Notre système immunitaire détecte les microorganismes via des molécules absentes de l’hôte appelées MAMPs. Mais étant donné que les MAMPs sont exprimés par tous les microorganismes indépendamment de leur potentiel pathogène, ce mécanisme n’explique pas comment le système immunitaire distingue les microorganismes pathogènes des non-pathogènes. De récents travaux ont mis en évidence un mécanisme de détection de l’activité des facteurs de virulence bactériens. En utilisant la drosophile, notre laboratoire a précédemment démontré que l’activation de la Rho GTPase Rac2 par la toxine CNF1 d’Escherichia coli induisait une réponse immunitaire innée conservée au cours de l’évolution chez le mammifère et similaire à l’immunité induite par les effecteurs chez la plante. Par la suite, nous avons évalué l’importance de cette réponse immunitaire au cours de la bactériémie chez la souris et démontré le rôle central de la cytokine IL-1β dans l’élimination des bactéries en réponse à la détection de CNF1. Des expériences in vitro nous ont permis d’identifier les mécanismes moléculaires mis en jeu et l’inflammasome responsable de l’activation de la caspase-1 et du clivage de l’IL-1β. De manière intéressante, CNF1 est toujours co-exprimée avec la toxine hémolysine-α (HlyA) dans les souches pathogènes d’E. coli. En outre, nous avons découvert que l’HlyA bloquait l’élimination des bactéries induite par CNF1 au cours de la bactériémie et inhibait la sécrétion de l’IL-1β. Ici, nous avons rapporté le premier exemple d’immunité induite par une toxine (CNF1) et contrecarrée par une autre (HlyA). / Our immune system detects microorganisms via molecules absent from the host called MAMPs. Since MAMPs are shared by all microorganisms regardless of their pathogenic potential, this mechanism does not explain how the immune system distinguishes between pathogenic and non pathogenic microorganisms. The detection of the activities of pathogen-encoded virulence factors has emerged as a new paradigm of pathogen recognition. Using Drosophila we previously demonstrated that the Escherichia coli CNF1 toxin-induced activation of the Rho GTPase Rac2 is sufficient to initiate a defense signal evolutionarily conserved from flies to mammals and similar to Effector-Triggered Immunity in plants. We further addressed the importance of this innate immune mechanism during bacteremia in mice and demonstrated the central role of the IL-1β cytokine in the clearance of bacteria in response to the detection of CNF1. In vitro experiments allowed us to identify the involved molecular mechanisms and the inflammasome responsible of caspase-1 activation and IL-1β maturation. Interestingly, CNF1 is always co-expressed with α-hemolysin toxin in pathogenic E. coli. In addition, we found that HlyA blocked the elimination of bacteria induced by CNF1 during bacteremia and inhibited the secretion of IL-1β. Here, we have reported the first example of immunity induced by a toxin (CNF1) and counteracted by another (HlyA).

L’avènement des thérapies antirétrovirales combinées (cART) a induit une baisse considérable de la mortalité chez les personnes infectées par le VIH. Comparativement à la population générale, les personnes infectées par le VIH ont un risque élevé de cancers classant SIDA (sarcome de Kaposi (SK), lymphome non Hodgkinien (LNH) et cancer du col de l’utérus) et de plusieurs cancers non classant SIDA (poumon, maladie de Hodgkin, foie, canal anal, …), avec des sur-risques différents selon le type de cancer. Dans la période récente des cART, le cancer est la cause de décès la plus fréquente chez les personnes infectées par le VIH. Ce projet de thèse se base sur les données des personnes infectées par le VIH suivies dans la base de données hospitalière française sur l’infection à VIH (FHDH ANRS CO4) et celles de la population générale à travers le réseau français des registres de cancers en France (FRANCIM). Les objectifs de ce projet de thèse étaient d’étudier les évolutions temporelles de l’incidence et du risque des cancers les plus fréquents chez les personnes infectées par le VIH et d’étudier le sur-risque chez les patients ayant un taux de CD4 ≥500/mm3 depuis au moins 2 ans sous traitement en comparaison avec le risque en population générale, de comparer l’âge au diagnostic de cancer entre les 2 populations et d’étudier les tendances temporelles de la survie après le diagnostic d’un cancer chez les personnes infectées par le VIH. / The advent of combination antiretroviral therapy (cART) has led to a decline in the mortality among HIV-infected individuals. Compared to the general population, persons living with HIV have a higher risk of AIDS-defining cancers (Kaposi's sarcoma (KS), non-Hodgkin lymphoma (NHL) and cervical cancer) and several non-AIDS-defining cancers (lung, Hodgkin's disease, liver, anal canal, ...) with different excess risk depending on the type of cancer. In the recent cART period, cancers are the most frequent causes of death among HIV-infected individuals. This thesis is based on data for persons infected with HIV followed in the French Hospital Database on HIV (FHDH ANRS CO4) and data of the general population through the French network of cancer registries in France (FRANCIM). The objectives of this thesis were to study temporal trends in the incidence and risk of the most common cancers in persons with HIV infection and to study the excess risk in patients with a CD4 count ≥500/mm3 for at least 2 years on treatment compared with the risk in the general population, to compare the age at cancer diagnosis between the two populations and to study the temporal trends in survival after cancer diagnosis in HIV-infected individuals.

