O hipocampo compõe uma das estruturas do sistema límbico, suas funções são variadas, tendo seu papel na regulação do comportamento emocional e em processos relacionados com a estocagem de memórias. Apesar de ter pouco ou nenhum papel no controle da função reprodutiva, o hipocampo é ainda assim um alvo sensível aos esteróides gonadais. Filamentos intermediários, como a proteína ácida fibrilar glial (GFAP) é um eficiente marcador do citoesqueleto de astrócitos e sofrem modificações sob ação de hormônios gonadais. Os objetivos do presente estudo foram mensurar o numero de células imunorretivas à GFAP (GFAP-ir), avaliar a imunorreatividade dos marcadores para filamentos intermediários astrocitários, bem como sua morfologia pelo método de Scholl, a GFAP-ir, no estrato radiatum da região CA1 do hipocampo, de ratos machos e fêmeas durante o desenvolvimento pós-natal. Além disso, também foi investigada a GFAP-ir nas mesmas regiões de fêmeas adultas, tanto em condições fisiológicas de variação hormonal (ao longo do ciclo estral), como em situações suprafisiológicas (reposição hormonal após ovariectomia). Três experimentos foram realizados: no primeiro foram utilizados ratos machos e fêmeas durante o desenvolvimento pós-natal (n = 48), cujas idades foram: 11 dias pós-natal (PN11), 21 (PN21), 31 (PN31) e 45 (PN45). No segundo experimento, utilizou-se ratos Wistar adultos machos e fêmeas nulíparas adultas durante as fases do ciclo estral (diestro, proestro, estro e metaestro; n = 30) para revelar diferenças provocadas pelos hormônios gonadais femininos na composição astrocitária do hipocampo. No terceiro experimento utilizaram-se fêmeas adultas nulíparas submetidas à ovariectomia (OVX) (n = 18) e tratadas com substituição hormonal de benzoato de estradiol adicionado ou não à progesterona. Os dados foram comparados entre os grupos por meio de um teste de análise da variância (ANOVA) de uma via, sendo aplicado o teste post-hoc Bonfferoni. A comparação dos dados de GFAP-ir apresentou diferenças significativas no número de células e na orientação dos prolongamentos. O número de prolongamentos centrais, aumentaram com a idade, sendo mais significativo para as fêmeas (F45xF11, p≤ 0,001, F45xF21, p≤ 0,01 e F45xF31 p≤ 0,01) que nos machos (M45x M21 p≤ 0,05). Já o número de processos laterais mostrou um aumento mais significativo com a idade nos machos (M45XM11, p≤ 0,001; M45XM21, p≤ 0,001 e M45xM31, p≤ 0,01) que nas fêmeas (F45xF11, p≤ 0,01). Havendo ainda diferenças quando analisados a orientação dos processos primários separadamente de suas ramificações. Os ratos machos apresentaram maior GFAP-ir do que as fêmeas em todas as fases do ciclo estral (diestro, proestro, estro e metaestro; p < 0,001), assim como apresentaram mais células que as fêmeas (p<0,001). Para orientação mais uma vez as diferenças ficaram restritas aos machos, tanto para os processos centrais como para os laterais (p<0,001 e p<0,05 respectivamente). Em fêmeas ovariectomizadas, injeções de estradiol provocaram aumento da GFAP-ir (P < 0,001), assim como houve um aumento do numero de células (P < 0,05) enquanto a morfologia não mostrou diferenças entre os grupos. Esses achados sugerem que a GFAP astrocitária pode ser afetada tanto por níveis fisiológicos de hormônios ovarianos quanto por manipulação hormonal destes esteróides, o que pode contribuir para a plasticidade neuro-glial relacionada a atividades locais e integradas destas áreas encefálicas em machos e fêmeas. Esses achados permitem concluir que esta influência hormonal sobre o hipocampo está presente ainda em fases iniciais do desenvolvimento do SN de ratos, apresentando particularidades morfológicas acima de tudo. Além disso, as diferenças de composição astrocitárias encontradas, ao longo do desenvolvimento, provavelmente se relacionam com a interação neurônio-glia em consonância com aspectos comportamentais e ajustes neuroendócrinos pertinentes a cada sexo, e a cada fase de diferenciação do sistema nervoso. / The hippocampus is part of the limbic system, its functions are varied, and their role in the regulation of emotional behavior and in processes related to the memories storage. Despite having little or no role in the control of reproductive function, the hippocampus still a sensitive target to gonadal steroids. Intermediate filaments such as glial fibrillary acidic protein (GFAP) is an efficient marker of the cytoskeleton of astrocytes and the action of gonadal hormones could alter this structure. The objectives of this study were to measure the number of GFAP imunorreactive cells (GFAP-ir), analysing the immunoreactivity the intermediate filaments of astrocyte, and their morphology by the Scholl‟s method, GFAP-ir in the stratum radiatum of the CA1 region from dorsal hippocampus of male and female rats during postnatal development. In addition, we investigated the GFAP-ir in the same regions of adult males and females, these under physiological hormonal changes (during the estrous cycle), as shown by supraphysiological (hormone replacement after ovariectomy). Three experiments were performed: the first was used male and female rats during postnatal development (n = 48), whose ages were 11 days postnatal (PN11), 21 (PN21), 31 (PN31) and 45 ( PN45). In the second experiment, we used adult male Wistar rats and nulliparous adult females during the estrous cycle (diestrus, proestrus, estrus and metestrus, n= 30) to reveal differences caused by female gonadal hormones on the content of astrocytes in the hippocampus. In the third experiment, a nulliparous adult females subjected to ovariectomy (OVX) (n = 18) and treated with hormone replacement therapy of estradiol benzoate added or not with progesterone. Data were compared between groups by means of a test analysis of variance (ANOVA) one-way, and applied post-hoc Bonfferoni‟s test. A comparison of the GFAP-ir showed significant differences in cell number and orientation of the extensions. The number of central extensions, increased with age, being more significant for females (F45xF11, p ≤ 0,001, F45xF21, p ≤ 0,01 and F45xF31 p ≤ 0,01) than in males (M45x M21 p ≤ 0,05). Since the number of lateral processes showed more significantly with age in males (M45XM11, p ≤ 0,001; M45XM21, p ≤ 0,001 and M45xM31, p ≤ 0,01) than in females (F45xF11, p ≤ 0,01). We also found differences when analyzed the orientation of primary processes separately from their branches. Male rats showed higher GFAP-ir than females at all stages of the estrous cycle (diestrus, proestrus, estrus and metestrus, p <0,001) and had more cells than females (p <0,001). About cell orientation, the differences were observed just in males, both for the core processes and