición de xilosa, en la cual hubo un mejoramiento de un 47% en la fracción 27. El rendimiento enzimático fue de 2,11 [mg xilosa/mg proteína], siendo más del doble de lo obtenido por las celulasas comerciales en la hidrólisis de paja de trigo. Finalmente, se concluyó que el sistema de separación es eficiente para tener una primera aproximación de las enzimas buscadas dentro de las fracciones cromatográficas, y enriquecer tales fracciones con las proteínas de interés. También fue posible constatar que existe un gran potencial hidrolítico dado por la batería enzimática del hongo T. versicolor, especialmente por las xilanasas producidas por éste. Esto es muy relevante para la etapa de sacarificación, ya que el xilano como sustrato es el segundo más abundante después de la celulosa, y por ende, con gran potencial fermentativo.

Magíster en Ciencias de la Ingeniería, Mención Química / Ingeniera Civil en Biotecnología / Existe una preocupación mundial por la disponibilidad de los combustibles fósiles para suplir la demanda de energía en el mundo, que aumenta año a año, y los problemas ambientales que su uso genera. Así, el bioetanol lignocelulósico ha surgido como una adecuada alternativa para reemplazar parcialmente la gasolina, pero todavía su costo no es competitivo con el petróleo o gasolina. El proceso de producción de bioetanol consta de tres etapas principales: pretratamiento, hidrólisis y fermentación. Específicamente, la hidrólisis es catalizada por celulasas y es una de las etapas con grandes proyecciones a disminuir su costo, por lo que este trabajo se enfoca en esta etapa, principalmente en el desarrollo de nuevas celulasas, que puedan aportar al desarrollo actual y a lograr reducir el costo de producción del bioetanol. El objetivo de este trabajo fue aislar y caracterizar el gen que codifica para una endoglucanasa del hongo Trametes versicolor y expresar la enzima en el sistema de expresión de Pichia pastoris. A partir de dos fragmentos de la secuencia del gen, se obtuvo una secuencia con el dominio catalítico completo, llamada tveg. La secuencia se clonó en el vector pPICZαA y se transformó células de la cepa GS115 de P. patoris para expresar la proteína en forma extracelular. Luego se realizó una curva de inducción y se estudió la expresión de la enzima en la fracción extracelular e intracelular. El análisis de la expresión se realizó mediante ensayos de actividad sobre carboximetilcelulosa (CMC) en medio sólido y en medio líquido, zimogramas y geles SDS-PAGE. El análisis de tveg mediante BLASTX mostró, con un 90% de identidad, que corresponde a la secuencia de una endoglucanasa del hongo T. versicolor, perteneciente a la familia 5 de las glicosil hidrolasas. Los ensayos en medio sólido revelaron actividad enzimática en la cepa recombinante GS115, indicando que la expresión fue exitosa. Por otra parte, los ensayos en medio líquido de la cepa GS115-TvEG permitieron cuantificar la actividad de la endoglucanasa TvEG recombinante, produciendo 8,3 U/l de cultivo a las 84 horas de inducción con metanol, de las cuales un 50% se encontraba en la fracción extracelular y un 50% en la fracción citoplasmática. Los zimogramas corroboraron los resultados de los ensayos en medio líquido y en los geles SDS-PAGE se vio una proteína con un peso molecular aparente de 90 kDa, mucho mayor a los 30 kDa estimados para TvEG, posiblemente por hiperglicosilación y/o problemas de corte de la señal de secreción. Por otro lado, se estudió la producción de celulasas nativas del hongo T. veriscolor en Avicel, CMC y astillas de Lenga como fuente de carbono. Con CMC se logró mayor producción de actividad celulolítica, llegando a un máximo de 225 U/l a los 6 días de cultivo. La gran diferencia entre el sistema nativo y el sistema recombinante, y la comparación con otros estudios, indican que la expresión de TvEG debe y puede ser mejorada.

