A leishmaniose é considerada como uma das seis endemias prioritárias no mundo. Sua gravidade vai depender da espécie contaminante, podendo variar de uma lesão cutânea relativamente branda a uma infecção visceral que pode ser fatal na ausência de tratamento. Atualmente, um dos grandes desafios encontrados nos estudos acerca da crescente urbanização da leishmaniose visceral (LV), é o desenvolvimento de vacinas com elevada eficácia para induzir proteção contra infecção por Leishmania. Neste contexto, o presente estudo teve como objetivo avaliar a resposta imune humoral e celular de uma nova formulação vacinal contra a leishmaniose visceral (VL) usando hamster (Mesocricetus auratus) como modelo experimental. A formulação vacinal foi constituída por dois peptídeos sintéticos da protease gp63 na Leishmania major com alta predição de MHC-I e II. A preparação dos peptídeos teve início com a sua predição, utilizando o software SYFPEITHI, seguida da sintetize química destes, usando a metodologia de fase sólida, segundo o protocolo padrão de Merrifield (1963). A purificação e identificação dos peptídeos foi realizada por meio de cromatografia liquida sob condições de baixa pressão. Nove animais com idade de 4-8 semanas foram selecionados de forma aleatória e dividos em três grupos experimentais: o grupo controle, o grupo imunizado com o adjuvante montanide (ISA) e o grupo imunizado com a associação dos peptideos + ajuvante Montanide (Pep+ISA), cada grupo contendo três animais. Os inóculos dos diferentes grupos experimentais foram administrados via subcutânea em três doses vacinais em intervalos de 14 dias. O grupo controle recebeu 100 μL de solução salina estéril a 0,85%, o grupo ISA recebeu 30 μL do adjuvante oleoso Montanide ISA-61VG diluído em 70 μL de solução salina 0,85% e o grupo Pep+ISA recebeu 30 μL do peptídeo MHC-I + 30 μL do peptídeo MHC-II, emulsionados em 30 μL do adjuvante Montanide ISA-61VG e diluídos em 10 μL de solução salina 0,85%. Seis dias após a última dose da vacina, os animais foram sedados com Clortamina® (50 mg/mL) por via intraperitoneal e o sangue coletado para prosseguir com as análises hematológicas, bioquímicas e sorológica. Após 205 dias da última dose vacinal, os animais foram eutanasiados e seus baços coletados para avaliação da resposta linfoproliferativa. Os resultados bioquímicos demostraram que a composição vacinal não teve ação tóxica, apresentando níveis séricos de ureia, creatinina e das enzimas hepatocelulares dentro das taxas normalidade do funcionamento renal e hepático. A formulação vacinal também exibiu níveis significativos de anticorpos e a existência de memória imunológica, evidenciada pelo aumento da atividade linfoproliferativa nas culturas de esplenócitos, quando comparado o grupo que recebeu a vacina com os demais grupos experimentais. / Leishmaniasis is considered one of the six endemics priority in the world. Its severity will depend on the contaminating species, and may range from a relatively mild cutaneous lesion to a visceral infection that can be fatal in the absence of treatment. Now a days, one of the major challenges encountered in studies of the increasing urbanization of visceral leishmaniasis (VL) is the development of highly effective vaccines to induce protection against Leishmania infection. In this context, the present study aimed to evaluate the humoral and cellular immune response of a new vaccine formulation against visceral leishmaniasis (VL) using hamster (Mesocricetus auratus) as an experimental model. The vaccine formulation consists of two synthetic peptides of the gp63 protease in Leishmania major with high prediction of MHC-I and II. The preparation of the peptides started with their prediction, using SYFPEITHI software, followed by their chemical synthesis, using the solid phase methodology, according to the standard protocol of Merrifield (1963). The peptides’ purification and identification of th was performed by liquid chromatography under low pressure conditions. Nine animals aged 4-8 weeks were randomly selected and divided into three experimental groups: the control group, the group immunized with the adjuvant montanide (ISA) and the group immunized with peptide + adjuvant montanide association (Pep + ISA), each group containing three animals. Inoculations of the different experimental groups were administered subcutaneously at three