La diabetis tipus 1 (DM1) és una malaltia autoimmune causada per la destrucció de cèl·lules productores d'insulina β en els illots pancreàtics, aquesta destrucció és mediada per limfòcits. En aquesta tesi es pretén donar a conèixer les dianes moleculars de les cèl·lules β responsables de la mort de les cèl·lules β causada per l'atac limfocític. Es van realitzar assajos de microarrays per tal d’identificar els gens expressats diferencialment en les cèl·lules endocrines d’illots, com a conseqüència de la infiltració insulítica, mitjançant la comparació de cèl·lules endocrines d’ illots provinents de ratolins NOD (Non Obese Diabetic)- model de ratolí predisposat genèticament a la diabetis autoimmune-, amb les provinents del seu homòleg lliure de limfòcits, NOD / SCID. Curiosament, vam descobrir que la ciclina D3 (CcnD3) es regula a la baixa a conseqüència de la inflamació d'una manera dosi-dependent, mentre que l'activitat proliferativa de les cèl·lules β no es veu alterada per aquesta disminució en l’expressió de ciclina D3. A més, les cèl·lules NIT-1 que sobreexpressen Ciclina D3 resten protegides de l'apoptosi espontània i de l'apoptosi induïda per un entorn proinflamatori proporcionat per IL-β. Per demostrar la relació de causalitat entre la repressió de CcnD3 repressió i la mort de les cèl·lules β in vivo, hem estudiat l’aparició de diabetis espontània en ratolins NOD deficients en CcnD3 (NODCcnD3KO). Els ratolins NODCcnD3KO desenvolupen diabetis exacerbada en comparació amb companys de llodrigada de tipus salvatge (WT) (88% enfront de 61% respectivament), i aquest fet deu únicament a la deficiència de CcnD3 a les cèl·lules β i no a un augment de diabetogenicitat del repertori limfocític dels ratolins NODCcnD3KO. No obstant això, l'exacerbació de la diabetis requereix de la complicitat de tots dos, la deficiència CcnD3 i la inflamació, ja que els ratolins NOD/SCIDCcnD3KO, els quals no tenen limfòcits, no desenvolupen diabetis espontània. CcnD3 té també un paper essencial en la fisiologia les de cèl·lules β del pàncrees, ja que illots pancreàtics deficients en CcnD3 no experimenten canvis adients en les concentracions intracel·lulars de Ca2+ en resposta a concentracions canviants de glucosa en el medi, el qual denota una sensibilitat deficient a la glucosa en aquests illots. Aquest deteriorament d'acoblament concentració de glucosa en el medi extracel·lular i l’augment a la concentració intracel·lular de Ca2+ no és a causa dels canvis en els nivells d’expressió del transportador de glucosa GLUT-2 entre illots NODCcnD3 KO i NODWT. D'altra banda, hem desenvolupat ratolins transgènics que sobreexpressen ciclina D3 en cèl·lules β pancreàtiques (NOD/RIPCcnD3). Aquests ratolins mostren protecció contra la diabetis autoimmune i rescaten ratolins NOD CcnD3KO de desenvolupar diabetis exacerbada. / Type 1 Diabetes (T1D) is an autoimmune condition caused by the lymphocytemediated destruction of insulin-producing β cells in pancreatic islets. This thesis aims to unveil the final targets in the β cells responsible for the β cell loss caused by the lymphocytic attack. Microarray studies were performed to assess differentially expressed genes in islet endocrine cells as a consequence of insulitic infiltration by comparing the autoimmune-prone Non-Obese Diabetic (NOD) mouse model with its congenic, lymphocyte-free, NOD/SCID strain. Interestingly, we discovered that cyclin D3 (CcnD3) underwent downregulation in beta cells upon inflammatory insult in a dose-dependent manner, while the proliferative activity of beta cells downregulating CcnD3 was not altered. Moreover, NIT-1 cells stably overexpressing CcnD3 were protected from spontaneous apoptosis and from apoptosis induced by a proinflammatory environment provided by IL-1β. To demonstrate the causal link between CcnD3 