La technique de spectroscopie basée sur la diffusion Raman Stokes spontanée est un procédé standard employé dans de nombreux domaines allant de la thermodynamique à la médecine, en passant par la science des matériaux. À la faveur d'un échange d'énergie inélastique, elle permet de déterminer les fréquences des vibrations moléculaires présentes dans un objet. On peut ainsi remonter à l'identification des molécules et ainsi caractériser l'objet d'étude sans utiliser de marqueur spécifique. Cette méthode est néanmoins affligée de défauts. Outre la présence d'un signal de fluorescence qui peut submerger la réponse Raman, le désavantage majeur est le long temps d'exposition que requière cette technique. Dans le cas d'étude d'échantillon biologique, cela proscris son usage pour des mesures de microspectroscopie : la cartographie spectrale d'objet microscopique. Afin de pallier ce problème, de nouvelles techniques ont été développées. C'est le cas de la spectroscopie employant la diffusion Raman anti-Stokes Cohérente (ou CARS pour Coherent Anti-Stokes Raman Scattering). Du fait de sa cohérence et de sa directivité le signal anti-Stokes affiche une intensité 10^5 to 10^6 fois plus importante que dans le cas de la diffusion Raman spontanée, ce qui permet alors d'abaisser le temps d'exposition à un niveau tolérable pour les objets biologiques lors d'une mesure de microspectroscopie. De plus, le caractère anti-Stokes du signal l'épargne de la contribution de la fluorescence. Pourtant, un défaut majeur limite encore l'utilisation de cette technique : le bruit de fond non résonant. Ce phénomène peut diminuer, voir noyer la contribution résonante qui porte l'information. Cette thèse a permis le développement de techniques CARS autorisant une réduction du bruit de fond non résonant. Pour ce faire un dispositif de spectroscopie CARS multiplex (M-CARS) en configuration copropagative a été construit. Ses capacités sont illustrées par des mesures spectrales d'échantillons minéral, végétal et biologique. À partir de ce système, il a été établi une méthode innovante permettant de discriminer le signal résonant du bruit non résonant en utilisant un champ électrique continu. Il est aussi démontré la mise en place d'un procédé qui a permis de mener la première mesure de microspectroscopie M-CARS en configuration contrapropagative sur un échantillon biologique. Cette configuration limite la collecte du signal à l'objet d'étude, empêchant ainsi l'acquisition du signal résonant et non résonant issu du solvant, principal responsable du bruit de fond non résonant lors d'une mesure CARS en configuration copropagative. / The spectroscopy technique based on spontanée Raman Stokes scattering is a standard process used in many fields spanning from thermodynamic and medicine, to materials sciences. An inelastic energy exchange permits to determinate the frequency of the molecular vibrations in an object. One can identify the molecules and thus, can characterize the object of study in a label-free way. Nevertheless, this method is afflicted with faults. Beside the presence of fluorecence that can drown the Raman answer, the main drawback is the long exposition time required. In the case of biological sample, this can prohibit the use of spontaneous Raman scattering for microspectroscopy measures: the spectral mapping of microscopic objects. To avoid this problem, new techniques have been developed. It is the case of Coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) spectroscopy. Due to its coherence and its directivity, the anti-Stokes signal has an intensity 105 to 106 times greater than the spontaneous Raman scattering one. The exposition time is then reduced to a tolerable level for biological objects during microspectroscopy measures. Moreover, the anti-Stokes characteristic of the signal prevents the fluorescence contribution. However, a major fault still limits the use of this technique: the nonresonant background. This phenomenon can diminish, even overwhelm the resonant contribution carrying the information. This thesis permitted the development of CARS approaches that allow the reduction of the nonresonant background. To do so, a multiplex CARS (M-CARS) spectroscopy apparatus in a forward configuration has been built. Its abilities are illustrated with spectral measures of mineral, vegetal and biological samples. Based on this system, it has been established an innovative method that can discriminate the resonant signal from the nonresonant one thanks to a static electric field. It has been also been demonstrated the development of a process that has allowed the first M-CARS microspectroscopy measure of a biological sample in a contrapropagative configuration. This setup limits the collect of the signal to the object of study, avoiding the acquisition of the resonant and resonant signals coming from the solvent, responsible for the major part of non resonant background during a CARS measure in a forward configuration.

