O biodiesel, que possui grande potencial para substituição do diesel tradicional na matriz energética, é amplamente estudado pela rota enzimática, cujo biocatalisador pode ser usado de duas formas principais: extra e intracelular. A forma intracelular é considerada mais vantajosa por evitar processos complexos de isolamento, purificação e imobilização, diminuindo o custo efetivo das enzimas. O custo enzimático também pode ser reduzido pela imobilização em suporte adequado. Com base neste contexto, este trabalho teve como objetivo sintetizar e caracterizar espumas de poliuretano utilizando diferentes formulações e verificar a influência das variáveis temperatura, pH, tempo de cultivo e quantidade mássica de suporte no crescimento de biomassa microbiana in situ de Mucor circinelloides URM 4182 nas espumas de poliuretano sintetizadas, visando a aplicação em processo não contínuo e contínuo de produção de biodiesel etílico a partir do óleo de babaçu. Definidas as melhores condições de cultivo, o trabalho teve como foco a otimização dos parâmetros de produção em sistema contínuo e reator de leito fixo: tempo espacial e razão molar óleo:álcool. Na primeira etapa de trabalho, a biomassa imobilizada em pH 5,5 a 35 ºC em 96 h e com 100 cubos de suporte EPU3 foi a que apresentou resultados de conversão mais elevados no sistema não contínuo (98%). Esta condição foi utilizada para definir os parâmetros da produção de biodiesel em reator de leito fixo e regime de fluxo contínuo. Inicialmente utilizou-se um reator com 44 mm de diâmetro e 56 mm de altura. Com este reator o melhor resultado em termos de rendimento foi da ordem de 64 ± 1,66 % obtido com um tempo espacial de 86 h e razão molar óleo:álcool de 1:6 com 120 cubos de biomassa imobilizada. Outras geometrias de suporte foram analisadas, mas o formato cúbico foi o mais estável, mantendo o rendimento durante o período analisado, apresentando uma perda de biomassa de 2% e produtividade de 5,68 ± 0,15 mg éster g-1 meio h-1. Visando aumentar o rendimento e a produtividade do sistema contínuo, utilizou-se uma segunda configuração de reator com 30 mm de diâmetro e 420 mm de altura. Utilizando os parâmetros já definidos e a nova configuração de reator, obteve-se um rendimento médio de 86 ± 3,53 % a partir do primeiro tempo espacial. A reação foi conduzida por um período máximo de 30 dias. O resultado apresentado em termos de produtividade foi de 7,57 ± 0,31 mg éster g-1 meio h-1 e a perda da biomassa de 44,55 ± 2,40 %. Os resultados de rendimento e produtividade apresentados pelo reator de razão diâmetro:altura de 1:14 foram superiores aos do primeiro reator utilizado que possuía essa razão de 1:1,3. Todavia, grande perda de biomassa foi observada. De forma geral, os resultados encontrados foram promissores para a utilização das células íntegras de Mucor circinelloides imobilizadas em espuma de poliuretano EPU3 para produção de biodiesel em reator de leito fixo operando em fluxo contínuo. Alguns ajustes ainda são necessários, como reduzir a vazão de alimentação inicial para estabilização do leito, visando uma menor perda de biomassa para obtenção de resultados ainda mais relevantes. / Biodiesel has a great potential to replace traditional diesel in the energy matrix and has been widely studied by enzymatic route, whose biocatalyst can be used in two main forms: extra and intracellular. The intracellular is considered more advantageous to avoid complex processes of isolation, purification and immobilization, reducing the effective cost of the enzymes which can also be reduced by immobilization of such biocatalysts on suitable matrix. This study aimed the synthesis and characterization of polyurethanes foams with different recipes and to verify the influence of the variables temperature, pH, cultivation time and mass amount of support in the growth in situ of Mucor circinelloides URM 4182 microbial biomass in the synthetized polyurethane foams, for application in noncontinuous and continuous production process of ethyl biodiesel from babassu oil. After the best growing conditions were defined, the focuses of this work changed to the optimization of the parameters of continuous production system in a fixed bed reactor: space time and molar ratio oil: alcohol. In the first stage of the work, the biomass immobilization in 100 cubes of support EPU3 at pH 5.5 and 35 °C in a period of 96h showed the highest conversion results in non-continuous system (98%). This condition was used to define the parameters of biodiesel production in a continuous flow fixed bed reactor. Initially, a 45 mm diameter and 55 mm height reactor was used. The best yield result with this reactor was approximately 64 ± 1.66% with a space-time of 86 h and the molar ratio oil: alcohol of 1:6 with 120 cubes of immobilized biomass. Different geometries of support were also analyzed, but the cuboid was the most stable, maintaining stable during the period analyzed, with a loss of 2% of biomass and productivity of 5.68 ± 0.15 mg ester. g-1 medium. h-1. In order to increase the yield and productivity in the continuous system, we used a second configuration of reactor: 30 mm in diameter and 420 mm height. It was obtained an average yield of 86 ± 3.53% from the first residence time using the parameters defined and the new configuration of the reactor. The reaction was carried for a period of 30 days. The productivity of was 7.57 ± 0.31 mg ester g-1 medium. h-1 and the biomass loss 44.55 ± 2.40%. The yield and productivity results presented with the second reactor, which diameter:height ratio was 1:14 was higher than that used in the first reactor which the diameter:height ratio was 1:1.3. However, great loss of biomass was observed. Overall, the results were promising for the use of whole cells of Mucor circinelloides immobilized in polyurethane foam EPU3 for biodiesel production in fixed bed reactor operating in continuous flow. Some adjustments are still needed, as the reduction the initial flow feed to stabilize the bed, in order to decrease biomass loss.