Los productos industriales obtenidos por la vía enzimática poseen propiedades y características distintivas frente a aquellos obtenidos por reacciones químicas tradicionales, lo que los hacen principalmente adecuados para su uso en la industria alimentaria. Particularmente, con la utilización de lipasas en la modificación de grasas y aceites, se evita el deterioro de los ácidos grasos insaturados y sus grupos funcionales. Con el fin de que la tecnología enzimática sea competitiva a nivel local y no tenga insumos críticos, se hace necesario tanto el desarrollo propio de catalizadores enzimáticos como el estudio y optimización de cada uno de los procesos de producción. Si bien las lipasas pueden ser de origen animal, microbiano o vegetal, actualmente, la producción de lipasas comerciales se encuentra focalizada principalmente en las de origen microbiano, seguidas por las animales. La presente tesis estudia la posibilidad de utilizar diferentes fuentes vegetales, como girasol, trigo y ricino, para la producción de biocatalizadores con aplicación en la modificación de aceites vegetales. La hidrólisis enzimática, proceso que conlleva la liberación de los ácidos grasos del esqueleto carbonado del glicerol presente en los triglicéridos, fue la reacción principal mediante la cual se evaluaron los biocatalizadores de interés. En el Capítulo 1 se desarrollaron los fundamentos teóricos necesarios para la comprensión de la tesis: estructuras químicas y reactividad de los lípidos, aplicaciones industriales y estado del arte de las lipasas. El Capítulo 2 describe los materiales y métodos utilizados, por lo que será frecuentemente referenciado en los capítulos restantes de la tesis. Para determinar si la metodología utilizada era confiable, se realizaron diversos ensayos, los cuales se describen en el Capítulo 3. Los Capítulos 4 y 5 se centran en el estudio de la actividad lipásica de extractos vegetales obtenidos a partir de semillas de girasol y trigo en reacciones de hidrólisis utilizando aceite de girasol como sustrato. El Capítulo 6 presenta el estudio de la actividad lipásica de biocatalizadores obtenidos a partir de semillas de ricino, profundizando en el estudio de características fundamentales como repetitividad del sistema de reacción, evolución de la actividad a diferentes tiempos de almacenamiento y el efecto de la concentración del biocatalizador, entre otros. En el Capítulo 7, luego de seleccionar las variables de reacción principales, se realizó la optimización de la actividad lipásica de este biocatalizador, utilizando metodologías de superficies de respuesta. Por otro lado, el Capítulo 8 se basa en el estudio de la cinética del catalizador utilizando tiempos de reacción prolongados a diferentes condiciones, así como también incluye el modelado matemático de los perfiles cinéticos obtenidos. Finalmente, en el Capítulo 9 se presentan las conclusiones más relevantes obtenidas mediante el desarrollo de la presente tesis, así como también los posibles ítems o lineamientos que se prevén como interesantes para ameritar su desarrollo a futuro. / The industrial products obtained by the enzymatic route have distinctive properties and characteristics over those obtained by traditional chemical reactions, which make them mainly suitable for its use in the food industry. Particularly, with the use of lipases in the modification of fats and oils, the deterioration of the unsaturated fatty acids and their functional groups is avoided. In order for the enzymatic technology to be competitive locally and without critical inputs, it is necessary both, the development of enzyme catalysts as well as the study and optimization of each of the production processes. Although lipases may be of animal, microbial or vegetable origin, the production of commercial lipases is currently mainly focused on those of microbial origin, followed by animals. The present thesis studies the possibility of using different plant sources, such as sunflower, wheat and castor bean, for the production of biocatalysts. Enzymatic hydrolysis of vegetable oils, a process leading to the release of fatty acids from the carbon skeleton of glycerol present in triglycerides, was the main reaction by which the biocatalysts of interest were evaluated. In Chapter 1 the theoretical foundations necessary for the understanding of this thesis were developed: chemical structures and reactivity of lipids, industrial applications and state of the art of lipases. Chapter 2 describes the materials and methods used, thus it will often be referenced in the remaining chapters of the thesis. To determine if the methodology used was reliable, several trials were performed, which are described in Chapter 3. Chapter 4 and 5 focus on the study of the lipase activity of plant extracts obtained from sunflower and wheat seeds in hydrolysis reactions using sunflower oil as substrate. Chapter 6 examines the lipase activity of the biocatalyst obtained from castor bean, deepening the study of fundamental characteristics such as repeatability of the reaction system, evolution of the activity at different storage times and the effect of the biocatalyst concentration, among others. In Chapter 7, after selecting the main reaction variables, the optimization of the lipase activity of this biocatalyst was performed, using response surface methodologies. On the other hand, Chapter 8 is based on the study of catalyst kinetics using extended reaction times at different conditions, as well as the mathematical modeling of the kinetic profiles. Finally, Chapter 9 presents the most relevant conclusions obtained through the development of this thesis, as well as the possible future work.