vaccine doses at 14 day intervals. The control group received 100 μL of 0.85% sterile saline, the ISA group received 30 μL of the Montanide ISA-61VG oily adjuvant diluted in 70 μL of 0.85% saline and the Pep + ISA group received 30 μL of the MHC-I peptide + 30 μL of the MHC-II peptide, emulsified in 30 μL of the Montanide ISA-61VG adjuvant and diluted in 10 μL of 0.85% saline solution. Six days after the last vaccine dose, the animals were sedated with Chlortamine® (50 mg / mL) intraperitoneally and the blood collected to proceed with hematological, biochemical and serological analyzes. After 205 days of the last vaccine dose, the animals were euthanized and their spleens collected for evaluation of the lymphoproliferative response. The biochemical results showed that the vaccine composition had no toxic action, presenting serum levels of urea, creatinine and hepatocellular enzymes within the normal range for renal and hepatic functioning. The vaccine formulation also showed significant levels of antibodies and the existence of immunological memory evidenced by the increase in lymphoproliferative activity in splenocyte cultures, when compared to the group that received the vaccine with the other experimental groups.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:52:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 01 - capa_abstract.pdf: 89125 bytes, checksum: 3903e49d4814eabf34674e8391c030ca (MD5) Previous issue date: 2007-06-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Some bacteria produce antimicrobial peptides called bacteriocins that show bactericidal or bacteriostatic effect against other bacteria from the same species or species that are phylogenetically related. These peptides have been studied mainly due to their potential application in food industry, in medicine and in livestock production. Bovicin HC5, a bacteriocin produced by Streptococcus bovis HC5, is similar to the lantibiotics and has a wide spectrum of action. Despite the great potential for practical applications, the production of bacteriocins is frequently limited by the methods used for detection, quantification and purification. However, immunoenzymatic assays can be used as an effective alternative to detect and purify antimicrobial peptides. This work aimed to produce polyclonal antibodies to detect and quantify the bacteriocin bovicin HC5 by immunoenzymatic assays and also to determine the cytotoxic effect of this bacteriocin on Vero cells. Production of the polyclonal antibodies was performed using HPLC-purified peptide followed by immunization of New Zealand rabitts and BALB/c mice. Periodical blood harvests were performed for up to 60 days. Immunoenzymatic analysis was carried out by indirect ELISA and Western blotting with samples from blood serum, S. bovis HC5 cell extracts or supernatants from cultures grown in basal media. Bovicin HC5 generated a immune response of moderated intensity. Nonspecific reactions were not observed between the antibody and the supernatants of other lactic acid cultures by Western blotting and indirect ELISA analysis. Only the purified bovicin HC5 was detected using these techniques. Agar diffusion assays indicated that the anti-bovicin HC5 anti-serum could neutralize 75 % of the bacteriocin activity. The bioassay also indicated that production of bovicin HC5 by S. bovis HC5 started during exponential phase and the biological activity of the bacteriocin increased when the culture reached stationary phase. Bovicin HC5 could be detected in the cell extract and in the supernatant of the S. bovis HC5 culture using the indirect ELISA technique. There was a direct relationship between the activity determined by the ELISA technique and the bioassays. Bovicin HC5 showed toxic effect against Vero cells at concentrations equal to or greater than 100 μg mL-1. These results indicated that immunoenzymatic assays can be used to detect bovicin HC5, but further work is needed to improve the sensitivity of the technique. The effect of bovicin HC5 on different cell lineages must also be investigated to evaluate the toxicity of the peptide and its potential application in animal production. / Algumas bactérias produzem peptídeos antimicrobianos denominados bacteriocinas, que apresentam ação bactericida ou bacteriostática sobre bactérias da mesma espécie ou de espécies filogeneticamente relacionadas. Esses