O glicerol é um dos resíduos mais abundantes na produção do biodiesel e sua disponibilidade está atrelada diretamente à intensidade de produção do biocombustível. Apesar da diversidade de aplicações industriais para o glicerol, a procura de novos usos é estimulada pela crescente disponibilidade e forte diminuição do seu custo. Desta forma, este trabalho procurou contribuir com uma nova alternativa para a aplicação do excesso deste poliálcool, propondo sua esterificação com o ácido caprílico - um antimicrobiano natural. A produção de monocaprilina, dicaprilina e tricaprilina a partir da esterificação do glicerol com ácidos graxos utilizando a lipase imobilizada Lipozyme RM IM sn-1,3 específica teve seu rendimento otimizado por um planejamento experimental do tipo DCCR - Delineamento Composto Central Rotacional. Assim, dois fatores foram considerados no planejamento experimental: temperatura e proporção molar de ácido caprílico. Estas variáveis foram estabelecidas em dois níveis nos seguintes intervalos: a temperatura variou de 30 a 70°C e a proporção molar (ácido caprílico:glicerol) de 2:1 a 6:1, resultando em 11 experimentos. O tempo foi fixado em 6 horas. A porcentagem total de acilgliceróis pode ser obtida tanto por titulação quanto por cromatografia gasosa. O planejamento experimental demonstrou ser eficiente, pois, obteve-se alto rendimento em produtos na maioria dos experimentos, onde se pôde notar que a melhor condição para produção de caprilinas ocorreu quando se combinou baixa temperatura e baixa proporção molar de ácido caprílico no substrato glicerol. As análises quantitativas revelaram que o melhor rendimento resultou em 87,8% de caprilinas. Adicionalmente, a síntese de caprilinas foi estudada em dois tipos de reatores descontínuos: munido ou não de membrana de microfiltração, para avaliar a possibilidade de reuso do biocatalisador. As reações ocorreram na melhor condição experimental do planejamento proposto e em três ciclos de bateladas sucessivas. A membrana de microfiltração aliada à enzima imobilizada demonstrou ser um instrumento importante para diminuir o custo da reação visto que, com seu uso a enzima reteve 82,7% de sua atividade inicial. / Glycerol is one of the most abundant residues in biodiesel production and its availability is directly linked to the intensity of biofuel production. Despite the diversity of industrial applications for glycerol, the demand for new uses is stimulated by increasing the availability and strong decrease of its cost. Thus, this study intended to propose a new alternative for using this polyalcohol, through its esterification with caprylic acid - a natural antimicrobial. The reaction was catalyzed by immobilized lipase (Lipozyme RM IM, sn-1-3 specific®) resulting mono, di and tricaprylin. The reactions were designed by using the statistical method called \"Delineation Central Composite Rotational (DCCR)\". Taking into account the variation of two parameters, i.e., temperature (from 30ºC to 70ºC) and molar ratio caprylic acid/glycerol (from 2:1 to 6:1) the DCCR pointed to the realization of eleven tests. The time was set at 6 hours. The total percentage of acylglycerols were obtained either by titration or by gas chromatography. The experimental design showed to be efficient because a high yield was achieved in most of the experiments, and the best condition for caprylins production occurred when low temperature and low caprylic acid/glycerol molar ratio were combined. Quantitative analysis revealed that the best yield resulted in 87.8% of caprylins. Additionally, caprilyns synthesis was studied by using a batch reactor coupled or not with microfiltration membrane. The reactions were performed under the best experimental condition pointed out by the DCCR and the enzyme reutilized threefold through successive batches. After that the enzyme retained about 83% of its original activity.

Biodiesel consiste de ésteres alquílicos de ácidos graxos produzidos pela transesterificação de triglicerídeos com álcoois de cadeia curta. Tradicionalmente, a reação ocorre na presença de catalisadores químicos, como álcalis ou ácidos. A utilização alternativa de lipases como biocatalisadores na reação de síntese do biodiesel não gera materiais residuais tóxicos, e o glicerol pode ser facilmente recuperado sem um processamento complexo. Neste trabalho estudou-se a síntese de biodiesel através da transesterificação enzimática de óleos vegetais e álcoois de cadeia curta catalisada pela lipase de Thermomyces lanuginosus (TLL). Primeiramente, as condições da reação de transesterificação, entre óleo de soja e etanol catalisada pela TLL em sua forma livre foram otimizadas através de planejamento experimental e da metodologia de superfície de resposta. A seguir, foram estudadas as condições para a reação catalisada pela TLL imobilizada comercial (Lipozyme TL-IM). Na etapa seguinte foram avaliados diferentes óleos vegetais (óleo de soja, óleo de girassol e óleo de arroz) e álcoois (metanol, etanol, propanol e butanol), na reação de transesterificação catalisada por três derivados enzimáticos comerciais de lipases de diferentes fontes (Lipozyme TL-IM, Novozym 435, Lipozyme RMIM), onde se verificou que cada lipase apresentou uma especificidade diferente em relação ao álcool preferente para a reação de transesterificação. Além disso, a reação utilizando diferentes óleos vegetais apresentou resultados semelhantes, mostrando ser este um fator mais dependente do ponto de vista econômico que processual. Também se estudou diferentes tratamentos para melhorar o reuso da lipase imobilizada, onde a lavagem do derivado com n-hexano, após cada ciclo, manteve a atividade da lipase em torno de 90% da atividade inicial após sete ciclos. Prosseguindo, foi estudada a imobilização e estabilização da TLL através da ligação covalente multipontual em suporte glioxil-agarose. Para obter isto se procedeu a aminação química da superfície da enzima, o que permitiu a obtenção de um derivado com alto grau de imobilização e alta estabilidade quanto à inativação por temperatura e solventes orgânicos. A seguir avaliou-se a possibilidade de reativação de derivados submetidos a processos de inativação. Em um primeiro momento os estudos foram realizados com derivados de TLL imobilizada unipontualmente em agarose ativada com brometo de cianogênio, onde foi possível obter a reativação completa do derivado inativado por solventes orgânicos através de incubação em meio aquoso. Verificou-se também que um dos principais pontos que dificultam a reativação de lipases é a recuperação do mecanismo de abertura do lid, que é facilitado com a presença de