repression and β cell death in vivo, we studied spontaneous diabetes onset in CcnD3 deficient NOD mice (NODCcnD3KO). NODCcnD3KO mice developed exacerbated diabetes compared to the wild type (WT) littermates (88% versus 61% respectively), and this fact was solely due to the CcnD3 deficiency in the β cells and not to an increased diabetogenicity of the NODCcnD3KO lymphocytic repertoire. However, diabetes exacerbation required the complicity of both CcnD3 deficiency and inflammation, since plain NOD/SCID CcnD3KO mice did not develop spontaneous diabetes. CcnD3 also plays an essential role in pancreatic β-cell fitness, since pancreatic islets deficient in CcnD3 do not experience proper intracellular Ca2+ influx changes in response to different concentrations of glucose. This impairment, coupling glucose concentration in the extracellular milieu and intracellular increase in Ca2+ concentration, is not due to changes in Glut-2 expression levels between the CcnD3 KO and WT islets. Moreover, we developed transgenic mice overexpressing cyclin D3 in pancreatic β cells (NOD/RIPCcnD3). These mice exhibit protection from autoimmune diabetes and NOD CcnD3KO mice are prevented from developing exacerbated diabetes. / La diabetes tipo 1 (T1D) es una enfermedad autoinmune causada por la destrucción de las células β productoras de insulina en los islotes pancreáticos por parte de los linfocitos. En esta tesis pretendemos dar a conocer dianas moleculares de las células β responsables de pérdida de la célula β causadas por el ataque linfocitico. Desarrollamos un estudio de microarreglos en el cual encontramos genes expresados diferencialmente en células endócrinas del islote como consecuencia de la infiltración insulítica mediante la comparación de un modelo de ratón autoinmune susceptible No Obeso Diabético (NOD) con una cepa congénica libre de linfocitos NOD/SCID. Interesantemente, descubrimos que, la ciclina D3 (CcnD3) experimentó una disminución como consecuencia de un asalto inflamatorio de forma dosis dependiente, mientras que la actividad de proliferación de las células β no fue alterada. Además, células NIT-1 que sobreexpresan CcnD3 fueron protegidas de apoptosis espontánea y apoptosis inducida por un entorno proinflamatorio proporcionado por la IL-1β. Para demostrar la relación causal entre la represión de la CcnD3 y la muerte de las células β in vivo, hemos estudiado la aparición de la diabetes espontánea en ratones NOD deficientes en CcnD3 (NODCcnD3KO). Los ratones NODCcnD3KO desarrollan una diabetes exacerbada en comparación con sus compañeros de camada de tipo salvaje (WT) (88% contra el 61% respectivamente) y este hecho debido únicamente a la deficiencia de CcnD3 de las células β y no a un aumento de diabetogenicidad del repertorio linfocítico de los ratones NODCcnD3KO. Sin embargo, la exacerbación de la diabetes requiere la complicidad de ambos, la deficiencia de CcnD3 e inflamación, ya que los ratones NOD/SCIDCcnD3KO, los cuales carecen de linfocitos, no desarrollan diabetes espontánea. CcnD3 tiene también un papel escencial en la fisiología de las células β del páncreas, ya que los islotes deficientes de CcnD3 no experimentan cambios apropiados en las concentraciones intracelulares de Ca2+ en respuesta a diferentes concentraciones de glucosa en el medio. Este deterioro en el acoplamiento de la concentración de glucosa en el medio extracelular y aumento de la concentración intracelular de Ca2 + no es debido al cambio del nivel de expresión del transportador de GLUT-2 entre islotes NODCcnD3 KO y NODWT. Por otro lado, hemos desarrollado ratones transgénicos que sobreexpresan la ciclina D3 en células β pancreáticas (NOD/RIPCcnD3). Estos ratones muestran protección contra la diabetes autoinmune y rescatan a ratones NOD CcnD3KO de desarrollar diabetes exacerbada.

