O hidroperóxido de urato (HOOU) é o produto da oxidação do ácido úrico por peroxidases. Sua produção é favorecida durante a inflamação e hiperuricemia, uma vez que há grande quantidade de ácido úrico, peroxidases inflamatórias e superóxido. Neste sentido, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito do hidroperóxido de urato sobre proteínas sensíveis à modulação redox em um ambiente inflamatório asséptico e outro que imita infecção. Assim, nesta tese comparou-se a estrutura química do HOOU obtido fotoquimicamente daquele obtido através da catálise enzimática pela mieloperoxidase. A obtenção do HOOU por foto-oxidação permitiu o melhor isolamento do composto. Este oxidante foi capaz de reagir especificamente com os aminoácidos contendo enxofre (metionina e cisteína). Neste sentido, foi investigada sua reatividade com tiol-peroxidases detoxificadoras de peróxido, a peroxiredoxina 1 e 2 (Prx1 e Prx2). O HOOU apresentou cinética rápida de reação com a Prx1, k = 4,9 × 105 M-1s-1 e Prx2, k = 2,3 × 106 M-1s-1, o que as torna um provável alvo celular, além disso, foi capaz de oxidar a Prx2 de eritrócitos humanos, mostrando ser capaz de atravessar a membrana plasmática. Além das Prxs, a albumina do soro também desempenha papel importante na homeostase redox. O HOOU foi capaz de oxidar a albumina com constante de velocidade de 0,2 × 102 M-1s- 1. Outra tiol-proteína com importante função na homeostase e sinalização redox é a tioredoxina (Trx). A Trx foi oxidada pelo HOOU com constante de reação de 2,8 × 102 M-1s-1 e foi liberada juntamente com a Prx1 e Prx2 das células de macrófagos humanos (linhagem THP-1) quando estas células foram incubadas com HOOU. A liberação dessas proteínas é reconhecidamente um sinal de estresse celular. Assim o HOOU pode estar envolvido na exacerbação do estresse oxidativo em ambiente inflamatório. Quando neutrófilos (linhagem HL- 60) e macrófagos humanos (linhagem THP-1) foram incubados na presença de ácido úrico e Pseudomonas aeruginosa houve uma diminuição na produção de ácido hipocloroso (HOCl). Isto se deveu à competição entre ácido úrico e cloreto pela mieloperoxidase e resultou em menor atividade microbicida pelas células, demonstrando que a formação do HOOU não contribui e, ao contrário, prejudica a atividade microbicida das células inflamatórias. Dessa forma, a oxidação do ácido úrico e formação do hidroperóxido de urato tanto altera a atividade microbicida das células inflamtárias, quanto leva à oxidação de tiósproteínas importantes para manutenção da homeostase redox. Assim, o HOOU pode ser o responsável pelos efeitos pró-oxidantes e pró-inflamatórios do ácido úrico solúvel, e isso indica que o papel antioxidante do ácido úrico deve ser revisto em situações de inflamação. / Urate hydroperoxide (HOOU) is the product of the oxidation of uric acid by peroxidases. The formation of HOOU is favored during inflammation and in hyperuricemia, where there is plenty amount of uric acid, inflammatory peroxidases and superoxide. Therefore, the aim of the present study was to evaluate the effect of urate hydroperoxide on redox sensitive proteins in an inflammatory environment and another that mimics infection. In this thesis the chemical structure of the HOOU produced by photo-oxidation was compared to that obtained by myeloperoxidase catalysis. The chemical production of HOOU allowed a better purification of the compound. This oxidant was able to specifically react with sulfur containing amino acids (methionine and cysteine). In this sense, its reactivity with peroxiredoxins (Prx1 and Prx2) was investigated. HOOU reacted fast with Prx1 k = 4.9 × 105 M-1s-1 and Prx2 k = 2.3 × 106 M-1s-1. In addition, HOOU was able to oxidize Prx2 from intact erythrocytes at the same extend as does hydrogen peroxide. Albumin is an important thiol-containing protein to redox homeostasis in plasma. HOOU was able to oxidize albumin with a rate constant of 0.2 × 102 M-1s-1. Another protein with important function in redox homeostasis is thioredoxin (Trx). Trx was oxidized by HOOU with a rate constant of 2.8 × 102 M-1s-1 and was released together with Prx1 and Prx2 from human macrophages cells (THP-1 cell line) that were incubated with HOOU. The release of these proteins is a signal of cellular stress. Thus, HOOU may be involved in the exacerbation of oxidative stress in inflammatory environments. When neutrophil (HL-60 cell line) and macrophages (THP-1 cell line) were incubated with uric acid and Pseudomonas aeruginosa there was a decrease in hypochlorous acid (HOCl) production because of the competition between chloride and uric acid by myeloperoxidase. It decreased HOCl and impaired the microbicidal activity of the cells, showing that HOOU does not contribute in bacteria clearance. Therefore, the oxidation of uric acid to urate hydroperoxide impairs microbicidal activity and oxidizes thiol-proteins in inflammatory cells contributing to a pro-oxidant status. In this context, the antioxidant role of uric acid in inflammatory response should be reviwed.