detergentes. Logo, estudos de reativação com derivados imobilizados por ligação covalente multipontual, mostraram que este tipo de imobilização auxilia no processo de reativação por oferecer mais pontos de referência no momento da reativação. A etapa final deste trabalho foi a aplicação do derivado de TLL imobilizado multipontualmente em suportes glioxil na reação de síntese de biodiesel. Verificou-se que este derivado foi mais ativo que o derivado comercial (Lipozyme TL-IM) na reação de transesterificação entre etanol e óleo de soja, obtendo 100% de conversão nas condições previamente otimizadas com presença de nhexano no meio de reação. Porém, quando se realizou a reação em dois passos, isto é a adição do etanol em duas etapas, foi possível obter 100% de conversão em 10 h de reação em um meio sem solvente. / Biodiesel consists of fatty acids alkyl esters, produced by transesterification of triglycerides with short-chain alcohols. Traditionally, the reaction occurs in the presence of chemical catalysts, such as acid or alkali. The alternative use of lipases as biocatalysts in the reaction of synthesis of biodiesel does not generate toxic waste material, and the glycerol can easily be recovered without complex processing. In this work it was studied the synthesis of biodiesel by transesterification of vegetable oils and short-chain alcohols catalyzed by lipase from Thermomyces lanuginosus (TLL). First, the conditions of transesterification reaction from soybean oil and ethanol catalyzed by TLL in its free form were optimized by experimental design and response surface methodology. Next, we studied the conditions for the reaction catalyzed by commercial immobilized TLL (Lipozyme TL-IM). In the next stage were evaluated some vegetable oils (soybean oil, sunflower oil and rice bran oil) and alcohols (methanol, ethanol, propanol and butanol) in the transesterification reaction catalyzed by three commercial enzyme preparations of lipases from different sources (Lipozyme TL-IM, Novozymes 435, Lipozyme RM-IM), where it was found that each lipase presented a different specificity in relation to preferred alcohol for the reaction of transesterification. In addition, the reaction using different vegetable oils presented similar results, showing that it is more dependent on the economic than technical aspects. It was also studied different treatments to improve the reuse of immobilized lipase, where washing the derivative with n-hexane after each batch, showed the high stability of the system, with activities of 90 % still remaining after seven cycles. Thus, it was studied the immobilization and stabilization of TLL through covalent multipoint immobilization in glyoxyl-agarose support. For this procedure, a chemical amination of the enzyme surface, allowed obtaining a derivative with a high degree of immobilization and high stability for inactivation by temperature and organic solvents. Then, it was evaluated the possibility of reactivation of derivatives previously inactivated. At first, the studies were carried out for TLL mild immobilized in cyanogen bromide activated agarose, where it was able to fully reactivate the derivative inactivated by organic solvents through incubation in aqueous medium. It was also noted that one of the main points that difficult the reactivation of lipases is the recovery of the mechanism for lid opening, which is helped by the presence of detergents. So, studies of reactivation with derivatives immobilized by multipoint covalent attachment showed that this type of immobilization helps the reactivation process by offering more reference points at the moment of reactivation. The final step of this study was the application of the TLL derivative multipointly immobilized on glyoxyl supports in the reaction of synthesis of biodiesel. It was found that this derivative was more active than the commercial derivative (Lipozyme TL-IM) in the transesterification reaction between ethanol and soybean oil, reaching 100% of yield conversion under the previously optimized conditions with the presence of n-hexane in the reaction medium. However, in the two stepwise ethanolysis it was possible to obtain 100% conversion in 10 h of reaction in a solvent-free system.

Lipases (EC 3.1.1.3) são um grupo de enzimas que catalisam a hidrólise e síntese de triacilgliceróis. Estas enzimas apresentam estabilidade em diversos solventes orgânicos, podendo ser aplicadas como biocatalisadores em vários processos anteriormente realizados apenas por catalisadores químicos. Este trabalho teve como objetivo produzir, purificar e imobilizar lipases de Staphylococcus warneri EX17, cepa capaz de utilizar glicerol como fonte de carbono. Inicialmente, as condições de cultivo para produção de lipases foram otimizadas através de duas ferramentas de planejamento experimental: delineamento Placket Burman (P-B) e delineamento composto central rotacional (DCCR). Determinou-se que as melhores condições para produção desta enzima são: temperatura de 36 °C; pH 8,1; 30 g/L de glicerol; 3,0 g/L de óleo de oliva e 2,5 g/L de óleo de soja. Também se verificou ser possível a utilização de glicerol residual, oriundo da síntese enzimática de biodiesel como fonte de carbono. O extrato enzimático mostrou-se estável em três solventes orgânicos testados (metanol, etanol e η-hexano). Ainda visando a otimização das condições de cultivo, foram realizados cultivos submersos em biorreatores a fim de estudar a influência da taxa volumétrica de transferência de oxigênio (kLa) e do controle do pH, na produção da enzima. A maior produção de lipases ocorreu quando aplicado um kLa de 38 h-1 e com o pH controlado em 7,0 ao longo do cultivo, o que permitiu aumentar a produção da enzima em 5 vezes, em relação ao obtido nas condições anteriormente empregadas. A purificação da lipase foi realizada baseando-se no mecanismo de ativação interfacial destas enzimas sobre superfícies hidrofóbicas. Duas resinas foram testadas, octil-Sepharose e butil- Toyopearl. A lipase produzida foi purificada em apenas um passo utilizando esta última resina. Foi estudada a hiperativação da lipase purificada na presença de detergentes, a atividade lipolítica foi aumentada em 2,5 vezes na presença de 0,1% de Triton X-100. A lipase purificada foi imobilizada através de três estratégias: adsorção em suporte hidrofóbico; união covalente unipontual e união covalente multipontual. A influência da imobilização na modulação das propriedades da enzima foi estudada. A lipase apresentou maior estabilidade quando imobilizada multipontualmente. A hidrólise de distintos ésteres quirais pelos diferentes biocatalisadores obtidos também foi estudada. Os