Desenvolvemos um instrumento capaz de provocar uma lesão muscular aguda por mecanismo de impacto, no músculo gastrocnêmio de ratas, através de um trauma direto e não-invasivo. Após a produção da lesão experimental avaliamos os efeitos do ultra-som terapêutico (UST), adicionado ou não à imobilização gessada, como forma de tratamento imediato à lesão muscular pela análise das propriedades mecânicas deste músculo. Foram utilizadas 68 ratas da raça Wistar, sendo divididas em 7 grupos experimentais da seguinte forma: Grupo 1 – Controle intacto; Grupo 2 – Sem tratamento efetivo, Grupo 3 – Imobilização gessada por 24 horas; Grupo 4 – Imobilização gessada por 72 horas; Grupo 5 – Estimulação com UST sem presença de imobilização; Grupo 6 – Imobilização gessada por 24 horas associada à estimulação com UST; Grupo 7 – Imobilização gessada por 72 horas associada à estimulação com UST tratadas durante 6 dias consecutivos com UST, durante 5 minutos diários. Avaliamos as propriedades mecânicas obtidas através de ensaios mecânicos de tração longitudinal e os resultados foram analisados estatisticamente. O estudo evidenciou que a propriedade de alongamento no limite de proporcionalidade não foi um bom parâmetro de correlação para avaliar a efetividade dos tratamentos empregados junto ao processo de reparação muscular. A utilização isolada do UST como técnica de tratamento apresentou melhores resultados em relação às propriedades mecânicas de carga no limite de proporcionalidade, rigidez, resiliência, carga e alongamento máximo. No entanto, a utilização da imobilização gessada por 72 horas associada ou não a estimulação ultra-sônica foi capaz de proporcionar melhorias somente em relação ao alongamento máximo. Sugere-se ainda, que a utilização da imobilização gessada por períodos de 24 horas associada ou não ao uso do UST não foi capaz de apresentar resultados benéficos para as propriedades mecânicas avaliadas / We developed an instrument capable to provoke a muscular injury acute for impact mechanism, in the muscle gastrocnemius of female rats, through a direct and non-invasive. After the production of experimental injury we evaluate the effects of the therapeutic ultrasound (UST), added or not to the cast immobilization, as form of immediate treatment to the muscular injury, for the analysis of the mechanical properties of this muscle. Sixty eight female Wistar rats were used and being divided in seven experimental groups: Group 1 – Intact Control; Group 2 – Without treatment; Group 3 -Immobilization in spica cast for 24 hours; Group 4 - Immobilization in spica cast for 72 hours; Group 5 – Stimulation with UST without immobilization presence; Group 6 - Immobilization in spica cast for 24 hours associated to the stimulation with UST and Group 7 - Immobilization in spica cast for 72 hours associated to the stimulation with UST, treated during six consecutive days with UST, for five minutes daily. We evaluted properties we carry through assays of logitudinal traction in the universal machine of assays and the gotten results had been analyzed statical test. The study it evidenced that the property of proportional limit strength in the was not a good parameter of correlation to evaluate the effectiveness of the employed treatments together to the process of muscular repairing. The isolated use of the UST as treatment technique presented better resulted in relation to the mechanical load properties in the proportional limits, stiffness, resilience, load and strength maximum. However, the use of the spica cast for periods of 72 hours associated or not ultrasound stimulation was not capable to only provide improvements in relation to the maximum strength. One still suggests, that the use of the spica cast in the immobilization for 24 hours periods associate or not to the use of the UST was not capable to present resulted beneficial for the evaluated mechanical properties

Este trabalho descreve o desenvolvimento de um sistema microfluídico, contendo, como componente principal, um reator enzimático constituído de um microcanal fabricado em substrato de poli(metacrilato de metila) e um sistema amperométrico como detector. Para a construção de microcanais foi utilizando equipamento de usinagem a laser de CO2 para escavar os microcanais, que a seguir foram selados termicamente. A superfície interna desse microcanal foi submetida à modificação química com poli(etilenoimina), que se mostrou eficiente para posterior imobilização da enzima glicose oxidase, utilizando glutaraldeído como agente de ligação covalente cruzada, gerando assim um microrreator para determinação amperométrica de glicose. O peróxido de hidrogênio gerado na reação enzimática foi detectado em uma célula eletroquímica em fluxo, localizada externamente ao reator, com eletrodo de platina como eletrodo de trabalho. Uma bomba peristáltica programável foi empregada para promover a injeção de amostra, utilizando tubulação de pequeno diâmetro (0,3 mm), permitindo alcançar reprodutibilidade para a injeção de pequenos volumes, tipicamente da ordem de 5 microlitros de solução. O sistema proposto foi utilizado para a determinação amperométrica diferencial de glicose presente em amostras de refrigerantes, apresentando boa repetibilidade (DPR = 1,72%, n = 50), limite de detecção apreciável (1,40 x10-6 mol L-1), elevada frequência de amostragem (345 amostras h-1) e relativa estabilidade a longo prazo (420 determinações em mais de 20 dias com perda de atividade menor que 50%). As análises realizadas com o sistema proposto neste estudo levaram a resultados concordantes com os obtidos pelo método espectrofotométrico clássico, utilizado para análise de glicose em fluídos biológicos. / This work describes the development of a microfluidic system having as a main component an enzymatic reactor constituted by a microchannel assembled in poly(methyl methacrylate) substrate, connected to an amperometric detector. To manufacture the microchannels, a CO2 laser ablation machine was utilized to engrave the channels, which in sequence were thermally sealed. The internal surfaces of the microchannels were chemically modified with poly(ethyleneimine) which showed good effectiveness for the immobilization of glucose oxidase enzymes using glutaraldehyde as crosslinking agent, producing in this way a microreactor effective for the amperometric detection of glucose. The hydrogen peroxide generated in the enzymatic reaction was detected in the electrochemical flow cell, localized outside of the reactor, using platinum as the working electrode. A programmable peristaltic pump was utilized to inject the samples, utilizing tubes with small diameter (0.3 mm), allowing attain reproducibility even for injections of small volumes, in the order of 5 microliters of solution. The proposed system was applied for differential amperometric determination of glucose content in soft drinks, showing good repeatability (DPR = 1.72%, n = 50) low detection limit (1,40 x10-6 mol L-1), high sample frequency (345 samples h-1) and relatively good stability for long term (420 determinations along more than 20 days, with a decrease of activity lower than 50%). The analysis performed with the system proposed in this study lead to results which agree with those obtained by the classical spectrophotometric method, utilized to analyze glucose in biological fluids.