O hidroperóxido de urato (HOOU) é o produto da oxidação do ácido úrico por peroxidases. Sua produção é favorecida durante a inflamação e hiperuricemia, uma vez que há grande quantidade de ácido úrico, peroxidases inflamatórias e superóxido. Neste sentido, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito do hidroperóxido de urato sobre proteínas sensíveis à modulação redox em um ambiente inflamatório asséptico e outro que imita infecção. Assim, nesta tese comparou-se a estrutura química do HOOU obtido fotoquimicamente daquele obtido através da catálise enzimática pela mieloperoxidase. A obtenção do HOOU por foto-oxidação permitiu o melhor isolamento do composto. Este oxidante foi capaz de reagir especificamente com os aminoácidos contendo enxofre (metionina e cisteína). Neste sentido, foi investigada sua reatividade com tiol-peroxidases detoxificadoras de peróxido, a peroxiredoxina 1 e 2 (Prx1 e Prx2). O HOOU apresentou cinética rápida de reação com a Prx1, k = 4,9 × 105 M-1s-1 e Prx2, k = 2,3 × 106 M-1s-1, o que as torna um provável alvo celular, além disso, foi capaz de oxidar a Prx2 de eritrócitos humanos, mostrando ser capaz de atravessar a membrana plasmática. Além das Prxs, a albumina do soro também desempenha papel importante na homeostase redox. O HOOU foi capaz de oxidar a albumina com constante de velocidade de 0,2 × 102 M-1s- 1. Outra tiol-proteína com importante função na homeostase e sinalização redox é a tioredoxina (Trx). A Trx foi oxidada pelo HOOU com constante de reação de 2,8 × 102 M-1s-1 e foi liberada juntamente com a Prx1 e Prx2 das células de macrófagos humanos (linhagem THP-1) quando estas células foram incubadas com HOOU. A liberação dessas proteínas é reconhecidamente um sinal de estresse celular. Assim o HOOU pode estar envolvido na exacerbação do estresse oxidativo em ambiente inflamatório. Quando neutrófilos (linhagem HL- 60) e macrófagos humanos (linhagem THP-1) foram incubados na presença de ácido úrico e Pseudomonas aeruginosa houve uma diminuição na produção de ácido hipocloroso (HOCl). Isto se deveu à competição entre ácido úrico e cloreto pela mieloperoxidase e resultou em menor atividade microbicida pelas células, demonstrando que a formação do HOOU não contribui e, ao contrário, prejudica a atividade microbicida das células inflamatórias. Dessa forma, a oxidação do ácido úrico e formação do hidroperóxido de urato tanto altera a atividade microbicida das células inflamtárias, quanto leva à oxidação de tiósproteínas importantes para manutenção da homeostase redox. Assim, o HOOU pode ser o responsável pelos efeitos pró-oxidantes e pró-inflamatórios do ácido úrico solúvel, e isso indica que o papel antioxidante do ácido úrico deve ser revisto em situações de inflamação. / Urate hydroperoxide (HOOU) is the product of the oxidation of uric acid by peroxidases. The formation of HOOU is favored during inflammation and in hyperuricemia, where there is plenty amount of uric acid, inflammatory peroxidases and superoxide. Therefore, the aim of the present study was to evaluate the effect of urate hydroperoxide on redox sensitive proteins in an inflammatory environment and another that mimics infection. In this thesis the chemical structure of the HOOU produced by photo-oxidation was compared to that obtained by myeloperoxidase catalysis. The chemical production of HOOU allowed a better purification of the compound. This oxidant was able to specifically react with sulfur containing amino acids (methionine and cysteine). In this sense, its reactivity with peroxiredoxins (Prx1 and Prx2) was investigated. HOOU reacted fast with Prx1 k = 4.9 × 105 M-1s-1 and Prx2 k = 2.3 × 106 M-1s-1. In addition, HOOU was able to oxidize Prx2 from intact erythrocytes at the same extend as does hydrogen peroxide. Albumin is an important thiol-containing protein to redox homeostasis in plasma. HOOU was able to oxidize albumin with a rate constant of 0.2 × 102 M-1s-1. Another protein with important function in redox homeostasis is thioredoxin (Trx). Trx was oxidized by HOOU with a rate constant of 2.8 × 102 M-1s-1 and was released together with Prx1 and Prx2 from human macrophages cells (THP-1 cell line) that were incubated with HOOU. The release of these proteins is a signal of cellular stress. Thus, HOOU may be involved in the exacerbation of oxidative stress in inflammatory environments. When neutrophil (HL-60 cell line) and macrophages (THP-1 cell line) were incubated with uric acid and Pseudomonas aeruginosa there was a decrease in hypochlorous acid (HOCl) production because of the competition between chloride and uric acid by myeloperoxidase. It decreased HOCl and impaired the microbicidal activity of the cells, showing that HOOU does not contribute in bacteria clearance. Therefore, the oxidation of uric acid to urate hydroperoxide impairs microbicidal activity and oxidizes thiol-proteins in inflammatory cells contributing to a pro-oxidant status. In this context, the antioxidant role of uric acid in inflammatory response should be reviwed.

