La reconnaissance de l’implication du système immunitaire dans le cancer a guidé l’industrie vers de développement d’immunothérapies nombreuses et prometteuses. Or, à l’ère de l’immuno-oncologie, on constate un manque criant de modèles précliniques capables de simuler les interactions immunitaires entre un patient et sa tumeur. Pour remédier à cette situation, nous avons développé des modèles de souris humanisées combinant la reconstitution immunitaire de souris immunodéficiente et l’injection de lignées tumorales issues d’un même donneur. L’utilisation de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) a permis notamment le développement de multiples lignées tumorales à partir d’un seul donneur sain, facilitant ainsi l’accès aux cellules immunitaires nécessaires à l’humanisation des souris. La transformation des cellules primaires ou dérivées d’iPSC a été faite par la transduction lentivirale des proto-oncogènes de la télomérase (hTERT), de Ras oncogénique (HRASV12) et de la région précoce du viruse simen 40 (SV40ER) encodant les gros et petits antigènes T (LgT et SmT). Cette approche permis de générer des tumeurs de haut grade, agressives et peu différenciées à l’aide de fibroblastes primaires et de cellules hépatiques, de cellules souches neurales et d’astrocytes dérivés d’iPSC. Dans tous les cas, les tumeurs ainsi générées ont été efficacement reconnues, infiltrées et souvent rejetées par le système immunitaire autologue implanté. Le rejet partiel de la plupart de ces tumeurs ouvre toutefois la porte à l’évaluation préclinique d’immunothérapies diverses reposant sur les réactions immunitaires anti-tumorales de l’hôte. Par exemple, nous avons pu étudier l’impact d’un traitement d’inhibition du point de contrôle immunitaire PD-1 sur la croissance de tumeurs d’origine fibroblastique où une augmentation marquée du taux d’infiltration immunitaire humaine a été observé sans toutefois mener à une réduction significative du fardeau tumoral. Nous avons aussi pu produire, de façon autologue, des lymphocytes T exprimant un récepteur d’antigène chimérique (CAR) contre le ganglioside GD2, un antigène tumoral préalablement identifié et détecté sur les tumeurs de cellules souches neurales générées par notre approche. L’efficacité cytotoxique de ces CAR a ainsi pu être validée in vitro dans un système autologue. Finalement, nous avons utilisé le modèle de tumeurs fibroblastiques dans des contextes immunitaires autologues et allogéniques pour déterminer si le potentiel immunomodulateur des cellules stromales mésenchymateuses (MSC) pouvait affecter la croissance tumorale. Selon nos résultats, les MSC n’auraient aucun effet ni sur le taux d’émergence et de croissance tumoral, ni sur l’infiltrat immunitaire, suggérant que leur utilisation thérapeutique serait sécuritaire en ce qui concerne ce type de tumeurs ayant préalablement un microenvironnement tumoral immunosuppresseur. En somme, les modèles innovateurs décrits dans cette thèse visent à améliorer la qualité prédictive des modèles murins précliniques en immuno-oncologie en récapitulant certaines interactions immunitaires entre un patient et sa tumeur. La grande flexibilité de cette approche permettra d’adapter aisément le modèle aux problématiques d’intérêt, tant fondamentales que précliniques. / Identification of the human’s immune system implication in cancer has guided the biotech industry towards the development of numerous and promising cancer immunotherapies. However, in the era of immuno-oncology, a distinct lack preclinical models can simulate the interactions between a patient’s tumor and immune cells. To tackle this issue, we developed humanized mouse models combining immune reconstitution of immunodeficient mice and injection of tumor cells lines from the same human donor. The use of induced pluripotent stem cells (iPSC) allowed the generation of multiple tumorigenic cell lines from a single donor, facilitating access to autologous immune cells necessary for mouse immune humanization. The transformation of primary or iPSC-derived cell lines was done using lentiviral transduction of proto-oncogenes telomerase (hTERT), oncogenic Ras (HRASV12) and simian virus 40 early region (SV40ER) encoding large and small T antigens (LgT and SmT). This approach allowed to generate high grade, aggressive and undifferentiated tumors from primary fibroblasts and iPSC-derived hepatic cells, neural stem cells and astrocytes. In all cases, such tumors were efficiently recognized, infiltrated and often