Este trabalho descreve o desenvolvimento de um sistema microfluídico, contendo, como componente principal, um reator enzimático constituído de um microcanal fabricado em substrato de poli(metacrilato de metila) e um sistema amperométrico como detector. Para a construção de microcanais foi utilizando equipamento de usinagem a laser de CO2 para escavar os microcanais, que a seguir foram selados termicamente. A superfície interna desse microcanal foi submetida à modificação química com poli(etilenoimina), que se mostrou eficiente para posterior imobilização da enzima glicose oxidase, utilizando glutaraldeído como agente de ligação covalente cruzada, gerando assim um microrreator para determinação amperométrica de glicose. O peróxido de hidrogênio gerado na reação enzimática foi detectado em uma célula eletroquímica em fluxo, localizada externamente ao reator, com eletrodo de platina como eletrodo de trabalho. Uma bomba peristáltica programável foi empregada para promover a injeção de amostra, utilizando tubulação de pequeno diâmetro (0,3 mm), permitindo alcançar reprodutibilidade para a injeção de pequenos volumes, tipicamente da ordem de 5 microlitros de solução. O sistema proposto foi utilizado para a determinação amperométrica diferencial de glicose presente em amostras de refrigerantes, apresentando boa repetibilidade (DPR = 1,72%, n = 50), limite de detecção apreciável (1,40 x10-6 mol L-1), elevada frequência de amostragem (345 amostras h-1) e relativa estabilidade a longo prazo (420 determinações em mais de 20 dias com perda de atividade menor que 50%). As análises realizadas com o sistema proposto neste estudo levaram a resultados concordantes com os obtidos pelo método espectrofotométrico clássico, utilizado para análise de glicose em fluídos biológicos. / This work describes the development of a microfluidic system having as a main component an enzymatic reactor constituted by a microchannel assembled in poly(methyl methacrylate) substrate, connected to an amperometric detector. To manufacture the microchannels, a CO2 laser ablation machine was utilized to engrave the channels, which in sequence were thermally sealed. The internal surfaces of the microchannels were chemically modified with poly(ethyleneimine) which showed good effectiveness for the immobilization of glucose oxidase enzymes using glutaraldehyde as crosslinking agent, producing in this way a microreactor effective for the amperometric detection of glucose. The hydrogen peroxide generated in the enzymatic reaction was detected in the electrochemical flow cell, localized outside of the reactor, using platinum as the working electrode. A programmable peristaltic pump was utilized to inject the samples, utilizing tubes with small diameter (0.3 mm), allowing attain reproducibility even for injections of small volumes, in the order of 5 microliters of solution. The proposed system was applied for differential amperometric determination of glucose content in soft drinks, showing good repeatability (DPR = 1.72%, n = 50) low detection limit (1,40 x10-6 mol L-1), high sample frequency (345 samples h-1) and relatively good stability for long term (420 determinations along more than 20 days, with a decrease of activity lower than 50%). The analysis performed with the system proposed in this study lead to results which agree with those obtained by the classical spectrophotometric method, utilized to analyze glucose in biological fluids.

Bien que les matériaux poreux soient nombreux dans la nature, la synthèse en laboratoirede matériaux présentant une porosité multi-échelle ou hiérarchisée est toujours délicate. Enutilisant la matière molle (émulsions concentrées, auto-assemblages, mésophases lyotropes, etc)et le procédé sol-gel, il est possible d’obtenir une grande variété de matériaux monolithiques, àporosité hiérarchisée, composés d’un squelette silicique. La porosité de ces matériaux peut êtreoptimisée en jouant avec la nature de l’émulsion, le tensioactif utilisé, ou avec l’ajout d’agentd’extérieur comme le sel. En combinant ces méthodes, des matériaux possédant une mésoporositéhexagonale ont été obtenus. Grâce à leur surface riche en silanols, ces matériaux poreux ont étéfonctionnalisés par greffage post-synthèse de molécules organiques. Dès lors, l’immobilisationd’entités biologiques comme les enzymes au sein de la structure poreuse a permis d’utiliser cesmatériaux pour des réactions d’hydrolyse, de synthèse ou de décoloration en milieu aqueux dansune approche de « chimie verte ». Enfin, des micro-organismes ont été piégés dans ces matériauxporeux qui ont été recouverts d’une coque en silice. Les micro-organismes peuvent s’y développersans restriction et leur croissance est très différente de celle observée dans les cultures classiques.La coque en silice, formée en surface, est donc imperméable au passage des bactéries (taillemicrométrique) mais perméable à la diffusion des substrats et des réactifs. Cette diffusion a étémise à profit pour réaliser des réactions enzymatiques en cascade. Ces matériaux se positionnentcomme des biocatalyseurs très prometteurs pour de nombreuses applications. / Although porous materials are numerous in nature, the laboratory synthesis of materials withmulti-scale or hierarchical porosity is always difficult. By using soft matter (concentrated emulsions,self-assemblies, lyotropic mesophases, etc.) and the sol-gel process, it is possible to obtaina wide variety of monolithic materials with hierarchical porosity composed of a silicic skeleton.The porosity of these materials can be optimized by playing with the nature of the emulsion,the surfactant used, or with the addition of external agents such as salt. By combining these methods,materials with hexagonal mesoporosity have been obtained. Thanks to their silanol-richsurface, these porous materials have been functionalized by post-synthesis grafting of organicmolecules. Therefore, the immobilization of biological entities such as enzymes within the porousstructure has made it possible to use these materials for hydrolysis, synthesis or discolorationreactions in aqueous media in a "green chemistry" approach. Finally, microorganisms were trappedin these porous materials which were covered with a silica shell. Microorganisms can growthere without restriction and their growth is very different from that observed in conventionalcultures. The silica shell formed on the surface is therefore impermeable to the passage of bacteria(micrometric size) but permeable to diffusion of substrates and reagents. This diffusion wasused to carry out cascade enzymatic reactions. These materials are positioned as very promisingbiocatalysts for many applications.