A oxidação do DNA por espécies reativas de oxigênio, como o oxigênio molecular singlete [O2 (1Δg)] , pode estar relacionada ao aparecimento de mutações e ao desenvolvimento de doenças. O O2 (1Δg) pode ser gerado biologicamente por reação de fotossensibilização, pela reação de H2O2 e HOCl e pela decomposição de peróxidos orgânicos contendo hidrogênio alfa (α-ROOH), na presença de metais de transição (Fe2+, Cu2+) ou HOCl. A decomposição de α-ROOH, como hidroperóxidos de lipídeos ou proteínas na presença de metais de transição, pode gerar O2 (1Δg) via mecanismo de Russell. Neste mecanismo, a oxidação de α -ROOH gera radicais peroxila, que podem reagir entre si, formando um intermediário tetraóxido linear. Este intermediário tetraóxido linear pode decompor através de um mecanismo cíclico e produzir O2 (1Δg), um álcool e um composto carbonílico. Como a decomposição de α-ROOH pelo mecanismo de Russell pode ser uma importante fonte biológica de O2 (1Δg) decidimos investigar se o α-hidroperóxido de timina, 5-(hidroperoximetil)uracil (5-HMPU), poderia gerar esta espécie reativa na presença de metais (Ce4+, Fe2+, Cu2+) e HOCl. Outro objetivo foi avaliar os efeitos oxidativos, em DNA plasmidial (pBR322), da decomposição de 5-HPMU na presença de Cu2+. A geração de O2 (1Δg) na reação de 5-HPMU e Ce4+ ou HOCl foi demonstrada por meio do monitoramento da emissão de luz monomolecular de O2 (1Δg) na região do infravermelho próximo (IR-próximo, λ = 1270 nm) e bimolecular na região do visível (λ = 634 e 703 nm). A aquisição do espectro de emissão de O2 (1Δg) forneceu evidências inequívocas da geração desta espécie reativa na reação de 5-HPMU e Ce4+ ou HOCl. Além disto, a formação de O2 (1Δg) na reação de 5-HPMU e Fe2+, Cu2+ ou HOCl foi demonstrada através da captação química de O2 (1Δg) utilizando 9,10- divinilsulfonatoantraceno (AVS) e detecção por HPLC/MS/MS do endoperóxido (AVSO2) formado. A detecção por HPLC/MS/MS dos produtos de decomposição de 5-HPMU, 5- (hidroximetil)uracila (5-HMU) e 5-formiluracila (5-FoU), reforçaram a hipótese de geração de O2 (1Δg) pelo mecanismo de Russell. A análise dos resultados da incubação de pBR322, 5-HPMU e crescente concentração de Cu2+ mostraram o aumento da forma circular aberta (OC), indicando a formação de quebra de fita simples do DNA, provavelmente proveniente da presença dos radicais peroxila e alcoxila de 5-HPMU. Já a utilização das enzimas de reparo FPG e NTH na incubação de pBR322, 5-HPMU e Cu2+ forneceu evidências da formação preferencial de purinas oxidadas, especialmente de 2’-desoxiguanosina (dGuo). O aumento significativo da forma OC na presença de FPG indicou a formação de 8-oxo-2’-desoxiguanosina, resultante da oxidação da dGuo por O2 (1Δg) e/ou pelos radicais derivados de 5-HPMU. Podemos concluir que 5-HPMU pode ser uma importante fonte biológica de O2 (1Δg) . Além disto, a presença de 5-HPMU pode levar a propagação dos danos oxidativos no DNA, pois sua decomposição pode gerar radicais peroxila e alcoxila / Oxidation of DNA by singlet molecular oxygen O2 (1Δg) can be involved in the development of mutations and diseases. In vivo, O2 (1Δg) can be generated by photosensitization reaction, H2O2 and HOCl reaction and decomposition of organic hydroperoxides with α-hydrogen (α-ROOH) in the presence of metal ions (Fe2+, Cu2+) or HOCl. The α-ROOH decomposition, such as lipid or protein hydroperoxides in the presence of metal ions or HOCl can generate O2 (1Δg) by Russell mechanism. In this mechanism, the self-reaction of peroxyl radicals generates a linear tetraoxide intermediate that decomposes to O2 (1Δg) , an alcohol and an aldehyde. Therefore, the purpose of this work is to investigate if O2 (1Δg) can be generated by α-thymine hydroperoxide, 5- (hydroperoxymethyl)uracil (5-HPMU) in the presence of Ce4+, Fe2+, Cu2+ or HOCl. Another purpose is to study base modification and strand breaks formation in plasmid DNA (pBR322) by 5-HPMU decomposition in the presence of Cu2+. The generation of O2 (1Δg) in the reaction of 5- HPMU and Ce4+ or HOCl was monitored by monomol light emission in the near-infrared region (NIR, λ = 1270 nm) and dimol light emission in the visible region (λ = 634 e 703 nm). The generation of O2 (1Δg) during the reaction of 5-HPMU and Ce4+ or HOCl was confirmed by acquisition of the light emission spectrum in the NIR. Furthermore, the generation of O2 (1Δg) produced by 5-HPMU and Fe2+, Cu2+ or HOCl was also confirmed by chemical trapping using anthracene-9,10-divinylsulfonate (AVS) and HPLC/MS/MS detection of the corresponding endoperoxide (AVSO2). The detection by HPLC/MS/MS of 5-(hydroxymethyl)uracil (5-HMU) and 5-formyluracil (5-FoU), two 5-HPMU decomposition products, support the Russell mechanism. Plasmid results from pBR322, 5-HPMU and Cu2+ reaction showed formation of DNA open circular form (OC), probably produced by 5-HPMU peroxyl and alkoxyl radicals. Additionally, the reaction of pBR322, 5-HPMU and Cu2+ following by Fpg and NTH enzyme treatment demonstrated evidences of purine modification, especially 2’-deoxyguanosine (dGuo). The use of FPG enzyme indicated the formation of 8-oxo-7,8-dihydro-2’-deoxyguanosine, a dGuo oxidation product formed by O2 (1Δg) and/or 5-HPMU peroxyl and alkoxyl radicals. We can conclude that 5-HPMU can be a biological source of O2 (1Δg)] and 5-HPMU decomposition can lead to an enhancing of DNA oxidative damage by 5-HPMU peroxyl and alkoxyl radicals formation