No tecido muscular esquelético, a interface entre o sarcolema e a matriz extracelular é constituída por proteínas especializadas responsáveis pela transmissão de força transversal e longitudinal à miofibra. As adaptações do músculo esquelético às forças fisiológicas e patológicas, como a imobilização segmentar e exercícios de reabilitação, podem contribuir para a percepção celular dos sinais mecânicos e, consequentemente, induzir modificações na flexibilidade e na força muscular. Este estudo investigou as respostas teciduais do músculo sóleo de ratas submetido ao estresse longitudinal induzido pela associação do treinamento do tipo alongamento passivo com a livre movimentação pós-imobilização dos membros posteriores direitos. O membro posterior direito das ratas foi imobilizado por 10 dias em flexão plantar, a fim de manter o músculo sóleo em posição de encurtamento. Após a imobilização, os animais passaram por um período de alongamento passivo manual intermitente. Antes da imobilização e durante o período de alongamento e de livre movimentação, foi realizada análise funcional da marcha dos animais. Noventa e seis ratas Wistar adultas foram divididas em 8 grupos: Imobilizado (I); Imobilizado e alongado por 1 dia (IAL(1)); Imobilizado e alongado por 3 dias (IAL(3)); Imobilizado e alongado por 10 dias (IAL(10)); Imobilizado e livre por 1 dia (IL(1)); Imobilizado e livre por 3 dias (IL(3)); Imobilizado e livre por 10 dias (IL(10)); Controle do Imobilizado (C(Imob)). Após os procedimentos experimentais, o músculo sóleo foi removido e congelado, para o processamento de reação de coloração Hematoxilina-Eosina; imunoistoquímica para fibronectina, colágenos tipos I e III; imunofluorescência de laminina, distrofina e macrófagos; western blot de laminina e distrofina. Análises qualitativa e quantitativa em Microscópio de Luz e sistema de análise de imagens foram realizadas. As variáveis foram avaliadas inter- e intra-grupos pelo Modelo de Regressão Linear com Efeitos Mistos. Após a imobilização, os animais apresentaram perda de peso corporal e alterações no tamanho e formato das fibras. Ainda, a hipocinesia modificou as variáveis funcionais da marcha, reduziu a amplitude de movimento (ADM) de dorsiflexão, aumentou a relação fibras com fibronectina intracelular/número total de fibras (rFFI/NTF), a expressão de distrofina, de laminina e dos colágenos tipos I e III. Após três dias de remobilização, as alterações morfológicas estavam exacerbadas: intensa celularidade, núcleos centralizados, corpos de inclusão, necrose. Estes achados foram mais intensos no IAL(3). Os grupos IAL(3) e IL(3) também apresentaram comprometimento funcional, restrição de ADM, aumento da rFFI/NTF e da expressão do colágeno tipo III. Outros achados observados nestes grupos foram aumento da quantidade de macrófagos no tecido e de distrofina. As anormalidades relativas aos parâmetros da marcha e as alterações morfológicas geradas pela imobilização mostraram melhora no grupo IAL(10). A remobilização associada ao alongamento durante dez dias mostrou significativa efetividade na reversão das anormalidades musculoesqueléticas induzidas pelo desuso, especialmente nas variáveis funcionais. / The interface between sarcolemma and extracellular matrix in skeletal muscle tissue is constituted by specialized proteins that are responsible for the transversal and longitudinal forces transmission to the myofiber. Skeletal muscle adaptations to physiological and pathological forces, such as segmental immobilization and rehabilitation exercises, may contribute to cellular perception of mechanical signals and consequently induce alterations related to flexibility and muscular force. This study investigated the tissue responses of the soleus muscle in female rats caused by longitudinal stress induced by the association of passive stretching training with the free movement after immobilization of the right hind limb. The right hind limbs of female rats were immobilized during 10 days in a plantar flexion in order to keep the soleus muscle in a shortened position. After the immobilization, the animals were submitted to intermittent passive manual stretching. The animals gait was functionally analyzed before immobilization and during the period of stretching or free movement. Ninety-six adult female Wistar rats were divided into 8 groups: Immobilized (I); Immobilized and stretched for 1 day (IS(1)); Immobilized and stretched for 3 days (IS(3)); Immobilized and stretched for 10 days (IS(10)); Immobilized and free for 1 day (IF(1)); Immobilized and free for 3 days (IF(3)); Immobilized and free for 10 days (IF(10)); Immobilized control (C(Immob)). After the experimental period, the soleus muscle was removed, frozen and further processed by Hematoxylin-eosin stain; immunohistochemistry reactions for fibronectin, types I and III collagen; imunofluorescence of laminin, dystrophin and macrophages; western blot of dystrophin and laminin. Qualitative and quantitative results were obtained using a Light Microscope and a system of image analysis. The between- and within-group data were analyzed using Mixed-Effects Linear Models. After the immobilization, the animals presented loss of body weight and alterations in size and shape of the fibers. Furthermore, the hypokinesia changed the functional variables of gait, reduced the dorsiflexion range of motion (ROM), increased the intracellular fibronectin/total number of fibers ratio (FIF/TNFr), the expression of dystrophin, of laminin and of the types I and III collagen. After three days of remobilization, the morphological changes were exacerbated: intense cellularity, nuclear centralization, inclusion bodies and necrosis. These findings showed increased in the IS(3). The groups IS(3) and IF(3) also showed functional impairment, ROM restriction, increased FIF/TNFr and immunoreactivity of the type III collagen. Others findings observed in these groups were increase of the amount of macrophages in the tissue and of dystrophin. The abnormalities related to gait parameters and the morphological changes induced by immobilization were improved in the IS(10) group. The remobilization using stretching for ten days showed significant effectiveness and reverted the skeletal muscle abnormalities induced by disuse, especially concerning the functional variables.