L’imagerie TEP repose à l’heure actuelle sur des détecteurs à base de cristaux scintillants ou de semi-conducteurs. Le projet CaLIPSO propose de tirer parti à la fois de l’émission de lumière (par effet Cerenkov) et de l’ionisation du milieu de détection, pour réaliser un détecteur de résolution temporelle et spatiale améliorée. Le milieu de détection, le TriMéthylBismuth liquide à température ambiante, de par sa forte teneur en Bismuth, permet une détection par effet photoélectrique efficace. Cette étude a pour objectif de concevoir et d’optimiser le détecteur optique du projet CaLIPSO, afin de prouver le concept de la détection de photons de 511 keV par effet Cerenkov dans le TMBi, et de caractériser les performances d’un tel détecteur en termes de résolution temporelle et efficacité de détection. Un premier démonstrateur a validé le principe de détection reposant sur l’effet Cerenkov, bien que ses performances soient décevantes. C’est la raison pour laquelle nous avons entrepris un effort d’optimisation en simulation Monte Carlo dans Geant4, afin d’améliorer la collection de la lumière Cerenkov dans le détecteur, et donc son efficacité de détection et sa résolution temporelle. Avant, nous avons mesuré les propriétés optiques du TMBi (indice de réfraction, absorption et diffusion de la lumière), afin d’être capables de modéliser la propagation de la lumière Cerenkov dans le détecteur. Nous avons également optimisé par simulation Monte Carlo l’outil permettant la mesure de résolution en temps, un cristal scintillant de YAP:Ce couplé à un PMT. Cela a permis une mesure plus fine de la résolution temporelle du démonstrateur. A l’issue de ces travaux, nous avons construit un second démonstrateur optique. On mesure alors une efficacité de détection de l’ordre de 32% pour une résolution en temps de 660 ps (FWHM). L’efficacité mesurée prouve que le détecteur est pleinement efficace à détecter les conversions photoélectriques du photon de 511 keV (27% des photons incidents). Plusieurs optimisations technologiques sont proposées pour améliorer la résolution temporelle, et espérer à l’avenir une mesure du temps de vol des photons gamma. / PET detectors are usually based on scintillation crystals or semiconductor materials. The CaLIPSO project aims to build a PET detector working on the double detection of Cerenkov light and pair productions in a novel detection material called TriMethylBismuth. This would allow at the same time an enhanced time resolution (thanks to the Cerenkov signal) and a excellent spatial resolution (thanks to the ionization signal). Liquid TMBi (at room temperature), thanks to its good photo fraction (47%), allows a good detection efficiency, principally by photoelectric effect. In this context, this work aims to design and optimize an optical detector as a proof of concept for the Cerenkov detection of 511 keV gamma photons, and to measure the time resolution and detection efficiency of such a detector. The optical signal based on Cerenkov effect in TMBi has been observed on a first demonstrator, but its performances were clearly inappropriate. So we used a Monte Carlo simulation (Geant4) of the detector in order to model the relevant phenomena and to optimize de detection. It appeared that light collection efficiency in the detector was the most important parameter to optimize so as to improve time resolution and detection efficiency. Before that, we measured TMBi optical properties (refractive index, light absorption and diffusion), in order to model accurately the Cerenkov light propagation in the detector. The tool used for the time resolution measurement is a YAP: Ce scintillator coupled to a PMT. We also needed to optimize this tool in order to allow a more accurate measurement of the detector time resolution. At the end of this work, a second version of the optical demonstrator was built. We measured a detection efficiency of 32%, and a time resolution of 660 ps FWHM. The measured efficiency proved that our detector is fully efficient to detect the photoelectric conversions of the 511 keV photons (27% of the incident photons). Several technological optimizations are proposed to further improve the time resolution, in order to be able to measure the gamma photons’ time-of-flight in the future.