peptídeos têm sido estudados principalmente devido ao potencial para aplicação na indústria de alimentos, na medicina e na agropecuária. Bovicina HC5, uma bacteriocina produzida por Streptococcus bovis HC5, apresenta similaridade com os lantibióticos e possui amplo espectro de ação. Apesar do grande potencial de aplicação das bacteriocinas, a produção destes peptídeos é frequentemente limitada pelos métodos de detecção, quantificação e purificação utilizados. Entretanto, os ensaios imunoenzimáticos podem ser utilizados como uma alternativa mais eficiente para a detecção e purificação de peptídeos antimicrobianos. Este trabalho teve como objetivo produzir anticorpos policlonais para detectar e quantificar a bacteriocina bovicina HC5 por meio de ensaios imunoenzimáticos e determinar o efeito citotóxico da bacteriocina sobre células Vero. A produção de anticorpos policlonais foi realizada com o peptídeo purificado em HPLC seguido da imunização de coelhos New Zealand e camundongos BALB/c e coleta periódica de sangue por até 60 dias. A análise imunoenzimática foi realizada por ELISA indireta e Western blotting em amostras coletadas de soro sanguíneo, extrato de células de S. bovis HC5 ou sobrenadante das culturas cultivadas em meio basal. Bovicina HC5 foi capaz de gerar resposta imunológica, de intensidade moderada. Nenhuma reação inespecífica dos anticorpos foi observada com o sobrenadante de outras culturas lácticas nos ensaios de Western blotting e ELISA indireta, sendo detectada somente a bovicina HC5 purificada. No ensaio de difusão em meio sólido, o antissoro anti-bovicina HC5 neutralizou a atividade da bacteriocina em 75 %. Bioensaios indicaram que a bovicina HC5 começou a ser produzida durante o crescimento exponencial de S. bovis HC5 e a atividade biológica da bacteriocina aumentou quando a cultura atingiu a fase estacionária de crescimento. A bovicina HC5 foi detectada no extrato de células e no sobrenadante da cultura de S. bovis HC5 pela técnica de ELISA indireta, a qual apresentou correlação com a atividade determinada por meio de bioensaios. A bovicina HC5 apresentou efeito tóxico sobre células Vero em concentrações iguais ou superiores a 100 μg mL-1. Esses resultados indicam que ensaios imunoenzimáticos podem ser utilizados para a detecção de bovicina HC5, porém outros trabalhos deverão ser realizados para aumentar a sensibilidade da técnica. O efeito de bovicina HC5 sobre diferentes linhagens celulares deverá ser determinado para avaliar o potencial tóxico deste peptídeo e sua possível aplicação na produção animal.

A infecção por Toxoplasma gondii, em hospedeiros imunocompetentes, resulta no desenvolvimento de anticorpos específicos e resposta imune celular que, frequentemente, induzem imunidade protetora e duradoura, prevenindo reinfecção. Entretanto, casos de toxoplasmose congênita em mulheres imunocompetentes em fase crônica de infecção indicam a possibilidade de reinfecção em humanos. Em modelos experimentais, reinfecção por T.gondii já foi descrita em casos de infecção por cepa de genótipo distinto ao da infecção primária e por cepas recombinantes, porém os estudos envolvendo genótipos clonais, em modelo murino, restringem-se à utilização de cepas do genótipo II na infecção primária, com desafio subsequente por cepas do mesmo genótipo, ou dos genótipos I e III, com ausência de informações sobre as cepas do tipo III, que correspondem ao genótipo de maior frequência e distribuição mundial. Procuramos explorar vários modelos de infecção sequencial com cepas clonais dos tipos I, II e III, buscando dados mais consistentes para compreensão dos seguintes questionamentos: (i) A infecção primária por um genótipo de T.gondii é capaz de proteger o hospedeiro da reinfecção por genótipo distinto? (ii) A imunidade induzida pela infecção primária pode prevenir a progressão da infecção causada pela cepa secundária, impedindo doença aguda e mortalidade dos animais? (iii) A imunidade da infecção primária previne a colonização do cérebro por cistos teciduais da cepa secundária? Nossos dados mostram que a imunidade induzida pela infecção primária por cepas clonais de T.gondii não protege o hospedeiro da reinfecção por cepa de genótipo distinto, já que foram detectados anticorpos contra as cepas das infecções primária e secundária em todos os modelos propostos. Somente a imunidade induzida pela infecção