Avaliou-se a tipificação das fibras musculares e determinou-se parâmetros morfoquantitativos dos efeitos da imobilização por 2 e 4 semanas. Após o período experimental, os músculos (mm.) foram corados por HE e Picro-sírius. Para a tipificação das fibras, utilizou-se as reações da ATPase e NADH-tr; a análise ultraestrutural procedeu-se com microscopia eletrônica de transmissão. Nos resultados, alguns mm. imobilizados (Im) exibiram núcleos centralizados e fibras tipo IIB com formas elusivas. O perimísio destes mm. se espessou, sendo constituído por fibras colágenas tipo III. Os fusos musculares apresentaram espessamento da cápsula. Houve alterações nas linhas Z e modificação de outras ultraestruturas como as mitocôndrias. A área de secção transversa dos mm. Im por 4 semanas foi menor. As fibras do tipo IIB reduziram a área de perfil e aumentaram a densidade, além disso, se ampliou a porcentagem das fibras do tipo IIA. Portanto, a imobilização promoveu alterações nos fusos e esqueleto fibroso muscular, assim como transformou fibras do tipo IIB em IIA. / The effects of muscle immobilization for 2 and 4 weeks were studied by determining morphoquantitative parameters and muscle fiber-typing. After the trial period the muscles (mm.) were subject to HE and Picrosirius stain. The reactions of ATPase and NADH-tr were used for muscles fiber-typing. The ultrastructural analyses were made by transmission electron microscopy. The results showed changes in some of immobilized (Im) mm., it exhibited centralized nuclei cells and type IIB fibers took indefinite forms. The perimisium of Im mm. thicker up, and consisted of type III collagen fibers. Also the muscle spindles capsule thickened. Changes in the Z lines and other ultrastructures such as mitochondria were noticed. The cross-section area of Im mm. for 4 weeks was lower. The type IIB fibers reduced the profile area and density increased. Also the percentage of type IIA fibers expanded. Therefore the immobilization promoted changes in muscle spindles, fibrous skeleton morphology and provide an interconversion of muscle fibers type IIB into IIA.

O tetracloroeteno (PCE), um dos principais contaminantes de águas subterrâneas, é uma molécula recalcitrante, com toxicidade elevada. Processos de biorremediação de água ou solo contaminados com PCE são normalmente limitados pela baixa eficiência de microrganismos sabidamente envolvidos em sua degradação. No entanto, a prospecção de novos microrganismos, mais eficientes na degradação do PCE é uma alternativa para otimizar esses processos. Os objetivos deste estudo foram desenvolver uma técnica de biorremediação utilizando um reator horizontal de leito fixo (RHLF) contendo consórcios de microrganismos eficientes na degradação do PCE, e caracterizar a via de degradação do PCE utilizada pelo consórcio selecionado. Para tanto, amostras de sedimento de dois poços de monitoramento de água foram coletadas de uma metalúrgica com histórico de contaminação com PCE. Os sedimentos foram imobilizados, acondicionados em RHLFs específicos e submetidos a cultivo de enriquecimento em meio mínimo suplementado com PCE. A estrutura das comunidades e a diversidade bacteriana dos RHLFs foram avaliadas e comparadas com as amostras do PM1 e PM2, por PCR-DGGE e sequenciamento de bibliotecas de clones do gene rRNA 16S. Os resultados evidenciaram a seleção de populações bacterianas no RHLF contendo o inóculo do PM1 (In1) após o cultivo de enriquecimento, enquanto no RHLF contendo o inóculo do PM2 (In2), a estrutura da comunidade bacteriana não diferiu daquela observada no PM2. Ensaios de degradação do PCE nos RHLFs, usando cromatografia gasosa associada à espectrometria de massas (CG/EM), mostraram, após 12 horas, uma eficiência de 87 % na degradação do PCE no reator com In1 e 96 % no reator com In2. Foi feito o isolamento e identificação, por sequenciamento do gene rRNA 16S, das bactérias dos RHLFs, sendo identificados 4 isolados do In1, similares a Burkholderia sp., Pseudomonas stutzeri, P. oryzihabitans e Stenotrophomonas maltophilia e 7 isolados do In2, similares a Microbacterium trichotecenenolyticum, S. maltophilia, Klebsiella sp., Exiguobacterium acetylicum, P. oryzihabitans, Acinetobacter junii e Comamonas sp. Compostos orgânicos voláteis nos reatores com In1 e In2 foram analisados