to the lateral (p <0,001 and p <0,05 respectively). In ovariectomized females, injections of estradiol benzoate caused an increase in GFAP-ir (P <0,001), as well as an increase in the number of cells (p <0,05), but the morphology did not differ between groups. These findings suggest that the GFAP astrocyte can be affected both by physiological levels of ovarian hormones and on the hormonal manipulation of these steroids, which may contribute to neuro-glial plasticity related to local activities and integrated these brain areas in males and females. These findings show that hormonal influence on the hippocampus were present in early stages of development of the SN of rat, specially in the morphological characteristics. In addition, differences in astrocytic composition found throughout the development, probably were related to the neuron-glia interaction in accordance with aspects of behavioral and neuroendocrine adjustments, specific to each gender, and each stage of differentiation of the nervous system.

O sistema colinérgico muscarínico desempenha uma função central na memória, mas o papel de cada subtipo de receptor é pouco compreendido separadamente. As toxinas muscarínica (MTs) extraídas da peçonha das serpentes Dendroaspis sp são ferramentas farmacológicas seletivas aos diferentes subtipos de receptores muscarínicos. O subsistema M4 muscarínico modula os processos de consolidação e evocação. Recentemente, tem se dado atenção aos processos subseqüentes à evocação e vários trabalhos demonstraram que a reconsolidação e a extinção da memória compreendem etapas importantes na formação do processo. O objetivo desse trabalho é investigar o envolvimento do subsistema M4 colinérgico muscarínico hipocampal na consolidação, evocação, reconsolidação e extinção da memória, além de investigar os receptores M4 da amígdala basolateral na consolidação e reconsolidação. Em trabalhos anteriores, foi demonstrado que os receptores M4 mudavam seu papel modulatório entre a consolidação e evocação, portanto, neste trabalho investigamos, também, em que momento do processo de consolidação ocorre essa mudança e se essa alteração é dependente de transcrição gênica. A toxina MT3, antagonista seletiva ao receptor M4, e a escopolamina, antagonista inespecífico, foram as ferramentas farmacológicas utilizadas e seus efeitos foram estudados na tarefa de condicionamento aversivo contextual (CAC) e esquiva inibitória (EI). Quando infundidos no hipocampo antes do treino CAC, ambos os fármacos foram amnésicos sobre a consolidação, entretanto, somente MT3 foi efetiva quando infundida antes do teste, sendo o efeito oposto, facilitatório. Além disso, somente a MT3 intra-hipocampal foi facilitatória sobre a reconsolidação e bloqueou a extinção da tarefa de CAC. Infundidas na amígdala basolateral os antagonistas foram amnésicos sobre a consolidação e a reconsolidação de CAC. Os experimentos com a esquiva inibitória demonstraram que a MT3 intra-hipocampal é amnésica somente quando infundida imediatamente após o treino. Porém, modifica seu efeito quando administrada 90 e 180 minutos após o treino, passando a ser facilitatória. A administração de um inibidor de transcrição gênica (DRB) imediatamente após o treino de EI reverte o efeito facilitatório da MT3 pré-teste. Os resultados sugerem uma modulação positiva do sistema colinérgico muscarínico hipocampal durante a consolidação e a extinção da memória de CAC, porém, uma ação contrária é observada durante a evocação e reconsolidação. Os resultados em conjunto sugerem que os receptores M4 hipocampais sofram alterações plásticas durante o processo de consolidação passando a controlar negativamente a atividade excitatória dos neurônios glutamatérgicos, fenômeno que parece não ocorrer na amígdala basolateral. / The cholinergic muscarinic system plays a central role in learning and memory, yet little is known about the specific roles of each receptor subtype. Muscarinic toxins (MTs) from Dendroaspis snakes venom are selective for muscarinic receptor subtypes. The hippocampus M4 subsystem, for instance, was shown to take part in the modulation of memory consolidation and retrieval. The memory phenomenon, by its turn, is being recently unveiled as a much more complex set of processes than previously thought, encompassing post-retrieval situations such as reconsolidation and extinction, each with its particular mechanisms. The scope of this study is to explore the involvement of the hippocampal cholinergic M4 muscarinic subsystem on the consolidation, retrieval, reconsolidation and extinction of memories, moreover to investigate the role of M4 subsystem of basoalteral amygdala on the consolidation and reconsolidation. Last works shown a different modulatory role of hippocampal M4 receptors about consolidation and retrieval processes, therefore This work aims to investigate the muscarinic cholinergic modulation at hippocampal circuits by M4 receptors, along different periods of memory consolidation for an inhibitory avoidance task, and verify if the change effect of pre-test MT3 are dependent of mRNA synthesis. MT3, a very selective M4 antagonist, and the less selective antagonist scopolamine were infused bilaterally into the rat CA1 area, and their effects studied in a contextual fear conditioning task (CFC) and inhibitory avoidance task (IA). When infused immediately after training, both treatments caused disruption of the memory consolidation, however, only MT3 was effective when infused before the test session, and the effect, was the opposite, i.e., memory facilitation. Moreover, only MT3 enhanced the reconsolidation of CFC following its infusion into the hippocampus or blocked its extinction. Infused into the basolateral amygdala, muscarínic antagonists shown an amnestic effect about the consolidation and reconsolidation of CFC memory. In the IA experiments, MT3 infused immediately after training was amnestic upon the consolidation process, while an “opposite effect” –memory facilitation– was observed in the 90-180min time window. The DRB was amnestic too upon the consolidation, showing that the transcriptional process is essential to the memory. Moreover, the DRB reverted the facilitatory effect of pre-test MT3. These results suggest an endogenous positive modulation of the cholinergic muscarinic system present during the consolidation or the extinction of an aversive memory, but an opposite action during memory retrieval or memory reconsolidation. Moreover, these results suggest that M4 receptors are likely expressed at different hippocampal localizations where they underlie different processes and plasticity events, may be over expressed upon glutamatergic excitatory cells.