Esta tesis doctoral está dirigida al desarrollo de poliuretanos a partir de dioles derivados de carbohidratos. Los poliuretanos son polímeros muy versátiles que pueden ser usados en una amplia variedad de aplicaciones que van desde espumas de relleno a artículos técnicos. Actualmente, existe un interés creciente por parte de la industria del poliuretano en la incorporación de productos procedentes de fuentes renovables. Dioles derivados de grasas naturales y aceites así como otros dioles de producción biotecnológica como el 1,3-propanodiol y ácido poliláctico han sido utilizados en la síntesis de estos polímeros. Hasta el momento, algunos poliuretanos derivados de sacáridos han sido descritos aunque ninguno de ellos ha alcanzado nivel industrial; incluyendo polímeros derivados de lignina polihidroxilada o dioles cíclicos como isosorbide y gulonolactonas. La Tesis describe la preparación de poliuretanos lineales a partir de dioles cíclicos derivados de carbohidratos, específicamente ácido tartárico y alditoles derivados del ácido tartárico, y arabino- y xilopiranosa. Además, otros dioles naturales derivados de la glucosa pero con estructura cíclica, 1,4:3,6-dianhidrosorbitol y 2,4:3,5-di-O-metilen-D-glucitol fueron usados. Todo los dioles usados en esta Tesis son accesibles vía síntesis química o son directamente comerciales, y por lo tanto son una buena opción para la introducción de productos naturales en la química del poliuretano. La incorporación de estas unidades hidrofílicas produce poliuretanos más susceptibles a la hidrólisis al ser incubados en soluciones neutras, ácidas o básicas. El primer bloque de esta Tesis está dedicado a la síntesis, caracterización y estudio de degradabilidad hidrolítica de poliuretanos derivados de alditoles con los grupos secundarios protegidos como éter de metilo, éter de bencilo o acetal. La hidrólisis total o parcial de los éteres bencílicos o los grupos acetal en el poliuretano es factible mediante hidrogenólisis o mediante tratamiento con ácidos, respectivamente, estos métodos proporcionan una ruta conveniente para la obtención de poliuretanos con grupos hidroxilo laterales, que son sumamente hidrofílicos, aumentando así la hidrodegrabilidad del poliuretano. El segundo bloque describe la síntesis de poliuretanos a partir de ésteres del ácido tartárico. En este caso, los tartratos se polimerizan directamente con los diisocianatos, obteniéndose poliuretanos con ésteres alquílicos o bencílicos laterales. La degradabilidad hidrolítica de estos poliuretanos fue estudiada mediante incubación en medio ácido o básico, observándose un aumento de la hidrodegradabilidad respecto a los poliuretanos lineales no funcionalizados. El tercer bloque está dedicado al estudio de poliuretanos segmentados. Debido al creciente interés por la introducción de extensores de cadena derivados de recursos renovables, y también con el objetivo de realzar la hidrodegradabilidad de los poliuretanos resultantes, dos dioles derivados de la glucosa fueron usados para la obtención de poliuretanos segmentados con segmento flexible de policaprolactona. Se estudiaron sus propiedades térmicas, mecánicas e hidrolíticas. Finalmente, el último bloque está dedicado al fenómeno de la estereocomplejación. Se describe el método de preparación, la formación, evidenciada por diferentes técnicas espectroscópicas, y la cristalizabilidad del estereocomplejo formado por dos politartaramidas enantioméricas. / The presented Thesis is addressed to the development of polyurethanes made from carbohydrate derived diols. Polyurethanes are extremely versatile polymers that can be used in a wide variety of applications going from massive filling foams to highly technical items. The preparation of polyurethanes from renewable feedstocks is currently receiving increasing attention in the polyurethane industry. Diols derived from naturally-occurring fats and oils as well as biotechnologically produced diols like 1,3-propanediol and hydroxyl end-caped poly(lactic acid) have been recently introduced in the synthesis of these polymers. A fair number of polyurethanes containing units derived from