ésteres utilizados foram: (±) mandelato de metila, (±)-2-O-butiril-2-fenilacético e (±)-2-hidroxi-4-fenilbutirato de etilo. A especificidade da enzima foi muito dependente do método de imobilização, sendo que a lipase imobilizada unipontualmente foi mais específica para o substrato (±)-2-hidroxi-4-fenilbutirato de etilo, enquanto que para os outros dois substratos foi a lipase adsorvida hidrofobicamente. Este estudo demonstrou que a lipase de S. warneri EX17 pode ser produzida utilizando glicerol residual como fonte de carbono, levando a diminuição do custo na produção da enzima, que apresenta propriedades bastante interessantes para sua aplicação em biocatálise. / Lipases (EC 3.1.1.3) constitute a group of enzymes that catalyze the hydrolysis and synthesis of triacylglycerols. These enzymes show stability in many organic solvents, being able to be used as biocatalysts in some processes that were once carried out only by chemical catalysys. The aim of this research was the production, purification, and immobilization of lipase by Staphylococcus warneri strain EX17 using glycerol as carbon source. Initially, the cultivation conditions for the production of lipases have been optimized through two statistical procedures, Plackett-Burman statistical design (PB) and central composite design (CCD). It was determined that the best conditions for this enzyme production are: temperature, 36 °C; pH, 8.1; glycerol, 30 g/L; olive oil, 3.0 g/L; and soybean oil, 2.5 g/L. It was also studied the use of raw glycerol from enzymatic synthesis of biodiesel as carbon source, and stability studies showed that this lipase from S. warneri EX17 was stable in methanol, ethanol and nhexane. Moreover, experiments were conducted in submerged bioreactors in order to study the influence of oxygen volumetric mass transfer rate (kLa) and the control of pH in the production of the enzyme. The higher lipase production occurred when the microorganism was submitted to a kLa of 38 h-1 and the pH controlled at 7.0 during the cultivation, which improved 5-fold the enzyme production, compared to the results obtained in shaker flasks. The lipase purification was carried out based on mechanisms of interfacial activation of these enzymes on hydrophobic surface. Two supports were tested, octyl-Sepharose and butyl-Toyopearl. The lipase produced was purified 20-fold in only one step of purification. The purified lipase was immobilized on cyanogens bromide activated agorese and its hyperactivation in the presence of detergents was studied. The lipolytic activity increased 2.5-fold in presence of 0.1% of Triton X-100. After this, lipase was immobilized by three strategies: adsorption on hydrophobic support, mild covalent attachment, and multipoint covalent attachment. The stability over thermal, organic solvent and detergent inactivation was verified, as well as the influence of the immobilization protocol in the modulation of the properties of the enzyme. The lipase showed higher stability when multipointly immobilized on glyoxyl agarose. The hydrolysis of different chiral esters by the three biocatalysts obtained was also studied. The esters used were: (±) methyl mandelate, ((±) methyl mandelate, (±)-2-O-butyryl-2-phenylacetic acid, (±)-2-hydroxy-4-phenyl-butyric acid ethyl ester. The specificity of the enzyme was highly dependent of the protocol of immobilization, and the lipase mildly immobilized on cyanogen bromide agarose was more specific to the hydrolysis of (±)-2-hydroxy-4-phenyl-butyric acid ethyl ester, while for the other two substrates was the lipase adsorbed on octyl agarose. This study demonstrated that the lipase from S. warneri EX17 can be produced using raw glycerol as carbon source, contributing to the reduction in production costs of the enzyme, and the enzyme, when immobilized on different supports, presented quite interesting properties that may be usefull as biocatalysts.

?-glucosidases são enzimas que catalisam a hidrólise de ligações glucosídicas ?-1,4, ?-1,3 e ?-1,6 a partir da extremidade não redutora de oligossacarídeos de cadeias pequenas, alquil e aril ?-D-glucosídeos e dissacarídeos. Além de serem enzimas chave do complexo celulolítico, apresentam funções importantes como o melhoramento de aromas de vinhos e a hidrólise de antocianinas. Malbranchea pulchella usualmente é encontrado em fragmentos vegetais em decomposição ou material rico em celulose, podendo ser considerado promissor à produção de enzimas de interesse biotecnológico. Neste contexto, o objetivo desse projeto foi a caracterização funcional de uma ?-glucosidase de M. pulchella e sua aplicação na hidrólise de resíduos agroindustriais e de antocianinas. Uma BGL da família GH3 foi purificada com um fator de purificação 6,32 e recuperação de aproximadamente 35 %. A sua massa molecular aproximado foi de 100 kDa, e o Km, Vmáx e Kcat foram calculadas em 0,33 mM, 13,67 U/mg, 26,5 s-1 respectivamente. O dicroísmo circular revelou uma estrutura composta por aproximadamente 25% de ?-hélices e 20% de ?-folhas. A BGL apresentou pH e temperatura ótimos igual a 6,0 e 50 °C; e foi estável a 40 °C e apresentou boa estabilidade nos pH 5,0 a 8,0, por 24 horas. Nenhum dos sais de íons metálicos ativou a enzima e apenas o HgCl2 inibiu a atividade em 90%. A enzima não apresentou inibição em presença de glucose (0,1-1M) por até 24 horas. Além disso, a GH3 mostrou-se glicosilada e a proporção de açúcar corresponde a 15% massa da enzima. O efeito da celobiose (C) e do bagaço de cana-de-açúcar in natura (BCAN) na produção das BGLs foram avaliados em um DCCR, que indicou um modelo reduzido com influência das duas variáveis. A melhor condição de cultivo para a produção de BGLs foi 0,6% de C (p/v) e 4% de BCAN (p/v). Por meio de um planejamento de mistura, os resíduos BCAN, a casca de soja moída (CS) e o bagaço de cevada (BCev), foram avaliados quanto ao potencial de hidrólise a partir das enzimas presentes no extrato enzimático, resultando no maior potencial de hidrólise sobre o BCev, com a produção de aproximadamente 2 mg/mL de açúcares redutores em 48 horas. As BGLs presentes no extrato enzimático otimizado foram imobilizadas em suporte MANAE-agarose, Concanavalina A-Sepharose e BrCN-Sepharose. Os derivados BGL-MANAE e BGL-ConA foram ativados aproximadamente 10 e 3 vezes, respectivamente. BGL-MANAE e BGL-ConA foram mais estáveis que o controle BGLBrCN em todos os pH testados em 24 horas e, além disso, BGL-ConA permaneceu com 100% de sua atividade em temperaturas de 40 °C, 50 °C e 60 °C, já o BGL-MANAE mostrou-se estável a 40 °C permanecendo com 83% de sua atividade, ambos em 24 horas. BGL-MANAE e BGL-ConA apresentaram