A doença de Alzheimer (DA) resulta de múltiplos eventos patogênicos, que incluem anormalidades no processamento protéico, inflamação e estresse oxidativo, levando à destruição seletiva de populações neuronais, especialmente de neurônios colinérgicos. Tal hipótese colinérgica justifica o uso de inibidores da acetilcolinesterase (AChE) como a estratégia utilizada para tratamento de pacientes com DA. Huperzina A (HupA), um alcalóide Licopodium extraído de uma espécie vegetal (Huperzia serrata) de uso tradicional pela medicina chinesa, parece se apresentar como uma alternativa. A HupA atua como um inibidor potente, reversível e altamente específico da AChE. Sua potência como anticolinesterásico é similar ou superior à da fisostigmina, galantamina, donepezil e tacrina, anticolinesterásicos aprovados para o tratamento da DA Este alcalóide também demonstrou múltiplos efeitos neuroprotetores, incluindo modificação do processamento do peptídeo -amilóide, redução do estresse oxidativo, proteção neuronal contra apoptose e regulação da expressão e secreção de fatores tróficos, tais como fator de crescimento neuronal e em situações de injúria com comprometimento de funções glutamatérgicas. A S100B é uma proteína da família S100 de proteínas ligantes de cálcio, produzida e secretada por astrócitos no SNC. Quando em baixas concentrações no meio extracelular (nanomolar), ela é trófica; já em concentrações maiores (micromolar), é tóxica, podendo levar à apoptose. Sabe-se que a S100B está envolvida na patofisiologia de diversas doenças neurodegenerativas, como por exemplo, na DA, no qual ocorre um aumento dos níveis dessa proteína no líquor em sua fase precoce. Neste trabalho investigamos o efeito da HupA, da tacrina (tetraaminoacridina ou THA) e da acetiltiocolina (ATCh) em astrócitos e em fatias hipocampais, quanto à secreção e conteúdo intracelular de S100B e proteína fibrilar glial ácida (GFAP), durante 1 e 24 h. A HupA (100 μM) aumentou a secreção em cultura de astrócitos em 1 h, mas diferentemente causou uma redução em fatias hipocampais, bem como ATCh (100 μM). Após 24 h de tratamento, foi possível observar em cultura de astrócitos um efeito da tacrina a 100 μM sobre a redução do conteúdo de S100B intracelular, mas não de HupA ou ATCh. O imunocontéudo de GFAP não foi alterado após os tratamentos. Uma análise geral desses resultados nos mostra que a HupA pode regular mecanismos de secreção da S100B. Além disto, a modulação de secreção desta proteína parece ser modulada por receptores colinérgicos. / Alzheimer´s Disease (AD) results in multiple pathogenic events, which include abnormalities of protein process, inflammation and oxidative stress, leading to a neuronal population destruction, especially of cholinergic neurons. This cholinergic hypothesis justifies the use of acetylcholinesterase inhibitors (IAChE) as the strategy for patients with AD. Huperzine A (HupA), a novel Lycopodium alkaloid isolated originally from a traditional Chinese medicine, seems to be an alternative. HupA is a reversible, potent and selective IAChE. Its potency and duration of AChE inhibition rival those of physostigmine, galanthamine, donepezil and tacrine, approved for treatment of DA. HupA also demonstrated multiple neuroprotector effects, including modifying the β-amyloid processing, decreasing oxidative stress, protecting neurons against apoptosis and also expressing and regulating secretion of trophic factors, such as neuronal growth factor (NGF) and also acts reducing glutamatergic excitotoxicity. S100B is a calcium-binding protein, produced and secreted by astrocytes in the central nervous system (CNS) and plays a regulatory role in the cytoskeleton and cell cycle. Moreover, extracellular S100B, a marker of glial activation in several conditions of brain injury, for example in AD, has a trophic or apoptotic effect on neurons, depending on its concentration. Here we investigated the effect of HupA, tacrina (tetraminoacridine or THA) and acetilthiocholine (ATCh), on S100B secretion, S100B and GFAP intracellular contend in cortical astrocytes cultures and hippocampal slices treated for 1 and 24 h. For 1 h, HupA and ATCh (100 μM) increased the secretion in astrocytes for 1 h, but caused a reduction on hippocampal slices (P < 0.05). After 24 h of treatment, tacrine (100 μM) reduced the S100B intracellular contend in astrocytes cultures, but it was not observed with HupA or ATCh. The GFAP immunocontent did not change after these treatments. Generally, our data show that HupA can regulate S100B secretion mechanisms and that this modulation could be activated by cholinergic receptors.