por CG/EM, identificando a produção de clorofórmio (TCM) e 1,1,1-tricloroetano (TCA) como produtos da degradação do PCE. Consórcios formados por bactérias isoladas dos reatores In1 (IIn1) e In2 (IIn2) foram imobilizados e acondicionados em RHLFs distintos para avaliar o potencial dos mesmos na degradação do PCE. Após 12 horas, 92 % do PCE foi degradado nos reatores com IIn1 e IIn2, com produção de TCM e TCA. Testes de degradação usando células em suspensão foram conduzidos para avaliar a eficiência de cada isolado na degradação do PCE. O isolado I8 do In2 (I8In2), identificado como Comamonas sp., teve 68 % de eficiência na degradação do PCE. Ensaios com inibidor de monoxigenases do citocromo P-450 (1-aminobenzotriazole) mostraram que a degradação do PCE nos RHLFs, contendo IIn1, IIn2 e I8In2, foram dependentes dessa enzima. Como conclusão, nós identificamos uma nova via de degradação do PCE altamente eficiente, aeróbia e mediada por monoxigenases e isolamos cepas bacterianas que podem ser usadas como consórcios imobilizados nos RHLFs como uma alternativa eficiente na remediação de áreas contaminadas com PCE. / Tetrachloroethene (PCE), one of the main contaminants of groundwater, is a recalcitrant molecule with high toxicity. Bioremediation processes of water or soil contaminated with PCE are usually limited by the low efficiency of microorganisms known to be involved in its degradation. However, the exploration of new and more efficient microorganisms in the degradation of PCE is an alternative to optimize these processes. The objectives of these studies were to develop a bioremediation technique using horizontal fixed bed reactor (HFBR) containing microbial consortia effective in the PCE degradation, and to characterize the PCE degradation pathway used by the selected consortium. For that, sediment samples of two groundwater monitoring wells were collected from a metallurgical plant with historical of PCE contamination. The sediments were immobilized, packed in specific HFBRs and subjected to enrichment in minimal medium supplemented with PCE. The bacterial community structure and diversity in the HFBRs were evaluated and compared to samples from the MW1 and MW2, by PCR-DGGE and sequencing of 16S rRNA gene clone libraries. The results revealed the selection of bacterial populations in the HFBR containing inoculum from MW1 (In1) after enrichment, while in the HFBRs containing inoculum from MW2 (In2), the bacterial community structure did not differ from that observed in MW2. Tests of PCE degradation in HFBRs using gas chromatography-mass spectrometry (GC/MS) showed, after 12 hours, an efficiency of 87 % in the PCE degradation in the In1 reactor and 96 % in the In2 reactor. Bacteria from HFBR were isolated and identified by sequencing of 16S rRNA gene, and 4 isolates from In1, similar to Burkholderia sp., Pseudomonas stutzeri, P. oryzihabitans and Stenotrophomonas maltophilia, and 7 isolates from In2, similar to Microbacterium trichotecenenolyticum, S. maltophilia, Klebsiella sp., Exiguobacterium acetylicum, P. oryzihabitans, Acinetobacter junii and Comamonas sp. were identified. Volatile organic compounds in the reactors with In1 and In2 were analyzed by GC/MS, showing the production of chloroform (TCM) and 1,1,1-trichloroethane (TCA) as PCE degradation products. Consortia composed of bacteria isolated from the In1 (IIn1) and In2 (IIn2) reactors were immobilized and packed in distinct HFBRs to evaluate the potential of specific consortia in PCE degradation. After 12 hours, 92 % of PCE was degraded in reactors with IIn1 and IIn2, with the production of TCM and TCA. Degradation tests using cells suspension were conducted to evaluate the efficiency of each isolate in PCE degradation. Isolate I8 from In2 (I8In2), identified as Comamonas sp., showed 68 % efficiency in the PCE degradation. Assays using inhibitor of monooxygenases cytochrome P-450 (1-aminobenzotriazole) showed that the PCE degradation in HFBRs containing IIn1, IIn2 and I8In2 were dependent of this enzyme. In conclusion, we have identified a new highly efficient PCE degradation pathway, aerobic and mediated by monooxygenases, and isolated bacterial strains that may be used as consortia which immobilized in HFBRs as an efficient alternative in the remediation of PCE contaminated areas.