El procés de disseminació metastàsic en el càncer colorectal és un procés complex multifactorial. La present tesi ha pretès aprofundir en dos aspectes: els mecanismes de defensa immunològic a través de la caracterització dels fenòmens de interacció leucocitària, i el procés de mobilització tumoral a través de la detecció i pronòstic de les cèl·lules neoplàsiques circulants.En la present tesi s'ha confirmat que existeix una deficient interacció dels leucòcits circulants amb l'endoteli dels vasos tumorals respecte a l'endoteli no tumoral, tant de rodament en condicions basals com d'adhesió rere l'administració d'un estímul inflamatori. S'ha demostrat que la molècula implicada en els fenòmens d'adhesió leucocitària es ICAM-1, ja que el seu immunobloqueig reverteix els fenòmens d'adhesió induïts per LPS. S'ha demostrat a través de la tècnica del doble marcatge amb anticossos que la deficient interacció leucòcit-endoteli a nivell tumoral no pot atribuir-se a una menor expressió de les diferents molècules d'adhesió implicades en aquest fenomen. Al intentar avaluar els mecanismes responsables de la deficient interacció leucòcit endoteli es va descartar la participació de l'antigen carcinoembrionari, els productes derivats de la ciclooxigenasa i la sintasa induïble de l'òxid nítric. No obstant es va demostrar que la inhibició no selectiva de la sintasa de l'òxid nítric augmentava de manera dosi-depenent el rodament leucocitari i l'adhesió post-LPS a nivell del teixit tumoral. Efecte similar es va observar al procedir al immunobloqueig del factor transformant B1. Per tant, dels resultats obtinguts, es pot ressaltar que tant l'òxid nítric com el factor de creixement transformant B1 participen, al menys de manera parcial, en els fenòmens d'escapament dels sistemes de immunovigilància a nivell tumoral.La segona part de la tesi doctoral ha confirmat en primer lloc que es possible detectar la existència de cèl·lules neoplàsiques circulants en sang perifèrica de malalts amb càncer colorectal a través de la detecció de RNA missatger de l'antigen carcinoembrionari. Aquesta tècnica s'ha confirmat sensible (detecta una cèl·lula neoplàsica per cada 107 leucòcits) i específica (negativa en els controls sans). Emprat aquesta tècnica s'ha intentat avaluar un dels aspectes més controvertits de la cirurgia laparoscòpica en el càncer colorectal, la disseminació tumoral. Mitjançant estudis de detecció de cèl·lules neoplàsiques circulants en sang perifèrica, portal i en el líquid peritoneal, s'ha descartat el potencial efecte deleteri atribuït a la cirurgia laparoscòpica. No es varen observar diferències significatives entre el grup de cirurgia convencional respecte al grup de cirurgia laparoscòpica, en el número de pacients amb determinacions positives en els tres territoris avaluats rere la resecció quirúrgica . Finalment, es va intentar establir la significació pronòstica de la detecció de cèl·lules neoplàsiques circulants en pacients amb càncer colorectal mitjançant el seu seguiment a llarg termini. Tant en el grup global de pacients amb càncer colorectal com en aquells en els que s'havia realitzat una resecció curativa , la determinació preoperatòria de cèl·lules circulants no s'associava a un pitjor pronòstic a llarg termini (supervivència global i supervivència lliure de malaltia). Tenint en compte que estudis previs havien demostrat que la cirurgia afavoria la mobilització de cèl·lules neoplàsiques en el càncer colorectal, es va valorar la significació pronòstica de la detecció de cèl.lules neoplàsiques a les 24 hores de la cirurgia. Novament, la detecció postoperatòria no s'associava a un pitjor pronòstic a llarg termini.