rejected by the implanted autologous immune system. However, partial rejection of most tumors allows for preclinical evaluation of targeted immunotherapies relying on the hosts’ pre-existing immune response. For instance, we could study the impact of PD-1 checkpoint blockade inhibition on tumor growth in fibroblastic tumors where a significant increase in tumor infiltration was observed, but without an associated decrease in tumor burden. We could also produce autologous chimeric antigen receptor (CAR)-expressing T lymphocytes against GD2 ganglioside, a previously described tumor antigen detected on our neural stem cell-derived tumor cells. Cytotoxic efficiency of these autologous CAR T cells could thus be validated in vitro. Finally, we used our fibroblast-derived tumor models in autologous and allogeneic settings to determine if mesenchymal stem cells’ (MSC) immunomodulatory potential could impact tumor growth. Our results showed that MSC had no effect neither on tumor emergence and growth nor on immune infiltration, suggesting therapeutic use of these cells should be safe regarding such tumors already harboring a strongly immunodeficient microenvironment. Overall, the novel models described in this thesis aim at improving the predictive capacity of mouse pre-clinical models in immuno-oncology by recapitulating some immune interactions between a patient and its tumor. The great flexibility of this approach will allow for easy adaptation to many research problematics both preclinical and fundamental.

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The human heart has poor endogenous regeneration. If myocytes are lost due to injury, the myocardium is unable to restore its myocyte content and instead undergoes compensatory hypertrophy and remodeling. Cardiac tissue engineering aims to recreate and provide functional myocardium that replaces the injured myocardium. In this study, human engineered heart muscle (EHM) from cardiomyogenically differentiated human embryonic stem cells was generated. EHMs consisted of elongated, anisotropically organized cardiomyocyte bundles and responded “physiologically” to increasing calcium concentrations. To generate large myocardium capable of encompassing the ventricles, a novel process to systematically upscale the dimensions of engineered myocardium to a humanized Biological Ventricular Assisted Device (hBioVAD) was introduced. The hBioVADs formed a “pouch-like” myocardium at rabbit heart dimensions and were beating spontaneously. Further enhancement by biomimetic pulsatile loading generated “more mature” myocardium. Additional paracrine functionality was integrated by generating insulin-like growth factor-1 (IGF-1) secreting fibroblasts for tissue engineering applications. IGF-1 release induced higher levels of Akt phosphorylation and hypertrophy in cardiomyocytes resulting in increased force generation of EHM. Finally, feasibility of “paraBioVAD” (IGF-1 cell line and cardiomyocytes) implantation was demonstrated in a healthy rat model. Histological observations demonstrated engraftment on the heart and the presence of vascular structures. In conclusion, a humanized “paraBioVAD” technology for mechanic and paracrine heart support was developed. Future studies will assess its therapeutic utility in heart failure

Dans le but de générer une souris transgénique produisant des anticorps humains, les trois loci humains (HC, LCκ et LCλ) ont été reconstitués sous forme de YAC circulaires. Puis, pour simplifier la manipulation des gènes codant pour la chaîne lourde, quatre vecteurs plasmidiques qui résument l’information génétique contenue dans le locus humain de la chaîne lourde ont été réalisés. La construction HC Minilocus (78 kbp) est donc composée des 13 segments V sélectionnés, de la région D-J synthétisée et des gènes codant pour les parties constantes de type μ, ɣ3 et ɣ1. Trois autres constructions (~22 kbp) ont été dérivées des étapes intermédiaires de clonage. Elles sont basées sur 7 segments V et la région D-J synthétisée. Le HC Microlocus Classic (22 kb) a été obtenu après clonage du gène codant pour la partie constante ɣ1 en 3’ des éléments V, D et J précédemment cités; cette construction code pour des chaînes lourdes d’IgG1 (ɣ1 HC). De la même façon, le HC Microlocus Light (21.5 kb) contient le gène codant pour ɣ1 CH1-, cette construction code donc pour des chaînes lourdes IgG sans domaine CH1 (ɣ1 HC CH1-). Les chaînes lourdes de ce type sont exprimées sans être associées à des chaînes