Many industrially important fungi can grow in the form of small spherical pellets.Such pellets reduce the viscosity and enhances mass transfer rates in culture broths.The pelleted morphology also influences the fungus’s metabolism, directing it tospecific metabolites. The pellets are easily harvested from the broth and recycled.These properties makes pelleted morphology very attractive.The pelleted morphology of four Zygomycetes strains was studies. Several differentnutrient media used by other researchers for achieving pelleted growth was tested.The influence of eight factors on pelletization of Rhizopus sp. in a completely definedmedium was determined using a fractional central composite design and logistic regression.Pelleted growth of all four Zygomycetes was achieved, with very good results for twoRhizomucor sp. strains. A simple medium containing calcium carbonate was foundto induce pelletization with very high reproducibility.Immobilization of yeast cells was attempted in pellets of Rhizomucor. It was foundthat a flocculating yeast can be immobilized inside pellets of fungal mycelium, forming”biocapsules”. This is accomplished by first using a medium that induces pelletizationof the filamentous fungus and does not allow for growth of the yeast. Thepellets are then inoculated into a second medium that induces growth and flocculationof the yeast and inhibits further growth of the filamentous fungus.Non-flocculating yeasts could not be immobilized, suggesting that the flocculin proteinsin the cell wall of flocculating strains are important for proper immobilization.The flocculation and immobilization arises due to expression of several differentFLO-genes and the importance of these genes for successful immobilization isdiscussed.The results demonstrate that the morphology of Zygomycetes can be controlled andthat this may be useful in industrial fermentation. The new immobilization techniquereveals the great importance of flocculation and cell surface hydrophobicity. Usingyeast strains that express certain FLO-genes may be beneficial in fermentation oflignocellulosic hydrolysates.Microscopy techniques were developed that allows for high quality microphotographyof pellets and thin cross-sections of pellets and biocapsules. / Program: MSc in Resource Recovery - Industrial Biotechnology

Melanina é um polímero constituído por uma grande heterogeneidade de monômeros tendo como característica comum a presença de grupos indóis. Por outro lado, a eumelanina produzida pela oxidação enzimática da tirosina é um polímero mais simples constituído principalmente de monômeros 5,6-dihidroxindol (DHI) e de indol-5,6-quinona (IQ). Tirosinase é a enzima chave na produção de melanina, sendo que a sua atividade cinética é medida em função da formação do intermediário dopacroma. Nanopartículas (NPs) de sílica são partículas nanométricas compostas de oxido de silício e são obtidas pelo processo sol-gel desenvolvido por Stöber de hidrólise e condensação de tetraetilortosilicato (TEOS), usando etanol como solvente em meio alcalino. As NPs foram funcionalizadas com 3-Aminopropiltrietoxissilano (ATPES) e depois com glutaraldeído. Este último permitiu a imobilização da tirosinase na superfície da sílica. Caracterizamos as NPs antes e após a reação da enzima, a atividade catalítica da enzima ligada à NP e o mecanismos de formação de melanina na superfície da sílica. As NPs foram caracterizadas por espectrofotometria de absorção e de reflectância, termogravimetria e microscopia eletrônica. A síntese da NP de sílica retornou partículas esféricas com 55nm de diâmetro e a funcionalização da partícula mostrou modificar eficientemente a sua superfície. A imobilização da tirosinase por ligação covalente foi de 99,5% contra 0,5% da adsorção física. A atividade da tirosinase foi caracterizada pela formação de dopacroma. O Km da enzima imobilizada não sofreu alteração em comparação com a tirosinase livre, mas a eficiência catalítica - que considera a eficiência recuperada - foi de apenas 1/3 para a enzima ligada covalentemente, significando que 2/3 das enzimas ligadas não estão ativas. Obtivemos NPs revestidas com melanina a partir de oxidação de tirosina solubilizada em duas preparações: NP com tirosinase ligada covalentemente na superfície e NP funcionalizada com glutaraldeido dispersa em solução de DHI e IQ. O revestimento de melanina foi na forma de um filme fino com espessura ~1,9nm, conferindo perfil de absorção luminosa equivalente ao da própria melanina. Mostramos que o mecanismo de polimerização passa pela oxidação da tirosina