menor efeito inibitório em presença de diferentes concentrações de glucose e etanol quando comparados ao BGL-BrCN, e esses resultados indicaram que a imobilização de alguma forma colaborou para uma maior estabilidade ao pH e à temperatura, bem como ao aumento da tolerância por glucose e etanol. Os derivados puderam ser reutilizados por até 20 vezes e quando avaliados quanto à capacidade de clarificar vinhos e sucos de uva (hidrólise de antocianinas), BGL-MANAE clarificou 52% o vinho, 71% o vinho diluído, 77% o suco de uva e 56% o suco de uva diluído, e BGL-ConA em contrapartida clarificou 41% o vinho, 46% o vinho diluído, 63% o suco de uva e 23% o suco de uva diluído. BGL-MANAE foi mais eficiente que BGL-ConA na clarificação de vinhos e sucos de uva podendo ser considerado um biocatalisador promissor na hidrólise de antocianinas e, consequentemente, para a produção de vinhos brancos e rose a partir de diferentes variedades de uvas. Este trabalho pelo que sabemos, é o primeiro a usar BGLs imobilizadas com aplicação na clarificação de sucos de uva e vinhos, podendo ser considerado um trabalho inovador, e de grande importância para a indústria de alimentos e bebidas. / ?-glucosidases are enzymes that catalyze the hydrolysis of ?-1,4, ?-1,3 and ?-1,6 glucosidic linkages, from the non-reducing end of short chain oligosaccharides, alkyl and aryl ?-D-glucosides and disaccharides. Besides being complex key cellulolytic enzymes, they have important functions such as the improvement of wine flavors and anthocyanins hydrolysis. Malbranchea pulchella is usually found in decaying plant debris or in material rich in cellulose, for this reason it can be considered promising for the production of enzymes of biotechnological interest. In this context, the aim of this project was the functional characterization of a ?-glucosidase from M. pulchella and its application in the organic residues and anthocyanins hydrolysis. A BGL GH3 family produced by M. pulchella was purified with a purification factor and recovery of about 6.32 and 35 times. Its approximate molecular mass was 100 kDa, and Km, Vmax and kcat were 0.33 mM, 13.67 U/mg, 26.5 s-1, respectively. The circular dichroism revealed a structure composed of approximately 25% of ?-helix and 20% of ?-sheets. BGL presented optimum pH and temperature at 6.0 and 50 °C; and it was stable at 40 °C. It also showed good stability at pH 5.0 to 8.0, for 24 hours. None of the metal ions salts activated the enzyme and HgCl2 inhibited the activity by 90%. The enzyme showed no inhibition in the presence of glucose (0,1-1M) for 24 hours. Furthermore, it is glycosylated and the sugar proportion correspondsto 15% of the enzyme mass. The effect of cellobiose (C) and sugarcane bagasse in natura (BCAN) in the production of BGLs were evaluated in a CCRD, which indicated a reduced model of influence of the two variables. The best culture condition for BGLs production was 0.6% of C (w/v) and 4% (w/v) of BCAN. Through a mixture design, using the BCAN, ground soybean hulls (CS) and barley bagasse (BCev) were used to evaluate the potential of hydrolysis of these residues in the presence of enzymes present in the enzymatic extract, resulting in a greater efficiency of (BCev) hydrolysis, producing approximately 2 mg/mL of reducing sugars in 48 hours. The BGLs present in the optimized enzyme extract were also used in the immobilization on ionic support MANAE-agarose and affinity support Concanavalin A-Sepharose (ConA-Sepharose). The BGL-MANAE and BGL-ConA derivatives were activated approximately 10 and 3 times, respectively. BGL-MANAE and BGL-ConA were more stable than BGL-BrCN control in all pH tested within 24 hours. In addition, BGL-ConA remained 100% of its activity at 40 °C, 50 °C and 60 °C , and BGL-MANAE was stable at 40 °C and remained 83% of its activity, both in 24 hours. BGL-MANAE and BGL-ConA showed lower inhibitory effect in the presence of different glucose and ethanol concentrations when compared to BGL-BrCN and these results indicate that the immobilization, somehow, cooperated to a greater pH and temperature stability, as well as to increased tolerance by glucose and ethanol. The derivatives could be reused up to 20 times and when they were tested for their capacity to clarify wine and grape juice (anthocyanins hydrolysis), BGL-MANAE clarified 52% wine, 71% diluted wine, 77% grape juice and 56% diluted grape juice. On the other hand, BGL-ConA clarified 41% wine, 46% diluted wine, 63% grape juice and 23% diluted grape juice. BGL-MANAE was more efficient than BGL-ConA in clarifying wines and grape juices and it may be considered a promising biocatalyst in the anthocyanins hydrolysis, and consequently in the production of white and rose wines from different varieties of grapes. This work as we know, is the first to use immobilized BGLs applied in the clarification of grape juice and wine, for this reason, it can be considered an innovative work, and of great importance to the food and beverage industry

Fruto-oligossacarídeos (FOS) são fibras prebióticas com poder adoçante considerável, sendo um produto de alto valor para a indústria de alimentos. Açúcar invertido é o produto da hidrólise da sacarose possuindo maior poder adoçante, menor susceptibilidade à cristalização e maior higroscopicidade com relação à sacarose, sendo de grande interesse industrial. Ambos produtos podem ser produzidos por reações enzimáticas, utilizando β-frutosiltransferase e β- frutofuranosidase respectivamente, no entanto processos enzimáticos costumam ser caros devido ao alto custo e baixa estabilidade de enzimas. Esses fatores podem ser contornados com a imobilização da enzima, permitindo a reutilização e por vezes aumentando a estabilidade. No presente trabalho a enzima β-frutosiltransferase proveniente de um extrato comercial de Aspergillus aculeatus (Viscozyme L) foi parcialmente purificada, com resina de troca iônica, imobilizada covalentemente em esferas de quitosana e utilizada na produção de FOS. O processo de purificação aumentou a atividade específica em 6 vezes. A estabilidade do biocatalisador imobilizado foi avaliada em 50 bateladas para produção de FOS, foi observado cerca de 55 % de rendimento em cada batelada, sem perda de atividade detectada após as utilizações. Após esse experimento foi testada a utilização das esferas em reatores contínuos com leito fixo e fluidizado, com rendimentos de 59 % e 54 % respectivamente. A produção de açúcar invertido foi feita utilizando a enzima Maxinvert L (β-frutofuranosidase de Saccharomyces cerevisiae) que foi imobilizada, da mesma forma, em esferas de quitosana e sua utilização foi testada em reatores