<p>Polyunsaturated fatty acids can be bioactivated by two families of dioxygenases, which either contain non-heme iron (lipoxygenases) or heme (cyclooxygenases, linoleate diol synthases and α-dioxygenases).</p><p>Lipoxygenases and their products play important roles in the pathophysiology of plants and fungi. The only known lipoxygenase with catalytic manganese (Mn-lipoxygenase) is secreted by a devastating root pathogen of wheat, the Take-all fungus <i>Gaeumannomyces graminis</i>. Its mycelia also contains linoleate diol synthase (LDS), which can oxidize linoleic acid to sporulation hormones.</p><p>Mn-lipoxygenase belongs to the lipoxygenase gene family. Recombinant Mn-lipoxygenase was successfully expressed in the yeast <i>Pichia pastoris</i> with an expression level of 30 mg/L in fermentor culture. The tentative metal ligands of Mn-lipoxygenase were studied by site-directed mutagenesis. The results show that four residues His-274, His-278, His-462 and the C-terminal Val-602 likely coordinate manganese, as predicted by sequence alignments with Fe lipoxygenases.</p><p>Mn-lipoxygenase (~100 kDa) contains an Asp-Pro peptide bond in the N-terminal region, which appears to hydrolyze during storage and in the acidic media during Pichia expression to an active enzyme of smaller size, mini-Mn-lipoxygenase (~70 kDa). The active form of Mn-lipoxygenase can oxygenate fatty acids of variable chain length, suggesting that the fatty acids enter the catalytic site with the ω-end (“tail first”).</p><p>Mn-lipoxygenase is an <i>R</i>-lipoxygenase with a conserved Gly316 residue known as a determinant of stereospecificity in other <i>R/S</i> lipoxygenases. The Gly316Ala mutant showed an increased hydroperoxide isomerase activity and transformed 18:3n-3 and 17:3n-3 to epoxyalcohols.</p><p>The genome of the rice blast fungus, <i>Magnaporthe grisea</i>, contains putative genes of lipoxygenases and LDS. Mycelia of <i>M. grisea</i> were found to express LDS activity. This enzyme was cloned and sequenced and showed 65% amino acid identity with LDS from <i>G.graminis</i>. </p><p>Take-all and the rice blast fungi represent a constant threat to staple foods worldwide. Mn-lipoxygenase and LDS might provide new means to combat these pathogens.</p>

Polyunsaturated fatty acids can be bioactivated by two families of dioxygenases, which either contain non-heme iron (lipoxygenases) or heme (cyclooxygenases, linoleate diol synthases and α-dioxygenases). Lipoxygenases and their products play important roles in the pathophysiology of plants and fungi. The only known lipoxygenase with catalytic manganese (Mn-lipoxygenase) is secreted by a devastating root pathogen of wheat, the Take-all fungus Gaeumannomyces graminis. Its mycelia also contains linoleate diol synthase (LDS), which can oxidize linoleic acid to sporulation hormones. Mn-lipoxygenase belongs to the lipoxygenase gene family. Recombinant Mn-lipoxygenase was successfully expressed in the yeast Pichia pastoris with an expression level of 30 mg/L in fermentor culture. The tentative metal ligands of Mn-lipoxygenase were studied by site-directed mutagenesis. The results show that four residues His-274, His-278, His-462 and the C-terminal Val-602 likely coordinate manganese, as predicted by sequence alignments with Fe lipoxygenases. Mn-lipoxygenase (~100 kDa) contains an Asp-Pro peptide bond in the N-terminal region, which appears to hydrolyze during storage and in the acidic media during Pichia expression to an active enzyme of smaller size, mini-Mn-lipoxygenase (~70 kDa). The active form of Mn-lipoxygenase can oxygenate fatty acids of variable chain length, suggesting that the fatty acids enter the catalytic site with the ω-end (“tail first”). Mn-lipoxygenase is an R-lipoxygenase with a conserved Gly316 residue known as a determinant of stereospecificity in other R/S lipoxygenases. The Gly316Ala mutant showed an increased hydroperoxide isomerase activity and transformed 18:3n-3 and 17:3n-3 to epoxyalcohols. The genome of the rice blast fungus, Magnaporthe grisea, contains putative genes of lipoxygenases and LDS. Mycelia of M. grisea were found to express LDS activity. This enzyme was cloned and sequenced and showed 65% amino acid identity with LDS from G.graminis. Take-all and the rice blast fungi represent a constant threat to staple foods worldwide. Mn-lipoxygenase and LDS might provide new means to combat these pathogens.