L'imagerie optique biomédicale est confrontée aux phénomènes d'absorption et de diffusion de la lumière par les tissus qui atténuent et brouillent le signal au cours de sa propagation. La Tomographie de Cohérence Optique (OCT) filtre les photons balistiques par interférométrie en lumière temporellement incohérente. En particulier, l'approche Plein Champ atteint une résolution de 1 µm, mais sa profondeur de pénétration ne dépasse pas 1 mm. Il est donc impossible d'imager les organes internes in vivo et in situ : il faut pour cela disposer d'un instrument doté d'un endoscope, ce qui n'avait pas été réalisé à ce jour. Nous proposons un système d'OCT Plein Champ avec endoscope flexible qui repose sur le couplage de deux interféromètres, l'un extérieur à la sonde et l'autre situé à l'extrémité de la sonde en contact avec le tissu. Ainsi la sonde est entièrement passive et le signal interférométrique qui la traverse n'est pas perturbé par l'environnement. Sa flexibilité lui permettrait d'imager des organes internes comme le colon. Cependant l'utilisation d'un faisceau de plusieurs milliers de fibres optiques fait apparaître un signal d'interférence parasite dû aux phénomènes de couplage inter-coeurs et inter-modes. Des solutions sont proposées pour s'en affranchir et permettre l'imagerie d'échantillons de tissus. En imagerie par endoscopie rigide deux systèmes sont comparés, avec un ou deux interféromètres, et une sonde composée de lentilles à gradient d'indice. Cette sonde peut imager directement au contact des zones comme la peau, ou en pénétrant l'organe à la manière d'une aiguille, par exemple dans le sein. Elle est assez performante pour être utilisée in vivo sur la peau.

L'imagerie médicale sur petits animaux est d'une grande utilité en recherche préclinique, car elle permet d'imager in vivo et en 3D l'intérieur de l'animal. Ceci sert au développement de nouveaux médicaments et au suivi de l'évolution de certaines pathologies. En effet, les techniques d'imagerie éliminent la nécessité de sacrifier les animaux, ce qui permet le suivi de processus biomoléculaires sur un même individu et l'obtention de données statistiquement plus significatives. Cependant, l'information moléculaire recueillie s'avère généralement de faible résolution spatiale, notamment en imagerie optique à cause de la diffusion de la lumière, et donc difficile à localiser dans le corps de l'animal. Le jumelage de modalités d'imagerie complémentaires permet donc d'obtenir des images anatomiques et moléculaires superposées, mais cela s'avère toutefois relativement coûteux. Le projet présenté vise à améliorer une technique d'imagerie 2D toute optique à faible coût permettant d'obtenir une carte approximative 3D des organes internes d'une souris. Cette technique devrait permettre le recalage spatial automatique d'informations moléculaires obtenues sur le même appareil, bien que cela n'ait pas encore été démontré. L'amélioration apportée par le projet consiste à obtenir des images anatomiques 3D, plutôt que 2D, en utilisant une caméra tournante et des techniques de vision numérique stéréo. Pour ce faire, la technique existante est d'abord reproduite. Celle-ci consiste à injecter de l'ICG , un marqueur fluorescent non spécifique qui demeure confiné au réseau vasculaire une fois injecté, à une souris anesthésiée. De par leurs métabolismes distincts et le temps que met l'ICG à atteindre chacun d'eux, la dynamique de fluorescence varie entre les organes, mais demeure relativement uniforme à l'intérieur d'un même organe. Certains organes peuvent donc être segmentés par des techniques appropriées de traitement de signal, telles l'analyse en composantes principales et la régression par moindres carrés non négative. Un système d'imagerie à caméra rotative comme le QOS® de Quidd permet d'obtenir des images 2D segmentées de l'anatomie. interne de l'animal selon plusieurs plans de vue. Ces plans de vue servent à reconstruire l'information anatomique en 3D par des techniques de vision numérique. La procédure pourrait être répétée avec un ou plusieurs marqueurs fluorescents fonctionnalisés dans le but d'obtenir des images moléculaires 3D du même animal et de les superposer aux images anatomiques 3D. La technique développée devrait ainsi permettre d'obtenir à faible coût et de manière toute optique des images 3D anatomiques et moléculaires recalées spatialement automatiquement.

