Insetos são os organismos multicelulares mais bem-sucedidos no ecossistema terrestre e sua riqueza se deve, em parte, à simbiose com microrganismos. Geradora de diversidade fenotípica, a comunidade microbiana associada a insetos permite a manutenção de fenótipos complexos capazes de colonizar novos nichos e de se adaptar a fatores de estresse. A relevância da relação de simbiose na ordem Lepidoptera, todavia, tem sido questionada em função da alta variabilidade da comunidade bacteriana associada aos seus representantes. Tendo como modelo de estudo lagartas do gênero Spodoptera (Lepidoptera: Noctuidae), esse trabalho teve por objetivo melhor compreender a composição e diversidade da microbiota associada ao intestino de lepidópteros, assim como verificar o efeito da pressão de seleção direcionada à resistência na sua estrutura e capacidade de utilização de inseticidas como fonte de carbono. Para isso, foi realizada a análise metagenômica da comunidade microbiana intestinal de quatro espécies do gênero Spodoptera assim como de cinco populações naturais de S. frugiperda e de linhagens suscetível e resistentes desse inseto praga. Foram avaliadas linhagens de S. frugiperda resistentes aos inseticidas spinosad, chlorpyrifos, lambda-cyhalothrin, flubendiamide, teflubenzuron e à toxina de Bacillus thuringiensis Cry1A.105+Cry2Ab2. A análise da composição, riqueza e capacidade da comunidade bacteriana utilizar inseticidas foi baseada na determinação de índices de diversidade alfa e beta, no isolamento de bactérias intestinais em meio seletivo e na análise do potencial de crescimento dos isolados em inúmeros inseticidas. Nossos resultados indicam a importância da microbiota intestinal para esse gênero de Lepidoptera. Bactérias do gênero Enterococcus foram predominantes em todas as populações de Spodoptera analisadas, independentemente da espécie, dieta ou pressões de seleção às quais as lagartas foram expostas. Populações naturais de S. frugiperda apresentaram um microbioma mais diverso e com maior número de bactérias capazes de metabolizar inseticidas. A diversidade do microbioma, assim como a presença e capacidade de bactérias utilizarem inseticidas como fonte de carbono para o seu crescimento foram influenciadas pelo nível de exposição a tais compostos, demonstrando que, assim como o hospedeiro, a microbiota intestinal também se encontra em pressão de seleção direcionada a resistência. / Insects are the most successful multicellular organisms in the terrestrial ecosystem and their richness is partially due to symbiosis with microorganisms. The microbial community associated with insects allows the maintenance of complex phenotypes capable of colonizing new niches and adapting to stressors. The relevance of symbiosis in Lepidoptera, however, has been questioned due to the high variability of the bacterial community associated with its representatives. Using Spodoptera larvae as a model, this work aimed to better understand the composition and diversity of the gut microbiota associated with Lepidoptera, as well as to verify the effects of the selection pressure with insecticides in the microbial gut structure and the ability of members of the community to metabolize insecticides as carbon source. Thus, we performed a metagenomic analysis of the gut microbial community of four species of the genus Spodoptera (Lepidoptera: Noctuidae), as well as for five natural populations of S. frugiperda and susceptible and resistant strains of this pest. Strains of S. frugiperda resistant to the insecticides spinosad, chlorpyrifos, lambda-cyhalothrin, flubendiamide, teflubenzuron and Bacillus thuringiensis toxin Cry1A.105 + Cry2Ab2 were evaluated. The analysis of the composition, richness and ability of the bacterial community to metabolize insecticides were carried out through alpha and beta diversity indexes, isolation of intestinal bacteria in selective medium and analysis of the growth potential of isolates in multiple insecticides. Our data indicate the importance of symbiosis for S. frugiperda. Enterococcus prevailed in all populations analyzed, regardless of the species of Spodoptera, food source or selection pressure that the larvae were exposed. Microbial diversity and ability to metabolize insecticides were higher in natural populations exposed to a range of stressors in the field. The diversity of the gut microbial community associated to Spodoptera frugiperda, as well as the ability of its members to metabolize insecticides, were influenced by the degree of exposure to insecticides, showing that, like the host, the gut microbiota is also under selection pressure to resistance.