pela tirosinase, que gera intermediários oxidados (principalmente DHI e IQ) que vão para solução (mesmo quando a tirosinase está ligada covalentemente na sílica). Estes intermediários ligam-se ao glutaraldeido e a superfície da sílica passa a funcionar como ambiente de polimerização da melanina. / Melanin is a polymer consisting of a large heterogeneity of monomers having as a common feature the presence of indole groups. Contrarily, eumelanin produced by enzymatic oxidation of tyrosine is a simpler polymer consisting mainly of 5,6-dihidroxindol (DHI) and indole-5,6-quinone (IQ) monomers. Tyrosinase is the key enzyme in melanin production, and its kinetic activity is measured by the formation of the intermediate dopacroma. Nanoparticles (NPs) are made of silica nanoparticles of silicon oxide and are obtained by sol-gel method developed by Stöber of hydrolysis and condensation of tetraethylorthosilicate (TEOS), using ethanol as solvent in an alkaline medium. NPs were functionalized with 3-Aminopropyltriethoxysilane (ATPES) and then with glutaraldehyde. The latter allows the immobilization of tyrosinase on the silica surface. We characterized NPs before and after the reaction of the enzyme, the catalytic activity of the enzyme bound to the NP and melanin-forming mechanisms on the silica surface. NPs were characterized by absorption spectrophotometry and reflectance, electron microscopy and thermogravimetric analysis. The synthesis of silica NP returned spherical particles of 55nm diameter and particle functionalization showed efficiently modify its surface. The immobilization of tyrosinase by covalent bond was 99.5% versus 0.5% by physical adsorption. The activity of tyrosinase was characterized by the formation of dopacroma. The Km of the immobilized enzyme did not change compared to the free tyrosinase, but the catalytic efficiency - considering the recovered efficiently - was only 1/3 for the enzyme covalently bound, meaning that 2/3 of the enzymes are not connected active. We obtained melanin coated NPs from tyrosine oxidation in two preparations: NP with covalently bound tyrosinase in the NP surface and NP functionalized with glutaraldehyde dispersed in DHI and IQ solution. The melanin coating was in the form of a thin film with the thickness of ~ 1,9 nm, giving light absorption profile equivalent to that of melanin itself. We showed that the polymerization mechanism involves the oxidation of tyrosine by tyrosinase, which generates oxidized intermediates (especially DHI and lQ) that go into solution (even when tyrosinase is covalently bound to the silica). These intermediates bind the glutaraldehyde and the surface of the silica begins to function as an environment for melanin polymerization.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / A imobilizaÃÃo de β-galactosidase para hidrÃlise de lactose à uma proposta para agregar valor ao soro de leite com conseqÃente produÃÃo de galactose e glicose. O objetivo deste trabalho foi desenvolver biocatalisadores a partir de diferentes suportes orgÃnicos e protocolos de ativaÃÃo visando à hidrÃlise de lactose proveniente do soro de leite. Inicialmente, prepararam-se os suportes a serem aplicados no estudo como quitosana 2,5% (m/v) (sem e com prÃ-tratamento com dimetilformamida) e 2,0% (m/v), quitosana-alginato-epoxilado (QAE), bagaÃo de caju (BC) e fibra de casca de coco verde (CV), os quais foram ativados de diferentes formas, com glutaraldeÃdo, epicloridrina ou glicidol. Na primeira etapa, determinaram-se o rendimento de imobilizaÃÃo, atividade recuperada e atividade aparente dos diferentes derivados obtidos para assim determinar os seis melhores â quitosana 2,5% (m/v) ativada com glutaraldeÃdo (QUITGLU1), quitosana 2,0% (m/v) coagulada com KOH a 50ÂC ativada com glutaraldeÃdo (QUITGLU2) ou epicloridrina (QUITEPI) ou glicidol (QUITGLI), quitosana 2,5% (m/v) tratada com dimetilformamida ativada com epicloridrina (QUIT-DMFEPI) ou glicidol (QUIT-DMFGLI). Para segunda fase, os catalisadores (QUITGLU1, QUITGLU2, QUITEPI, QUITGLI) foram estudados quanto à estabilidade operacional com o uso de reator contÃnuo, assim como ensaios de carga mÃxima e efetividade. Baseado nestes ensaios determinou-se QUITGLU2 como melhor biocatalisador e realizaram-se os seguintes estudos: variaÃÃo do tempo de imobilizaÃÃo, determinaÃÃo da melhor temperatura e pH para atividade enzimÃtica, determinaÃÃo de parÃmetros cinÃticos, estocagem sob 10ÂC e estabilidade operacional com o uso de alta carga enzimÃtica usando soro de leite como substrato. Suportes como CV e BC nÃo apresentaram boa adequaÃÃo para imobilizaÃÃo de β-galactosidase de Kluyveromyces lactis, assim como o suporte QAE. Suportes com tratamento com dimetilformamida apresentaram baixos rendimentos de imobilizaÃÃo. Os resultados para o derivado QUITGLU2 apresentaram carga mÃxima de 75 mgProteÃna.g-1 de suporte e efetividade superiores aos demais. A estabilidade operacional para este derivado apresentou-se estÃvel, visto sua produÃÃo de glicose constante por 10 h de reaÃÃo. O tempo 3 h mostrou-se suficiente para imobilizaÃÃo. Os valores de Km e VmÃx tanto para enzima solÃvel (46,79 mM e 7.142,86 μmol.