L’objectif de ma thèse a été de développer de nouvelles sondes utilisables en imagerie biomédicale, basées sur l’utilisation d’aptamères, pour la détection de deux types de tumeurs : les glioblastomes et les mélanomes. Les traceurs développés ont pour objectif de cibler la protéine matricielle hMMP-9. Lors d’une thèse précédente, un aptamère anti hMMP-9 noté F3B a été obtenu. Afin de transformer cet aptamère en une sonde pour l’imagerie biomédicale, différents conjugués F3B ont été préparés: Cy5, DOTA ou MAG3. L’affinité des nouveaux conjugués pour l’hMMP-9 a été évaluée par SPR et sur coupes de tumeurs. Des études de biodistribution des conjugués F3B-DOTA et F3B-MAG3 ont été réalisées sur des souris portant le mélanome, les résultats ont montré que les deux aptamères marqués détectent spécifiquement l’hMMP-9. De plus, la détection de la protéine hMMP-9 par le conjugué F3B-CY5 a été confirmée par imagerie de fluorescence. Afin d’améliorer la sensibilité de détection des tumeurs, deux types de modifications ont été envisagées, développer des structures multimériques de F3B et élaborer d’un système bi-fonctionnel. Pour ces deux approches, nous avons synthétisé un dendrimère à point focal, pouvant donner accès à une imagerie multi-modale. Ce dendrimère porte deux ou trois bras espaceur porteurs d’un groupement azoture utilisé pour le couplage avec les aptamères par la chimie «click». Le dendrimère porte au point focal une fonction amine NH2 utilisée pour fixer une biotine, afin de déterminer l'affinité Kd de cette nouvelle sonde par SPR. Par la suite un ligand DOTA sera fixé afin de pouvoir visualiser ce traceur en TEMP. / The aim of my thesis was to develop new probes that can be used in biomedical imaging, based on the use of aptamers for the detection of two types of tumors: glioblastomas and melanomas. Tracers have been developed with the aim to target the matrix protein hMMP-9. In a thesis, an aptamer anti-hMMP-9 noted F3B was obtained. Based on this compound, different derivatives were prepared for using in biomedical imaging: F3B-Cy5, F3B-DOTA or F3B-MAG3. The affinity of the new conjugates for hMMP-9 was evaluated by SPR and on sections of human melanomas. Biodistribution studies of F3B-DOTA conjugates and F3B-MAG3 were performed at on melanoma bearing mice, the results showed that both radiolabeled aptamers specifically detected the hMMP-9. In addition, optical fluorescence imaging confirmed the binding to hMMP-9 by F3B-CY5. In order to improve tumor detection sensitivity, two types of modifications were investigated: developing of F3B multimeric structures and a bi-functional system. For both these approaches, we synthesized a dendrimer with a focal point, which could give access to a multi-modal imaging. This dendrimer has two or three spacers bearing an azide group used for coupling with aptamers by "click" chemistry. The dendrimer carrying at the focal point an amine function NH2 used for fixing biotin in order to determine the affinity Kd of this new probe by using SPR. A DOTA ligand will be fixed later in order to view this tracer in SPECT.

Les travaux réalisés aux cours de cette thèse ont portés sur la création de nouveaux complexes borates fluorescents. Des voies de synthèse relativement simples et efficaces ont permis d’accéder à deux nouvelles familles de fluorophores : les Boranils et les Boricos. Les Boranils présentent des coefficients d’absorption molaire élevés, des rendements quantiques pouvant atteindre 90% et la capacité à agir comme antenne efficace pour du transfert d’énergie photoinduit. De nombreuses modifications post-synthétiques ont été mises au point permettant l’accès à des fonctions de greffage utile pour des applications dans le domaine des cristaux liquides ou l’imagerie biomédicale. Enfin, l’extension de la conjugaison des Boranils a permis de déplacer les émissions vers le proche infrarouge. Les Boricos présentent des coefficients d’absorption élevés, des rendements quantiques allant jusqu'à 81% et la capacité à agir comme antenne ou accepteur dans des systèmes de transfert d’énergie photoinduit. / This work is dealing with new fluorescent boron complexes. Simple and efficient synthetic pathways have been described to access to two new families of fluorophores: Boranils and Boricos. Boranils present good molar absorption coefficients, high quantum yields up to 90% and the ability to act as efficient antennae for photoinduced energy transfer. Several post-synthetic modifications have been carried out leading to linking functions useful in the liquid crystal and biomedical imaging fields. Then the electronic delocalization has been extended on Boranils resulting in near-infrared emitting dyes. Boricos present good molar absorption coefficients, high quantum yield up to 81%, and the ability to act as an antenna or acceptor in photoinduced energy transfer systems.