Ces travaux de thèse reposent sur le double objectif de proposer des approches innovantes pour l’étude des relations entre un hôte et son microbiote, et de les appliquer à la description fine de l’holobionte du puceron du pois par des données métagénomiques. Les relations symbiotiques façonnent le fonctionnement et l’évolution de tous les organismes, mais restent décrites de manière imparfaite, notamment à cause de la difficulté à caractériser la diversité génomique des partenaires microbiens constitutifs des holobiontes. L’essor des technologies de séquençage métagénomique révolutionne l’étude de ces systèmes, mais pose également des problèmes méthodologiques pour analyser les jeux de données métagénomiques. La métagénomique est ici appliquée au puceron du pois, un modèle d’étude des relations symbiotiques qui abrite une communauté bactérienne d’une complexité modérée, idéale pour développer de nouvelles approches de caractérisation de la diversité microbienne. Cette thèse vise à mieux décrire la communauté de symbiotes qu’abrite cet holobionte, notamment en distinguant les différents niveaux de variabilité génomique en son sein. Nous présentons une démarche pour l’analyse métagénomique d’holobiontes, qui repose d’abord sur l’assignation taxonomiques des lectures par alignement à des génomes de référence ou préalablement assemblés, puis sur la recherche de variants génomiques. L’étude de génotypes complets de symbiotes permet de retracer l’histoire évolutive des relations hôte-microbiote avec une résolution élevée. Chez le puceron du pois, nous mettons en évidence des niveaux et structures de diversité génomique différents selon les symbiotes, que nous proposons d’expliquer par les modalités de transmission ou l’histoire évolutive propre à chacun des partenaires microbiens. Cette approche repose sur la disponibilité d’un génome de référence adapté, qui est souvent difficile à obtenir en métagénomique. Dans un second temps, nous présentons donc une méthode d’assemblage guidé par référence en contexte métagénomique. Cette méthode se déroule en deux temps : le recrutement et l’assemblage de lectures par alignement sur un génome de référence distant, puis l’assemblage de novo ciblé des régions manquantes, permis par des développements complémentaires apportés au logiciel MindTheGap. Comparativement à un assembleur métagénomique, cette méthode permet l’assemblage d’un seul génome en un temps réduit, et permet de détecter d’éventuels variants structuraux sur le génome ciblé. Appliqué au puceron du pois, MindTheGap a réalisé l’assemblage du symbiote obligatoire Buchnera en un seul contig, et a permis d’identifier différents variants structuraux du bactériophage APSE. Ces travaux ouvrent la voie à la fois à une caractérisation plus précise des relations hôte-microbiote chez le puceron du pois par des approches fonctionnelles et métaboliques, ainsi qu’à l’application des outils présentés à des systèmes plus complexes. / The aim of this PhD thesis is to develop innovative approaches to characterize host-microbiota relationships, and to apply them to finely explore the pea aphid microbiota using metagenomic data. Symbiotic relationships play a major role in the life and evolution of all organisms, but are imperfectly described, essentially because of the difficult characterization of the genomic diversity of the microbial partners. The rise of high throughput metagenomic sequencing is a game changer for the study of those systems, but also raises methodological issues to analyze large metagenomic datasets. Metagenomic is here applied to the pea aphid holobiont, a model system for the study of symbiotic relationships, sheltering a moderately complex microbial community. This level of complexity seems to be ideal to develop new approaches for the strain-resolved characterization of host-microbiota relationships. This thesis aims at a better description of this symbiotic community by distinguishing several scales of metagenomic diversity. In a first part, we present a framework for the metagenomic analysis of holobionts, relying first on the taxonomic assignation of reads by alignment to reference or newly assembled genomes, and then on the detection of genomic variants. Whole genome variant profiles make possible to track the evolutionary history of host-microbiota associations with a high resolution. In the case of the pea aphid, we highlight different scales and structures for the metagenomic diversity of the different symbionts, accounting for different transmission modes or evolutionary histories specific to each microbial partner. This framework is based on the availability of a suitable reference genome, that may be hard to obtain in a metagenomic context. In a second part, we therefore present a novel method for reference guided genome assembly from metagenomic data. This method is based on two steps. First, the recruitment and assembly of reads by mapping metagenomic reads on a distant reference genome, and second, the de novo assembly of the missing regions, allowed by the development of an improved version of the software MindTheGap. Compared to a standard metagenomic assembler, this methods makes possible to assemble a single genome in a reasonable time, and allows to detect eventual structural variations within the targeted genome. When applied to the pea aphid holobiont, MindTheGap yielded single contig assemblie of the obligatory symbiont Buchnera aphidicola, and helped to identify different structural variants of the bacteriophage APSE. This works paves the way to a finer characterization of host-microbiota interactions, and to the application of the presented approaches to more complex systems.