Na doença de Alzheimer, o grau de demência pode ser correlacionado com o dano dos neurônios colinérgicos, particularmente aqueles que inervam o hipocampo e neocórtex. Lesões no núcleo basal magnocelular (nbm) são extremamente utilizados para estudar déficits cognitivos e alterações comportamentais envolvendo a disfunção colinérgica. Neste modelo, astrogliose cortical é descrita, mas ainda não está claro se há ativação dos astrócitos hipocampais. Para tanto, este estudo buscou avaliar possíveis alterações astrogliais no hipocampo de ratos Wistar machos adultos após lesão do nbm através da infusão de ácido ibotênico. Foram investigados os conteúdos de GFAP (proteína glial fibrilar ácida), S100B (tecido e líquor), GSH (glutationa), atividade da GS (glutamina sintetase) e da AChE (acetilcolinesterase), além da captação de glutamato, secreção de S100B (com alta e baixa concentração de K+) e imunoistoquímica para GFAP após 7 e 28 dias de lesão. O déficit cognitivo foi confirmado através da tarefa de esquiva inibitória (parâmetro demência/não demência). Nossos resultados confirmam alterações astrogliais hipocampais, particularmente uma diminuição da defesa antioxidante (diminuição do conteúdo de GSH), diminuição da captação de glutamato, diminuição do conteúdo de GFAP e S100B (tecido) e diminuição da atividade da AChE após 28 dias de lesão no nbm. O conteúdo de S100B e GFAP após 7 dias de lesão não sofreu modificações significativas assim como o conteúdo de S100B no líquor. A atividade da GS também não alterou após 7 ou 28 dias de lesão com ácido ibotênico, bem como a secreção de S100B, que se manteve em níveis basais após 28 dias de lesão. Esses dados contribuem para o entendimento de lesão no nbm através da infusão de IBO, particularmente provocando uma disfunção colinérgica no hipocampo acompanhada de hipofunção glial; este procedimento pode ser considerado um modelo adequado para estudar alguns aspectos da demência, comumente associada à disfunção colinérgica. / In Alzheimer’s disease, the degree of dementia could be correlated with the damage of cholinergic neurons, particularly with those supply the hippocampus and neocortex. Lesions of the nucleus basalis magnocellularis (nbm) was extremely used to study cognitive deficits and behavior alterations involved cholinergic dysfunction. In this model cortical astrogliosis is described, but it is not clear if the activation of hippocampal neurons exist. Despite this, the present study evaluates the possible astroglial alterations in the hippocampus of Wistar male rats after lesion in the nbm with ibotenic acid infusion. Was investigate the GFAP, S100B, GSH content and AChE and GS activity, glutamate uptake, secretion of S100B (with high and low concentration of K+) and immunohistochemistry of GFAP after 7 and 28 days of lesion. The cognitive deficit was confirmed through the stepdown inhibitory avoidance task (dementia/no dementia). Our results confirm hippocampal astroglial alterations, particularly a decrease of antioxidant defense (decrease of GSH content), decrease of glutamate uptake, decrease of GFAP and S100B content and decrease of AChE activity after 28 days of lesion. The content of GFAP and S100B after 7 days of lesion was not modified as well as the S100B content in the CSF (cerebrospinal fluid). The GS activity was not altered after 7 or 28 days of lesion and the S100B secretion was maintained in basal levels after 28 days of insult. These data contribute to understand the nbm lesion with ibotenic acid, particularly a cholinergic dysfunction caused in the hippocampus together with glial hypofunction; this procedure could be considered a good model to study some aspects of dementia, commonly associated with cholinergic dysfunction.

A deficiência de guanidino acetato metiltransferase (GAMT) é um erro inato do metabolismo da creatina caracterizado por hipotonia muscular, movimentos extrapiramidais involuntários e epilepsia. A doença é bioquimicamente caracterizada por acúmulo de guanidino acetato e deficiência de creatina e fosfocreatina nos tecidos dos pacientes afetados. Os mecanismos de disfunção neurológica que ocorrem nessa doença ainda são desconhecidos. A Na+,K+-ATPase desempenha um papel fundamental no sistema nervoso central (SNC), sendo responsável pela manutenção dos gradientes iônicos e pela propagação do impulso nervoso, consumindo cerca de 50% do ATP formado no cérebro. A acetilcolinesterase (AChE) é uma importante enzima regulatória que controla a transmissão de impulsos nervosos através de sinapses colinérgicas pela hidrólise da acetilcolina, e apresenta um papel fundamental na cognição. Com o propósito de ampliar o conhecimento sobre os mecanismos fisiopatológicos da deficiência de GAMT, esse trabalho teve como objetivo investigar o efeito do guanidino acetato, o principal metabólito acumulado na deficiência de GAMT, sobre as atividades das enzimas Na+,K+-ATPase, Mg2+-ATPase e AChE em estriado de ratos. A cinética de inibição da Na+,K+-ATPase causada pelo guanidino acetato também foi estudada. Além disso, investigamos o efeito in vitro do guanidino acetato sobre as atividades da Na+,K+-ATPase, Mg2+-ATPase e da AChE de hipocampo de ratos. Nossos resultados mostraram que o guanidino acetato não altera as atividades da AChE e Mg2+-ATPase. No entanto, a atividade da Na+,K+-ATPase foi inibida por esse composto guanidínico (CG), e a análise cinética mostrou uma inibição do tipo acompetitiva. Também foi demonstrada uma interação entre o guanidino acetato e o ácido arginínico, sugerindo um sítio comum de ligação entre esses dois compostos na Na+,K+-ATPase. Os resultados mostraram que, o guanidino acetato inibiu a atividade da Na+,K+-ATPase in vitro mas não alterou as atividades da Mg2+-ATPase e da AChE. Considerando que o guanidino acetato e outros compostos guanidínicos (CG) induzem a formação de espécies reativas de oxigênio e que a Na+,K+-ATPase e a AChE são inibidas por radicais livres, estudamos o efeito da pré-incubação de homogeneizado de hipocampo de ratos na presença de guanidino acetato sobre a atividade dessas enzimas. Além disso, o efeito da pré-incubação de homogeneizado de ratos com guanidino acetato foi investigado na presença e ausência de antioxidantes, tais como glutationa (GSH), trolox, taurina e L-NAME. A pré-incubação de homogeneizado de hipocampos na presença de guanidino acetato inibiu a atividade da Na+,K+-ATPase, mas não alterou a atividade da Mg2+-ATPase. No entanto, L-NAME e taurina foram capazes de prevenir tal efeito. Dessa forma, propõem-se que a inibição da atividade da Na+,K+-ATPase pelo guanidino acetato seja um dos mecanismos envolvidos na disfunção neuronal observada em pacientes com deficiência de GAMT.