La réponse immunitaire humorale désigne l’ensemble des processus menant à la production d’anticorps suite à une stimulation du système immunitaire. Les lymphocytes T folliculaires régulateurs (Tfr) forment une population essentielle dans le contrôle de l’immunité humorale. Dotés de fonctions régulatrices comme les lymphocytes T régulateurs conventionnels (Treg), les Tfr joueraient un rôle majeur dans les mécanismes de régulation de la production d’anticorps suite à une stimulation. Ils pourraient, par exemple, contrôler l’aide apportée par les lymphocytes T folliculaires helpers (Tfh) aux cellules B leur permettant de se différencier en plasmocytes producteurs d’anticorps dans une structure hautement spécialisée appelée centre germinatif (CG). Suite au constat de la non-réponse des Tfr à l’interleukine (IL)-2, nous avons observé l’absence d’expression de la sous-unité du récepteur à l’IL-2 (CD25) sur ces cellules et ainsi donné de nouvelles bases à la caractérisation phénotypique des Tfr. Cette redéfinition restrictive de la population cellulaire a permis une description plus approfondie de ces cellules et la découverte d’un axe de régulation du CG dépendant de l’IL-1ß. La dualité de régulations observée entre d’une part l’axe Treg - lymphocytes T effecteurs contrôlé par l’IL-2 en dehors du CG et d’autre part l’axe Tfr - Tfh contrôlé par l’IL-1ß dans le CG nous a amenés à nous poser la question de l’origine et de la spécificité des Tfr en partie élucidée par une analyse du répertoire de ces populations. Nous avons mis en évidence une similarité en matière de distribution et caractéristiques globales des répertoires des cellules folliculaires qu’elles soient régulatrices (Tfr) ou non (Tfh). Il est également apparu une proximité de spécificités entre le répertoire des Treg et des Tfr confortant l’hypothèse d’une origine commune de ces deux populations. Ce travail de thèse a permis la découverte d’éléments importants de la biologie des Tfr, population impliquée dans le contrôle des régulations humorales. Il ouvre des perspectives relatives au contrôle de la production d’anticorps tant sa limitation - dans le contexte de maladies auto-immunes - que son exploitation dans le développement de stratégies vaccinales. / The immune humoral response offers the organism an efficient protection through the production of antibodies following an immune stimulation. Follicular regulatory T cell (Tfr) is an essential subset in the control of humoral immunity. These cells share with conventional regulatory T (Treg) cells regulatory functions and should play a major role in the control of antibody production following stimulation. As T follicular helper (Tfh) cells help is essential in the differentiation of B cell into antibody-producing plasma cells, one of the possible mechanisms of Tfr’s control could be the limitation of the Tfh cells’ help to the B cells. As a consequence of the non-response of Tfr cells to interleukin (IL)-2, we thoroughly revealed the CD25- phenotype of Tfr cells thus redefining the subset. This stringently-selected population allowed a fine-tuned characterization of Tfr cells and the discovery of an IL-1β axis regulating the germinal center responses. The dual regulation of T cells in secondary lymphoid organs, one between Treg and Teff cells regulated by IL-2 outside germinal centers and the other between Tfh and Tfr cells regulated by IL-1 inside GCs brought us to question the origin and specificity of Tfr cells. We partially answered this with a high-resolution analysis of these populations’ repertoires. We highlighted a similarity in the distributions and global characteristics of the follicular cells’ repertoires regardless their regulatory (Tfr) or not (Tfh) phenotype. We also brought out the major sharing between Treg and Tfr repertoires underpinning the hypothesis of a common origin for these populations. This work has disclosed important aspects of Tfr cells’ biology, a fundamental subset in the control of humoral immune responses. It opens many perspectives including the control of antibody production, negatively in the context of autoimmune diseases or its positive exploitation to enhance vaccine efficacy

Le Sepsis et le choc septique, associés à une inflammation systémique sévère et incontrôlée, sont les principales causes de mortalité dans les unités de soins intensifs. Les macrophages jouent un rôle central dans ces pathologies. Ils participent à l'initiation et à la régulation de l'inflammation. Lors d'une infection bactérienne, ils reconnaissent le LPS de la paroi bactérienne par l’intermédiaire du TLR4 ce qui déclenche l’activation des MAPK, des facteurs de transcription NF-kB et AP1 et, in fine, la production des cytokines pro-inflammatoires dont le TNF et l'IL6. L’expression de la protéine GILZ dans les macrophages limite, in vitro, la production d'IL6 et de TNF en réponse au LPS. Cet effet est attribué à une inactivation de NF-kB. D’autre part, l'expression de GILZ décroît dans les macrophages humains et murins après une stimulation par du LPS.Compte tenu des effets régulateurs de GILZ dans les macrophages, les objectifs de notre étude sont 1) de déterminer si l’expression de GILZ est altérée dans les monocytes/macrophages (M/M) au cours du Sepsis, 2) de déterminer si une modulation de l’expression de GILZ dans les M/M est suffisante pour influencer l’inflammation systémique, et 3) d’identifier le mécanisme d'action de GILZ dans les M/M humains.Nous avons mesuré l’expression de GILZ dans les M/M de patients atteints de choc septique ou de syndrome de détresse respiratoire aiguë, et dans un modèle murin d’endotoxémie. Nous avons observé une diminution significative de GILZ dans ces