Calcium phosphates are important compounds as they exist in natural aqueous systems such as rivers, lakes, ocean, and soil. These calcium phosphates are widely used to provide information on paleotemperatures as well as many anthropological features, such as paleodiets. One of the most ubiquitous forms of calcium phosphate is hydroxyapatite (Ca10(PO4)6(OH)2) which is a major component of hard tissue such as bones, fossils, and tooth enamel. The oxygen isotope systematics in the hydroxyapatite associated with carbonate-water system will provide further information to allow for the reconstruction of terrestrial and marine environments. For example, Fricke et al. (1998) used oxygen isotope analysis of the carbonate components of hydroxyapatite in tooth enamel of mammals to investigate changes in terrestrial climate. Therefore, the purpose of this research study was to examine the oxygen isotope systematics in inorganic carbonate-bearing hydroxyapatite and water at low temperatures. This Master’s thesis followed and modified the methods described in Lécuyer et al. (2010) in an attempt to synthesize hydroxyapatite crystals and carbonate-bearing hydroxyapatite. The crystals synthesized were characterized in terms of several conditions (i.e., influence of mixing rate and maturations, pH, and concentrations of NaHCO3). Methods to produce hydroxyapatite were developed and analyzed using X-Ray diffraction analysis. The results demonstrated a strong dependence of pH in the hydroxyapatite solutions. Moreover, the effect of concentrations of NaHCO3 was deemed to be essential in order to obtain the desired amount of structural carbonates in the hydroxyapatite crystals. Furthermore, this research evaluated the temperature dependence of oxygen isotopic fractionation between HAP-bound carbonate and water at 10, 25, and 40 oC. Our study is the first to assess the two mixing-rates experiments with different maturations (7 and 14 days) on the oxygen isotope effects and fractionation behaviour between HAP-bound carbonate and water. Both maturation time and the effect of initial concentration of NaHCO3 were found to be the most important in determining the equilibrium conditions in our experiments. / Dissertation / Master of Science (MSc)

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L'industrie laitière représente le deuxième secteur alimentaire par le volume de sa production au Québec. Son développement s'explique par la croissance des besoins en matières grasses laitières, notamment en produits transformés tels que le fromage. En production fromagère, la concentration du lait par ultrafiltration (UF) entraîne le rejet d'importants volumes de perméat de lait contenant du lactose et des sels; lui conférant un fort impact environnemental. Pour produire 1 kilogramme de fromage, 9 litres de lactosérum sont rejetés. Il contient des protéines, du lactose et des sels. Les protéines sont valorisées sous forme de concentrés par UF; ce qui génère de larges volumes de perméat de lactosérum. Les résidus organiques de la transformation laitière sont de 264 972 tonnes/an au Québec. Le lactose des perméats est valorisé par cristallisation ou bio fermentation, mais la présence de minéraux est limitante. L'induction d'une précipitation phosphocalcique sélective avant la valorisation du lactose permettrait l'extraction de ces éléments sous forme d'hydroxyapatites (HAp), utilisées comme supplément dans les formulations alimentaires et la récupération conjointe de lactose. Pour favoriser la précipitation des HAp, une concentration du perméat par osmose inverse(OI) a été réalisée. D'autres paramètres ont aussi été étudiés : pH, température et ensemencement. Les précipités ont été récupérés par centrifugation, lyophilisés puis chauffés à 550°C pour éliminer la phase organique. Pour suivre l'efficacité de la précipitation, la composition des principaux éléments salins (K, Ca, Na, P, Mg) a été déterminée par spectrométrie de masse à plasma à couplage inductif et le Ca ionique de la phase soluble a été mesuré avec une électrode. Les phases cristallines obtenues ont été analysées par diffraction des rayons X et par FTIR. La morphologie des particules a été étudiée par microscopie électronique à balayage. Les résultats ont confirmé que le taux de phosphate de calcium précipité a augmenté avec l'ensemencement, la chaleur et l'alcalinisation; surtout dans les perméats concentrés par OI. L'alcalinisation induit le changement de phase vers la forme HAp, démontrant le potentiel de la précipitation sélective du phosphate de calcium et de l'impact positif de l'OI sur son efficacité. Cette étude ouvre la voie à la valorisation