DE LA TESIS:Durante mucho tiempo se había sospechado la naturaleza inmunológica de los fenómenos patogénicos de la glomerulonefritis humana; aún antes de que la Inmunología tomase cuerpo como una rama amplia e independiente, en la cual sólo los agentes bacterianos eran capaces de influir en los procesos inmunológicos, Bright sugirió que la "inflamación" del riñón en la nefritis era debida a la "acción" mórbida que afectaba directamente al órgano, a consecuencia de dicha acción mórbida en otra parte del organismo.Es Schick quien aportó nueva luz al observar que la nefritis asociada a la escarlatina o a la amigdalitis no aparece en el estado agudo de la infección, cuando se espera que el estreptococo o sus productos estén en mayor abundancia, sino tras un período de latencia; sugiere entonces que el lapso de tiempo transcurrido entre la infección sintomática y el inicio de la nefritis podría representar el periodo requerido para el desarrollo de una hipersensibilidad del huésped frente a los organismos todavía existentes. Von Pirquet llama la atención sobre la similitud entre el periodo de latencia en el desarrollo de la nefritis postestreptocócica y el de la enfermedad del suero producida al inyectar suero de caballo; evidencia además el aspecto similar de la glomerulonefritis en ambas situaciones, permitiéndole sostener la hipótesis de que la glomerulonefritis era el resultado de la interacción de los microorganismos con los anticuerpos producidos en el periodo de latencia de la enfermedad. La disminución del complemento sérico apoya más estos supuestos. Finalmente Seegal, Andres, Hsu, y Zabriskie demuestran la presencia de 7S-alfa globulina, beta-1 C y antígeno estreptocócico en los glomérulos de pacientes con glomerulonefritis aguda. Los últimos 50 años de inmunología experimental no han hecho otra cosa que apoyar en todos los aspectos la implicación inmunológica en la glomerulonefritis humana.Los fenómenos inmunitarios se presentan para el nefrólogo como una ciencia paradójica, pues si bien por un lado van a permitir conocer la etiopatogenia de ciertas nefropatías que faciliten un adecuado abordaje terapéutico, por otro lado impiden un acto terapéutico esencial en nefrología, el trasplante.La microscopía óptica convencional ha renovado la patología renal permitiendo reconocer y clasificar sobre bases morfológicas, las principales glomerulopatías. Esta vía habría resultado medio ciega en ausencia de otras técnicas. Así, la microscopía óptico, indescirnibles anteriormente, resolución naturaleza de los depósitos gracias a la "periodicidad" característica, como es el caso de la amiloide o de la fibrina, que se tiñen con el ácido ósmico o las sales de plata, por ejemplo. El examen por Inmunofluorescencia llena en parte la laguna dejada por la microscopía electrónica, nos revela los íntimos componentes de un fenómeno inmunológico, nos aumenta la resolución de nuestros microscopios no en unidades ópticas sino en acercamiento patogénico; en resumen, plasma "in vitro" un aspecto de la reacción inmunológica vital que en sus primeros experimentos vislumbró Masugui.La inmunofluorescencia es un procedimiento utilizado tanto en inmunología como en histología para evidenciar la fijación de anticuerpos sobre el antígeno, del que gracias a la especificidad del anticuerpo se puede determinar su naturaleza y localización, todo ello gracias al marcado previo del anticuerpo con una sustancia fluorescente que no altera su especificidad. La reacción antígeno-anticuerpo es entonces fácilmente visible gracias al microscopio de fluorescencia.El presente trabajo ha estudiado 100 biopsias renales utilizando la técnica de inmunofluorescencia mediante inmunosueros marcados con fluoresceína anti-C3, anti-lgA, anti-lgG, anti IgM y anti-fibrinógeno; componentes éstos que al detectarse implican en principio un mecanismo inmunológico de lesión. Los pacientes pertenecen al Servicio de Nefrología (Clínica Médica B) del Hospital Clínico y Provincial de Barcelona. Las biopsias se efectuaron quirúrgicamente por lumbotomía y con anestesia general. De cada pieza biópsica se efectuaron sendas partes para el estudio por microscopía óptica, inmunofluorescencia y microscopía electrónica.