A imobilização de membros e/ou articulações é prática utilizada na clínica no tratamento de diversas patologias, podendo variar em sua extensão e duração. Acometimentos ortopédicos comuns, como fraturas e lesões músculo-tendíneas, podem exigir como tratamento de dias a semanas de imobilização do segmento afetado. Além dos efeitos clínicos almejados, a imobilização desencadeia alterações negativas que afetam localmente o sistema musculoesquelético, mas que também trazem consequências para o sistema nervoso central (SNC) e sistema nervoso periférico. Tais consequências negativas implicam em perdas funcionais, que podem levar à dependência parcial ou completa para a realização de atividades da vida diária, como a higiene, a alimentação e a locomoção, com enormes custos individuais, familiares e sociais. É necessário, portanto, esclarecer a natureza de tais efeitos negativos e, em especial identificar o quão cedo se apresentam as alterações comportamentais e fisiológicas decorrentes do imobilismo, assim como quantificá-las e determinar a efetividade de estratégias de interferência neste processo. Neste trabalho, investigamos os efeitos de 24 horas de imobilização sobre diferentes tarefas motoras, como apertar botões, realizar a oposição do polegar em sequências variadas e fazer o alcance de alvos com o membro superior. Investigamos também, para a tarefa de oposição do polegar, o potencial terapêutico do treino motor imaginário durante o período de imobilização. Em nossos resultados, não encontramos efeitos estatísticamente significativos da imobilização sobre o comportamento motor nas tarefas pesquisadas. Adicionalmente, o treino motor imaginário na tarefa de oposição do polegar levou a uma piora no desempenho na tarefa de alcance. Esses resultados são relevantes no sentido de ressaltar que a imobilização, um recurso terapêutico importante, apresenta efeitos colaterais, mas esses não se instalam tão rapidamente quanto inicialmente hipotetizamos. É provável, ainda, que a imobilização atue de forma distinta sobre diferentes habilidades motoras, sendo umas prejudicadas com maior intensidade e precocidade do que outras. Entre as habilidades motoras afetadas pela imobilização, pode ser que encontremos, inclusive, a habilidade de imaginar cinestesicamente movimentos. O presente estudo investigou um tipo específico de treino motor imaginário, em voluntários saudáveis, submetidos a um período extremamente curto de imobilização. Possivelmente, os resultados de outros tipos de treino (variando, por exemplo, a intensidade do treino, a forma de admnistração e até mesmo a tarefa) podem ser diferentes. As sutilezas envolvidas na execução do treino motor imaginário provavelmente são a raiz da variabilidade nos resultados obtidos nos diversos experimentos da literatura. Os usos do treino motor imaginário devem, portanto, continuar a ser submetidos à experimentação, para que sua prescrição seja criteriosa e beneficie satisfatoriamente a função motora após a imobilização / The immobilization of body segments is frequently used for the treatment of orthopaedic injuries, such as fractures and soft tissue lesions. Immobilization may be as long as days or weeks, leading to several undesired side effects. The negative effects due to immobilization are felt not only in the immobilized limb, but also in the central nervous system. They lead to several functional impairments, compromising the independency of the patients in fulfilling their daily activities. Therefore, its necessary to determine the nature of such negative effects, and, specially, determine how early the functional and physiological impairments present themselves, as much as to quantify them and stabilish strategies for interference on them. In the present work, we investigated the effects of a 24-hour period of immobilization of the upper limb over several motor tasks, such as pressing buttons, oppose the thumb to the other fingers in several sequences and reaching targets. We also addressed the issue of the potential benefits of delivering a motor imagery training session, specific to the thumb opposition, during the immobilization period. Our results showed no significant effect of immobilization over the motor behavior in the evaluated tasks. Aditionally, the motor imagery training in opposing the thumb lead to an impairment on the reaching task. These results are relevant to reassure that immobilization is a safe therapeutic tool, for its side effects do not present themselves as early as hypothesized by us. Its possible, yet, that immobilization has distinct effects over different motor habilities and, in doing so, that some of the motor skills are more affected than others. It is possible that, between the motor skills affected by immobilization, we found the motor imagery hability. The present study investigated specific schedule of motor imagery training, in healthy volunteers, submited to a very short immobilization period. Its possible that other training schedules (varying the intensity, the way of administering it e even the task) might have other results then ours. The subtleties involved in motor imagery training may be the cause for the great amount of variance found in literature about it. The uses of motor imagery should be submitted to experimentation. In this way, it might be prescribed with criteria and benefit the restoration of motor function

A manipulação de materiais em escala nanométrica representa uma das fronteiras em nanociência e nanotecnologia, devido à possibilidade de controle de propriedades específicas do material. No caso de materiais biológicos, em particular, a manipulação e imobilização na forma de filmes ou camadas ultrafinas é crucial para seu emprego em dispositivos biotecnológicos. Neste trabalho, objetivou-se o estudo de detecção de diferentes hormônios tireoidianos (HTs) e análogos a partir da imobilização da região LBD do receptor de hormônio tireoidiano humano TRTRβ1 em um eletrodo interdigitado, para o desenvolvimento de um biossensor capacitivo. Este sistema consiste em um arranjo estrutural na forma de filme fino capaz de distinguir a interação específica receptor-ligante de outras interações possivelmente interferentes, visando a quantificação dos níveis de HTs. Para isto, a técnica de SAMs (Self-Assembled Monolayers) foi empregada, por permitir um alto controle da espessura e ordenamento molecular dos filmes, assim como a preservação das atividades das biomoléculas. Análises espectroscópicas e morfológicas foram realizadas para o estudo de adsorção das biomoléculas no filme. As interações específicas receptor-ligante foram avaliadas por meio de respostas elétricas (impedância) do biossensor contendo o TRβ1-LBD imobilizado em um filme orgânico ultrafino, e também por SPR (Surface Plasmon Resonance). Os resultados mostraram a capacidade dos eletrodos contendo TRTRβ1-LBD de detectar e diferenciar entre diferentes HTs em concentrações da ordem de nanomolar, compatível com níveis fisiológicos, evidenciando o grande potencial de aplicação para este sistema no diagnóstico e tratamento de disfunções tireoidianas. / Manipulation of materials at the nanoscale represents one of the frontiers in nanoscience and nanotechnology, mainly due to the possibility of specific controlling, improved properties, not observed if conventional bulk processing is applied. For biomolecules, in particular, processing via immobilization in the form of nanostructured films has allowed their use in biotechnological applications and devices. In this master dissertation, we aimed at investigating the immobilization of the LBD domain of human thyroid hormone receptor TRTRβ1 on interdigitated electrodes, to be used as capacitive biosensors for thyroid hormones (THs) and analogues detection. The nuclear receptors were immobilized via SAMs (Self-Assembled Monolayers), since this technique allows a high control of molecular order and thickness of the films, as well as the preservation of biological activities. Spectroscopic and morphological analyses were performed to investigate the adsorption of biomolecules on the nanostructured film. The interactions between receptor - ligand were also evaluated by means of electrical response (impedance) and SPR (Surface Plasmon Resonance). The bioelectrodes containing immobilized TRTRβ1 were capable of detecting and distinguishing among different HTs, including T3, T4, TRIAC and GC-1 at concentrations down to nanomolar, compatible with physiological levels. The latter results point to the possibility of applications of the bioelectrodes in the diagnosis and treatment of thyroid dysfunctions.