des minéraux à partir des perméats de fromagerie, qui a été très peu investiguée comparativement à celle du lactose. / The dairy industry represents the second-largest food sector in Quebec. Its development could be explained by the growth of the dairy fat needs with the demand for processed products, such as butter or cheese, increasing yearly. The concentration of milk proteins by ultrafiltration (UF) leads to the rejection of important volumes of milk permeate (WP), which contains lactose and minerals, responsible for its environmental impact. The production of one kg of cheese rejected 9 liters of whey, representing 1.2 billion tons per year. Whey is rich in proteins, lactose, and mineral components. Whey proteins are generally concentrated by UF and used in various foods for their excellent technological and nutritional properties. This process generates large volumes of whey permeate. The dairy industry is responsible for rejecting a weight of 264 972 tons/years of organic matter in the province of Quebec. Lactose can be valorized by crystallization of bio-fermentation, but salts content could be a limit factor. The induction of selective phosphocalcic precipitation of those elements into hydroxyapatite (HAp) could permit the supplementation of Ca in food formulas and recover lactose simultaneously. To favor HAp precipitation, permeate concentration by reverse osmosis (RO) was tried. Other parameters were studied, including the pH, heating treatments, and DCP seeding. Precipitates were condensed by centrifugation, lyophilized, and then put in a 550°C furnace to remove organic traces. Specific milk salts recovered in the precipitate (K, Ca, Na, P, Mg) was determined by ICP to follow the efficiency of the process. Ionic Ca from the aqueous phase was measured as well with an electrode. Crystalline phases were analyzed by X-ray diffraction and FTIR. The particle's morphology was studied by scanning electron microscopy. Results confirmed that the calcium-phosphate precipitated rate increased with solution's seeding, heating, and alkalinization. Reverse osmosis increased the precipitation. Alkalinization inducts the phase change from simple apatic minerals to complex ones such as HAp. These results demonstrate the potential of selective calcium-phosphate precipitation and RO's positive impact on reaction efficiency. This study opens the path to cheese permeate salt's valorization, low investigated until now.

L'émail dentaire est la couche de tissu externe calcifié recouvrant la couronne de la dent; c’est la structure la plus minéralisée du corps humain. L'émail est synthétisé par l’améloblaste au cours du développement de la dent, mais cette population cellulaire dégénère et régresse totalement lorsque la dent devient fonctionnelle. L'émail mature est donc complètement dépourvu de cellules et de contenu protéique. L’amélogénine, la principale protéine de l’émail a la capacité de s’assembler en structures très organisées de type nanochaînes qui vont guider et réguler les cristaux d’hydroxyapatite de l’émail en formation. Le Leucine Rich Amelogenin Peptide (LRAP) est un produit de l'épissage alternatif du gène de l'amélogénine ; c’est un peptide court (56kDa), composée des séquences actives et N- et C-terminales de la protéine d’amélogénine complète. Dans ce travail, nous avons cherché à comprendre le rôle de LRAP dans l’amélogenèse. Nous avons montré 1) que LRAP présentait les mêmes propriétés d’auto-assemblage que la forme complète d’amélogénine et ses produits de clivage ; 2) que LRAP possédait les même propriétés de régulation des phosphates de calcium que la protéine complète ; et 3) que la conformation de la forme phosphorylée de LRAP était modifiée par une augmentation de la concentration de calcium dans le milieu environnant contrairement à la forme déphosphorylée de LRAP. Dans un second temps, nous avons étudié les propriétés de signalisation du peptide et confirmé nos résultats de minéralisation sur des modèles de culture de cellules de type améloblastique LS8 et ALC in vitro et sur un modèle de culture de germe de première molaire de souris ex vivo. Nous avons montré que la présence des deux formes de LRAP, active la cinétique de différenciation des cellules LS8 et ALC in vitro et favorise la formation de cristaux d’HAP organisés et allongés. Dans les germes en culture, la présence de LRAP(+P) dans un milieu minéralisant permet une augmentation de la densité et du volume de minéral formé alors que dans un milieu standard, il favorise la différenciation des germes. LRAP(-P) entraine en revanche, la synthèse par les améloblastes sécréteurs de longs et fins cristaux d’HAP