primária por cepa do tipo III foi capaz de prevenir a progressão da infecção secundária causada pelas cepas do tipo I e do tipo II, impedindo a mortalidade e colonização do cérebro dos animais por cistos teciduais da cepa secundária. Esses achados são extremamente importantes para auxiliar estudos vacinais e terapêuticos da toxoplasmose. / Toxoplasma gondii infection in immunocompetent hosts results in the development of specific antibodies and cellular immune responses that often induce protective and lifelong immunity, preventing reinfection. However, cases of congenital toxoplasmosis in immunocompetent women at a chronic phase of infection indicate the possibility of reinfection in humans. In experimental models, reinfection by T.gondii has been described in cases of infection by genotype distinct from that of primary infection and by recombinant strains, but studies involving clonal genotypes in the murine model are restricted to the use of type II genotype in primary infection, with subsequent challenge by strains of the same genotype, or genotypes I and III, without information about type III strains, which correspond to the genotype with the highest frequency and worldwide distribution. We explore several models of sequential infection with clonal strains of types I, II and III, looking for more consistent data to understand the following questions: (i) Primary infection by a T.gondii genotype is able to protect the host from reinfection by different genotype? (ii) Does the immunity induced by the primary infection prevent the progression of infection caused by the secondary strain, preventing acute disease and animal mortality? (iii) Does the immunity of primary infection prevent colonization of the brain by tissue cysts of the secondary strain? Our data show that the immunity induced by primary infection by T.gondii clonal strains does not protect the host from reinfection by a distinct genotype strain, since antibodies against the strains of primary and secondary infections were detected in all proposed models. Only the immunity induced by the primary infection by type III strain was able to prevent the progression of the secondary infection caused by type I and type II strains, preventing the mortality and colonization of the brains of the animals by tissue cysts of the secondary strain. These findings are extremely important to support vaccine and therapeutic studies of toxoplasmosis.

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-05-21T19:40:25Z No. of bitstreams: 1 alexandre_santos_silva_ioc_bp_0011_2010.pdf: 1220834 bytes, checksum: e61580079e61e5f06f901abb6feddfb9 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-05-21T19:40:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 alexandre_santos_silva_ioc_bp_0011_2010.pdf: 1220834 bytes, checksum: e61580079e61e5f06f901abb6feddfb9 (MD5) Previous issue date: 2010 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / A hepatite A é uma doença endêmica no Brasil e na América Latina. A prevalência da infecção tem correlação com precárias condições de higiene e saneamento. Em países em desenvolvimento, um saneamento inadequado resulta em maior transmissão desta doença, principalmente entre crianças e jovens. Atualmente, devido às melhorias das condições sanitárias, o perfil epidemiológico da doença está se deslocando para idades mais avançadas, o que facilita a ocorrência de surtos epidemiológicos. Os kits comerciais para detecção de anti-HAV total normalmente utilizam imunoglobulina G (IgG) de mamíferos no período convalescente da doença para a produção dos anticorpos de captura e do conjugado. Uma alternativa à aplicação dos anticorpos de mamíferos no diagnóstico é o uso da imunoglobulina Y (IgY), encontrada no soro e gema dos ovos de aves e répteis. Essas proteínas têm varias vantagens quando comparadas com IgG: alta resposta contra antígenos de mamíferos, redução da cor de fundo em ensaios imunoenzimáticos e de serem obtidas por um método não-invasivo (coleta da gema dos ovos). O objetivo deste trabalho foi a obtenção de anticorpos IgY anti-HAV produzidos em galinhas imunizadas contra o vírus da Hepatite A (HAV) e o desenvolvimento de um ensaio imunoenzimático para detecção de anti-HAV total utilizando IgY anti-HAV como imunoglobulinas de captura e conjugado. Cinco grupos de galinhas foram imunizadas com diferentes inóculos