L’OCT plein champ est une technique d’imagerie permettant de faire de la microscopie des milieux diffusants à une profondeur donné à l’aide d’un système interférométrique. L’un des principaux objectifs qui ont motivé le développement de l’OCT plein champ ces dernières années a été de pouvoir fournir au chirurgien, durant les opérations des images similaires aux coupes histologiques mais en temps réel. Actuellement, les diagnostiques effectué à partir des images d’OCT plein champs donne de bon résultats, notamment dans le cas de certaine pathologie mammaire. Cependant, la différence majeure entre les coupes histologiques et les images d’OCT plein champs est qu’en OCT plein champ le contraste est uniquement un contraste morphologique et que dans certain cas, ce contraste seul ne suffit pas pour faire le diagnostic. Au cours des travaux de recherche décrits dans cette thèse nous nous sommes attachés à développer de nouvelles approches tomographiques, conduisant à de nouvelles formes de contraste susceptible d’enrichir les images d’OCT plein champ pour une meilleure qualité du diagnostic. Plus précisément, nous avons travaillé sur la détection optique et photo-thermique de nanoparticules d’or par OCT plein champ et la cartographie des propriétés mécaniques par trois méthodes dans le but de développer de nouveaux types de contrastes qui pourront permettre d’améliorer le diagnostic. / Full Field OCT (FF-OCT) is an imaging technic use to do microscopy inside scattering media at a given depth using an interferometric setup. One of the main objectives that motivated the development of FF-OCT was to provide during surgery to the surgeon images similar to histological slices but in real time. Currently, diagnostic made from FF-OCT images gives good results, especially in the case of some breast disease. However, the major difference between the histological and FF-OCT is that FF-OCT has only a morphological contrast and in some cases, this contrast is not enough to make the diagnosis. In the research described in this thesis we are committed to developing new tomographic approaches, leading to new forms of contrast may enhance images of FF- OCT for a better quality of diagnosis. Specifically, we worked on the optical and photothermal detection of gold nanoparticles by FF-OCT and the mechanical properties mapping by three methods in order to develop new types of contrasts that will help improve the diagnosis.

En imagerie numérique, les approches «problèmes inverses» régularisées reconstruisent une information d'intérêt à partir de mesures et d'un modèle de formation d'image. Le problème d'inversion étant mal posé, mal conditionné et le modèle de formation d'image utilisé peu contraint, il est nécessaire d'introduire des a priori afin de restreindre l'ambiguïté de l'inversion. Ceci permet de guider la reconstruction vers une solution satisfaisante. Les travaux de cette thèse ont porté sur le développement d'algorithmes de reconstruction d'hologrammes numériques, basés sur des méthodes d'optimisation en grande dimension (lisse ou non-lisse). Ce cadre général a permis de proposer différentes approches adaptées aux problématiques posées par cette technique d'imagerie non conventionnelle : la super­-résolution, la reconstruction hors du champ du capteur, l'holographie «couleur» et enfin la reconstruction quantitative d'objets de phase (c.a.d. transparents). Dans ce dernier cas, le problème de reconstruction consiste à estimer la transmittance complexe 2D des objets ayant absorbé et/ou déphasé l'onde d'éclairement lors de l'enregistrement de l'hologramme. Les méthodes proposées sont validées à l'aide de simulations numériques puis appliquées sur des données expérimentales issues de l'imagerie sans lentille ou de la microscopie holographique en ligne (imagerie cohérente en transmission, avec un objectif de microscope). Les applications vont de la reconstruction de mires de résolution opaques à la reconstruction d'objets biologiques (bactéries), en passant par la reconstruction de gouttelettes d'éther en évaporation dans le cadre d'une étude de la turbulence en mécanique des fluides. / In Digital Imaging, the regularized inverse problems methods reconstruct particular information from measurements and an image formation model. With an inverse problem that is ill-posed and ill­conditioned, and with the used image formation mode! having few constraints, it is necessary to introduce a priori conditions in order to restrict ambiguity for the inversion. This allows us to guide the reconstruction towards a satisfying solution. The works of the following thesis delve into the development of reconstruction algorithms of digital holograms based on large-scale optimization methods (smooth and non-smooth). This general framework allowed us to propose different approaches adapted to the challenges found with this unconventional imaging technique: the super-resolution, reconstruction outside the sensor's field, the color holography and finally, the quantitative reconstruction of phase abjects (i.e. transparent). For this last case, the reconstruction problem consists of estimating the complex 2D transmittance of abjects having absorbed and/or dephased the light wave during the recording of the hologram. The proposed methods are validated with the help of numerical simulations that are then applied on experimental data taken from the lensless imaging or from the in-line holographie microscopy (coherent imaging in transmission, with a microscope abject glass). The applications range from the reconstruction of opaque resolution sights, to the reconstruction of biological objects (bacteria), passing through the reconstruction of evaporating ether droplets from a perspective of turbulence study in fluid mechanics.