O glutamato, quando em altas concentrações na fenda sináptica, é excitotóxico, podendo levar à morte celular devido à hiper-estimulação de seus receptores. Seu efeito neurotóxico tem sido relacionado a várias doenças agudas e crônicas do SNC, tais como isquemia, epilepsia, Alzheimer e Parkinson. A manutenção dos níveis de glutamato abaixo de seus níveis excitotóxicos é realizada através de um mecanismo de transporte de alta afinidade dependente de sódio. Os principais transportadores de glutamato, GLAST e GLT-1, estão presentes nos astrócitos. Alguns estudos demonstram que a captação de glutamato parece variar de acordo com o período de desenvolvimento e envelhecimento; entretanto, poucos estudos avaliam este parâmetro em animais imaturos, maduros e velhos utilizando uma única metodologia. Neste trabalho, nós traçamos um perfil ontogenético da captação de glutamato in vitro, durante o desenvolvimento e envelhecimento, usando fatias de estriado, hipocampo e córtex de ratos com 10, 21 e 60 dias, 15 e 26 meses. Também analisamos se a captação de glutamato era sensível à presença de guanosina. Em todas as estruturas a captação de glutamato foi maior em animais jovens decaindo então, até ratos velhos (15 meses) em estriado e hipocampo ou ratos adultos jovens (60 dias) em córtex. Em estriado e hipocampo observamos um aumento parcial e total, respectivamente, na captação em ratos muito velhos (26 meses). O efeito da guanosina parece ser idade e estrutura dependentes, visto que a mesma aumentou a captação basal de glutamato somente em fatias de córtex de ratos de 10 dias. A diminuição da captação de glutamato observada em animais com 15 meses em estriado e hipocampo pode estar relacionada às diversas desordens neurodegenerativas que ocorrem em idosos, e a recuperação deste parâmetro em ratos muito velhos (26 II meses), tanto parcial como total, parece ser um mecanismo de adaptação compensatório que pode estar ocorrendo durante o processo de envelhecimento.

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O LPS, endotoxina lipopolissacarídea presente na parede das bactérias gram-negativas, é capaz de gerar a produção de citocinas, mimetizando dessa forma um quadro de inflamação pré-natal quando administrado na fêmea prenhe durante o período gestacional. A prole de ratas prenhes expostas a esta endotoxina pode apresentar assim diversos problemas comportamentais e/ou cognitivos que refletem alterações ocorridas no sistema nervoso central (SNC) durante o seu desenvolvimento. Entre as diversas patologias que podem resultar de um transtorno no neurodesenvolvimento está o transtorno do espectro autista (TEA). Ainda sem uma causa definida em humanos, estima-se que cerca de uma a cada 150 crianças nascidas atualmente são acometidas por essa patologia. Distúrbios de comportamento e de comunicação/interação social constituem a díade que caracteriza o TEA e dependendo do grau de acometimento é comum encontrar também nestes e de forma geral em indivíduos com transtornos de neurodesenvolvimento problemas atencionais, de aprendizado e memória. O quadro inflamatório no período de gestação causa uma série de alterações no organismo materno, sendo que algumas destas alterações alcançam o feto em desenvolvimento. Uma destas alterações pode ser a redução no conteúdo de melatonina na circulação materna e fetal. A melatonina, hormônio produzido pela glândula pineal, apresenta funções sincronizadora, antioxidante e neuroprotetora que podem ser importantes durante o neurodesenvolvimento e a alteração na síntese e liberação desse hormônio no organismo materno ao longo da gestação vem sendo correlacionada a casos de TEA. Além disso, a exposição ao LPS durante o desenvolvimento do SNC em um modelo animal resulta em uma prole que apresenta comportamentos autísticos. Apesar destes dados, os efeitos desse quadro pré-natal no comportamento, na morfologia e na neuroquímica de áreas encefálicas da prole ainda não foram totalmente esclarecidos e sua elucidação pode contribuir como base de conhecimento para estudos que investiguem prevenção e terapias farmacológicas ou comportamentais nessas patologias. O presente trabalho teve como objetivos verificar se o quadro inflamatório pré-natal induzido por LPS: 1) Altera a concentração plasmática de melatonina materna, 2) altera a expressão de comportamentos que dependem da função de memória espacial e 3) induz mudanças morfométricas e neuroquímicas no hipocampo. Para atingir o primeiro objetivo foi coletado o sangue de ratas prenhe 3 h (fase de claro) e 16 h (fase de escuro) após à exposição ao LPS ou a solução salina e a dosagem de melatonina foi realizada por meio do método ELISA. Para alcançarmos o segundo e terceiro objetivos as proles de ratas expostas ao LPS e de ratas controles expostas a solução salina no dia gestacional 9,5 foram avaliadas por meio de teste comportamental de alternância espontânea no labirinto em T. Em seguida, os animais foram perfundidos e os encéfalos processados para o estudo do volume hipocampal por estereologia, para análise de expressão neuronal das proteínas ligantes de cálcio calretinina e parvalbumina e para análise de expressão glial da proteína glial fibrilar ácida (GFAP) e da proteína de associação de ligação ao cálcio ionizada – 1 (IBA-1) por meio da técnica de imunohistoquímica. Os resultados mostraram que