contendo: vacina com e sem o adjuvante CpG-ODN, HAV com adjuvante incompleto de Freund (IFA) com e sem o adjuvante CpG-ODN e um grupo controle com IFA. Os ovos foram coletados e a gema foi purificada pela precipitação com polietileno glicol. A solução purificada contendo IgY anti-HAV foi avaliada para determinação da concentração da IgY anti-HAV por espectrofotometria e sua especificidade e título foram determinados à partir de um teste imunoenzimático. Os anticorpos foram conjugados com a peroxidase e foi estabelecida a diluição ideal para os anticorpos de captura e conjugado. Para avaliar o ensaio imunoenzimático “in-house” com IgY anti-HAV, foi avaliado um painel composto de 100 amostras positivas e 100 amostras negativas para anti- HAV-total. A presença da IgY anti-HAV nas gemas dos ovos foi confirmada por SDS-PAGE e Western Blotting, e após a purificação, a média da concentração de proteínas nas gemas dos ovos foi de 8,7406 mg /mL. O grupo imunizado com HAV, IFA e CPG-ODN apresentou os maiores títulos de anticorpo. O ensaio “in-house” apresentou sensibilidade de 84%, especificidade de 79% e eficiência de 81,5%. Os métodos utilizados para a produção de IgY anti-HAV e sua conjugação com peroxidase foram eficientes e o ensaio imunoenzimático “in-house” IgY anti-HAV demonstrou uma boa sensibilidade e especificidade. A produção de anti-HAV IgY apresenta vantagens quando comparado com obtenção da IgG anti-HAV. O teste imunoenzimático “in house” com IgY anti- HAV pode ser uma alternativa a utilização da IgG nos ensaios imunoenzimáticos. / Hepatitis A is an endemic disease in Brazil and Latin America. Prevalence of this infection is related to the low degree of hygiene and sanitation. In developing countries, inadequate sanitation results in larger transmission of the disease mostly in children and young people. Nowadays, due to better sanitation conditions, the epidemiological profile of disease is changing to older ages resulting in the occurrence of outbreaks. Diagnostic kits for detection of total anti-HAV generally use mammals immunoglobulin G (IgG) in the convalescent period of disease for production of capture and conjugated antibodies. One alternative to the application of mammals antibodies in the diagnosis is the use of immunoglobulin Y (IgY), encountered in birds and reptiles. These proteins have several advantages when compared to IgG: high response against mammals antigens, reduction of the background in imunoenzymatic assays and it is obtained by a non-invasive method (harvest of the egg yolks). The objective of this work was the acquisition of anti-HAV IgY antibodies produced in immunized chickens against Hepatitis A virus and the development of an immunoenzymatic assay for total anti-HAV detection using IgY anti-HAV as capture and conjugated immunoglobulins. Five groups of chickens were immunized with different inocula containing: vaccine with and without CpG-ODN adjuvant, HAV with incomplete Freund adjuvant (IFA) with and without CpG-ODN and one control group with IFA. The eggs were harvested and the yolk was purified by precipitation with polyethylene glycol. The purified solution containing anti-HAV IgY was evaluated by espectrofotometry and their specificity and title were determined by an immunoenzymatic assay. These antibodies were conjugated with peroxidase and was estabilized the ideal dilution for capture and conjugated antibodies. For evaluation of the immunoenzymatic “in-house” assay with IgY anti-HAV, a panel composed of 100 positive samples and 100 negative samples for total anti-HAV was assessed. The presence of IgY anti-HAV in egg yolks was established by SDS-PAGE and Western Blotting, and after the purification, the average of the proteins concentrations in the egg yolks was of 8,7406 mg/mL. The group immunized with HAV, IFA and CpG-ODN demonstrate the higher titer of antibodies. The “in-house” assay showed sensibility of 84%, specificity of 79% and efficiency of 81,5%. The methods used for anti-HAV IgY production and conjugation with peroxidase were efficient and the “in-house” immunoenzymatic assay IgY anti-HAV demonstrated a good sensitivity and specificity. The production of IgY anti-HAV showed advantages when compared to the acquisition of IgG anti-HAV. The immunoenzymatic “in-house” assay IgY anti- HAV can be an alternative to the utilization of IgG in immunoenzymatic assays.