As enzimas, acetilcolinesterase (AChE) e ?-secretase1 (BACE1), são alvos validados para o tratamento da Doença de Alzheimer (DA) uma vez que atuam no sistema nervoso central contribuindo para o avanço da doença. Neste contexto, o interesse por inibidores destas enzimas e a busca por ensaios enzimáticos seletivos e eficazes tem importância crucial. Neste trabalho é descrito o desenvolvimento de metodologias on-line, em capilares de sílica fundida, e off-line, em esferas de agarose para triagem de ligantes envolvendo as enzimas AChE e BACE1 via imobilização e co-imobilização por ligação covalente. Nos métodos on-line, a imobilização da BACE1 e a co-imobilização das enzimas AChE e BACE1 em capilares de sílica fundida foram realizadas via ligação amino-glutaraldeído e as atividades das enzimas foram monitoradas on-line por cromatografia líquida de alta de eficiência e espectrometria de massa (CLAE-EM) através da medida das massas correspondentes aos produtos das clivagens enzimáticas. Nestes, foram possíveis se determinar os parâmetros cinéticos para as enzimas imobilizadas como; variações de pH e temperatura, as constantes cinéticas (KMap) e validação com inibidores padrão. Ressaltando também a aplicação na triagem de uma coleção de oito compostos sintéticos com identificação de dois compostos e a caracterização dos mesmos. Nos métodos off-line, a imobilização da AChE e da BACE1 em suportes de agarose foram realizadas partindo de diferentes tipos de ligação com grupos nucleófilos previamente ligados ao suporte. Os diferentes suportes de agarose com a AChE imobilizada foram estudados usando o propionato de p-nitrofenil como substrato por meio da medida da absorbância do produto formado p-nitrofenol a 348 nm. O sistema com a enzima imobilizada agarose-trietilamina-AChE (agarose-TEA-AChE) ótimo foi utilizado para validação do método para triagem de ligantes com o inibidor padrão sendo determinado os parâmetros cinéticos e termodinâmicos de inibição, tais como; potência inibitória (IC50), constante de inibição (Ki) e constante de dissociação (KD). Já para a enzima BACE1, a atividade enzimática foi monitorada por fluorescência a ?em= 495 nm (?ex= 395 nm) utilizando o substrato IV, sendo possível a seleção do melhor método para imobilização da BACE1. Em ambos os métodos, on-line e off-line, a imobilização foi eficiente refletindo na atividade de cada enzima após o processo. Os métodos para triagem desenvolvidos neste trabalho são inéditos para ambas as enzimas e reportam grandes avanços comparados aos ensaios já consolidados, uma vez que a co-imobilização contribuiu para a construção de um modelo de triagem inovador, sendo possível a avaliação das interações específicas de um ligante contra dois alvos biológicos em um mesmo sistema (CLAE-EM) automatizado. Ressaltando também que os métodos com a AChE e BACE1 em duas matrizes distintas forneceram modelos de ensaios com formatos diferentes que podem ser aplicados de acordo com as ferramentas analíticas disponíveis, desde as mais simples como espectrofotometria no UV-Vis, fluorescência, aos mais sofisticados e automatizados como CLAE-EM. / The enzymes, acetylcholinesterase (AChE) and ?-secretase1 (BACE1), are targets validated for the treatment of Alzheimer\'s Disease (AD) because they act in the central nervous system contributing to the disease advance. In this context, the interest in inhibitors of these enzymes and the search for selective and effective enzymatic assays is of crucial importance. This work describes the development of on-line methodologies, in fused silica capillaries, and off-line in agarose beads for screening ligands involving the AChE and BACE1 enzymes via immobilization and co-immobilization by covalent attachment. In the on-line methods the immobilization of BACE1 and co-immobilization of AChE and BACE1 enzymes in fused silica capillaries were performed via amino-glutaraldehyde bonding and the enzyme activities were monitored on-line employing high performance liquid chromatography and mass spectrometry (HPLC-MS) by measuring the masses corresponding to the products of the enzymatic cleavages. In these enabled the determination of kinetic parameters for immobilized enzymes such as; pH and temperature variations, kinetic constants (KMap) and validation with standard inhibitors. Also, the application in the screening of a collection of eight synthetic compounds with identification and characterizations of two compounds was carried out. In the off-line methods, the immobilizations of AChE and BACE1 on agarose supports were performed through different types of binding with nucleophilic groups previously attached to the support. The different active-agarose supports with immobilized AChE were studied using p-nitrophenyl propionate as substrate by measuring the absorbance of the product formed p-nitrophenol at 348 nm. The system with the immobilized enzyme optimal agarose-triethylamine-AChE (agarose-TEA-AChE) was used for validation of the method for screening ligands with the standard inhibitor being determined the kinetic and thermodynamic parameters of inhibition, such as; inhibitory power (IC50), inhibition constant (Ki) and dissociation constant (KD). For BACE1 enzyme, the enzymatic activity was monitored by fluorescence at ?em = 495 