Relações de simbiose são comuns na natureza e tornaram-se fundamentais para a desconstrução do antigo conceito de indivíduo, único e indivisível, para o surgimento da ideia do holobionte, definido como o ser constituído de características próprias somadas aos simbiontes a ele associados. Tais relações são comuns em Insecta, sendo bactérias os microrganismos mais comumente encontrados em simbiose, influenciando diversos aspectos bioecológicos do hospedeiro. Dentre os insetos, pulgões são organismos modelos para o estudo de interações com simbiontes devido à associação com diversas espécies de bactérias, as quais produzem diferentes fenótipos do hospedeiro. Este trabalho teve por objetivo avaliar o papel do endossimbionte secundário Arsenophonus nas interações de seu hospedeiro Aphis citricidus (Kirkaldy) (Hemiptera: Aphididae) com o primeiro e terceiro níveis tróficos. Assim, isolinhagens de A. citricidus infectadas (Ars+) ou não (Ars-) por Arsenophonus foram estabelecidas e utilizadas para a condução de estudos comparativos para a exploração de plantas hospedeiras com diferentes valores nutricionais, Citrus sinensis (hospedeiro ótimo) e Murraya paniculata (hospedeiro subótimo). Foram observadas a sobrevivência, longevidade e fecundidade de A. citricidus Ars+ e Ars- em cada planta hospedeira, sendo os valores obtidos utilizados na construção de tabelas de vida de fertilidade. Para o estudo das interações com o terceiro nível trófico, foram realizados estudos comparativos do parasitismo de A. citricidus Ars+ e Ars-, criados em ambos hospedeiros, pelo parasitoide Aphelinus asychis (Walker) (Hymenoptera: Aphelinidae). Foram observados o desenvolvimento do parasitoide e o sucesso de parasitismo. Os resultados obtidos comprovaram ser C. sinensis o hospedeiro mais adequado e que o simbionte secundário beneficia seu hospedeiro na exploração do alimento, resultando na redução do período de desenvolvimento e em insetos de maior tamanho no hospedeiro subótimo. Os parâmetros de tabela de vida de fertilidade calculados para pulgões Ars+ foram superiores aos de Ars-. Além de beneficiar A. citricidus na utilização do alimento, o simbionte Arsenophonus também afetou a relação de seu hospedeiro com o parasitoide A. asychis. Pulgões Ars+ foram inadequados ao completo desenvolvimento do parasitoide. A relação de simbiose de A. citricidus e Arsenophonus estudada demonstrou a importância de simbiontes secundários nas interações multitróficas do hospedeiro e as implicações que elas podem ter para o controle do crescimento populacional de insetos de interesse econômico. / Symbiotic relationships are common in nature and have become essential for the deconstruction of the old concept of individual, as a single and indivisible entity, for the emergence of the holobiont idea, being consisted of its own characteristics added to the symbionts associated with it. Such relationships are common in Insecta, and bacteria are the microorganisms most commonly found in symbiosis, influencing many bioecological aspects of the host. Among insects, aphids are model organisms for the study of interactions with symbionts due to their association with various species of bacteria that produce different host phenotypes. This study aimed to evaluate the role of the secondary endosymbiont Arsenophonus on the interactions of its host Aphis citricidus (Kirkaldy) (Hemiptera: Aphididae) with the first and third trophic levels. Thus, isofemale strains of A. citricidus infected (Ars+) or not (Ars-) with Arsenophonus were established and used to conduct comparative studies on the use of host plants with different nutritional values, Citrus sinensis (optimum host) and Murraya paniculata (suboptimum host). We assessed survival, longevity and fecundity rates of Ars- and Ars+ A. citricidus in each host plant, and the obtained data were used in for calculation of fertility life tables. We also carried out comparative studies on the success of parasitization of Ars- and Ars+ A. citricidus reared on both host plants by the parasitoid Aphelinus asychis (Walker) (Hymenoptera: Aphelinidae). We assessed parasitoid development on aphids reared on both host plants and measured the success of parasitization on aphids reared on the optimum host plant. Our data proved C. sinensis as a more suitable host than M. paniculata, and that the secondary symbiont benefited infected aphids to explore the food source by reducing the time of development and producing larger adults in the suboptimal host. The fertility life table parameters calculated for Ars+ aphids were higher than those for Ars-. Besides benefiting A. citricidus in the use of food, Arsenophonus also affected the relationship of its host with the parasitoid A. asychis. Ars+ aphids were unsuitable to A. asychis and did not allow the full development of the parasitoid. The studied symbiotic relationship of A. citricidus and Arsenophonus showed the importance of secondary symbionts in multitrophic interactions of the host and the implications they may have for controlling the population growth of insects of economic interest.