A oxidação do ácido úrico (7,9-diidro-1H-purina-2,6,8(3H)-triona) pela mieloperoxidase (MPO) gera o radical de urato que, em presença do radical ânion superóxido combinam para formar o hidroperóxido de urato (HOOU). Considerando os altos níveis de MPO, ácido úrico e superóxido na placa de ateroma espera-se que o ácido úrico seja oxidado a HOOU neste microambiente inflamatório. O HOOU é um oxidante mais forte que o peróxido de hidrogênio e pode oxidar grupos tiólicos de proteínas como a proteína dissulfeto isomerase (PDI). Como consequência à oxidação da PDI, ocorre uma modulação positiva sobre a NADPH oxidase (Nox) com aumento da produção de superóxido por neutrófilos. Sendo assim, a formação do HOOU no leito vascular poderia elucidar os mecanismos moleculares pelos quais o urato colabora para a progressão da aterosclerose em pacientes com hiperuricemia. Para investigar a interação do HOOU com a PDI, padronizou-se a síntese química do HOOU através de um sistema de fotooxidação do tipo I, utilizando urato, riboflavina (fotossensibilizador) e luz UVA. Inicialmente padronizou-se o tipo de irradiação e tempo de reação com o melhor rendimento para a síntese do HOOU. O HOOU formado e seu produto de redução o álcool 5-hidroxiisourato foram separados, identificados e caracterizados através de cromatografia liquida acoplada à espectrometria de massa (LC/MS). Após a purificação, determinou-se o coeficiente de absortividade molar em 308 nm (&#949;308 = 6537 &#177; 377 M-1.cm-1) e o tempo de meia-vida, aproximadamente 41 minutos à 22&#176;C do HOOU. O HOOU foi capaz de reagir seletivamente com o aminoácido metionina e com o tripeptídeo glutationa. Além disso, o HOOU não forma adutos estáveis com a glutationa, sendo que toda glutationa consumida foi transformada em glutationa dissulfeto. Quando incubado com a PDI (10 &#181;M), cerca de 70 e 100% do total de HOOU (3 &#181;M) foi consumido após 30 e 120 segundos, respectivamente, enquanto que a PDI (23 &#181;M) teve seus grupos tiólicos oxidados após a incubação com 140 &#181;M HOOU por 30 min a 22&#176;C. O HOOU oxidou os resíduos de cisteína dos dois sítios catalíticos da PDI com uma constante de velocidade da reação de 1,5 &#177; 0,04 x 103 M-1.s-1, demonstrando uma interação favorável com essa proteína no meio biológico e um possível papel modulatório do HOOU sobre a via PDI-Nox. Interessantemente, o ácido úrico aumentou a produção de superóxido e o consumo de oxigênio de células HL-60 diferenciadas em neutrófilos (dHL-60) e ativadas com acetato de miristato de forbol (PMA). Essa regulação poderia ser mediada através da formação do HOOU durante o \"burst\" oxidativo dos neutrófilos que oxidaria a enzima PDI induzindo um consequente aumento da atividade da Nox. / The oxidation of the uric acid (7,9-dihidro-1H-purine-2,6,8(3H)-trione) by myeloperoxidase (MPO) generates the urate radical. In inflammatory conditions the superoxide reacts with urate radical to form the urate hydroperoxide (HOOU). Taking into account the high amount of MPO, urate and superoxide in the atheroma plaque, it is likely that HOOU is being formed in this inflammatory environment. The HOOU is a strong oxidizing agent and can react with thiol groups from proteins, like the protein disulfide isomerase (PDI). As a consequence of its oxidation, PDI positively modulates NADPH oxidase (Nox) and increases superoxide production by neutrophils. Therefore, the formation of HOOU in the vascular sheet would contribute to tissue damage and would explain the positive correlation between hyperuricemia and the risk for cardiovascular disease. To investigate the interaction of HOOU with PDI, we performed the chemical synthesis of the compound by the Type I photooxidation, using UVA irradiation and riboflavin as a photosensitizer. Initially, we standardized the irradiation light and the time of the reaction that produced the highest income. The HOOU and its reduced product 5-hydroxiisourate were separate, identified and characterized by liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC/MS). We also determine the molar extinction coefficient of HOOU at 308 nm (&#949;308 = 6537 &#177; 377 M-1.cm-1). The half-life of the compound was 41 min at 22&#176;C. The HOOU selectively oxidized methionine and glutathione. The reaction of HOOU with glutathione did not form any stable adducts. Thus, all consumed glutathione generated glutathione disulfide. When incubated with PDI (10 &#181;M), 70 and 100% of the total amount of HOOU (3 &#181;M) was consumed within 30 and 120 seconds, respectively. Besides, the PDI (23 &#181;M) had its thiol groups oxidized after incubation with 140 &#181;M HOOU for 30 min at 22&#176;C. The HOOU oxidized the cysteine residues from the catalytical sites of PDI with a second order rate constant of 1.5 &#177; 0.04 x 103 M-1.s-1. This result suggests a favorable interaction of HOOU with this protein in the biological system, as well as a possible modulatory role of HOOU on the PDI-Nox pathway. Interestingly, urate increased superoxide production and oxygen consumption by neutrophil-like cells (differentiated HL-60 cells). This effect could be mediated by the formation of HOOU during the neutrophil oxidative burst, followed by the oxidation of PDI, a positive regulation of Nox and an increase in superoxide production.