de leito fixo e fluidizado com rendimentos de 98 % e 94 % respectivamente. Os reatores de leito fixo possuem potencial para estudos envolvendo aplicações industriais tanto para produção de FOS quanto para produção de Açúcar Invertido. / Fructooligosaccharides (FOS) are prebiotic fibre with sweetening power, being a highvalue product for the food industry. Invert sugar is the product of sucrose hydrolysis; it has a higher sweetening power, it is less susceptible to crystallization and has a higher hygroscopicity than regular sugar. Finding many uses in food industry processes. Both products can be obtained by enzymatic reactions using β-fructosyltransferase and β- fructofuranosidase, respectively. However, enzymatic processes are often costly because of high enzymatic cost and lack of operational stability. These drawbacks can be overcome by immobilization of enzyme, enabling reuses and usually increasing its stability. In the present work, β-fructofuranosidase from a commercial preparation from Aspergillus aculeatus (Viscozyme L) was partially purified, covalently immobilized on chitosan spheres and used for FOS production. Partial purification resulted in a 6-fold increase in specific activity. Operational stability of biocatalyst was evaluated along 50 batches, resulting in around 55 % yield on each batch and no loss of activity after batches. The immobilized biocatalyst was also used for FOS production in packed bed and fluidized bed reactors with yields of 59 % and 54 % respectively. Invert sugar production was carried out using Maxinvert L (β- fructofuranosidase from Saccharomyces cerevisiae) immobilized, by the same method, on chitosan spheres. Its application on packed bed and fluidized bed reactors was evaluated resulting in yields of 98 % and 94 % respectively. The packed bed reactors presented potential for further studies aiming industrial applications for FOS and Invert Sugar production.

A ciclodextrina glicosiltransferase (CGTase) é a única enzima capaz de catalisar a reação de ciclização a partir do amido e, assim, formar oligossacarídeos cíclicos conhecidos como ciclodextrinas (CDs). Através desta reação é produzida uma mistura de α-, β- e γ-CD que, respectivamente, contém 6, 7 e 8 resíduos de glicose. As CDs têm atraído enorme atenção devido ao seu grande potencial de aplicação em diversas áreas da indústria. Potencial este proporcionado por sua estrutura cônica, com interior hidrofóbico, capaz de encapsular sólidos, líquidos e gases, conferindo propriedades importantes e protegendo-os. Neste trabalho foi estudada a imobilização de uma CGTase em sílica mesoporosa de forma direcionada às cisteínas presentes em sua superfície, alterando a exposição do sítio ativo. A ligação via cisteínas nativas da proteína aumentou em quatro vezes a eficiência da imobilização, quando comparada a ligação via grupamento amino. Esta, no entanto, apresentou maior atividade enzimática em faixas mais amplas de temperatura e pH, além de maior estabilidade operacional, mantendo 100 % de sua atividade após 200 h de reação contínua a 60 °C e pH 4. Ainda que apresentando menor estabilidade da ligação, o derivado obtido por ligação dissulfeto manteve 40 % da atividade inicial durante 200 h e então, o suporte pôde ser recarregado e reutilizado por igual período. Os suportes desenvolvidos apresentaram estabilidade satisfatória, possibilitando o uso do derivado imobilizado em reator de leito fixo operado de forma contínua. Quando avaliado em relação a produção das três ciclodextrinas principais, o derivado cuja imobilização da enzima ocorreu via grupamento amino, evidenciou a possibilidade de modulação da produção apenas variando as condições de reação. α- e β-CD foram produzidas preferencialmente em pH 8,0 e 2 min (3,44 mg mL-1 e 3,51 mg mL-1, respectivamente), enquanto que pH mais ácido (4,0) e maior tempo de reação (141 min) favoreceram a formação de γ-CD (3,35 mg mL-1), com baixa formação α-CD (0,75 mg mL-1). Por fim, os resultados deste estudo evidenciam a importância da imobilização da CGTase para a estabilização de sua estrutura a fim de aplicá-la em sistemas contínuos de produção de CDs onde é possível modular o perfil dos produtos gerados em função das condições de reação, aumentando assim a produtividade do biocatalisador. / Cyclodextrin glycosyltransferase (CGTase) is the only enzyme capable of catalyzing the cyclization reaction from the starch and thus forming cyclic oligosaccharides known as cyclodextrins (CDs). Through this reaction, is produced a mixture of α-, β- and γ-CD containing, 6, 7 and 8 glucose residues respectively. Cyclodextrins (CD) have been attracting considerable attention because of its great potential for application in various areas of industry. This potential is provided by its conical structure with hydrophobic interior, capable of encapsulating solids, liquids and gases, changing important features and protecting them. In this work, the immobilization of CGTase in mesoporous silica was studied in a way directed to cysteines present on its surface, altering the exposure of the active site. The connection via native cysteine of the protein increased by four times the efficiency of immobilization compared to amino groups connection. The binding of amino groups, however, showed greater enzymatic activity in wider ranges of temperature and pH, and higher operational stability, while maintaining 100 % of its activity after 200 h of continuous reaction at 60 °C and pH 4. Although showing less stable connection, the derivative obtained by disulfide bond retained 40 % of the initial activity for 200 h and then, the support could be reloaded and reused for the same period. Developed supports showed satisfactory stability, enabling the use of the derivative assets in a packed bed reactor and operated continuously. It was demonstrated the possibility of modulating the CDs production just varying the reaction conditions, using the derivative of which the enzyme immobilization occurred via amino group, to evaluate the production of three main cyclodextrins. α- and β-CD were produced preferentially at pH 8.0 and 2 min (3.44 mg mL-1 and 3.51 mg mL-1, respectively), whereas the more acid pH (4.0) and longer reaction (141 min) favored the formation of γ-CD (3.35 mg mL-1 and 0.75 mg mL-1 of α-CD). Finally, the results of this study show the importance of the immobilization of CGTase to the stabilization of its structure in order to apply it in continuous CD production systems, where it is possible to modulate the profile of the products generated as a function of the reaction conditions, thus increasing the productivity of the biocatalyst.