Nous avons collecté et comparé les microbiotes et les microbiomes intestinaux de plusieurs dizaines de lézards de l’espèce Podarcis sicula, vivant dans des populations continentales et insulaires croates. L’une de ces populations présentait la particularité d’avoir subi un changement de régime alimentaire récent, une transition d’un régime insectivore vers un régime omnivore (à 80% herbivores) sur une période de 46 ans. Les analyses de diversité menées sur la région V4 de l’ARN ribosomique 16S de ces communautés microbiennes ont révélé que la diversité spécifique (diversité alpha) des microbiotes de lézards omnivores (enrichis en archées méthanogènes) excède celle des microbiotes de lézards insectivores. Les communautés microbiennes des lézards apparaissent en outre faiblement structurées : 5 entérotypes peuvent être identifiés au niveau du phylum, et 3 phyla majoraires (les Bactéroidètes, les Firmicutes et les Protéobactéries) sont présents dans cette espèce. Cependant, ni le régime alimentaire, l’origine spatiale ou temporelle, et le sexe des lézards ne se traduisent par des différences significatives et majeures dans les microbiotes. Des analyses linéaires discriminantes avec effet de la taille des OTUs et des reads des microbiomes fonctionnellement annotés indiquent plutôt que le changement de régime alimentaire de Podarcis sicula est associé à des changements ciblés dans l’abondance de certains composants du microbiote et du microbiome de ces lézards, nous conduisant à formuler l’hypothèse de changements ciblés des communautés microbiennes dans cet holobionte non-modèle, par opposition à des transformations plus radicales. Sur un plan plus théorique, cette thèse propose également des modèles de réseaux (réseaux de similarité de reads et graphes bipartis) susceptibles d’aider à approfondir les analyses des microbiomes. / We collected and compared intestinal microbiota and microbiomes from several Podarcis sicula lizards, which live in Croatian continental and insular populations. One of these populations has recently changed its diet over an 46 years timespan, switching from an insectivorous diet to an omnivorous one (up to 80% herbivorous). Diversity analyses of these microbial communities, based on the V4 region of their 16S rRNA, showed that the microbiota taxonomic diversity (or alpha diversity) is higher in omnivorous lizards (enrichment in methanogenic archaea) than in insectivorous ones. Besides, microbial communities seem weakly structured: 5 enterotypes are detected at the phylum level, and 3 major phyla (Bacteroidetes, Firmicutes and Proteobacteria) are present. However, neither diet, spatial or temporal origin, nor lizard gender correlate with significant differences in microbiota. Linear discriminant analyses with size effect, based on OTUs and functionally annotated reads from the microbiomes, suggest that Podarcis sicula diet change is associated to targeted changes of the abundance of some enzymes in the microbiomes. Such a result leads us to propose a hypothesis of targeted changes in the microbial communities of this non-model holobiont, instead of more radical transformations. On a more theoretical level, this thesis also proposes network models (Reads similarity networks and bipartite graphs) that can help improving microbiome analyses.