A bactéria fitopatogênica Xylella fastidiosa é o agente etiológico da Clorose Variegada dos Citros (CVC), que causa perdas anuais estimadas em US$ 100 milhões no Brasil. Durante o processo infeccioso, a geração extracelular de espécies ativas de oxigênio é um dos principais mecanismos de defesa da planta contra o patógeno. Em contrapartida, para se defender do estresse oxidativo imposto pelo hospedeiro, os fitopatógenos possuem mecanismos de defesa que incluem enzimas antioxidantes, como as peroxirredoxinas, alquil hidroperóxido redutase subunidade C (AhpC) e proteína comigratória com bacterioferritina (Bcp). As peroxirredoxinas são proteínas que utilizam suas cisteínas ativas para catalisar a redução de hidroperóxidos. Por análise proteômica, os produtos dos genes ahpc e bcp foram identificados no extrato celular protéico de X. fastidiosa (Smolka e col., 2003). Com o intuito de caracterizar funcional e estruturalmente as proteínas AhpC e Bcp de X. fastidiosa, clonamos e expressamos seus respectivos genes em Escherichia coli e purificamos as proteínas por cromatografia de afinidade a níquel. As proteínas recombinantes apresentaram atividade dependente de tiól de redução de peróxido de hidrogênio e hidroperóxidos orgânicos. A atividade peroxidase da AhpC e Bcp são dependentes, respectivamente, de alquil hidroperóxido redutase subunidade F (AhpF) e do sistema tiorredoxina. Paradoxalmente, a flavoproteína AhpF possui atividade NAD(P)H oxidase, que resulta na produção de peróxido de hidrogênio. As constantes de segunda ordem da reação das proteínas com peróxido de hidrogênio (da ordem de 107 M-1.s-1), determinadas pelo ensaio de cinética competitiva com peroxidase de raiz forte, indicam que ambas possuem atividades peroxidase equivalentes às apresentadas por glutationa peroxidases dependentes de selênio e catalases, ao contrário do descrito na literatura. Por SDS-PAGE não-redutor e pela quantificação de cisteínas livres por DTNB, verificamos que as proteínas possuem mecanismos catalíticos distintos: AhpC é uma 2-Cys Prx típica (com formação de ponte dissulfeto intermolecular), enquanto Bcp é uma 2-Cys Prx atípica (com formação de ponte dissulfeto intramolecular). Para AhpC, a atividade catalítica envolve as cisteínas conservadas (Cys-47 e Cys-165), em contraste, apenas através de estudos de mutação sítio-dirigida e espectrometria de massas conseguimos identificar os resíduos de cisteínas envolvidos na atividade catalítica da Bcp (Cys-47 e Cys-83). A caracterização estrutural de AhpC por cromatografia de exclusão molecular e espalhamento dinâmico de luz mostram que a proteína nativa é um decâmero estável, independentemente do estado de oxidação de suas cisteínas. A caracterização da estrutura cristalográfica de Bcp C47S, inédita para 2-Cys Prx atípicas que possuem as cisteínas ativas separadas por 35 aminoácidos, indica que a proteína possui o enovelamento característico das peroxirredoxinas e que as cisteínas ativas estão localizadas a uma distância média de 12,4 Å. Baseado em dicroísmo circular, apresentamos dados que indicam que a aproximação das cisteínas deve envolver um significativo rearranjo estrutural, que provavelmente se inicia com a formação do intermediário ácido sulfênico na cisteína peroxidásica (Cys-47). Assim, conseguimos elucidar o papel catalítico dessas proteínas, bem como identificar seus sistemas redutores, obtendo informações que podem ser relevantes para o entendimento do mecanismo da patogenicidade da X. fastidiosa. Os resultados apresentados neste trabalho podem contribuir para o desenvolvimento de novas técnicas de controle de praga para a doença CVC em citrus e outras que envolvam a bactéria X. fastidiosa. / The phytopathogenic bacterium Xylella fastidiosa is the etiological agent of Citrus Variegated Chlorosis (CVC) that causes losses of about 100 millions dollars per year in Brazil. During infection, reactive oxygen species play a central role in plant pathogen defense. To survive under oxidative stress imposed by the host, microorganisms express antioxidant proteins, including the peroxiredoxins alkyl hydroperoxide reductase subunit C (AhpC) and bacterioferritin comigratory protein (Bcp). Peroxiredoxins are peroxidases, which rely on an activated cysteine residue to catalyze the reduction of hydroperoxides. By proteome analysis, Smolka et al. (2003) identified the products of ahpc and bcp genes present in whole cell extract of X. fastidiosa. To characterize the function and structure of AhpC and Bcp protein, their genes were cloned in Escherichia