A infecção por Toxoplasma gondii, em hospedeiros imunocompetentes, resulta no desenvolvimento de anticorpos específicos e resposta imune celular que, frequentemente, induzem imunidade protetora e duradoura, prevenindo reinfecção. Entretanto, casos de toxoplasmose congênita em mulheres imunocompetentes em fase crônica de infecção indicam a possibilidade de reinfecção em humanos. Em modelos experimentais, reinfecção por T.gondii já foi descrita em casos de infecção por cepa de genótipo distinto ao da infecção primária e por cepas recombinantes, porém os estudos envolvendo genótipos clonais, em modelo murino, restringem-se à utilização de cepas do genótipo II na infecção primária, com desafio subsequente por cepas do mesmo genótipo, ou dos genótipos I e III, com ausência de informações sobre as cepas do tipo III, que correspondem ao genótipo de maior frequência e distribuição mundial. Procuramos explorar vários modelos de infecção sequencial com cepas clonais dos tipos I, II e III, buscando dados mais consistentes para compreensão dos seguintes questionamentos: (i) A infecção primária por um genótipo de T.gondii é capaz de proteger o hospedeiro da reinfecção por genótipo distinto? (ii) A imunidade induzida pela infecção primária pode prevenir a progressão da infecção causada pela cepa secundária, impedindo doença aguda e mortalidade dos animais? (iii) A imunidade da infecção primária previne a colonização do cérebro por cistos teciduais da cepa secundária? Nossos dados mostram que a imunidade induzida pela infecção primária por cepas clonais de T.gondii não protege o hospedeiro da reinfecção por cepa de genótipo distinto, já que foram detectados anticorpos contra as cepas das infecções primária e secundária em todos os modelos propostos. Somente a imunidade induzida pela infecção primária por cepa do tipo III foi capaz de prevenir a progressão da infecção secundária causada pelas cepas do tipo I e do tipo II, impedindo a mortalidade e colonização do cérebro dos animais por cistos teciduais da cepa secundária. Esses achados são extremamente importantes para auxiliar estudos vacinais e terapêuticos da toxoplasmose. / Toxoplasma gondii infection in immunocompetent hosts results in the development of specific antibodies and cellular immune responses that often induce protective and lifelong immunity, preventing reinfection. However, cases of congenital toxoplasmosis in immunocompetent women at a chronic phase of infection indicate the possibility of reinfection in humans. In experimental models, reinfection by T.gondii has been described in cases of infection by genotype distinct from that of primary infection and by recombinant strains, but studies involving clonal genotypes in the murine model are restricted to the use of type II genotype in primary infection, with subsequent challenge by strains of the same genotype, or genotypes I and III, without information about type III strains, which correspond to the genotype with the highest frequency and worldwide distribution. We explore several models of sequential infection with clonal strains of types I, II and III, looking for more consistent data to understand the following questions: (i) Primary infection by a T.gondii genotype is able to protect the host from reinfection by different genotype? (ii) Does the immunity induced by the primary infection prevent the progression of infection caused by the secondary strain, preventing acute disease and animal mortality? (iii) Does the immunity of primary infection prevent colonization of the brain by tissue cysts of the secondary strain? Our data show that the immunity induced by primary infection by T.gondii clonal strains does not protect the host from reinfection by a distinct genotype strain, since antibodies against the strains of primary and secondary infections were detected in all proposed models. Only the immunity induced by the primary infection by type III strain was able to prevent the progression of the secondary infection caused by type I and type II strains, preventing the mortality and colonization of the brains of the animals by tissue cysts of the secondary strain. These findings are extremely important to support vaccine and therapeutic studies of toxoplasmosis.