houve queda no conteúdo plasmático de melatonina noturno e aumento no conteúdo diurno após injeção com LPS nas fêmeas prenhes. A prole do grupo controle apresentou melhor desempenho no teste comportamental quando comparado a prole do grupo LPS. O hipocampo da prole do grupo LPS não apresentou diferença de volume total do desta estrutura em comparação ao grupo controle. Também não houve alteração na expressão de GFAP em astrócitos hipocampais no grupo LPS em relação ao controle. Por outro lado, ocorreu aumento na expressão de IBA-1, marcador de microglia, nas regiões do CA1, CA2 e CA3 no hipocampo da prole do grupo LPS em relação a prole do grupo controle. A prole do grupo LPS, considerada um modelo animal de autismo também apresentou variações na expressão das proteínas ligantes de Cálcio no hipocampo com menor expressão da proteína parvalbumina e maior expressão da proteína calretinina que o grupo controle. Os resultados mostraram que a exposição materna ao LPS foi capaz de alterar a concentração de melatonina plasmática circulante e que a prole exposta a esse ambiente inflamatório pré-natal apresentou alterações de comportamento dependente da memória espacial. Além disso, os resultados nos permitem concluir que tais alterações na memória espacial não são coincidentes com alterações no volume do hipocampo ou na reatividade astrocitária, mas sim com a ativação microglial e com alterações na neuroquímica dos neurônios gabaérgicos hipocampais que expressam as proteínas ligantes de cálcio e que conhecidamente controlam as conexões excitatórias e inibitórias envolvidas nos fenômenos de memória. / Immune reactions generated in the maternal organism during the gestational period may cause changes in the fetal development. The endotoxin lipopolysaccharide (LPS) present on the wall of Gram-negative bacteria is able to induce the production of cytokines, mimicking a state of prenatal inflammation when administered in the pregnant female during the gestational period. The offspring of pregnant rats exposed to this endotoxin may present several behavioral and/or cognitive problems that reflect changes in the central nervous system (CNS). The autism spectrum disorder (ASD) is one of this neurodevelopmental conditions, and although without a definite cause in humans, is related to be present in one to every 150 children born. Behavior and communication/social interaction disorders constitute the dyad that characterizes the ASD. Besides these, depending on the degree of involvement it is common to find in these individuals‟ attention, learning and memory problems. Melatonin, a hormone produced by the pineal gland, presents several functions during neurodevelopment and the alteration in the synthesis and release of this hormone in the maternal organism throughout pregnancy has been correlated to cases of ASD. Investigations about the effects of a prenatal inflammatory condition in behavior, in the morphology and neurochemistry of brain areas can contribute for future pharmacological or behavioral studies in these patients. Considering that exposure to LPS during the development of CNS in an animal model results in offspring presenting autistic behaviors, the present work aimed to check whether the prenatal inflammatory condition: 1) Changes the maternal melatonin plasma concentration, 2) alters behaviors that depend on the spatial memory function and 3) induces morphometric and neurochemical changes in the hippocampus. For this, blood from pregnant rats 03h and 16h after LPS exposure was collected and the melatonin dosage was performed using the ELISA method. Offsprings of rats exposed to the LPS (autism model) or saline (control) on the 9.5 gestational day were evaluated in the T-maze spontaneous alternation test. After, the animals were perfused with 4% paraformaldehyde and the brains were processed for the hippocampal volume quantification and for the analysis of the calretinin, parvalbumin, glial fibrillary acidprotein (GFAP) and ionized calcium binding association protein – 1 (IBA-1) expression by immunohistochemistry. There was difference in the plasma melatonin dosage in the day and night periods of the pregnant females of the control group and the LPS group. The results showed that the control group presented better performance in behavioral testing when compared to the autism model. The hippocampal volume showed no difference between the groups, as well as the expression of the GFAP in astrocytes. There was an increase in IBA-1 expression in all regions of the hippocampus except in the dentate gyrus in the autism model group in relation to the control group.The autism model presented lower expression of the parvalbumin and greater expression of de calretinin than the control group. The results showed that maternal exposure to LPS was able to alter maternal plasma melatonin concentration and that the offspring exposed to prenatal inflammatory environment showed deficits in behaviors dependent of spatial memory and indicate that these behaviors deficits are not coincident with changes in the hippocampal volume or in astrocytic reactivity, but but with microglial activation and with changes in the calcium binding proteins expression in gabaergic neurons of the hippocampus which are known to control excitatory and inhibitory sinapses involved in the memory phenomena.