(mL.min)-1) quanto para o derivado (69,56 mM e 113,25 μmol.(g.min)-1). Durante os 120 dias de armazenamento sob 10ÂC, nÃo houve decrÃscimo da atividade hidrolÃtica do derivado, demonstrando Ãtima estabilidade à estocagem. Por fim, o biocatalisador mostrou bons resultados de estabilidade operacional quando utilizado em alta carga oferecida (255,9 mgProteÃna.g-1 de quitosana de carga teoricamente imobilizada) para hidrÃlise de soro de leite / β-galactosidase immobilization was studied seeking to add value to cheese whey trough lactose hydrolyze producing galactose and glucose. This work aimed to develop biocatalysts using different organic supports and activation protocols. Firstly, some supports were prepared as chitosan 2.5% (w/v) (with and without pretreatment with dimethylformamide) and 2.0% (w/v), chitosan-alginate-epoxide (QAE), cashew bagasse (BC) and coconut shell fiber (CV), which were activated in different ways with glutaraldehyde, epichlorohydrin or glycidol. Initially, it was determined the immobilization yield, couple yield and apparent activity from obtained catalysts, being chosen six derivatives according to better results parameters: 2.5% chitosan (w/v) glutaraldehyde activated (QUITGLU1), 2.0% chitosan (w/v) KOH coagulated at 50ÂC glutaraldehyde activated (QUITGLU2) and epichlorohydrin (QUITEPI) or glycidol (QUITGLI), chitosan 2.5% (w/v) dimethylformamide treated with epichlorohydrin (QUIT-DMFEPI) or glycidol (QUIT-DMFGLI). Thus, catalysts (QUITGLU1, QUITGLU2, QUITEPI, QUITGLI) were studied as operational stability by using a continuous reactor, as well as, maximum enzyme loading and effectiveness assays. Then, it was determined QUITGLU2 as the best biocatalyst and following studies were carried out: immobilization time, enzyme optimum temperature and pH, kinetic parameters using lactose as substrate at 37ÂC, storage at 10ÂC and operational stability using high load enzyme and cheese whey as substrate. CV and BC supports did not present good results for β-Kluyveromyces lactis galactosidase immobilization, as well as, QAE support. Supports treated with dimethylformamide presented low immobilization yields. The results for QUITGLU2 derivative presented maximum loading of 75 mgProtein.g-1support and higher effectiveness than others. The operational stability for this derivative remained stable, with constant glucose production for 10 h of reaction. Immobilization time of 3h proved enough for the process. The Km and VmÃx values were respectively: free enzyme (46.79 mM and 7,142.86 μmol.(mL.min)-1) and catalyst (69.56 mM and 113.25 μmol.(g.min)-1). During 120 days of storage at 10ÂC, no decrease derivative hydrolitic activity was noted, demonstrating satisfactory storage stability. Finally, the biocatalyst showed good results as operational stability when used high offered enzyme load (theoretically immobilized load 255.9 mgProtein.g-1chitosan) for cheese whey hydrolysis

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / O objetivo deste trabalho foi estudar a preparaÃÃo de biocatalisadores utilizando lipase de Candida antarctica tipo B (CALB) imobilizada covalentemente em quitosana, uma matÃria-prima abundante e de baixo custo no CearÃ, em quitosana-alginato e em agarose, com o intuito de utilizÃ-los na sÃntese de Ãsteres de vitamina A. Diversas estratÃgias de imobilizaÃÃo foram realizadas com o intuito de obter um derivado com elevada atividade enzimÃtica e com alta estabilidade tÃrmica e operacional. TrÃs tipos de suportes (agarose, quitosana e quitosana-alginato) foram preparados a partir de tais estratÃgias, sendo que um estudo aprofundado foi realizado com dois desses suportes (quitosana e quitosana-alginato). Apenas uma estratÃgia de imobilizaÃÃo foi realizada com agarose para testÃ-lo na sÃntese de palmitato de retinila, juntamente com dois derivados comerciais (lipase imobilizada de Thermomyces lanuginosus (Lipozyme TL IM) e lipase imobilizada de Mucor miehei (Lipozyme RM IM)), com o objetive de