coli and the corresponding proteins purified by nickel affinity chromatography. Recombinant proteins presented thiol-dependent peroxidase activity against hydrogen peroxide and organic hydroperoxides. AhpC and Bcp peroxidase activities are dependent on alkyl hydroperoxide reductase subunit F (AhpF), and on thioredoxin system, respectively. Paradoxically, AhpF flavoenzyme possesses hydrogen peroxide-forming oxidase activity. Contrary to classical assumptions, competitive kinetics employing horseradish peroxidase assays showed that the second-order rate constants of AhpC and Bcp reaction with hydrogen peroxide are in the order of 107 M-1.s-1, as fast as the activity of selenium-dependent glutathione peroxidases and catalases. Non-reducing SDS-PAGE and cysteine quantification using DTNB indicated different peroxidasic mechanisms: AhpC is a typical 2-Cys peroxiredoxin (with intermolecular disulfide bond formation), while Bcp is an atypical 2-Cys peroxiredoxin (with intramolecular disulfide bond formation). In contrast to the well-conserved AhpC cysteines responsible for the peroxidase activity (Cys-47 and Cys-165), only through site-specific mutagenesis and mass spectrometry we could identified the cysteine residues involved in the Bcp peroxidase activity (Cys-47 and Cys-83). Structural characterization by size exclusion chromatography and dynamic light scattering revealed that AhpC native protein forms stable and redox state independent decamers. The crystal structure of Bcp C47S, the first 2-Cys Prx with a 35-residue between the active cysteines ever characterized, shows that protein contains the common fold of peroxiredoxins and that active cysteines lies ~12.4 Å away one from the other. Based on circular dichroism, we presented data indicating that disulfide bond formation may require significant conformational changes, which probably is triggered by the peroxidatic cysteine oxidation to sulfenic acid. In conclusion, we elucidated the catalytic mechanisms and reduction systems of AhpC and Bcp proteins that may help to understand the pathogenicity mechanism of X. fastidiosa. These results can contribute to the development of plague control methods against X. fastidiosa.

Two small combustion systems, methyl hydroperoxide (CH3OOH) and 2-propanol ((CH3)2CHOH), were studied using imaging photoelectron photoion coincidence spectroscopy (iPEPICO), which combines photoelectron spectroscopy and photoionization mass spectrometry to detect coincident photoelectron-photoion pairs. In the photon energy range of 11.4–14.0 eV, energy selected CH3OOH+ ions dissociate into CH2OOH+, HCO+, CH3+, and H3O+ ions. The lowest-energy dissociation channel is the formation of the cation of the smallest “QOOH” radical, CH2OOH+. A statistical rate model fitted to the experimental data yields a 0 K appearance energy of 11.647 ± 0.005 eV for the CH2OOH+ ion, and a 74.2 ± 2.6 kJ mol–1 mixed experimental-theoretical 0 K heat of formation for the CH2OOH radical. The proton affinity of the Criegee intermediate, CH2OO, was also obtained from the heat of formation of CH2OOH+ (792.8 ± 0.9 kJ mol–1) to be 847.7 ± 1.1 kJ mol–1, reducing the uncertainty of the previously available computational value by a factor of 4. RRKM modeling of the higher-energy fragmentation processes, supported by Born–Oppenheimer molecular dynamics simulations, found that the HCO+ fragment ion is produced through a roaming transition state; H3O+ is formed in a consecutive process from the CH2OOH+ fragment ion; and direct C–O fission of the molecular ion leads to the methyl cation. Experimentally, 2-propanol has been found to dissociate primarily into CH2CHOH+, CH3CHOH+, CH3CHCH3+, and, as a minor product, into (CH3)2COH+ ions within a photon energy range of 10.0–13.1eV. There are interesting dissociation dynamics involving breaking the C–¬C bond: the lowest energy product (CH3 loss) is quickly outcompeted by a kinetically favored CH4 loss. At low internal energies of < 0.3 eV, the loss of CH4 dominates through a roaming pathway, when the leaving CH3 abstracts a hydrogen atom from the other methyl group. At higher energy, the direct loss of CH3• quickly takes over as its transition state is much less tight and, thus, it is kinetically favored. The statistical model fitted to the experimental data yielded the appearance energy corresponding to the thermochemical limit for the CH3-loss dissociation and the 0 K heats of formation of the CH3CHOH+ ion was found to be in good agreement with ATcT values and with our previous study on ethanol.