bien organisés. Ce travail pourrait ouvrir de nouvelles stratégies de régénération des tissus de l'émail afin de traiter des altérations de la couche d'émail résultant de lésions carieuses à l’aide du LRAP(-P) ou de troubles génétiques comme l’amélogenèse imparfaite en utilisant plutôt le LRAP(+P). / Tooth enamel is the outer calcified layer covering the crown of the tooth; it is the most mineralized tissue of the human body. Enamel is synthesized by ameloblast during tooth development, but this cell population degenerates and regresses when the tooth becomes fully functional. The mature enamel is completely devoid of cells and protein content. The amelogenin, the main protein of the enamel has the ability to assemble into highly organized nanochains, which will guide and regulate the deposition of hydroxyapatite crystals during enamel formation. The Leucine Rich Amelogenin Peptide (LRAP) is a product of alternative splicing of the amelogenin gene; it is a short peptide (56kDa), composed of the active N- and C-terminal sequences of the complete amelogenin protein. The aim of this work is to understand is to understand the role of LRAP in enamel formation. We have shown 1) that LRAP presents the same self-assembling properties as the full-length form of amelogenin and its cleavage products; 2) that LRAP exhibits the same calcium phosphate regulating properties as the full-length protein; and 3) that the conformation of the phosphorylated form of LRAP was modified by increasing concentration of calcium in the surrounding medium unlike the dephosphorylated form of LRAP. In the second part of this work, we have studied the peptide signaling properties and confirmed our mineralization results on ameloblast lineage cell culture models (LS8 and ALC) in vitro and on mice first molar germ culture model ex vivo. We have shown that the presence of both forms of LRAP activate the kinetic of differentiation of LS8 and ALC cells in vitro, and results in the formation of organized elongated HAP crystals. In the germ culture experiments, addition of LRAP(+P) in a mineralizing medium induces an increase in the density and volume of the mineral formed whereas in the standard medium, it promotes differentiation of the germs. LRAP(-P) leads to the synthesis by secretory ameloblasts of well organized long and fine HAP crystals. This work may lead the way toward new strategies for enamel tissue regeneration in order to treat alterations in the enamel layer resulting from carious lesions with the LRAP(-P) or genetic disorders such as amelogenesis imperfecta using LRAP(+P).

Dans l'objectif de combler le gap entre l'offre et la demande en propène, la réaction d'oxydation déshydrogénante du propane (ODHP) est une solution alternative à la réaction de déshydrogénation directe. Les hydroxyapatites (HAp) modifiées au vanadium sont des matériaux bi-fonctionnels aux propriétés acido-basiques et redox intéressants pour cette réaction. L'objectif de cette thèse est d'étudier le comportement catalytique de ces systèmes et d'établir des relations entre structure et réactivité. Par le contrôle des conditions de synthèse et pourvu que le pH soit maintenu élevé (~9), la solution solide Ca10(PO4)6-x(VO4)x(OH)2 est obtenue dans toute la gamme de composition (x 0→ 6), alors que pour un pH inférieur, un mélange de phases d'HAps au vanadium et de Ca2V2O7 est obtenu pour x ≥ 4. Pour la solution solide, contrairement à la sélectivité en propène, la conversion en propane n'augmente pas avec la teneur en vanadium non exposé en surface. L'activation de la liaison C-H du propane s'explique par une propriété intrinsèque à la structure HAp, en lien avec la formation thermiquement activée d'anions O2- très basiques. Leur formation in situ résulte de la déshydratation progressive des colonnes d'ions OH- via le processus de conduction ionique par les protons, exalté sous conditions réactionnelles. L'organisation du vanadium sous la forme de tétramères dans Ca2V2O7 au lieu de tétraèdres isolés dans la seule solution solide favorise les échanges redox et explique l'augmentation de la sélectivité. Le contact intime entre les deux phases et la formation d'une interface cohérente permet un optimum de rendement en propène du fait de la synergie des propriétés des deux phases. / In order to fill the gap between propene supply and demand, the oxidative dehydrogenation of propane (ODHP) is an alternative solution to the direct dehydrogenation process. Vanadium-modified hydroxyapatites (HAp) are bifunctional catalysts combining acid-base and redox properties which were shown to be of interest for the ODHP reaction. In order to optimize this