saccharides have been reported so far although none of them has reached industrialization; the selection embraces polymers made from complex polyhydroxylated lignin fragments to cyclic diols such as isosorbide and gulonolactones. The Thesis describes the preparation of linear polyurethanes from acyclic carbohydrate derived diols, specifically tartaric acid and alditols from tartaric acid, and arabino- and xylopyranose. Additionally, other natural diols from glucose but with cyclic structure, 1,4:3,6-dianhydrosorbitol and 2,4:3,5-di-Omethylene-D-glucitol were used. All diols used in this Thesis are accessible via chemical synthesis or are directly commercially available, and therefore they are a good option to introduce natural products in the polyurethane chemistry. The incorporation of these hydrophilic units can also render polyurethanes more susceptible to hydrolysis. The first block of this Thesis is dedicated to the synthesis, characterization and hydrodegradability of polyurethanes from alditols having all secondary hydroxyl groups protected as methyl ether, benzyl ether or acetal. Since total or partial splitting of the benzyl ethers or acetal groups after polymerization was feasible by hydrogenolysis or treatment by acids, respectively, these methods provided a suitable route to polyurethanes bearing pendant hydroxyl groups, which are highly hydrophilic and more susceptible to hydrolysis. The second block describes the synthesis of tartrate derived polyurethanes. In this case, tartrates were directly reacted with diisocyanates, and polyurethanes with different alkyl or benzyl ester side groups were obtained. The hydrodegradability of these polyurethanes was enhanced by incubating them in acid or basic buffers that hydrolysate the side alkyl esters, or by hydrogenolysis of the benzyl esters; in both cases polyurethanes bearing carboxylic side groups much more hydrolysable than their parent polyurethanes were prepared. The third block is dedicated to the study of segmented polyurethanes. Because there is a growing interest in introducing new chain extenders derived from renewable resources as an alternative to oil-based monomers, and also with the objective of enhancing the hydrodegradability of the resulting polyurethanes, two different carbohydrate derived monomers and their corresponding segmented polyurethanes were used as chain extenders in segmented polyurethanes with soft segment of polycaprolactone. Finally, the last block is dedicated to the phenomenon of stereocomplexation. The preparation method, the formation, evidenced by different spectroscopic techniques, and crystallizability of a polytartaramide stereocomplex is described. In addition, the exploration of stereocomplexation in other systems is presented.

Actualmente las proteasas alcalinas son ampliamente utilizadas en la industria del cuero, en distintas formulaciones de detergentes, también en el proceso de recuperación de plata, y en la producción de hidrolizados de proteínas. Comúnmente, todas estas proteasas se obtienen de fuentes microbianas que crecen en sustrato relativamente caros. Muchos estudios demuestran que cerca del 40% del costo de producción de estas enzimas está relacionada con la composición del medio de cultivo. Para reducir el costo de producción es importante la búsqueda de microorganismos capaces de crecer y de producir suficiente cantidad de la enzima usando sustratos baratos. En este sentido desechos de naturaleza queratínica tienen un enorme potencial para ser utilizacos como sustrato para la producción de un grupo de enzimas proteolíticas llamado queratinasas, las cuales presentan la capacidad de hidrolizar la queratina, proteína sumamente resistente a la degradación por su estructura y por la presencia en su molécula de puentes disulfuro. En el presente trabajo de tesis seis cepas de hongos no patógenos aislados de suelos alcalinos de la provincia de Buenos Aires, Argentina, (Acremonium murorum, Aspergillus sidowii, Cladosporium cladosporioides, Neurospora tetrasperma, Purpureocillium lilacinum (ex Paecilomyces lilacinus) y Westerdikella dispersa) fueron evaluados de