definir algumas condiÃÃes operacionais. Uma condiÃÃo avaliada que apresentou bons resultados na sÃntese foi o uso de peneira molecular para a retirada de Ãgua no meio reacional, sendo, portanto, utilizada nos estudos posteriores. ApÃs os estudos de imobilizaÃÃo e estabilidade tÃrmica a 60 ÂC, dois derivados (J8: quitosana ativada com glicidol seguido de etilenodiamina (EDA) e glutaraldeÃdo, e G10: quitosana-alginato ativada com glutaraldeÃdo) foram escolhidos, por apresentarem maiores atividades especÃficas (422,44 Â 50,4 U/g e 378,30 Â 34,7 U/g, respectivamente) e melhores estabilidades tÃrmicas (fatores de estabilizaÃÃo de 10,25 e 29,00, respectivamente), para estudos de estabilidade operacional de hidrÃlise e para sÃntese de palmitato de retinila. O derivado que apresentou melhor estabilidade tÃrmica a 60ÂC foi o G10, CALB imobilizada em quitosana-alginato, sendo aproximadamente 29 vezes mais estÃvel que a enzima solÃvel, e mais de 2 vezes mais estÃvel do que a enzima comercial Novozyme 435. PorÃm, o derivado J8 apresentou melhor estabilidade operacional de hidrÃlise, semelhante ao derivado comercial Novozyme 435. Um planejamento experimental 22 foi realizado para se avaliar a sÃntese de palmitato de retinila. Avaliou-se a influÃncia da temperatura (37 ÂC e 45 ÂC) e da razÃo entre os substratos, retinol:Ãcido palmÃtico (1:3 e 1:5), no rendimento de sÃntese, catalisada pelo derivado J8. Uma reaÃÃo utilizando o derivado G10 utilizando a melhor condiÃÃo do planejamento experimental foi realizada para ver o comportamento desse derivado. Com uma anÃlise estatÃstica dos resultados, pÃde-se observar que a razÃo entre os substratos teve efeito significativo no rendimento de sÃntese. Maiores foram obtidos quando a razÃo entre substratos foi igual a 1:5. Como os resultados nas temperaturas de 37 ÂC e 45 ÂC foram semelhantes, selecionou-se a temperatura de 37 ÂC para reaÃÃes posteriores, por necessitar de um menor gasto de energia para atingi-la / The objective of this work was to study the preparation of biocatalysts using lipase of Candida antarctica type B (CALB) covalently immobilized in agarose, chitosan, an abundant and low cost raw material, to be used in the synthesis of ester of Vitamin A. Several strategies of immobilization were studied in order to obtain a biocatalyst with good enzymatic activity and high thermal and operational stabilities. Three types of supports (agarose, chitosan and chitosanalginate) were activated by different strategies, but most of attention was given to the supports chitosan and chitosan-alginate. Only one derivative was prepared by immobilizing CALB in agarose and results of synthesis were compared to commercial derivatives (immobilized lipase of Thermomyces lanuginosus - Lipozyme TL IM - and immobilized lipase of Mucor miehei - Lipozyme RM IM), for the definition of some operational conditions. The operational condition that presented good results in the synthesis was used in further studies, such as removal of water from the reacional media by molecular sieves. After immobilization and thermal stabilities at 60 ÂC tests, two derivatives (J8: chitosan actived with glicidol follow by EDA and glutaraldehyde; G10: chitosan-alginate actived with glutaraldehyde) were selected: the ones that presented higher specific activities (422.44 Â 50.4 U/g and 378.30 Â 34.7 U/g, respectively) and best thermal stabilities (factors of stabilization of 10.25 and 29.0, respectively). Operational hydrolytic stabilities and the performance of these biocatalysts on the synthesis of retinyl palmitate were evaluated. One factorial design 22 was carried out to evaluate the synthesis of retinyl palmitate. The influence of the temperature (37 ÂC and 45 ÂC) and ratio between substrates concentration, retinol: palmitic acid (1:3 and 1:5), in the yield of synthesis, catalyzed for the J8 derivative, were evaluated. A statistical analysis of the results showed that the the most significant effect was the rate of substrates concentration. Higher yields of synthesis were obtained when the ratio of substrates concentration was equal to 1:5. Results of reaction yields at 37ÂC and 45 ÂC were very similar. Therefore, 37 ÂC was selected for further studies. Best results for thermal stability at 60ÂC were obtained for G10, CALB immobilized in chitosan-alginate, being approximately 29-fold more stable than soluble enzyme, and 2-fold more stable than the commercial enzyme (Novozyme 435). On the other hand, J8, CALB immobilized in chitosan, presented higher operational hydrolysis stability, with a similar deactivation profile to Novozyme 435