contextes pathologiques chez l’homme et la souris. L'impact de cette altération a été exploré dans des souris transgéniques uniques dont les macrophages surexpriment GILZ de façon non régulable. Nous avons confirmé que la surexpression de GILZ limite la production de TNF et favorise celle de l'IL-10 dans les macrophages stimulés in vitro par du LPS. Nous avons ensuite étudié la réponse inflammatoire et la survie de ces souris dans un modèle d’endotoxémie et de choc septique, et montré que cette surexpression de GILZ restreinte aux macrophages limite la production sérique de cytokines pro-inflammatoires et, par conséquent, l'inflammation systémique en améliorant significativement la survie des souris. Ces résultats mettent en évidence les conséquences, au niveau systémique, de la régulation des macrophages par GILZ.Dans l’optique d’élucider les mécanismes impliqués dans la régulation des macrophages par GILZ, nous avons confirmé que GILZ inhibe NF-kB dans les macrophages humains sans toutefois retrouver l’interaction directe décrite entre GILZ murin et la sous-unité p65 de NF-kB.Ce résultat nous a conforté dans la nécessité de caractériser l’interactome de GILZ dans les macrophages humains. Deux approches complémentaires ont été utilisées. La première est un criblage pan-génomique des interactants de GILZ humain par la technique du double-hybride. La seconde méthode consiste en une purification d'affinité en tandem (TAP-TAG) de la protéine GILZ et de ses interactants, suivie d'une identification de ces protéines par spectrométrie de masse. Ce complexe a été isolé à partir d'extraits nucléaires ou cytoplasmiques de cellules humaines différenciées en macrophages et génétiquement modifiées afin d’exprimer la protéine GILZ flanquée des deux étiquettes nécessaires à sa purification. Ces deux approches ont mis en évidence des interactions nouvelles entre GILZ et des protéines clés de la signalisation du TLR4 dans les macrophages humains ainsi qu'un rôle probable de GILZ comme facteur régulateur de la transcription.Ces résultats montrent que la régulation de la réponse anti-inflammatoire des macrophages par GILZ a un impact sur l’inflammation systémique in vivo et améliore la survie dans un modèle de choc septique sévère. De plus, ces travaux identifient pour la première fois les partenaires cytoplasmiques et nucléaires de GILZ dans les macrophages humains et devraient permettre dans le futur, une meilleure compréhension de cette protéine. / Sepsis and septic shock, associated with a severe and uncontrolled systemic inflammation, are the main causes of death in intensive care units. Macrophages play a central role in these pathologies. They are involved in the initiation and regulation of inflammation. They recognize LPS from the bacterial cell wall via TLR4, which triggers the activation of MAPK signaling pathway and transcription factors such as NF-KB and AP1 and ultimately, the production of pro-inflammatory cytokines including TNF and IL6. The expression of the protein GILZ in macrophages limits in vitro the production of IL6 and TNF in response to LPS. This effect is attributed to inactivation of NF-kB. Moreover, GILZ expression decreases in human and mouse macrophages exposed to LPS.Given the regulatory effects of GILZ in macrophages, the objectives of our study were 1) to determine whether GILZ expression is down-regulated in monocytes / macrophages (M/M) in the sepsis, 2) to determine whether the modulation of GILZ expression in M/M is sufficient to influence systemic inflammation, and 3) to identify GILZ mechanism of action in human M/M.GILZ expression was measured in the M/M of patients with septic shock or acute respiratory distress syndrome, and in a murine model of endotoxemia. We observed a significant reduced expression of GILZ in these pathological contexts in human and mice. The impact of this alteration was explored in unique transgenic mouse model in which macrophages stably overexpress GILZ (CD68-GILZ).We confirmed that GILZ overexpression limits TNF production and promotes IL-10 production in in vitro LPS-stimulated macrophages. We further studied the inflammatory response and survival of these mice in models of endotoxemia and septic shock. We showed that GILZ overexpression restricted to macrophages, limits serum pro-inflammatory cytokines production, therefore decreases systemic inflammation and significantly improves mice survival. These results highlight the effects of macrophage polarization by GILZ at a systemic level.This result confirmed the need to characterize GILZ interactome in human macrophages. Two complementary approaches have been used. The first one consists of a pan-genomic double hybrid screening of human GILZ partners. The second method consists of a tandem affinity purification (TAP-TAG) of GILZ protein and its associated partners, followed by the identification of these partners by mass spectrometry. Analyses have been performed independently on nuclear and cytoplasmic extracts from human macrophage cells, genetically engineered to express GILZ protein with the two tags required for purification. This dual approach led us to identify new direct and indirect interactions between GILZ and other key proteins of TLR4 signaling pathway in human macrophages and highlight a likely role of GILZ as a transcription regulatory factor.These results confirm the anti-inflammatory role of GILZ on systemic inflammation and enhancement of lifetime in murine models of endotoxemia and septic shock. Furthermore, this work identifies for the first time the cytoplasmic and nuclear GILZ partners in human macrophages and would allow in the future, a better understanding of GILZ mechanism of action.