system, the aim of the work was to investigate the catalytic behavior of the vanadium-modified hydroxyapatites and to establish structure reactivity relationships. By peculiar attention was devoted to the control of synthesis. Provided high pH value is maintained during the synthesis, the Ca10(PO4)6-x(VO4)x(OH)2 solid solution was successfully obtained for x 0→ 6, whereas at lower pH, a mixture of Vx-HAp solid solution and of Ca2V2O7 was obtained from x ≥ 4. For the solid solution, contrary to propene selectivity, the propane conversion does not depend on the vanadium content, unexposed on the surface. The activation of the C-H bond of propane is controlled by an intrinsic properties of the HAp structure, in relation with the thermally activated formation of strong basic O2- anions. Their in situ formation results from the progressive dehydration of OH- columns via an ionic conduction process by protons that is enhanced under catalytic conditions. Due to the tetrameric environment of vanadium in Ca2V2O7 against isolated tetrahedra in the solid solution, redox exchanges are facilitated, improving the selectivity in propene. The intimate contact between the two phases and the formation of a coherent interface leads to an optimal yield in propene, due to synergistic effects of the two phases.

Dans le but de réduire la morbidité et la durée d’hospitalisation, la médecine régénérative progresse de nos jours vers le développement de techniques chirurgicales moins invasives. Cette recherche en chirurgie mini-invasive a motivé le développement de matrices injectables pour l’ingénierie tissulaire osseuse. Ces matrices doivent aussi être capables de durcir une fois injectées in situ, acquérir la forme souhaitée ainsi que des propriétés mécaniques compatibles avec le tissu hôte qu’elles doivent réparer. De nombreux hydrogels sont déjà employés pour cette application mais aucun ne remplit complètement les propriétés requises. L’objectif de cette thèse est de développer de nouveaux substituts de greffe osseuse : des hydrogels à base de biopolymères associés à des cellules osseuses pour obtenir des greffons mi-synthétiques, mi-biologiques. Des nanoparticules de phosphates de calcium sont ajoutées pour améliorer les propriétés biologiques et mécaniques des hydrogels. L’hydroxyapatite, le phosphate de calcium choisi, est attrayante à cause de ses similitudes chimiques et structurales au constituent minéral de l’os humain. Le but de ce travail est de synthétiser des nanofils d’hydroxyapatite par la méthode template et des nanopoudres d’hydroxyapatite de taille contrôlée par sonoélectrochimie pulsée déphasée. Ensuite pour améliorer les propriétés intrinsèques des structures 3D, ces nanoparticules de phosphates de calcium seront insérées dans des matrices d’hydrogel synthétisées par le laboratoire d’ingénierie ostéo-articulaire et dentaire (LIOAD) de Nantes. Des mesures de coefficient de diffusion seront suivies par des tests de cytotoxicité et de biocompatibilité de ces matériaux. Des études en sous-cutané et après implantation en milieu osseux suivront. / In order to reduce morbidity and hospital stay, regenerative medicine is nowadays moving towards the development of less invasive surgical techniques. This search for a minimally invasive surgery has motivated the development of injectable matrices for bone tissue engineering. These matrices must also be able to harden in situ once injected, acquire the desired shape and mechanical properties compatible with the host tissue it intends to repair. Many hydrogels are already used for this application but none fully meets the required properties. The objective of this thesis is to develop new bone graft substitutes: hydrogels based on biopolymers associated with bone cells to achieve half synthetic and half biological grafts. Nanoparticles of calcium phosphates are added to improve the biological and mechanical properties of hydrogels. Hydroxyapatite, calcium phosphate chosen, has attracted much attention because of its chemical and structural similarity to the mineral constituent of human bone. The aim of this work is to synthesize firstly hydroxyapatite nanowires by the template method and secondly size controlled hydroxyapatite nanopowders by out-of-phase pulsed sonoelectrochemistry. Thirdly to improve the intrinsic properties of these three-dimensional structures, those nanoparticles of calcium phosphates will be added in the matrices of hydrogel synthesized by the LIOAD. Measurements of diffusion coefficient will be followed by testing cytotoxicity and biocompatibility of those materials. A subcutaneous study and bone model study will follow.