Les communautés du coralligène dominées par des gorgonaires ont été sévèrement affectées par des évènements de mortalités massives liés au réchauffement de la Méditerranée. Pour évaluer la contribution des bactéries associées à l’holobionte Paramuricea clavata à son fonctionnement et sa santé, il est apparu primordial de caractériser le compartiment microbien naturel de ce gorgonaire tempéré.Dans ce contexte, l’objectif général de cette thèse était de décrire les interactions existant entre la gorgone rouge P. clavata et ses bactéries associées en Méditerranée nord-occidentale. Les analyses entreprises par des techniques culture-indépendantes basées sur l’analyse des ADN ribosomiques 16S bactériens ont inclus (i) la caractérisation de la variation spatio-temporelle des communautés bactériennes, (ii) la localisation des bactéries dans les tissus de l’hôte, (iii) l’évaluation de la stabilité des associations gorgones-bactéries en conditions de stress et (iv) la détermination de la spécificité d’hôte des bactéries dominantes entre différentes espèces de gorgonaires sympatriques (Eunicella singularis, Eunicella cavolini et Corallium rubrum). Les résultats obtenus ont établi que P. clavata et son microbiote forment un holobionte au sein duquel hôte et bactéries vivent en étroite association, stable dans le temps et l’espace ou en conditions de stress. Les communautés bactériennes associées sont principalement endosymbiotiques et dominées par un ribotype bactérien appartenant à un genre nouveau de la famille des Hahellaceae qui semble présenter une forte spécificité d’hôte. Ces résultats suggèrent un rôle particulier de ce genre bactérien chez les holobiontes gorgonaires. / Coralligenous communities dominated by gorgonian species have been severely affected by diseases and mass mortality events linked to the current warming trends reported for the Mediterranean Sea. The characterization of the natural microbial compartment of this temperate gorgonian species becomes a crucial step in the evaluation of the bacterial contribution to health and functioning of the Paramuricea clavata holobiont.Under these circumstances, the global aim of this PhD work was to describe the interactions existing between the red gorgonian P. clavata and its associated bacteria in the Northwestern Mediterranean basin. The culture-independent analyses based on the bacterial 16S ribosomal DNA included (i) the characterization of spatiotemporal variation of the bacterial communities, (ii) the localization of the bacteria within host tissues, (iii) the evaluation of the stability of gorgonian-bacterial associations under stress conditions and (iv) the determination of the host-specificity of dominant bacteria in different sympatric gorgonian species (Eunicella singularis, Eunicella cavolini and Corallium rubrum).The results of this study highlighted that P. clavata and its microbiota form a holobiont in which host and bacteria live in close association. This association is spatiotemporally stable and maintained under stress conditions. Associated bacterial communities are mostly endosymbiotic and dominated by a bacterial ribotype belonging to a new genus within the Hahellaceae family that seems to be host-specific. These results suggest a particular role of this bacterial genus in the gorgonian holobionts.

L’ubiquité de la symbiose bactérienne, et sa présence à tous les niveaux de l’organisation biologique, bouleverse toute la science du vivant. Aujourd’hui, malgré le profond renouvellement de la biologie, de la médecine et de la philosophie de la biologie, il manque une approche de la relation symbiotique même, de son établissement et de son évolution. Au cours de ce travail, nous montrons que l’ubiquité de la symbiose et sa diversité rendent difficile la détermination d’un modèle particulier pour répondre à toute la complexité de la relation. Pour pallier cette difficulté, proposons de suivre un caractère particulier : le métabolisme syntrophique, solution évolutionnaire commune à toutes les symbioses et l’utilisons comme base de l’analyse. Par une approche évolutionnaire des mécanismes moléculaires et cellulaires, nous démontrons le caractère obligatoire de toute symbiose en établissant la dépendance des partenaires les uns aux autres. Le microbiote, formé des communautés bactériennes symbiotiques, est un organe évolutionnaire intégré fonctionnellement à l’organisme hôte. Les bactéries symbiotiques sont des agents d’homéostasie qui permettent aux organismes hôtes de s’adapter aux fluctuations des conditions environnementales. Cette fonction homéostatique est à l’origine d’une structuration réciproque entre les partenaires symbiotiques, donnant lieu à un holobionte avec une reproduction hybride et une héritabilité étendue. En analysant la symbiose intestinale bactérienne chez l’humain, nous établissons l’interaction codéveloppementale