Le développement de bactéries sous la forme de communautés multicellulaires, appelées biofilms, engendre la formation d’un environnement très hétérogène dans lequel les bactéries sont confrontées à différents stress nécessitant un rapide réajustement de leur métabolisme et de leur physiologie. Cette capacité d’adaptation ainsi que des études transcriptomiques, suggèrent fortement que les bactéries vivant sous forme de biofilm puissent présenter des propriétés nouvelles en comparaison à des bactéries planctoniques. Cela nous a conduit à examiner si la formation de biofilm chez Escherichia coli pouvait engendrer des modifications originales de l’enveloppe bactérienne. Nous avons tout d’abord comparé la structure du lipopolysaccharide de bactéries issues de cultures planctoniques et biofilms et mis en évidence que la formation de biofilm chez les bactéries à Gram négatif entraine une augmentation du niveau de palmitoylation du lipide A dépendante de l’enzyme PagP et contribuant à la tolérance des bactéries aux agents antimicrobiens. L’étude des mécanismes sous-jacents a permis de déterminer que cette augmentation du niveau de palmitoylation est, en partie, causée par une induction de l’expression de pagP qui est spécifique au biofilm et regulée par RcsB en réponse à l’osmolarité du biofilm. Nous avons également étudié l’impact de l’adaptation des bactéries au mode de vie biofilm sur la structure de la paroi bactérienne et mis en évidence des différences dans les ponts inter peptidiques présents au sein du peptidoglycane qui pourraient conduire à une augmentation de la rigidité de l’enveloppe bactérienne ainsi qu’à la résistance au stress chez les bactéries. Pour finir, nous avons examiné si les protéines SPFH (QmcA HflK HflC YqiK) associées à des microrégions spécialisées de la membrane -ou radeaux lipidiques- pouvaient jouer un rôle dans la formation de biofilm chez E. coli. Alors que les gènes codant pour ces protéines ne semblent pas être induits en biofilm ni être essentiels à son développement, nous avons identifié plusieurs régulateurs influençant leur expression ainsi que plusieurs fonctions associées aux protéines SPFH que nous sommes en train d’étudier. / The development of bacterial multicellular communities, called biofilms, creates a highly heterogeneous environment, in which bacteria subjected to various stresses need to quickly readjust their metabolism and physiology. This capacity of adaptation, confirmed by many transcriptome analyses, strongly suggest that biofilm bacteria could display novel properties compared to individualized cells. This prompted us to investigate whether biofilm formation could trigger original membrane modifications in Escherichia coli. We first compared the lipopolysaccharide structure of planktonic and biofilm bacteria and demonstrated that biofilms formed by Gram-negative bacteria undergo an increase in lipid A palmitoylation mediated by the PagP enzyme and contributing to bacterial resistance to antimicrobial peptides and host immune defenses. Investigation of the underlying mechanisms of this phenomenon allowed determining that increased lipid A palmitoylation is, at least partially, due to a biofilm-specific and RcsB-dependent induction of pagP expression in response to biofilm osmolarity. We also investigated how bacterial adaptation to the biofilm environment could impact the cell wall structure and identified differences in peptidoglycan linkages that could increase cell rigidity and bacterial resistance to stress. Finally, we investigated the potential role in biofilm formation of E. coli SPFH proteins (QmcA HflK HflC YqiK) associated with dynamic membrane microdomains - or lipid rafts-. Whereas SPFH encoding genes are not differentially expressed in biofilm and are not essential for biofilm formation, we identified several regulators impacting their expression and several functions associated to SPFH proteins that we identified is currently under investigation.