Pulsed laser deposition (PLD) was used to deposit hydroxyapatite (HA) thin films on various substrates, including silicon (100) and titanium (Ti-6Al-4V) alloy. Thin films of amorphous HA were deposited at room temperature and then annealed over a range of temperatures. The microstructure and composition of the films were determined using scanning electron microscopy (SEM), energy dispersive x-ray spectroscopy (EDS), and X-ray diffraction (XRD). The HA films were found to achieve total crystallinity at 350㮠The mechanical properties of the films were studied by means of nanoindentation and scratch adhesion testing. Crystalline and adherent HA thin films prepared using PLD and post deposition annealing have many potential medical and dental applications.

Apatite containing bioceramic materials are considered to be potentially useful for replacement or repair of natural bone. In the present study, the aim was to produce a new composite bioceramic containing crystalline apatite and wollastonite phases with a bimodal grain size distribution. The manufacturing scheme was based on the liquid phase sintering process in which the compacts pressed from powders of apatite (HAP or Si&shy / HAP) and pseudowollastonite was sintered in the presence of a liquid phase. Three distinct fluxing agents, magnesium flux (MCAS), sodium feldspar and sodium frit (NCAS), were prepared to act as additives for generating the liquid phase during sintering. Among those, the use of sodium frit resulted in the expected bimodal microstructural assembly. During the sintering studies, it was discovered that the apatite component of the ceramic was prone to compositional modifications by reaction with the liquid phase. This interaction resulted in a formation of siliconized HAP which crystallized in the form of rod-like grains. Meanwhile wollastonite grains tended to exhibit faceted equiaxed morphology and bonded to rod-like apatite grains with the help of a glassy phase. The results showed significant enhancement in the mechanical properties of apatite-wollastonite composites compared to phase pure hydroxyapatite. For example, the sample with 47.5 wt% Si-HAP2 + 47.5 wt% W + 5 wt% NCASfrit had the highest value of flexural strength, 83.6 MPa, which was almost twice that of hydroxyapatite, 46.3 MPa. The results for other properties such as compressive strength, hardness and fracture toughness also demonstrated the benefit of apatite-wollastonite composite approach.