Cyclin D3 and CDK11 are downregulated in pancreatic islet endocrine cells during the autoimmune attack progression in autoimmune-prone NOD (Non-obese diabetic) mouse strain. D-type cyclins are crucial in order to connect mitogenic signals with the Rb/E2F pathway, which regulates transcription of factors involved in further cell cycle progression. CDK11, protein-kinase PITSLRE, exhibits two gene products: p58 and p110 (p130 in mouse) in humans. CDK11p110 regulates transcription and RNA splicing. CDK11p110 is expressed in all cell cycle phases, while CDK11p58 is only expressed during mitosis (G2/M) and is essential in apoptosis. The interaction between CDK11p58 and cyclin D3 has been reported and it represses certain nuclear receptors action. This observation may suggest that in pancreatic beta cells simultaneous downregulation of cyclin D3 and CDK11 may obey to a coordinated regulation of both molecules. In this thesis we have studied whether there is a causal relationship between coordinated cyclin D3 and CDK11 downregulation and type 1 diabetes in vivo and in vitro.The outcome of our research will allow us to establish whether cyclin D3 and CDK11 are molecular targets in type1 diabetes / La ciclina D3 i CDK11 estan regulades a la baixa en les cèl•lules endocrines de l'illot pancreàtic durant la progressió atac autoimmune en la soca de ratolins NOD propensos a la diabetis autoimmune. Les ciclines de tipus D són crucials per connectar senyals mitogèniques amb la via Rb/E2F , que regula la transcripció de factors implicats en la progressió del cicle cel • lular . El gen que codifica per a la CDK11 , proteïna-quinasa PITSLRE, té dos productes gènics en humans: p58 i p110 ( p130 al ratolí ). LaCDK11p110 regula la transcripció i processament del 'ARN. La CDK11p110 s'expressa en totes les fases del cicle cel•lular , mentre que la CDK11p58 només s'expressa durant la mitosi (G2 / M) i participa en processos apoptòtics . La interacció entre CDK11p58 i ciclina D3 reprimeix certa acció d'alguns receptors nuclears, per exemple afecta negativament l'activitat transcripcional del receptor d'andrògens . Aquesta observació pot suggerir que en les cèl•lules beta del pàncrees la regulació a la baixa simultània de ciclina D3 i CDK11 pot obeir a una regulació coordinada de les dues molècules . En aquesta tesi s'ha estudiat si hi ha una relació causal entre la regulació a la baixa coordinada de ciclina D3 i CDK11 i l'aparició de la diabetis tipus 1 , in vivo i in vitro .El resultat de la nostra recerca ens permetrà establir si la ciclina D3 i la CDK11 podran ser blancs moleculars en la diabetis tipus 1. / Ciclina D3 y CDK11 están regulados a la baja en las células endocrinas del islote pancreático durante la progresión ataque autoinmune en la cepa de ratones NOD predispuesta genéticamente a la autoinmunidad. Los ciclinas de tipo D son cruciales para conectar las señales mitogénicas con la vía Rb/E2F, la cual regula la transcripción de factores implicados en la progresión del ciclo celular. El gen que codifica para la CDK11, la proteína-quinasa PITSLRE, tiene dos productos génicos en humanos: p58 y p110 ( p130 en el ratón). CDK11p110 regula la transcripción y procesameinto del ARN. CDK11p110 se expresa en todas las fases del ciclo celular, mientras que CDK11p58 sólo se expresa durante la mitosis (G2 / M) y está implicada en procesos apoptóticos. La interacción entre CDK11p58 y ciclina D3 reprime cierta acción de algunos receptores nucleare, por ejemplo, afecta negativamente a la actividad transcripcional del receptor de andrógenos. Esta observación puede sugerir que en las células beta del páncreas la regulación a la baja simultánea de ciclina D3 y CDK11 puede obedecer a una regulación coordinada de ambas moléculas. En esta tesis se ha estudiado in vivo e in vitro si existe una relación causal entre la regulación a la baja coordinada de ciclina D3 y CDK11 y la aparición de la diabetes tipo 1.El resultado de nuestra investigación nos permitirá establecer ciclina D3 y CDK11 como blancos moleculares en la diabetes tipo 1.