Les lymphocytes T (LT) jouent un rôle clé dans la mise en place d’une réponse immunitaire efficace. De part des besoins énergétiques et biosynthétiques distincts, leur activation, leur prolifération et leur différenciation fonctionnelle requièrent un contrôle métabolique très fin. La kinase mTOR est apparue comme un régulateur important de la biologie des LT. En effet, cette kinase contrôle le métabolisme et permet une augmentation de la synthèse d’énergie notamment par une augmentation de la glycolyse, indispensable à l’activation des LT. mTOR détecte la disponibilité des nutriments (ex. les acides aminés et le glucose) ainsi que les facteurs de croissance, puis intègre de tels signaux pour réguler le métabolisme des LT. Un rôle clé des acides aminés dans la réponse des LT a été mis en évidence. La petite protéine-G RagA joue un rôle clé dans la détection du glucose et des acides aminés ramifiés, requise pour l’activation de mTOR dans le complexe mTORC1, impliqué dans le contrôle du métabolisme. Afin d’appréhender l’influence du microenvironnement métabolique sur l’activation, la prolifération et la polarisation des LT auxiliaires, nous avons généré et analysé des souris avec des mutations de RagA dans les LT. Les souris mutantes ne présentent aucun signe macroscopique de perturbations du système immunitaire tel que des pathologies autoimmunes ou le développement de tumeurs. Le développement des LT dans le thymus est globalement normal, même si l’on peut observer une légère diminution du développement des LT régulateurs. En périphérie, l’homéostasie immunitaire ne semble pas altérée mis à part une légère diminution du pourcentage de LT mémoires. Nous avons constaté que la perte de RagA entraîne une diminution substantielle de l’activité de mTORC1 observée après activation des LT mais, de façon inattendue, pas une abolition totale. A l’inverse, nous avons observé une augmentation de l’activité de mTORC2 dans les cellules KO. De façon plus surprenante, nous avons mis en évidence que, très rapidement après la délétion de RagA dans le thymus, une faible activité basale de mTORC1 se met en place. Précocement après activation, les LT RagA KO ne présentent pas de problème de survie, cependant ils prolifèrent moins rapidement, ce qui est vraisemblablement dû à un apport d’énergie plus faible par glycolyse. Nous avons constaté que des LT RagA-KO activés in vitro dans des conditions « neutres » expriment spontanément des niveaux plus élevés de T-bet, facteur de transcription « maître » des lymphocytes T auxiliaires de type I (Th1). Aussi suite à une activation des LT en condition polarisante Th1, nous avons observé davantage de cellules RagA-KO que WT produisant de l’interféron-γ. Ces résultats montrent que l’activité de RagA, et par conséquent vraisemblablement de mTORC1, inhibe la différenciation Th1. Nous avons pu constater que les LT RagA-KO favorisent la différenciation Th1 au moins en partie par des mécanismes intrinsèques et extrinsèques. De plus, nous observons une activité tardive de mTORC1 dans les LT RagA-KO. Nous émettons l’hypothèse que RagA inhibe l’activité tardive de mTORC1 et que cette activité tardive permet une meilleure différenciation en Th1. En conclusion, nos résultats montrent que l’absence de la GTPase RagA dans les LT diminue l’activité de mTORC1 sans l’abolir totalement. De façon importante et surprenante, nous démontrons que malgré la baisse d’activité de mTORC1 en absence de RagA, la différenciation en lymphocytes Th1 est augmentée. Ainsi, la GTPase RagA semble avoir un rôle inhibiteur de la différenciation en Th1 potentiellement en inhibant une activité à long terme de mTORC1. / T lymphocytes play a key role in the development of an effective immune response. Because of their distinct energy and biosynthetic needs, their activation, proliferation and functional differentiation require very fine metabolic control. The mTOR kinase has emerged as an important regulator of the biology of helper T cells. Indeed, this kinase controls the metabolism and allows an increase in the synthesis of energy in particular by an increase in glycolysis, essential for the activation of T cells. mTOR detects the availability of nutrients, such as amino acids, glucose and growth factors, and then integrates such signals to regulate T cell metabolism. Studies have shown a key role of amino acids in the response of T cells. The small RagA-G protein plays a key role in the detection of glucose and branched amino acids required for the activation of mTOR in the mTORC1 complex involved in metabolic control. In order to understand the influence of the metabolic microenvironment on the activation, proliferation and polarization of helper T cells we generated and analyzed mice with mutations of RagA in T cells. Mutant mice show no signs of immune system disturbances such as autoimmune pathologies or tumor development. T cell development in the thymus is g normal even though a slight decrease in the development of regulatory T cells can be observed. In the periphery, immune homeostasis does not seem to be altered except for a slight decrease in the percentage of memory T cells.We found that the loss of RagA results in a substantial decrease in mTORC1 activity after T cell activation but unexpectedly not complete abolition. Conversely, we observed an increase in mTORC2 activity in KO cells. More surprisingly, we have shown that, very soon after the deletion of RagA in the thymus, a low basal activity of mTORC1 takes place. Early after activation, RagA KO T cells did not present a survival problem, however they proliferated less rapidly, which is probably due to a lower energy intake by glycolysis. We have found that RagA KO T cells activated in vitro under "neutral" conditions spontaneously express higher levels of T-bet, the "master regulator" transcription factor of type I (Th1) helper T cells. Therefore, following activation of T cells in polarizing condition Th1, we observed more RagA KO cells than wt producing interferon-γ. These results show that the activity of RagA, and therefore presumably of mTORC1, inhibits Th1 differentiation. We have seen that RagA KO cells favor Th1 differentiation by intrinsic and extrinsic mechanisms. We hypothesize that IFN-γ, more produced by RagA-KO cells, is involved. In addition, we observed a late activity of mTORC1 in RagA-KO LT. We hypothesize that RagA inhibits the late activity of mTORC1 and that this late activity allows better Th1 differentiation. In conclusion, our results show that the absence of RagA GTPase in T cells decreases the activity of mTORC1 without completely abolishing it. Significantly and surprisingly, we demonstrate that despite the decrease in mTORC1 activity, Th1 cell differentiation is increased in the absence of RagA. Thus, RagA GTPase appears to have an inhibitory role in Th1 differentiation potentially by inhibiting a long-term activity of mTORC1.