légères, à l’image de ce qui est observé chez les camélidés (Heavy Chain only antibodies). Enfin le HC Microlocus Light shRNA (22 kbp) est une construction basée sur le Microlocus Light à laquelle a été ajoutée une séquence codant pour quatre shRNA (small hairpin RNA) visant à réprimer l’expression d’IgM murin. Ce locus est destiné à être injecté dans des souris natives (wilde type, WT). La fonctionnalité de ces quatre vecteurs a été évaluée par transfection dans la lignée cellulaire 300-19, des lymphocytes pro B d’origine murine pouvant progresser du stade pro B au stade de cellule B mature, lorsqu’elles sont maintenues en culture. Pour les quatre constructions, plusieurs réarrangements DJ et VDJ ont été identifiés, montrant une grande diversité combinatoire et jonctionelle. Par cytométrie en flux (FACS), des chaînes lourdes humaines ont été identifiées dans le cytoplasme et à la surface des cellules transfectées avec les trois constructions intermédiaires. Les cellules exprimant des chaînes lourdes en surface ont été enrichies par FACS. Par la suite, en utilisant des méthodes immuno-enzymatiques (ELISA et ELISPOT), il a été prouvé que les chaines lourdes d’anticorps humains étaient secrétées dans le milieu extracellulaire. La transgénèse avec les constructions HC Microlocus Light et HC Microlocus Light shRNA s’est révélée efficace puisque nous avons obtenu plusieurs animaux transgéniques. Aucune cellule B n’a été détectée dans les souris HC Microlocus Light (background HC KO); alors que cette même construction associée à un shRNA (HC Microlocus Light shRNA) dans une souris transgénique au système immunitaire humoral intact, montre l’expression de chaînes lourdes d’anticorps humains dans le cytoplasme et à la surface des cellules B. La chaine lourde humaine est exprimée en parallèle des immunoglobulines endogènes à la surface des cellules pre-B, ainsi que dans les cellules B immatures et matures. / In order to generate a transgenic mouse producing human antibodies, three human loci (HC, LCκ et LCλ) were reconstituted in the form of circular YAC. Then, to simplify the manipulation of genes encoding the heavy chain, four vectors summarizing the genetic information contained in the human heavy chain locus were designed and cloned. The HC Minilocus (78 kbp) is composed of 13 V segments, a synthetic DJ cluster and the genes encoding the constant parts Cμ, Cɣ3 and Cɣ1. Three other constructions (~22 kbp) were derived from the intermediate cloning steps. They are based on 7 V segments and a DJ region synthesized. The HC Microlocus Classic (22 kbp) was obtained after cloning of the gene encoding the constant part ɣ1 in 3' of the V , D and J elements mentioned above; this construct encodes the heavy chain of IgG1 (ɣ1 HC). The HC Microlocus Light (21.5 kb) contains the gene encoding ɣ1 CH1-, therefore, this construction encodes IgG1 HC without CH1 domain (ɣ1HC CH1-). Such HC are expressed without being associated with light chain (Heavy Chain only antibodies). Finally, the HC Microlocus Light shRNA (22 kb) is based on the HC Microlocus Light to which was added a sequence encoding four shRNA (small hairpin RNA) to repress the murine IgM expression. This locus is designed to be injected into wild type mouse. The functionality of the four reduced human HC constructs was assessed in mouse cells. The 300-19 cell line was used because is a pro-B cell line able to rearrange endogenous or transgenic Ig genes and to express the rearranged genes as Ig proteins. 300-19 cells were transduced with the four reduced human HC constructs and the expression of the transgenic Ig genes was investigated in detail. Indeed, DJ and VDJ rearrangement, recombinatory diversity, junctional diversity, transcription, mRNA maturation, alternative splicing, Ig surface expression and secretion were assessed. The data demonstrated that these constructs undergo editing and processing in murine cells and give rise to a large diversity of human heavy chains. The HC Microlocus Light was injected in HC knock out mouse oocytes and the HC Microlocus Light shRNA (which is exactly identical to the Microlocus Light concerning the antibody gene part) in wild type mouse oocytes. Injection in wild type mice led to human γ1 HC expression, whereas injections in HC KO mice did not show any B cell population reconstitution and consequently no human HC γ1 expression. Transgenic human ɣ1 HC and endogenous mouse IgM are co-expressed at the surface of progenitor-, immature- and mature B cells.