Submitted by Natalie Mendes (nataliermendes@gmail.com) on 2015-07-29T00:33:48Z No. of bitstreams: 1 Disserta??o Mestrado em Biotecnologia-PPGBIOTEC UEFS- Geise Camila.pdf: 2048024 bytes, checksum: e92340d2b71036b615c4cb83414b0373 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-07-29T00:33:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Disserta??o Mestrado em Biotecnologia-PPGBIOTEC UEFS- Geise Camila.pdf: 2048024 bytes, checksum: e92340d2b71036b615c4cb83414b0373 (MD5) Previous issue date: 2014-12-18 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior - CAPES / The exploration of the microorganisms species semiarid region has become a viable alternative for the industry, especially producing yeast inulinases which can be applied in the production of fructo-oligosaccharides and fructose from the hydrolysis of inulin. This work had as its theme the study of the immobilization inulinases enzymes produced by yeasts of the semiarid region of Bahia, with the overall objective of the work is to study the application of inulinases immobilized in the production of concentrated fructose and fructo-oligosaccharides. The strains of yeast Pseudozyma sp. (CCMB 306) and Rhodotorula mucilaginosa (CCMB 604) were obtained from the Culture Collection of Microorganisms of Bahia (CCMB), Universidade Estadual de Feira de Santana (UEFS). Immobilization was performed using as support eggshell, celite, Immobeads?, Sepabeads? and silica, and the results analyzed using the Origin version 8.5.1 program. Immobilization in solid supports inulinase shown to be a viable technique, since the non-inactivated enzyme, showing increased activity in the inulinase CCMB 306 samples immobilized on celite in organic medium. Optimization of fructo-oligosaccharides production was achieved the highest concentration of product in samples with inulin concentration of 25% and time of reaction 16 h. In conclusion, the application of inulinases enzymes produced by micro-organisms of the semiarid in the hydrolysis of inulin is of significant importance for biotechnology development in the region. / A explora??o de esp?cies de micro-organismos da regi?o semi?rida tem se tornado uma alternativa vi?vel para a ind?stria, destacando-se leveduras produtoras de inulinases, que podem ser aplicadas na produ??o de frutose e fruto-oligossacar?deos, a partir da hidr?lise da inulina. O presente trabalho teve como tema o estudo da imobiliza??o de enzimas inulinases produzidas por leveduras do semi?rido baiano, sendo o objetivo geral estudar a aplica??o de inulinases imobilizadas na produ??o de concentrados de frutose e fruto-oligossacar?deos. As linhagens de leveduras Pseudozyma sp. (CCMB 306) e Rhodotorula mucilaginosa (CCMB 604) foram obtidas da Cole??o de Cultura de Micro-organismos da Bahia (CCMB) da Universidade Estadual de Feira de Santana (UEFS). A imobiliza??o foi realizada utilizando-se como suporte casca de ovo, celite, Immobeads?, Sepabeads? e s?lica, sendo os resultados analisados com aux?lio do programa Origin vers?o 8.5.1. A imobiliza??o de inulinase nos suportes s?lidos demonstrou ser uma t?cnica vi?vel, uma vez que n?o inativou a enzima, apresentando a maior atividade nas amostras de inulinase de CCMB 306 imobilizada em celite em meio org?nico. Na otimiza??o da produ??o de fruto-oligossacar?deos obteve-se a maior concentra??o de produto nas amostras com concentra??o de inulina de 25% e tempo de rea??o de 16 h. Em conclus?o, a aplica??o de enzimas inulinases obtidas atrav?s de micro-organismos presentes no semi?rido na hidr?lise da inulina ? de significativa import?ncia para o desenvolvimento biotecnol?gico da regi?o, sendo interessante a otimiza??o dos m?todos de imobiliza??o e sele??o adequada dos suportes a serem utilizados para obten??o de melhores resultados.

Nosso objetivo foi investigar o efeito da suplementação de leucina na via intracelular acionada por miostatina, uma proteína reguladora negativa da massa muscular, em um modelo de atrofia gerada por imobilização em ratos. Nossa hipótese inicial contemplava que a expressão de miostatina se elevaria com a imobilização e que a leucina poderia atenuar esse aumento. Nossos resultados, entretanto, mostraram uma regulação gênica no sentido de suprimir a via da miostatina. A suplementação com leucina, associada à imobilização, também provocou queda da expressão gênica de miostatina. Em ambos os grupos a expressão proteica permaneceu inalterada. Em contrapartida, a folistatina, inibidor endógeno da miostatina, apresentou acentuado aumento de expressão no grupo imobilizado e imobilizado/suplementados com leucina. Nossos resultados mostraram que o efeito protetor da leucina no modelo atrófico utilizado não se dá através da sinalização da miostatina. Os dados também sugerem uma resposta biológica coordenada entre o ligante, miostatina, e seu inibidor endógeno, a folistatina. / Our purpose was to investigate the effect of leucine supplementation upon the intracellular pathway triggered by myostatin, a negative regulator of muscle mass, in an atrophic model driven by immobilization in rats. Our initial hypothesis contemplated that myostatin expression would be elevated under immobilization and that leucine supplementation would be able to attenuate this raise. However our results showed a strong downregulation of myostatin gene expression in atrophy induced by cast. The immobilization associated with leucine supplementation also caused mRNA myostatin downregulation. Protein levels were unchanged. On the other hand, follistatin, a myostatin endogenous inhibitor, was markedly upregulated in both immobilized and immobilized/supplemented groups. Our results revealed that leucine protective effect in this atrophic model is not through myostatin signailing. Furthermore, these data suggest a coordinated biological response between ligand, myostatin, and its endogenous inhibitor, follistatin.