A atividade catalítica de clusters trigonais de acetato de rutênio e porfirinas supramoleculares contendo quatro unidades de clusters periféricos ou complexos de bis(bipiridina)rutênio, na oxidação de substratos orgânicos por iodosil-benzeno ou terc-butil-hidroperóxido, é abordada nesta tese. Foram feitos estudos cinéticos para elucidar o mecanismo de catálise, com especial destaque para duas espécies supramoleculares isoméricas representadas por Mn(3-TRPyP) ou Mn(4-TRPyP), nos quais os complexos de bis(bipiridina)(cloro)rutênio se coordenam à tetrapiridilporfirina através das posições meta ou para da ponte piridínica, respectivamente. Além da maior seletividade proporcionada pelos catalisadores supramoleculares, a substituição do íon cloreto pela água nos complexos periféricos de rutênio, intensificou a atividade catalítica, gerando novos sítios ativos, do tipo Ru(IV)=O. Também foram estudados clusters trinucleares de rutênio, altamente reativos, no estado Ru(III)Ru(IV)Ru(IV)=O. Estes foram gerados eletroquimicamente em solução aquosa, apresentando pronunciada atividade catalítica na oxidação do alcool benzílico. Finalmente, uma espécie dimérica de cluster, ainda inédita, com ponte oxo, foi caracterizada e investigada do ponto de vista catalítico. / The catalytic activity of trinuclear ruthenium clusters and supramolecular tetrapyridylporphyrins containing four peripheral cluster units or bis(bipyridine)ruthenium complexes, in the oxidation of organic substrates by iodosylbenzene or tert-butil-hydroperoxide, is dealt with in this thesis. Kinetic studies were performed in order to elucidate the mechanisms of catalysis involving two isomeric species denoted Mn(3-TRPyP) or Mn(4-TRPyP), in which the bis(bipyridine)(chloro)ruthenium complexes are bound to the tetrapyridylporphyrin center, at the meta or para positions of the pyridine bridge, respectively. In addition to the improved selectivity by such supramolecular catalysts, the substitution of the chloride ion by water in the peripheral ruthenium complexes, greatly enhanced their catalytic activity by generating new Ru(IV)=O reactive sites. Highly reactive trinuclear ruthenium clusters of the type Ru(III)Ru(IV)Ru(IV)=O were also generated electrochemically in aqueous solution, exhibiting pronounced catalytic activity in the oxidation of benzyl alcohol. Finally, a novel dimeric oxo-bridged cluster species was characterized, and its role in catalysis investigated.

A atividade catalítica de clusters trigonais de acetato de rutênio e porfirinas supramoleculares contendo quatro unidades de clusters periféricos ou complexos de bis(bipiridina)rutênio, na oxidação de substratos orgânicos por iodosil-benzeno ou terc-butil-hidroperóxido, é abordada nesta tese. Foram feitos estudos cinéticos para elucidar o mecanismo de catálise, com especial destaque para duas espécies supramoleculares isoméricas representadas por Mn(3-TRPyP) ou Mn(4-TRPyP), nos quais os complexos de bis(bipiridina)(cloro)rutênio se coordenam à tetrapiridilporfirina através das posições meta ou para da ponte piridínica, respectivamente. Além da maior seletividade proporcionada pelos catalisadores supramoleculares, a substituição do íon cloreto pela água nos complexos periféricos de rutênio, intensificou a atividade catalítica, gerando novos sítios ativos, do tipo Ru(IV)=O. Também foram estudados clusters trinucleares de rutênio, altamente reativos, no estado Ru(III)Ru(IV)Ru(IV)=O. Estes foram gerados eletroquimicamente em solução aquosa, apresentando pronunciada atividade catalítica na oxidação do alcool benzílico. Finalmente, uma espécie dimérica de cluster, ainda inédita, com ponte oxo, foi caracterizada e investigada do ponto de vista catalítico. / The catalytic activity of trinuclear ruthenium clusters and supramolecular tetrapyridylporphyrins containing four peripheral cluster units or bis(bipyridine)ruthenium complexes, in the oxidation of organic substrates by iodosylbenzene or tert-butil-hydroperoxide, is dealt with in this thesis. Kinetic studies were performed in order to elucidate the mechanisms of catalysis involving two isomeric species denoted Mn(3-TRPyP) or Mn(4-TRPyP), in which the bis(bipyridine)(chloro)ruthenium complexes are bound to the tetrapyridylporphyrin center, at the meta or para positions of the pyridine bridge, respectively. In addition to the improved selectivity by such supramolecular catalysts, the substitution of the chloride ion by water in the peripheral ruthenium complexes, greatly enhanced their catalytic activity by generating new Ru(IV)=O reactive sites. Highly reactive trinuclear ruthenium clusters of the type Ru(III)Ru(IV)Ru(IV)=O were also generated electrochemically in aqueous solution, exhibiting pronounced catalytic activity in the oxidation of benzyl alcohol. Finally, a novel dimeric oxo-bridged cluster species was characterized, and its role in catalysis investigated.