Este trabalho teve como objetivo sintetizar e caracterizar uma matriz híbrida estável de poli(estireno-co-divinilbenzeno) magnetizado pela adição de magnetita (Fe3O4) e avaliar seu potencial como suporte para a imobilização de lipases. A matriz híbrida foi sintetizado pela técnica de polimerização em suspensão utilizando dos monômeros de estireno e divinilbenzeno e ao qual foram adicionadas partículas de magnetita preparadas por coprecipitação dos íons Fe+2 e Fe+3. A caracterização foi realizada pelas técnicas de microscopia eletrônica de varredura (MEV), espectroscopia na região do infravermelho por transformada de Fourier (FTIR), difratometria de raios-X (DRX) e magnetização de amostra vibrante (VSM), comparando os materiais magnetizados e não magnetizados. Os biocatalisadores foram preparados pela imobilização da lipase de Candida rugosa (LCR) e lipase PS Burkholderia cepacia (LPS) via adsorção física e foram caracterizados em função da influência de pH e temperatura na atividade hidrolítica, parâmetros cinéticos, estabilidade térmica, estabilidade operacional e estabilidade de estocagem. O derivado de LCR foi aplicado em reações de esterificação e o derivado de LPS em reações de transesterificação. Os resultados obtidos pelas análises de FTIR, DRX e VSM confirmaram que a magnetita foi incorporada ao polímero, gerando atração das partículas por um campo magnético externo. A caracterização bioquímica indicou forte influência do pH na atividade hidrolítica, apresentando ponto ótimo próximo a 8,0 tanto para as lipases livres quanto imobilizadas. Os biocatalisadores magnetizados preparados apresentaram bom desempenho em todos os aspectos, o derivado da lipase de Candida rugosa alcançou conversões entre 89-94% nas reações de esterificação, revelando tempo de meia vida de t1/2=52 dias na estabilidade operacional. O derivado de Burkholderia cepacia atingiu rendimentos próximos a 80% nas reações de transesterificação com t1/2=40 dias. A imobilização aumentou a estabilidade térmica das lipases em 50 vezes no caso da LCR e em 2,3 vezes para a LPS. Estes resultados indicam que o material híbrido magnetizado sintetizado possui grande potencial para ser utilizado como suporte na imobilização de enzimas com aplicação em reações de interesse industrial. / This study aimed to synthesize and characterize a stable hybrid matrix of poly (styrene-codivinylbenzene) magnetized by the addition of magnetite (Fe3O4) and evaluate its potential for application in the immobilization of lipases, by characterization of the prepared biocatalysts. The support was synthesized by the suspension polymerization technique by applying styrene and divinylbenzene monomers and adding magnetite particles synthesized by co-precipitation of Fe + 2 and Fe + 3. The characterization of the material was performed by scanning electron microscopy (SEM), Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR), X-ray diffraction (XRD), vibrating sample magnetization (VSM), by comparison of the magnetized and the not magnetized particles. The biocatalysts were prepared by immobilization of lipase from Candida rugosa (CRL) and lipase from Burkholderia cepacia (Lipase PS) via physical adsorption and they were characterized according to the influence of pH and temperature on the hydrolytic activity, kinetic parameters, thermal stability, operational stability and storage stability. The CRL derivative was applied in esterification reactions and the lipase PS derivative was applied in transesterification reactions. The results obtained by the analysis FTIR, XRD and VSM confirmed the magnetite was successfully incorporated into the polymer and generated the atraction for an external magnetic field. Biochemical characterization indicated a strong influence of pH on the hydrolytic activity, showing better results on pH around 8,0 for free and both immobilized lipases. The magnetized biocatalysts prepared had good performance in all respects, derivative from Candida rugosa lipase reached 89-94% conversion in esterification reactions showing half-life of operational stability t1 / 2 = 52 days. The immobilized lipase from Burkholderia cepacia reached yields close to 80% in transesterification reactions presenting t1/2 = 40 days. Immobilization increased the thermal stability of lipase by 50 times in the case of CRL and 2,3 times for Lipase PS. These results indicate that the magnetized hybrid material synthesized has great potential to be used as a support for the immobilization of enzymes for use in reactions of industrial interest.