L'inflammation du tissu adipeux, le stress oxydatif ou encore les modifications du microbiote intestinal semblent constituer des facteurs essentiels dans l'initiation, l'aggravation, voire même la "chronicisation" du syndrome métabolique et de l'insulinorésistance. La lectine Reg3a (également appelée HIP/PAP) est un composant de l'immunité innée qui déploie des activités anti-bactérienne, anti-oxydante et anti-inflammatoire. Dans ces conditions, Reg3a pourrait jouer un rôle clé en tant que modulateur du dialogue moléculaire entre le foie, le tissu adipeux et le tube digestif. Via son expression dans le foie de souris transgéniques, ou bien son administration par voie sous-cutanée, nous montrons que la protéine humaine Reg3a présente des effets bénéfiques sur le phénotype des animaux, en contribuant à leur capacité à mieux gérer les troubles du métabolisme d’origine à la fois glucidique et lipidique liés au vieillissement, à un régime alimentaire hyperlipidique ou une obésité et une insulinorésistance génétiquement acquises. Elle permet une diminution de la proportion de masse grasse et une meilleure régulation de la glycémie. Les mécanismes moléculaires sous-jacents restent à déterminer mais pourraient d’une part impliquer le régulateur énergétique AMPK, d’autre part être en lien avec le phénomène de brunissement du tissu adipeux. / Inflammation of adipose tissue, oxidative stress or modifications of intestinal microbiota seem to stand among crucial factors contributing to the initiation, worsening or even "chronification" of metabolic syndrome and insulin resistance. The lectin Reg3a (also called HIP/PAP) is a component of innate immunity with antibacterial, antioxidant and anti-inflammatory activities. In these conditions, Reg3a could play a key role as a modulator of the molecular dialogue between the liver, the adipose tissue and the gut. Through its expression in the liver of transgenic mice or its subcutaneous administration, we show that the human protein Reg3a has a positive impact on animals’ phenotype and contribute to their capacity to better manage both glucose and lipid metabolic disorders related to ageing, a high fat diet or genetically acquired obesity and insulin resistance. Notably it leads to a decrease in the proportion of fat and allows a better control of glycaemia. The associated molecular mechanisms remain to be determined but they could involve the energy sensor AMPK and the phenomenon of adipose tissue browning.

La légumineuse Medicago établie une interaction symbiotique avec des bactéries du sol fixatrices d’azote, les rhizobia. Cette interaction provoque la formation d’un nouvel organe racinaire, la nodosité, au sein de laquelle les bactéries infectent de manière massive et chronique les cellules de la plante. Malgré cette invasion, aucune réaction de défense n’est observée ce qui suggère l’existence de mécanismes symbiotiques locaux de contrôle de l’immunité. Les gènes de Medicago DNF2 et SymCRK codant une phospholipase C-like et un récepteur-like kinase riche en cystéines, semblaient intervenir dans ces mécanismes peu connus. Mon travail de thèse a consisté à mieux caractériser les mécanismes de tolérance aux rhizobia notamment ceux faisant intervenir ces deux gènes. Nos résultats indiquent que dnf2 et symCRK forment des nodosités non-fixatrices, nécrotiques, présentant une activation des défenses et une perte de viabilité des bactéroïdes (forme intracellulaire des bactéries). Par ailleurs, l’utilisation de mutants bactériens nous a permis de montrer que, chez la plante sauvage, la perte de viabilité des bactéroïdes et l’absence de fixation d’azote ne sont pas suffisantes pour stimuler les défenses. Nos résultats indiquent également que dnf2 et symCRK agissent successivement lors du processus symbiotique et que la nécessité de dnf2 pour l’établissement de la symbiose peut être contournée dans certaines conditions de culture. Enfin, nous avons réalisé une analyse du protéome de symCRK et des expériences de physiologie végétale qui ont mis en évidence la nécessité, pour le maintien d’une symbiose efficace, de réprimer la voie éthylène après internalisation des rhizobia dans les cellules végétales. Ensemble, nos données améliorent la compréhension du phénomène de tolérance observée dans les nodosités de Légumineuses. / The legume plant Medicago establishes symbiotic interaction with nitrogen fixing bacteria, called rhizobia. This interaction leads to the formation of root organs, the nodules. A massive and chronic infection of nodule cells is observed without induction of any plant defense suggesting that a symbiotic mechanism controls immunity in the nodules. The two Medicago genes, DNF2 and SymCRK encoding a phospholipase C-like protein and a cysteine-rich receptor-like kinase respectively were identified as potentially involved in the prevention of defenses during the late steps of the symbiosis. However, this phenomenon was poorly characterized. Herein we improved the characterization of the Legume tolerance to intracellular rhizobia with an emphasis on the role of DNF2 and SymCRK. Our results indicate that dnf2 and symCRK produce necrotic nodules that do not fix nitrogen, that develop defenses and in which bacteroids, the intracellular form of rhizobia, rapidly loose viability. Using bacterial mutants, we show that reduced bacteroid viability and/or nitrogen fixation defect are not per se enough to trigger defenses in wild type plants. Our results also indicate that DNF2 and SymCRK act successively during the symbiotic process and that artificial culture conditions can bypass DNF2 requirement for symbiosis. Finally, symCRK proteome analysis and physiological studies together indicate that the ethylene pathway has to be repressed after rhizobia internalization within the plant cells to maintain efficient symbiosis. Together our data improve the knowledge on the basis of legume tolerance to rhizobia.