nm (?ex = 395 nm) using the substrate IV, and it was possible to select the best method for immobilization of BACE1. In both methods, both on-line and off-line, the immobilizations procedures were efficient reflecting on the activity of each enzyme after the process. The screening methods developed in this work are unprecedented for both enzymes and represent an improvement to the already consolidated screenings assays, because the co-immobilization contributed to the construction of an innovative screening model, being possible the evaluation of the specific interactions of a ligand against two biological targets in the same automated system. It is worth emphasizing that the AChE and BACE1 methods in two different matrices have provided models of assays in different format that can be applied according to the available analytical tools, from the simplest ones such as UV-Vis spectrophotometry, fluorescence, to the automated systems such as HPLC-MS.

Introdução: A imobilização prolongada no leito pode desencadear alterações em diferentes sistemas do corpo e na capacidade funcional. Durante a internação hospitalar, o repouso acontece com frequência e alterações na funcionalidade instaladas neste período podem perdurar mesmo após a alta. Este ambiente pode induzir o paciente à inatividade física o que pode afetar principalmente a força muscular. Objetivos: Avaliar o impacto da internação hospitalar na capacidade funcional e força muscular de pacientes hospitalizados e identificar possíveis preditores de ocorrência de eventos pós alta. Métodos: Trata-se de um estudo coorte prospectivo que inclui 250 pacientes internados em enfermarias do Instituto Central do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. Foram incluídos pacientes de ambos os gêneros, com idade >=50 anos. Foram excluídos pacientes com déficits cognitivos, dellírium, aqueles que não conseguiram realizar os testes propostos e/ou apresentarem > 48 horas de admissão na enfermaria. Dados clínicos e sociodemográficos foram avaliados a partir da análise dos prontuários. A força de preensão palmar (FPP) foi avaliada pelo dinamomêtro palmar e a capacidade funcional (CF) avaliada pelo índice de Barthel. Para verificar a ocorrência de quedas e re-internações, foi realizado um acompanhamento por telefone de 1, 3 e 6 meses pós-alta. Análise estatística: As variáveis numéricas foram representadas em mediana e intervalo interquartil (5% a 95%) e média e desvio padrão (DP). As variáveis categóricas foram descritas em valores absolutos e porcentagem. A comparação entre os sujeitos adultos e idosos no momento da admissão, foi realizada através do teste de Mann-Whitney Rank Sum Test e teste de Qui-Quadrado. A comparação entre as pontuações da admissão e alta hospitalar da FPP e CF foi realizada através do teste t de Student e Wilcoxon Signed Rank Test. Um modelo de Regressão Logística Múltipla foi utilizado para identificar possíveis preditores de perda de FPP durante a hospitalização e a ocorrência de quedas e re-internação no acompanhamento pós-alta. Resultados: A CF avaliada pelo Índice de Barthel não sofreu alterações (p=0,83), no entanto, foi verificada uma redução significativa de FPP durante o período de hospitalização (p=0,03), sendo a FPP no momento admissão o principal preditor de perda de força. A ocorrência de quedas e re-internações aumentam progressivamente com o acompanhamento pós-alta, sendo os principais preditores de ocorrência de quedas o auto-relato de queda prévia e a idade e, para re-internação o tempo de hospitalização. Conclusão: A hospitalização pode gerar perda de força de preensão palmar, no entanto, a capacidade funcional avaliada pelo Indice de Barthel não se altera. A ocorrência de queda e re-internação aumentam com o período de acompanhamento pós-alta e foi possível identificar preditores para a ocorrência destes eventos / Introduction: Prolonged bed rest can trigger changes in different body systems and functional capacity. During hospitalization, the rest happens frequently and changes in functionality installed in this period can last even after hospital discharge. This environment can induce the patient to physical inactivity which can affect the musculoskeletal system, especially the muscular strength. Objectives: Evaluated the impact of hospitalization on functional capacity and muscle strength of hospitalized patients. Methods: This was a prospective cohort study including 250 patients in wards of the Hospital Central Institute of the Faculty of Medicine, University of São Paulo. They included patients of both genders, aged >= 50 years. Patients with cognitive deficits, dellírium, those who cannot perform the tests proposed and / or submit > 48 hours of admission to the ward. Clinical and sociodemographic data were evaluated from the analysis of medical records. The hand grip strength (HGS) was evaluated by the hand dynamometer and the functional capacity (FC) evaluated by the Barthel Index. To verify the occurrence of falls and re-hospitalizations, a telephone follow-up of 1, 3 and 6 months post-discharge was performed. Statistical analysis: Numerical variables were represented in median and interquartile range (5% to 95%) and mean and standard deviation (SD). Categorical variables were described in absolute