Submitted by Automa??o e Estat?stica (sst@bczm.ufrn.br) on 2015-09-17T21:10:57Z No. of bitstreams: 1 AnnieDaCostaSouza_DISSERT.pdf: 4581835 bytes, checksum: 75b58eb36554ceea210d1f40fcbb7f5e (MD5) / Approved for entry into archive by clediane guedes (clediane@bczm.ufrn.br) on 2015-10-27T15:25:21Z (GMT) No. of bitstreams: 1 AnnieDaCostaSouza_DISSERT.pdf: 4581835 bytes, checksum: 75b58eb36554ceea210d1f40fcbb7f5e (MD5) / Made available in DSpace on 2015-10-27T15:25:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 AnnieDaCostaSouza_DISSERT.pdf: 4581835 bytes, checksum: 75b58eb36554ceea210d1f40fcbb7f5e (MD5) Previous issue date: 2014-10-15 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior - CAPES / O ritmo teta consiste em uma oscila??o eletrofisiol?gica hipocampal presente em v?rias esp?cies de mam?feros (4-12 Hz, com varia??es entre esp?cies). Essa oscila??o est? presente durante a vig?lia ativa de ratos e tamb?m ? predominante no PCL desta esp?cie durante o sono de movimento r?pido dos olhos (sono REM). V?rios trabalhos demonstraram que o ritmo teta ? importante em tarefas cognitivas. O septo medial ? uma regi?o importante na gera??o do ritmo teta hipocampal. Possui proje??es colin?rgicas, GABA?rgicas e glutamat?rgicas para o hipocampo, que por sua vez, possui proje??es de feedback para o septo. Al?m do septo, outras regi?es est?o envolvidas na regula??o do teta, formando uma rede complexa de intera??o e coordena??o entre ?reas que resultam no ritmo. A optogen?tica ? uma ferramenta desenvolvida recentemente que tem sido amplamente utilizada em pesquisas de diversas ?reas. Ela nos permite manipular a atividade el?trica de neur?nios atrav?s de estimula??o luminosa. A t?cnica consiste em, atrav?s de um vetor viral, induzir a express?o neuronal de canais i?nicos associados a opsinas (ex.: ChR2), que uma vez infectados passam a ser sens?veis a luz de determinado comprimento de onda. O presente trabalho de pesquisa de mestrado teve como objetivo implantar a optogen?tica em animais em livre comportamento pioneiramente no Brasil, atrav?s de experimentos com implantes cr?nicos de eletrodos e fibras ?ptica em animais infectados com vetor viral para express?o de ChR2. Foram realizadas cirurgias de inje??es de v?rus no septo medial; resultados histol?gicos confirmaram a express?o de ChR2 atrav?s da marca??o da prote?na rep?rter eYFP no septo e tamb?m em processos hipocampais. Al?m disso, foram realizados experimentos agudos com estimula??o luminosa do septo medial e registro de potenciais de campo local (PCL) no pr?prio septo e hipocampo em animais anestesiados. Ainda nesses experimentos foi poss?vel registrar potenciais de a??o no septo. Nesses experimentos observamos aumento da taxa de disparo dos neur?nios septais durante estimula??o luminosa (n=300 est?mulos). Al?m disso, encontramos uma resposta evocada no PCL do hipocampo no in?cio do pulso luminoso. Tamb?m foram realizados experimentos cr?nicos com estimula??o luminosa do septo medial e registro de PCL do hipocampo em animais em livre comportamento. Atrav?s de an?lise do PCL, verificamos se a estimula??o luminosa do septo ? capaz de induzir ritmo teta no hipocampo. / Theta rhythm consists of an electrophysiological hippocampal oscillation present in mammalian species (4-12 Hz with variations across species). This oscillation is present during active waking and is also prevalent in local field potentials (LFP) during rapid eye movement sleep (REM sleep). Several studies have shown that theta rhythm is important in cognitive tasks and that the medial septum is a key region for its occurrence. The septum sends cholinergic, GABAergic and glutamatergic projections to the hippocampus, which in turn projects axons to the septum. Besides the septum, other regions are involved in regulating theta rhythm, forming a complex network of interactions among brain areas that result in theta rhythm. Optogenetics is a recently developed method that has been widely used in various research areas. It allows us to manipulate the electrical activity of neurons through light stimulation. One of the existing techniques consists in using a viral vector to induce the neuronal expression of ion channels associated with the light-sensitive molecule rhodopsin (e.g. ChR2). Once infected, the neurons become sensitive to light of a particular wavelength. The present M. Sc. research aimed to perform luminous stimulation of the brain in anesthetized and freely behaving animals using chronically implanted electrodes and optical fibers in animals infected with a viral vector for ChR2 expression. Surgical viral injections were performed in the medial septum; histological results confirmed the expression of ChR2 by way of the presence of the eYFP reporter protein in the septum and also in hippocampal processes. Moreover, we performed acute experiments with luminous stimulation of the medial septum and LFP recordings of the septum and hippocampus of anesthetized animals. Action potentials were recorded in the septum. In these experiments we observed a significant increase in the firing rates of septal neurons during luminous stimulation (n = 300 trials). Furthermore, we found an early light-evoked response in the hippocampal LFP. Chronic experiments with luminous stimulation of the medial septum and hippocampus in freely behaving animals were also performed in combination with LFP recordings. We found that the luminous stimulation of the septum is able to induce theta rhythm in the hippocampus. Together, the results demonstrate that the luminous stimulation of the medial septum in optogenetically-modified animals causes relevant electrophysiological changes in the septum and the hippocampus.