La brucellose est infection causée par les bactéries du genre Brucella. Cette maladie est répandueà travers le monde entier chez les mammifères et est transmissible aux humains. Causant notammentstérilité, avortement et destruction des articulations, la brucellose représente un risque sanitaire majeur.La chronicité et la récurrence de cette infection provoquent une morbidité importante chez l'hommemalgré des traitements antibiotiques longs et coûteux. Actuellement, les vaccins disponibles ne sont pasconsidérés comme sûrs et efficaces. Le confinement de la maladie repose en partie sur l'identification etl’élimination des troupeaux infectés. La brucellose représente toujours d'énormes pertes économiquespour les pays où la maladie est endémique. Le développement rationnel d'un vaccin atténué efficace etsûr contre les infections à Brucella nécessite l'identification des gènes de virulence indispensables à laréplication in vivo de la bactérie.Dans un modèle d'infection intranasale bien caractérisé chez la souris imitant l'infection naturellepar voie aérienne, nous avons décrit la dynamique de l'infection. En utilisant un marqueur fluorescent,nous sommes en mesure de surveiller la multiplication bactérienne in situ et de déterminer les différentesphases de l'infection. Lors d'une infection intranasale, les macrophages alvéolaires (MA) sont le principaltype cellulaire infecté mais seule une petite proportion de la MA infectée (5 à 15%) est permissive àl'infection. Les bactéries entrant dans la réplication au cours des premières 24 heures sont massivementéliminées, mais cette importante pression sélective peut être partiellement levée par des déficitsimmunitaires génétiques par exemple pour la signalisation de l’IL-17 (réponse immunitaire de type TH17)ou même par une altération de la réponse immunitaire en induisant un phénotype asthmatique (réponseimmunitaire de type TH2).Une identification approfondie de tous les gènes essentiels nécessaires à la croissance sur desmilieux riches ou des gènes conditionnellement nécessaires à la survie lors d'une infection in vitro(macrophages RAW murins) ou in vivo (souris) a été effectuée à différents moments clés précoces du cycleinfectieux en utilisant la technique du séquençage des transposons (Tn-Seq). Sur les 3140 gènes de B.melitensis, 643 sont requis pour la croissance extracellulaire sur des milieux riches. 179 gènessupplémentaires sont indispensables à la survie dans les poumons de la souris jusqu'à 5 jours aprèsl'infection. Seule la moitié de ces gènes peuvent être identifiés à l'aide du modèle in vitro standard,illustrant la limitation d'une telle approche in vitro pour identifier les exigences d'adaptation àl'environnement hôte. L'application de l'analyse en cluster montre que la plupart de ces gènes identifiéspeuvent être recadrés en voies complètes ou impliqués dans des fonctions liées. La synthèse deslipopolysaccharides, la synthèse de certains acides aminés, la B oxydation des acides gras et la cytochromeC oxydase seraient particulièrement importantes face à l'environnement hôte. Nous avons maintenantune idée plus claire des exigences minimales pour que la bactérie infecte avec succès son hôte. Enappliquant cette approche en cas d’immunodéficience pour la signalisation de l’IL-17 ou en conditionasthmatique, nous savons maintenant que l'essentialité de certains gènes peut être levée à savoir lasynthèse du core et de la chaîne O du lipopolysaccharide et la B oxydation des acides gras respectivement.La délétion génétique de certains gènes sélectionnés (10) candidats valide les résultats de nos analysesTn-Seq. Ces analyses comparatives ont le potentiel d'identifier des souches de mutants atténués quipourraient déclencher une immunité protectrice sans la capacité de se propager ou de devenir chroniqueou d'être entièrement virulente même chez des animaux avec une immunité compromise. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Introduction : Le récepteur TLR3 (Toll-like receptor 3) détecte l'ARN double brin viral ou cellulaire; il est exprimé dans les hépatocytes humains dans lesquels son activation engendre une réponse proinflammatoire médiée par la production d’interféron de type I. Dans les cellules cancéreuses, TLR3 peut entraîner l’apoptose par sa capacité à activer la voie extrinsèque des caspases. Notre objectif était de caractériser l’expression et la fonctionnalité de TLR3 dans les carcinomes hépatocellulaires (CHC). Matériels et Méthodes : Ce travail a été mené de manière translationnelle. In vitro : le rôle de TLR3 a été analysé dans un modèle de transformation d’hépatocytes primaires humains (PHH) par les oncogènes SV40LT-ST et H-RasG12 V. In vivo : l’impact de TLR3 a été étudié dans un modèle de souris exprimant l’oncogène SV40 avec un TLR3 sauvage (TLR3+/+) ou invalidé (TLR3-/-). Enfin une cohorte française de 126 patients opérés d’un CHC de toutes étiologies a été analysée afin d’évaluer la valeur pronostique en termes de récidive du niveau d’expression du récepteur en ARNm (q-rt-PCR) en protéine (Western Blot) dans le foie tumoral par rapport au foie non tumoral. Résultats: In vitro, la transformation cancéreuse de PHH in vitro par SV40LT-ST et H RasG12 V s’accompagne d’une baisse drastique du niveau d’expression de TLR3 en ARNm et en protéine. L'expression forcée de TLR3 avant transduction par SV40LT-ST est responsable de l'entrée en apoptose des cellules. In vivo, dans le modèle murin SV40, les foyers de transformation cancéreuse et de CHC sont significativement plus nombreux dans les souris SV40-TLR3-/- que dans les souris SV40-TLR3+/+ à 8, 10 et 12 semaines. De plus, dans les souris SV40-TLR3-/-, l’évaluation de l’apoptose montre une diminution significative au sein du parenchyme hépatique comparée aux souris SV40-TLR3+/+ sans impact sur la prolifération hépatique ni le recrutement des cellules immunitaires. Enfin dans une série de 126 patients résequés d'un CHC, la sous-expression de l’ARNm de TLR3 (déterminée par rapport à un panel de foies sains) était significativement associée à la récidive précoce post-résection en analyse univariée (HR=1.79 [1.04 - 3.06] p=0.03) et multivariée (HR=1.73 [1.01–2.97] p=0.04). L'impact pronostique de la sous-expression de TLR3 a été validé dans une large cohorte de 306 CHC réséqués issus du TCGA. Conclusion: la sous-expression de TLR3 est un mécanisme d’échappement à la mort cellulaire des hépatocytes par apoptose durant l'hépatocarcinogenèse. L’évaluation du niveau d’expression pourrait servir de biomarqueur puisque l’absence de TLR3 est associée au risque de récidive. A contrario, la présence de TLR3 constitue une cible thérapeutique / Introduction: The receptor TLR3 (Toll-like receptor 3) detects viral or cellular double-stranded RNA; it is expressed in human hepatocytes in which its activation generates a pro-inflammatory response mediated by the production of type I interferon. In cancer cells, TLR3 can cause apoptosis by its ability to activate the extrinsic pathway of caspases. Our goal was to characterize the expression and functionality of TLR3 in hepatocellular carcinoma (HCC). Materials and Methods: This work was conducted in a translational way. In vitro: the role of TLR3 was in a model of transformation of primary human hepatocytes (PHH) by the oncogene SV40LT-ST and H-RasG12V. In vivo: the impact of TLR3 was studied in a mouse model expressing the SV40 oncogene with wild-type TLR3 (TLR3 + / +) or invalidated (TLR3 - / - ). Finally, a French cohort of 126 patients operated on with a CHC of all etiologies was analyzed in order to evaluate the prognostic value in terms of recurrence of the receptor expression at mRNA (q-rt-PCR), protein (Western Blot) levels in the tumoral compared to the non-tumoral liver. Results: In vitro, PHH trasformation by SV40LT-ST and H-RasG12V is asociated with a drastic decrease of TLR3 expression at mRNA and protein levels. A forced expression of TLR3 before SV40LT-ST transduction is responsible for the apoptosis of the cells. In vivo, in the SV40 mouse model, CHC foci were significantly higher in SV40-TLR3- / - mice than in SV40-TLR3+ / + mice at 8, 10 and 12 weeks. In addition, in SV40-TLR3- / - mice, comparison of apoptosis showed a significant decrease in hepatic parenchyma compared to SV40-TLR3+ / + mice with no impact on hepatic proliferation or immune cell infiltration. Finally, in a cohort of 126 patients with resected HCC, the downregulation of TLR3 mRNA (compared to a panel of normal livers) was significantly associated with early post-resection recurrence in univariate analysis (HR = 1.79 [1.04 - 3.06] p = 0.03) and multivariate (HR = 1.73 [1.01-2.97] p = 0.04). The prognostic impact of TLR3 downrégulation was validated in a large cohort of 306 resected CHCs from the Cancer genome Atlas (TCGA). Conclusion: TLR3 downregulation is an escape mechanism to apoptosis during hepatocarcinogenesis. TLR3 expression could be used as a prognosis biomarker since the absence of TLR3 is associated with recurrence. On the other hand, the presence of TLR3 constitutes a therapeutic target