acuerdo a su capacidad de producir enzimas queratinolíticas. Entre estas cepas, P. lilacinum resultó ser el hongo con mayor producción de actividad proteolítica y queratinolítica, tanto en fermentación en sustrato solido como en sumergido, siendo seleccionado para continuar con este trabajo. Se establecieron las condiciones óptimas de cultivo para la producción enzimática utilizando diseños experimentales y la metodología de superficie de respuesta. Las condiciones óptimas fueron: 7,10 g/l de glucosa; 0.0065 mg/l de CaCl<SUB>2</SUB> y pH inicial de 5.60; en estas condiciones de cultivo, el rendimiento máximo para la producción de queratinasas predijo por el modelo fue de 26,7 U azo/ml. La validación del modelo demostró que, tanto el polinomio como las correspondientes superficies de respuesta obtenidas describen adecuadamente la influencia de la concentración de glucosa, de calcio y el pH inicial en la producción de queratinasas. Luego de la optimización del medio de cultivo se procedió a la purificación de la enzima, las etapas involucradas en la purificación fueron la precipitación con sulfato de amonio y distintas técnicas cromatográficas de intercambio iónico y permeación en gel, con un factor de purificación de 19.8 veces y una actividad específica de 1430 U/mg de proteína. El peso molecular de la enzima, determinado por SDS-PAGE, fue de 37 kDa. La queratinasa extracelular de P. lilacinum se caracteriza por su apreciable estabilidad en un amplio intervalo de pH (4.0 a 9.0), y hasta 65°C. La inhibición que presenta frente a PMSF (98,2% de la inhibición) sugiere su naturaleza serínica. La enzima es activa y estable en presencia de solventes orgánicos tales como dimetilsulfóxido, metanol, e isopropanol; ciertos tensioactivos como Triton X-100, dodecilsulfato de sodio, y Tween 85, y agentes oxidante como el peróxido de hidrógeno. Sus parámetros cinéticos de inactivación térmica fueron estimados bajo diferentes condiciones y fue posible observar cómo afectan calcio, el glicerol y el propilenglicol a la estabilidad térmica de la enzima. Se investigó la inmovilización covalente de la queratinasa pura sobre un soporte de quitosán, optimizando la concentración de los agentes entrecruzantes glutaraldehído y genipina, así como también el tiempo de activación. La enzima inmovilizada presentó mayor estabilidad frente a pH y temperaturas extremas en comparación con la enzima libre, además retiene 61.37 % de la actividad enzimática inicial después de cinco ciclos de hidrolisis. Se estudiaron las potenciales aplicaciones biotecnológicas del extracto enzimático, entre ellas se estudió por su compatibilidad y estabilidad frente a detergentes comerciales (7 mg/ml) como Ariel y Skip, observándose que éste retiene más de 70 % de su actividad proteolítica inicial después de 1 h de incubación a 40ºC. La simulación de lavado reveló que el extracto era capaz de eliminar eficazmente las manchas de sangre. Se estudió también la posibilidad de utilizar este extracto enzimático en la recuperación de plata a partir de placas radiográficas usadas. En dosis de enzima de 6,9 U azoc/ml y a 60ºC, la eliminación completa de la capa de gelatina con la liberación completa de las partículas de plata se alcanzó en 6 min a pH 9.0. Por último, P. lilacinum además de producir enzimas queratinolíticas con la producción de paralela de amonio, mostró la capacidad producir sideróforos y ácido indolacético (IAA) al crecer con residuo pelo como sustrato en presencia de Trp y baja concentración de hierro. Se realizaron ensayos a nivel de invernadero con plantas de tomate, encontrándose que, en términos de peso seco, el hidrolizado mostró un efecto similar al del fertilizante de referencia. Además, el hidrolizado demostró poseer actividad antifúngica contra varios patógenos de las plantas. Estos resultados indican el potencial biotecnológico tanto del extracto enzimático como el de la enzima pura de P. lilacinum siendo interesante además la capacidad del hongo de producir esta enzima utilizando un como sustrato un residuo de valor nulo, con lo cual sería de esperar que su costo de producción resulte relativamente bajo.