La tomographie de cohérence optique plein champ est une technique de microscopie permettant d’imager un plan d’intérêt en profondeur dans un milieu diffusant. Cette technique a été utilisée pour l’examen de pièces opératoires dans un but de diagnostic en cancérologie. L’utilisation de cette technique permettrait en effet de fournir un outil de diagnostic peropératoire rapide et fiable, évitant ainsi de nombreuses procédures de réopération. Ces réopérations peuvent survenir lorsque – lors du diagnostic final par analyse de coupes histologiques – le pathologiste décèle la présence de tissus cancéreux restant, non retirés au cours de l’opération.L’OCT plein champ a montré de bons résultats pour cette application. Néanmoins, cette technique ne fournit qu’un contraste morphologique des tissus, ne permettant pas d’utiliser des critères de qualification des pièces opératoires basées – par exemple – sur la morphologie ou la densité cellulaire.Nous avons développé une nouvelle modalité d’imagerie basée sur l’OCT plein champ permettant de révéler un contraste métabolique dans le tissu à une échelle subcellulaire. Ce contraste permet de révéler les cellules précédemment non distinguées en OCT plein champ. Nous avons également utilisé la mesure quantitative de cette modalité pour réaliser des outils d’aide au diagnostic utilisant des approches d’apprentissage par ordinateur. / Full filed optical coherence tomography is a microscopy imaging technique allowing to image a specific slice in a scattering medium, in depth. This technique has been used for the diagnosis of biopsy in cancerology. This technique could be an efficient and fast way to diagnose excised tissues during surgery. This would avoid numerous reoperations procedures. These reoperations are necessary when a pathologist suspects cancerous tissue to still be present in the patient, based on histological slide examination.FFOCT has shown promising results for that purpose. Nevertheless, this technique only gives a morphological contrast of tissues, which is not enough for applying some diagnostic criteria such as cell morphology or cell density.We developed a new imaging modality based on FFOCT allowing to reveal metabolic contrast in tissues at the subcellular scale. This contrast reveals cells previously indistinguishable with FFOCT. We also used this quantitative metric to propose tools to facilitate diagnosis, using machine learning approaches.

Les travaux réalisés aux cours de cette thèse ont portés sur la création de nouveaux complexes borates fluorescents. Des voies de synthèse relativement simples et efficaces ont permis d'accéder à deux nouvelles familles de fluorophores : les Boranils et les Boricos. Les Boranils présentent des coefficients d'absorption molaire élevés, des rendements quantiques pouvant atteindre 90% et la capacité à agir comme antenne efficace pour du transfert d'énergie photoinduit. De nombreuses modifications post-synthétiques ont été mises au point permettant l'accès à des fonctions de greffage utile pour des applications dans le domaine des cristaux liquides ou l'imagerie biomédicale. Enfin, l'extension de la conjugaison des Boranils a permis de déplacer les émissions vers le proche infrarouge. Les Boricos présentent des coefficients d'absorption élevés, des rendements quantiques allant jusqu'à 81% et la capacité à agir comme antenne ou accepteur dans des systèmes de transfert d'énergie photoinduit.