values and percentage. The comparison between adult and elderly subjects at admission was performed using the Mann-Whitney Rank Sum Test and Chi-Square test. The comparison between admission and discharge scores of FPP and CF was performed using Student\'s t-test and Wilcoxon Signed Rank Test. A Multiple Logistic Regression model was used to identify possible predictors of FPP loss during hospitalization and the occurrence of falls and re-admission at post-discharge follow-up. Results: The FC assessed by the Barthel Index did not change (p = 0.83); however, there was a significant reduction in FPP during the hospitalization period (p = 0.03). The occurrence of falls and re-hospitalizations increase progressively with post-discharge follow-up, the main predictors of occurrence of falls being the self-reported prior fall and the age, and for re-hospitalization, hospitalization time (p < 0,001). Conclusion: Hospitalization may lead to loss of hand grip strength, however, the functional capacity assessed by the Barthel Index does not change. The occurrence of fall and re-hospitalization increased with the post-discharge period and it was possible to identify predictors for the occurrence of these events

O objetivo deste trabalho foi estudar a produção do antitumoral retamicina por células imobilizadas de Streptomyces olindensis ICB20 em biorreatores. A imobilização das células foi conseguida após uma etapa inicial de cultivo em erlenmeyers (reativação e pré-imobilização) e posterior envolvimento em gel, utilizando-se alginato de cálcio 3%; as esferas produzidas tinham diâmetro médio de 3,0 ± 0,2 mm. Foram utilizados neste trabalho os biorreatores tipo cesta (2,4 L de volume útil) e coluna de bolhas (1,6 L de volume útil), efetuando-se cultivos em batelada simples, bateladas repetidas e contínuos, visando-se uma comparação dos diferentes sistemas empregados. Também foram realizados alguns cultivos com células livres, a fim de efetuar uma comparação com os sistemas com células imobilizadas nos diferentes biorreatores. Os ensaios consistiram em empregar diferentes condições de agitação (300 e 500 rpm) e aeração (0,4 e 1 vvm) para o biorreator cesta em sistema com células imobilizadas, assim como diferentes vazões de aeração no biorreator coluna de bolhas (1, 2 e 3 vvm). Os cultivos em bateladas repetidas e contínuos foram operados a partir das melhores condições obtidas nos cultivos descontínuos. Foram aplicadas nos sistemas contínuos com células imobilizadas, as vazões específicas de alimentação de 0,05 e 0,2 h -1 no biorreator cesta e vazões de 0,015 a 0,05 h -1 no biorreator coluna de bolhas. A comparação entre os sistemas com células livres e imobilizadas mostrou que as limitações difusionais afetaram significativamente as cinéticas dos ensaios com células imobilizadas, considerando-se apenas uma batelada. A operação do biorreator cesta em sistema de bateladas repetidas apresentou os maiores valores de produção da retamicina (em torno de 1,5 a 1,7 UA), porém sua operação foi possível por apenas três bateladas. O sistema contínuo operado com vazão específica de alimentação de 0,03 h-1, com células imobilizadas no biorreator coluna de bolhas, mostrou ser o mais adequado dentre todos os ensaios realizados com células imobilizadas, apresentando estabilidade na produção, em torno de 0,8 UA, durante 96 horas de alimentação (cerca de três tempos de residência). / The purpose of this study was to investigate the production of the antitumor antibiotic retamycin by immobilized cells of Streptomyces. olindensis ICB20 in bioreactors. Cells were immobilized by entrapment in Ca-alginate gel (3%) after being grown in Erlenmeyers (reactivation and pre-immobilization cultures). The average diameter of the Ca-alginate beads was 3.0 ± 0.2 mm. Aiming to compare different cell systems, immobilized cell cultures were carried out in a 2.4L working volume basket-type stirred tank reactor (BSTR) and a 1.6 L working volume bubble column reactor (BCR) in batch, repeated-batch and continuous modes. Free cell suspension cultures were also performed and the results obtained compared to those in immobilized cell systems. Different agitation rates (300 and 500 rpm) and air flow rates (0.4 and 1.0 v.v.m.) were employed in the BSTR immobilized cell experiments.The BCR cultures were conducted at 1.0, 2.0 and 3.0 v.v.m. The optimal operating conditions for the batch mode were used in the repeated-batch and continuous cultures. Immobilized cells were grown in continuous mode at feed dilution rates of 0.05 and 0.2 h-1 in the BSTR and at 0.015 and 0.05 h-1 in the BCR. The comparative evaluation of the batch cultures with free and immobilized cells showed that diffusion limitations had affected the kinetics of cell growth and retamycin production in the immobilized cell systems. The highest average values of retamycin content (from 1.5 to 1.7 AU) were achieved in repeated batch cultures conducted in the basket-type reactor (BSTR) in spite of a limited number of batches (3 batches). Of all the systems, the continuous cell immobilized culture carried out in the BCR at a dilution rate of 0.03 h-1 proved to be the most adequate for retamycin production as retamycin levels remained stable (around 0.8 AU) over 96 hours (about 3 residence times).