As características nutricionais de produtos alimentícios têm sido cada vez mais valorizadas pelo mercado consumidor em função da constante preocupação com os efeitos dos alimentos na saúde. O sucesso de um produto alimentício no mercado, entretanto, depende também de suas características físicas, tais como espalhabilidade, aparência e impressões sensoriais dos alimentos na boca. Estas características desempenham papel fundamental no processamento industrial e na aceitabilidade do produto pelo consumidor. Neste contexto, o presente projeto teve como objetivo avaliar o efeito da transesterificação enzimática da gordura de leite com óleo de soja na composição e na textura do produto alimentício obtido, empregando como catalisador lipase de Aspergillus niger previamente imobilizada em suporte híbrido polissiloxano-álcool polivinílico. Em uma primeira etapa, as matérias-primas foram caracterizadas quanto à umidade, índices de acidez, saponificação, peróxido e iodo, propriedades reológicas e térmicas. Em seguida, os materiais de partida foram misturados em diferentes proporções seguindo um planejamento experimental estatístico de misturas, e empregados nas reações de transesterificação. As variáveis resposta foram os índices de acidez, saponificação, iodo e peróxido, as propriedades de textura consistência e dureza, e o grau de transesterificação. Os resultados obtidos mostraram que os índices de acidez, saponificação, peróxido e iodo apresentaram uma dependência linear em função da fração mássica de gordura de leite tanto para a mistura das matérias-primas como para os produtos transesterificados. Com relação às propriedades de textura, modelos estatísticos foram compostos e permitiram verificar que a transesterificação promoveu uma diminuição tanto da consistência quanto da dureza nas misturas contendo proporções superiores a 50% de gordura de leite. As misturas preparadas com frações de gordura inferiores a este valor praticamente não sofreram alterações de textura após a reação. A avaliação da composição dos produtos obtidos demonstrou que as amostras correspondentes à gordura de leite pura e às misturas contendo 67 e 75% desta, apresentaram modificações no perfil de triacilgliceróis (TAGs), mostrando de forma geral diminuição na concentração dos TAGs C34-C38 e C54 e aumento dos TAGs C24-C30 e C44-C50. A reação empregando gordura de leite pura resultou em um grau de transesterificação (5,20%) mais elevado em relação ao óleo puro (3,33%), o que pode estar diretamente relacionado à especificidade da enzima pelos ácidos graxos presentes nesta gordura. O grau de transesterificação mais elevado (10,75%) foi obtido para a mistura contendo 67% de gordura de leite. Os resultados indicaram que a transesterificação de misturas contendo 50-67% de gordura de leite resultou em produtos com melhores propriedades de textura (espalhabilidade) sob temperatura de refrigeração em comparação à manteiga, à gordura de leite ou à simples mistura física com igual composição, sendo os valores de consistência e dureza pelo menos 32% menores em comparação à manteiga. Portanto, o desenvolvimento experimental deste trabalho permitiu demonstrar a viabilidade da transesterificação enzimática de uma mistura contendo elevados teores de gordura de leite, o que resultou na preservação de parte de suas características organolépticas, obtendo-se como resultado um produto com melhores características de textura (maior espalhabilidade) e nutricionais (maior teor de ácidos graxos insaturados). / The nutritional food characteristics have been highly considered by consumers due to the constant worries with their effects on health. However, the success of a new food product in the market depends also on its physical characteristics, such as spreadability, appearance and mouthfeel. These properties are very important for industrial processing and acceptability of the product by the consumer. In this context, the objective of present project was to assess the effect of the enzymatic transesterification of milkfat with soybean oil on the composition and texture of the obtained product. For this reaction Aspergillus niger lipase previously immobilized in polysiloxane-polyvinyl alcohol hybrid matrix was chosen as catalyst. The work was carried in three steps. Firstly, raw materials were characterized regarding their humidity, acid, saponification, peroxide and iodine indexes, rheological and thermal properties. Following these, raw materials were mixed at different proportions according to a statistical mixture factorial design and used as substrate in the transesterification reactions. The response variables were acid, saponification, iodine and peroxide indexes, texture properties (consistency and hardness) and transesterification yields. Acid, saponification, peroxide and iodine indexes showed a linear dependence on the milkfat mass fraction for both physical raw materials blends and transesterified products. Regarding the texture properties, statistical models were composed and allowed verifying that the transesterification reaction decreased both consistency and hardness for substrates containing more than 50% of milkfat. No alteration in these properties was noted for substrates containing lower milkfat fraction. The evaluation of the product compositions showed that samples containing pure milkfat and mixtures containing 67 to 75% of milkfat yielded modifications in the triacylglycerols profile (TAGs) such as decreased on the C34-C38 and C54 TAGs concentrations and increased on the C24-C30 and C44-C50 TAGs concentrations. Reactions carried with pure milkfat resulted in higher transesterification yield (5.20%) as compared with pure soybean oil (3.33%), and this was related to the specificity of the enzyme for fatty acids presented in the milkfat. The highest transesterification yield (10.75%) was obtained for mixtures containing 67% of milkfat. Theses results indicated that the transesterification reactions of substrates containing 50-67% of milkfat gave products having better properties regarding the texture (more spreadability) under cooling temperature than butter, milkfat or simple physical blend at the same composition. Consistency and hardness values were at least 32% lower than data for butterfat. Therefore, the proposed experimental work allowed demonstrating that the enzymatic transesterification of a mixture containing high milkfat levels besides partially preserving the milkfat organoleptic characteristics also rendering a product with better texture (higher spreadability) and nutritional properties (higher amount of unsaturated fatty acids).