O presente projeto teve como objetivo selecionar lipases comerciais para a interesterificação enzimática da gordura do leite com óleo de soja visando à obtenção de produto enriquecido com ácidos graxos essenciais. Foram testadas lipases de diferentes fontes microbianas (Aspergillus niger, Mucor javanicus, Rhizopus oryzae, Candida rugosa, Penicillium roqueforti e Rhizomucor miehei) imobilizadas em matriz híbrida polissiloxano-álcool polivinílico (POS-PVA) previamente caracterizada quanto às suas propriedades físicoquímicas e morfológicas. Tanto as enzimas livres como imobilizadas, foram inicialmente caracterizadas com relação às suas atividades hidrolítica e de esterificação. Em função da alta complexidade das matérias-primas \"gordura do leite e óleo de soja\", optou-se pela triagem inicial da enzima em um sistema reacional modelo de interesterificação. Como reagentes de partida, foram escolhidos tripalmitina e trioleína, uma vez que os ácidos graxos palmítico e oléico estão presentes em grande quantidade nos triglicerídeos que compõem as matériasprimas de interesse. Assim, as lipases imobilizadas no suporte POS-PVA foram empregadas na catálise de reações de interesterificação no sistema modelo empregando-se hexano como solvente. O valor mais elevado de rendimento de interesterificação (31%) foi obtido com o emprego da lipase de Rhizopus oryzae (L036P), sendo esta enzima selecionada para continuidade do trabalho. Testes adicionais foram efetuados para verificar a influência da concentração de trioleína e tripalmitina no rendimento da reação. Neste caso, o melhor resultado foi alcançado no substrato equimolar de tripalmitina e trioleína (40mM), para o qual observou-se um rendimento de interesterificação de 45%, em 24 h de reação. O sistema imobilizado selecionado foi caracterizado quanto às suas propriedades físico-químicas e de estabilidade, empregando-se técnicas como difratometria de raios-X e espectroscopia no infravermelho. Foi observada boa estabilidade à estocagem, mantendo-se 100% da atividade hidrolítica inicial após 120 dias de armazenamento. Finalmente, foram realizados testes de interesterificação da gordura do leite com óleo de soja sendo que, de maneira geral, a lipase de Rhizopus oryzae imobilizada em POS-PVA promoveu o aumento na concentração dos triglicerídeos C26-C34 e C46-C50, e diminuição dos triglicerídeos C38, C44 e C54, obtendo-se 12% de rendimento de interesterificação. A análise de textura do meio reacional e do produto interesterificado mostrou que a simples mistura física de óleo de soja com a gordura do leite provocou uma diminuição de mais de 50% na consistência desta gordura. Após a reação de interesterificação, o produto obtido apresentou redução de aproximadamente 24 % na consistência em relação à da mistura física das matérias-primas, devido à incorporação dos ácidos graxos insaturados do óleo de soja nos triglicerídeos presentes na gordura do leite, e à formação de mono e diglicerídeos devida à hidrólise parcial das matérias-primas. Assim, os resultados promissores obtidos com o uso da lipase de Rhizopus oryzae (L036) imobilizada em POS-PVA, tanto na reação modelo de interesterificação de tripalmitina com trioleína quanto nas matérias-primas lipídicas, possibilitaram a seleção deste sistema enzimático visando ao seu emprego no bioprocesso de interesse. / The objective of this work was to select a commercial lipase for enzymatic interesterification of milkfat with soybean to obtain a product enriched with essential fatty acids. Lipases from different microbial sources (Aspergillus niger, Mucor javanicus, Rhizopus oryzae, Candida rugosa, Penicillium roqueforti, Rhizomucor miehei) were immobilized on polysiloxane- polyvinyl alcohol hybrid matrix (POS-PVA) previously characterized in relation to its physico-chemical and morphological properties. All lipase preparations in both free and immobilized forms were initially characterized, regarding their hydrolytic and esterification activities. Owing to the high complexity of the raw materials \"milkfat and soybean oi\", the lipase screening assay was carried out using a model interesterification system consisted of tripalmitin and triolein. These triglycerides were chosen as starting materials since palmitic and oleic fatty acids are present at high amount proportions in the raw materials. Thus, immobilized lipase derivatives on POS-PVA were used to catalyze the interesterification of tripalmitin with triolein in the presence of hexane as solvent. The highest interesterification (31%) was obtained using the lipase from Rhizopus oryzae (L036P) and therefore, this enzyme was selected for continuing the work. Additional tests were performed to verify the influence of the molar ratio between triolein and tripalmitin in the reaction yield. The best result was achieved for the substrate containing equimolar amounts of tripalmitin and triolein (40 mM), attaining 45% of interesterification yield at 24 h reaction. The selected immobilized system was characterized in relation to its physico-chemical and stability properties using techniques as X-ray difractometry and IR spectroscopy. High stability was found for the immobilized lipase that maintained full original activity after 120 days storage at 4?C. Finally, interesterification tests of milkfat with soybean oil were carried out, and the use of Rhizopus oryzae lipase immobilized in POS-PVA increased the concentration of the triglycerides C26- C34 and C46-C50, and decreased the concentration of the triglycerides C38, C44 and C54, which corresponded to 12% of interesterification yield. The texture analysis of both reaction medium and interesterified product showed that simple physical blend of soybean oil with milk fat reduced more than 50% the milkfat consistency. After the interesterification reaction, the obtained product showed even lower consistency (24% reduction) in comparison with the physical raw materials blend, due to the incorporation of unsaturated fatty acids from soybean oil in the triglycerides of milkfat, and to the formation of mono and diglycerides resulting from partial hydrolysis of the raw materials. Thus, the promising results obtained using Rhizopus oryzae lipase (L036P) immobilized on POS-PVA, both in the model interesterification reaction of tripalmitin with triolein and in the lipid raw materials, indicated the suitability of the selected immobilized derivative to be applied in the proposed bioprocess.