et coévolutionnaire des partenaires, et démontrons l’extension de la structuration réciproque métabolique vers une structuration cognitive qui passe par les systèmes immunitaire et neurologique chez les organismes supérieurs. En démontrant l’intrication du métabolisme avec l’information nous proposons une perspective informationnelle de la symbiose. L’échange d’informations significatives entre l’hôte et son microbiote définit l’organisation informationnelle du holobionte. / The pervasiveness of bacterial symbiosis and its omnipresence at every level of the biological organization deeply trouble life sciences. Today, despite biological, medical and philosophical renewal, a relational perspective analyzing the symbiotic relation, and the establishment and evolution of symbiosis is still lacking. In this work, we reveal difficulties to adopt an appropriate symbiosis model covering the complexity of the diverse and ubiquitous relation, and we propose to analyze the syntrophic metabolism as a common feature to all symbiosis. We apply an evolutionary approach to study molecular and cellular mechanisms, and we demonstrate the reciprocal dependency of symbiotic partners determining an obligatory symbiosis. The microbiota composed of symbiotic bacterial communities is an evolutionary homeostatic organ, functionally integrated in its host organism. Symbiotic bacteria are homeostatic agents that allow host organisms to adapt to fluctuations in environmental conditions. This homeostatic function enables the reciprocal scaffolding between symbiotic partners, resulting in a holobiont characterized by a hybrid reproduction and an extended inheritance. The analysis of bacterial symbiosis in human gut demonstrates the partner’s coevolutionary and codevelopmental interaction and determines the extension of the reciprocal metabolic scaffolding to a cognitive scaffolding based on immune and neurological systems in higher organisms. We demonstrate the entanglement of metabolism and information, and propose an informational perspective to define the symbiosis. This establishes an informational organization of the holobiont through the exchange of significant information between the host and its microbiota.

Originaire d'Asie du Sud et de l'Est, le moustique tigre Aedes albopictus est aujourd'hui implanté sur 5 des 6 continents et les moyens de lutte mis en place pour l'éliminer peinent à freiner son expansion. Ces dernières années, l'étude des communautés microbiennes associées aux insectes a permis de démontrer leur implication dans des fonctions clefs de la biologie de leurs hôtes (nutrition, immunité, résistance aux stress biotiques et abiotiques …). Ensemble, ils constituent un super-organisme appelé holobionte. Ainsi, une meilleure connaissance de l'écologie microbienne d'Ae. albopictus pourrait nous apporter de nouvelles perspectives dans la compréhension du fonctionnement du pathosystème vectoriel. C'est dans ce contexte que s'est inscrit mon projet de thèse qui a consisté à décrire le microbiote bactérien du moustique tigre en lien avec son écologie et la génétique de ses populations. Nos travaux se sont tout d'abord portés sur des exemples précis d'interactions avec des symbiotes d'intérêts puis nous avons élargi cette étude à l'ensemble des communautés bactériennes et leurs facteurs de variation, en bénéficiant du développement des nouvelles technologies de séquençage. Les résultats obtenus ouvrent la voie vers de nouvelles hypothèses sur le fonctionnement et la dynamique de l'holobionte moustique avec la prise en compte des interactions symbiotiques comme un élément majeur du pathosystème vectoriel / Originated from South East Asia, the Asian tiger mosquito Aedes albopictus is now established on 5 of the 6 continents. Control strategies to limit its introduction and expansion remain restricted. Those last years, studies on insect microbial communities highlighted the key role of symbionts in the biology of their hosts (nutrition, immunity, resistance to biotic and abiotic stresses…). Together, they constitute a super-organism called the holobiont. Therefore, a better knowledge of microbial ecology of Ae. Albopictus should increase the understanding of vectorial pathosystem. In this context, my thesis project consisted to improve the description of bacterial microbiota associated with the Asian tiger mosquito in relation with its ecology and population genetics. We first based our attention on specific models of symbiotic interactions and then we extended our study to the whole bacterial community and its variation factors using high throughput sequencing technologies. Our results open the way to new hypotheses about the function and dynamics of mosquito holobionte taking into account the symbiotic interactions as a major component of the vectorial pathosystem

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