In vivo, les cellules osseuses évoluent dans un microenvironnement complexe, tridimensionnel et interagissent avec celui-ci à de nombreuses échelles, depuis le nanomètre (tropocollagène) jusqu’à des structures de plusieurs centaines de micromètres (trabécules). Paradoxalement, la majeure partie de nos connaissances sur la physiologie cellulaire est issue d’expériences réalisées sur des cellules cultivées sur du plastique et en deux dimensions. Ces différences ne peuvent qu’avoir une influence sur le comportement des cellules, qui n’entretiennent plus les mêmes relations spatiales entre elles, ainsi qu’avec leur environnement. De plus, si ces dernières années, nombre d’études ont été réalisées sur l’influence de la topographie à des échelles nano et micrométriques, peu d’études ont montré le rôle de la géométrie du substrat à une échelle tissulaire, soit au sein de structures supérieures à 100 µm. Afin d’étudier l’influence de la macroarchitecture du substrat sur le comportement cellulaire, des céramiques en hydroxyapatite à architecture contrôlée ont été ensemencées avec des cellules primaires de calvaria de souris. Une première étude a été entreprise sur des substrats macroarchitecturés, présentant des sillons de différentes géométries : sillons semi-circulaires (Wave), sillons triangulaires à angle de 90° ou à angle de 45°. Plus la géométrie du substrat était refermée (45°>90°>Wave), plus la différenciation ostéoblastique était rapide. Cela s’est traduit par une augmentation des niveaux d’expression génique et protéique d’ostéocalcine et de sclérostine, indiquant la présence d’ostéocytes au sein de l’important tissu déposé par les cellules. De plus, au sein de la géométrie à l’angle le plus fermé (i.e. « 45° »), des structures fibreuses minéralisées, orientées parallèlement au fond du substrat ont été observées. Cette orientation s’est confirmée au niveau cellulaire, avec une orientation similaire des fibres de stress et un étirement des noyaux cellulaires. La géométrie du substrat influence donc le comportement des cellules en modifiant très probablement leur signalisation intracellulaire. Ces investigations ont été poursuivi par le développement d’un modèle d’ostéogénèse 3D sous perfusion au sein du bioréacteur BOSE ElectroForce® 5270 BioDynamic®de la plateforme Equipex IVTV, afin d’explorer les interactions cellulaires-substrat en réponse à des contraintes mécaniques (forces de cisaillement). Le dépôt tissulaire était particulièrement abondant au sein des pores triangulaires à angle de 45°, confirmant les données obtenues sur les substrats macroarchitecturés et laissant penser que ce type de pores est le plus à même de permettre une différenciation ostéoblastique optimale. Les résultats de ces travaux pourront permettre des avancées dans la compréhension de la biologie de l’os, mais également dans la conception d’implants innovants destinés à la réparation de défaux osseux, avec une ostéointégration stimulée via la présence de structures à géométrie fermée, tel que des sillons triangulaires à angles de 45°. / In vivo, cells reside in a complex and three-dimensional microenvironment, with which they interact at multiple scales, from the nanometer (tropocollagen) to structures of several hundred of micrometers (trabeculae). However, most of our knowledge on cell physiology has been obtained from cells grown in Petri dishes, on plastic and in two dimensions. In those conditions, the spatial relationships between cells and their environment can only be deeply modified. Moreover, if the impact of substrate closure at a cellular level is particularly well documented, very few studies have shown its role at a tissue level (i.e. greater than 100 µm), and thus focused mostly on the matrix deposition rather than on the osteoblastic differentiation. In order to study the effects of substrate macroarchitecture on cells, primary mouse calvarial cells were seeded on hydroxyapatite-based bioceramics, made from wax molds by 3D printing. A first study was conducted on macroarchitectured substrates. These bioceramics have three patterns of different degrees of closure: semi-circular grooves (Wave), triangular grooves with 90° angle and triangular grooves with 45° angle. The tighter was the substrate geometry (45°> 90°> Wave), the faster was osteoblastic differentiation. This resulted in increased levels of gene and protein expression of osteocalcin and sclerostin, indicating the presence of osteocytes inside the tissue layed by cells. Moreover, in the tightest geometry (i.e. 45°), mineralized fibrous structures, oriented parallel to the bottom substrate were observed. This orientation was confirmed at the cellular level, with a similar orientation of stress fibers and a stretch of cell nuclei. Thus, the substrate macroarchitecture influences the cellular behavior by, most likely, modifying the intracellular signaling. These investigations were pursued with the development of a 3D model of osteogenesis under perfusion, in the BOSE 5270 ElectroForce® BioDynamic® bioreactor of the IVTV Equipex platform, to explore cell-substrate interactions in response to mechanical stress (shear forces). Tissue deposition was particularly abundant in the triangular pores with 45° angles, confirming our previous observations and suggesting that this geometry was able to promote osteoblast differentiation.Our results could lead to breakthroughs in the understanding of the bone biology but also in the design of innovative implants for the repair of bone defects, with a stimulated osseointegration throught the presence of structures with closed geometries, such as triangular grooves with 45° angles.