Made available in DSpace on 2014-12-17T15:36:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Nelson A M Lemos _ TESE.pdf: 4129745 bytes, checksum: 7d969b769c0e0046548b13ae069e3e65 (MD5) Previous issue date: 2012-12-12 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico / Hebb postulated that memory could be stored thanks to the synchronous activity of many neurons, building a neural assembly. Knowing of the importance of the hippocampal structure to the formation of new explicit memories, we used electrophysiological recording of multiple neurons to access the relevance of rate coding from neural firing rates in comparison to the temporal coding of neural assemblies activity in the consolidation of an aversive memory in rats. Animals were trained at the discriminative avoidance task using a modified elevated plus-maze. During experimental sessions, slow wave sleep periods (SWS) were recorded. Our results show an increase in the identified neural assemblies activity during post-training SWS, but not for the neural firing rate. In summary, we demonstrate that for this particular task, the relevant information needed for a proper memory consolidation lies within the temporal patters of synchronized neural activity, not in its firing rate / Hebb postulou que a mem?ria poderia ser armazenada gra?as a atividade s?ncrona de v?rios neur?nios, formando um assembleia neural. Sabendo da import?ncia da estrutura hipocampal para a forma??o de novas mem?rias expl?citas, utilizamos o registro eletrofisiol?gico de m?ltiplos neur?nios para investigar a relev?ncia da codifica??o de taxa (rate coding) dos disparos neurais, comparada com a codifica??o temporal (temporal coding) da atividade de assembleias, na consolida??o de uma mem?ria aversiva de ratos. Os animais foram treinados na esquiva discriminativa usando um labirinto em cruz elevado modificado. Durante as sess?es experimentais foram registrados per?odos de sono de ondas lentas (SOL). Nossos resultados indicam um aumento da atividade das assembleias neuronais identificadas durante o SOL ap?s o treino na tarefa, sendo que o mesmo n?o acontece com a taxa de disparo. Em resumo, demonstramos que para essa tarefa em particular, a informa??o relevante ? consolida??o adequada da mem?ria est? codificada nos padr?es temporais de sincroniza??o da atividade neural e n?o em sua taxa de disparo

Emaranhados neurofibrilares intraneuronais, juntamente com as placas beta-amilóide e astrogliose são importantes marcadores neuropatológicos da doença de Alzheimer (DA). Apesar dos mecanismos envolvidos na DA do tipo esporádica ainda não estarem bem esclarecidos, a hiperfosforilação da proteína tau é sugerida como grande fator para o desenvolvimento dos emaranhados neurofibrilares, que podem gerar disfunção neuronal e morte. A toxina ácido ocadáico (AO) é considerada um efetivo inibidor das fosfatases 1 e 2A, as quais podem gerar a hiperfosforilação da tau. Dessa forma, este trabalho tem como objetivo, avaliar alterações neurogliais em hipocampo e líquido cerebroespinhal (LCE) de ratos expostos ao AO intracerebroventricular após 3 e 12 semanas da infusão. E ainda, verificar alterações neurogliais de fatias hipocampais expostas de forma aguda ao AO (in vitro). Como resultados encontramos no modelo in vivo, declínio cognitivo, hiperfosforilação da tau (Ser 396) e alteração astroglial hipocampal principalmente devido a redução da captação de glicose e aumento da expressão da GFAP e ainda, redução da S100B no LCE, a qual pode atuar na sinalização neurônio-astrócito, em condições fisiológicas ou patológicas, como na DA. Ao observar as alterações neurogliais 12 semanas após a infusão, verificamos que o modelo é parcialmente reversível, uma vez que a fosforilação da proteína tau não mostrou alteração, mas foi observado declínio cognitivo em um dos comportamentos realizados e hipometabolismo da glicose. E ainda, in vitro, o AO foi capaz de hiperfosforilar a proteína tau (Ser 396), mas não alterou parâmetros astrogliais. Portanto, o modelo animal se mostra adequado para avaliação de alterações neuroquímicas. Mas nossos resultados também apontam para uma reversibilidade parcial do modelo a longo prazo, indicando a necessidade de cautela na avaliação de estratégias terapêuticas com este modelo. E ainda, nossos dados reforçam a importância de investigar alterações do metabolismo cerebral da glicose em indivíduos com déficit cognitivo. / Intraneuronal aggregates of neurofibrillary tangles (NFTs), together with beta-amyloid plaques and astrogliosis, are important markers of Alzheimer’s disease (AD). The underlying mechanism of sporadic AD remains poorly understood, but abnormal hyperphosphorylation of tau protein is suggested to have a role in NFTs genesis, which leads to neuronal dysfunction and death. The okadaic acid (OKA) toxin is a protein phosphatase 1 e 2A inhibitor and can lead to tau protein hyperphosphorylation. We have investigated the effects of intracerebroventricular (ICV) OKA on neuroglial alterations 3 and 12 weeks after OKA infusion. We have also researched the effects on neuroglial parameters on hippocampal slices treated with OKA in vivo. Our results have shown cognitive impairment, hippocampal astrogliosis, based on GFAP increment, decreased glucose uptake and increase on tau phosphorylation (at Ser396) in hipocamppus and decrease in S100B protein on cerebrospinal fluid 3 weeks after ICV OKA-infusion. Moreover, 12 weeks after ICV OKA infusion we also observed a cognitive impairment and decreased on glucose uptake. In vitro, exposure of hippocampal slices to OKA altered tau phosphorylation at Ser396 without any associated change in astroglial function. In conclusion, the OKA-animal model proved to be a suitable model for neurochemical parameters assessment. Our results also indicate a partial reversibility of long-term animal model, suggesting that therapeutics strategies evaluations must be caution on this model; and reinforce how important is to investigate on brain glucose metabolism alterations on cognitive impairment.