As caprilinas são acilgliceróis de cadeia média com diversas aplicações nos campos alimentício, farmacêutico e cosmético. A esterificação direta é um processo importante para a síntese de caprilinas, dado que o glicerol é subproduto da produção de biodiesel e que a tricaprilina, material de partida para a glicerólise e hidrólise, não é um composto abundante naturalmente. As reações existentes para a síntese de acilgliceróis podem ser catalisadas por via química ou enzimática, sendo esta última superior em diversos aspectos. Dois dos principais contrapontos à utilização de enzimas são seu alto custo e dificuldade de recuperação. A imobilização de enzimas é uma das maneiras existentes para contornar estas questões. A maioria dos estudos científicos relativos à obtenção destes compostos refere-se aos acilgliceróis de cadeia longa. Portanto, é necessário aprimorar a esterificação direta entre o glicerol e ácido caprílico catalisada por lipase, através da compreensão da cinética reacional e da influência dos parâmetros reacionais. A existência de uma metodologia de separação, identificação e quantificação simples e eficaz também é importante, tornando as pesquisas relacionadas às caprilinas mais rápidas e menos complicadas. Desta maneira, este trabalho consistiu de três etapas principais: (1) a imobilização de lipases em resinas de troca aniônica, visando reduzir os custos em relação à lipase imobilizada comercial; (2) o desenvolvimento de um método de cromatografia em camada delgada capaz de quantificar as caprilinas formadas; (3) o estudo da reação de esterificação para a obtenção de caprilinas em regime descontínuo e descontínuo-alimentado. A resina DOWEX® 1X2-400 foi a que apresentou a melhor eficiência de imobilização (EI) da Palatase®. Sua atividade lipolítica foi apenas 12,7% inferior à versão imobilizada comercial da lipase, a Lipozyme®RM IM, indicando a viabilidade de substituição desta última. O desenvolvimento de método de cromatografia em camada delgada resultou em relações lineares para a detecção e quantificação de ácido caprílico, monocaprilina, dicaprilina e tricaprilina com R2 e R2pred de 99,3%/98,73%; 98,9%/97,6%; 99,8%/99,8% e 99,7%/99,5%, respectivamente, e com valor-p de 0,000. As reações em regime descontínuo foram realizadas seguindo planejamento fatorial completo, no qual foram variadas a temperatura (30 ou 70°C), a proporção molar entre os reagentes (1:1 ou 3:1 - ácido caprílico : glicerol) e o tempo reacional (6 ou 10h). A análise de regressão do rendimento reacional expresso em porcentagem de consumo de ácido caprílico indicou que, nestas condições, os fatores relevantes para o resultado final são a temperatura e a proporção molar, bem como a interação entre eles. As melhores condições para a obtenção de mono e dicaprilinas foram, portanto, de 30ºC e razão molar de 1:1. O estudo da cinética da reação indica que 40,4% do ácido caprílico são consumidos na primeira hora e que o consumo máximo ocorre na terceira hora de reação. Houve uma queda drástica no rendimento reacional, quando a reação foi conduzida em regime descontínuo-alimentado, provavelmente devido à menor eficiência catalítica da lipase devido ao baixo teor de água na primeira hora de reação. / Caprylins are medium chain acylglycerols that find several applications in food, pharmaceutical and cosmetic fields. Direct esterification is an important route for the synthesis of caprylins, since glycerol is a byproduct of biodiesel production and tricaprylin, the starting material of glycerolysis and hydrolysis, is not a naturally abundant compound. The glycerides synthesis can be catalyzed by either chemical or enzymatic routes, the latter being superior in several aspects. The biggest issues regarding the use of enzymes are their high cost and difficult recovery. Using immobilized enzymes can minimize these concerns. Most of scientific studies concerning the obtainment of these compounds address to long chain acyglycerols. Thus, the improvement of lipase catalyzed esterification of glycerol and caprylic acid is necessary, by understanding the reaction kinetics and the role of reaction parameters. A simple and effective method of separation, identification and quantification of caprylins is also a relevant contributing factor for easier and faster researches. Therefore, this work consisted of three main steps: (1) immobilization of lipases on anion exchange resins in order to produce a cheaper alternative to imported commercial immobilized lipases; (2) development of a thin layer chromatographic method capable of quantifying caprylins; (3) studying the obtainment of caprylins by direct esterification in batch and fed batch systems. DOWEX® 1X2-400 resin presented the best immobilization efficiency (IE) results. Additionally, its lipolytic activity was only 12.7% lower than the commercial Lipozyme® RM IM, suggesting that Lipozyme\'s substitution is feasible. Regarding the developing of a thin layer chromatography method, linear correlations were obtained for detection and quantification of caprylic acid, monocaprylin, dicaprylin and tricaprylin, with a R2 and R2pred of 99,3%/98,73%; 98,9%/97,6%; 99,8%/99,8% e 99,7%/99,5%, respectively, with a p-value of 0,000. The batch reactions were carried out according to a complete factorial design, in which the temperature (30 or 70ºC), the molar ratio between the reagents (1:1 or 3:1) and reaction time (6h or 10h) were varied. The regression analysis of reactional yield expressed in terms of percentage of caprylic acid consumption indicated that only the temperature, molar-ratio and their interaction were important for reaction yields, within the studied conditions. The best conditions related to the obtainment of mono and dicaprylins were 30ºC and molar ratio of 1:1. The reaction kinetics indicates that 40.4% of the caprylic acid is consumed within one hour of reaction and that the maximal consumption was achieved in the third hour. A drastic drop in reaction yield was observed when the fed batch mode was adopted, probably due a lower catalytic efficiency presented by lipase as a result of the lower water content in the first hour of reaction.

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