El treball de recerca que presentem en aquesta memòria ha tingut com a objectius principals aprofundir en l’estudi, per una banda, de la funció efectora dels limfòcits B en la T1D, i, per l’altra, del paper de les cèl·lules del SNP com a dianes en el procés de desenvolupament de la malaltia. Amb aquest objectiu vàrem generar els ratolins NOD transgènics de limfòcits B, el 280.IgH.NOD i el 280.IgH.IgL.NOD, portadors de BCRs amb especificitat per la periferina, i per una altra banda el ratolí NOD knockout pel gen de la periferina, el ratolí NOD.Per-/-. L’estudi d’aquests models ha mostrat que en els ratolins 280.IgH.NOD i el 280.IgH.IgL.NOD la incidència de la malaltia s’incrementa i s’accelera el seu debut, mentre que en el ratolí ratolí NOD.Per-/- la incidència de la malaltia no varia en relació amb el ratolí NOD però en canví sí que s’hi observa un retard lleuger en el debut. Això ens permet concloure que tot i que la periferina és diana de la malaltia de l’atac durant el procés diabetogènic, i per tant és un autoantigen rellevant en la resposta autoimmunitària en la T1D, la resposta contra altres autoantígens fa que aquesta resposta no sigui imprescindible per tal que el procés es desenvolupi plenament. També ens permet concloure que la resposta autoimmunitària contra el SNP està directament lligada al procés diabetogènic. / El trabajo de investigación que presentamos en esta memoria ha tenido como objetivos principales profundizar en el estudio, por un lado, de la función efectora de los linfocitos B en la T1D, y por otro, el estudio del papel de las células del SNP como dianas en el ataque autoinmune. Con este objetivo se generaron los ratones NOD transgénicos de linfocitos B, el 280.IgH.NOD y el 280.IgH.IgL.NOD, portadores de BCRs con especificidad para la periferina, y el ratón NODPer-/-, un ratón knockout por el gen de la periferina. El estudio de estos modelos ha mostrado que tanto en los ratones 280.IgH.NOD como en los 280.IgH.IgL.NOD la incidencia de la enfermedad se incrementa y se acelera el debut, mientras que en el ratón NOD.Per-/- la incidencia de la enfermedad no varia en comparación con el ratón NOD, pero, en cambio, se observa un ligero retraso en el debut de esta. Esto nos permite concluir que aunque la periferina es diana del ataque durante el proceso diabetogéinco, y por lo tanto es un autoantígeno relevante en la respuesta autoinmune en la T1D, la respuesta contra otros autoantígenos hace que la respuesta anti-periferina no sea imprescindible para el desarrollo de la enfermedad. También nos permite concluir que la respuesta autoinmune contra el SNP está estrechamente relacionada con el proceso diabetogénico. / The main objectives of the present study were to explore the role of B cells in T1D, and to analyze the involvement of some functional defects of PNS neurons in promoting the disease. For this purpose we generated the 280.IgH.NOD and the 280.IgH.IgL.NOD mice bearing BCRs with specificity for Peripherin, and on the NOD.Per-/- mouse knockout of the Peripherin gene. The results indicate that whereas diabetes incidence increases and disease onset accelerates in 280.IgH.NOD and 280.IgH.IgL.NOD, disease incidence is unchanged and diabetes onset is slightly delayed in NOD.Per-/-, compared to the NOD mouse. This allows us to conclude that although Peripherin is a target of the autoimmune response and therefore is a relevant autoantigen in T1D, it is not essential for the full development of the disease. Furthermore, the results allow us to conclude that the autoimmune response against PNS is directly linked to the diabetogenic process.

La diabetis de tipus 1 (T1D) és una malaltia autoimmune en què les cèl·lules beta del pàncrees productores d’insulina són atacades pel sistema immunitari propi, la qual cosa provoca la deficiència de la producció d’insulina (insulinopènia) i l’aparició de la malaltia. En aquest treball de recerca es dóna a conèixer una de les dianes moleculars de les cèl·lules beta responsable de la seva mort a causa de l’atac limfocític. L’expressió de la CDK11 sofreix una reducció en les cèl·lules endocrines dels illots pancreàtics durant l’atac autoimmune en el model murí NOD (non obese diabetic) de T1D. El gen que codifica per a la CDK11 té 2 productes gènics en humans: p58 i p110 (p130 en el ratolí). La CDK11p110 està implicada en la transcripció i splicing de l’mRNA i s’expressa al llarg de tot el cicle cel·lular de manera ubiqua. La CDK11p58 s’expressa només durant la mitosi (fase G2/M) i està implicada en els processos apoptòtics. Davant d’aquests fets, s’ha estudiat la relació causal entre la disminució de la CDK11 i el debut diabètic en el ratolí NOD. Es va generar el ratolí NODCDK11HTZ, que tenia 1 al·lel de la CDK11 eliminat, i, per tant, era hemideficient en CDK11. Els ratolins HTZ presentaven una incidència acumulativa de diabetis inferior, comparada amb els ratolins WT, i aquesta millora al fenotip diabètic venia determinada per una resistència de les cèl·lules beta pancreàtiques a l’apoptosi induïda per la infiltració limfocitària. El conjunt de la fisiologia de l’illot pancreàtic no semblava que estigués alterat per l’hemideleció de la CDK11, ja que les proves d’IPGTT i IPITT, així com les fluctuacions de calci intracel·lular, no es veien modificades en els ratolins HTZ. Pel que fa a les poblacions de la infiltració limfocítica, no es veien canvis entre els 2 genotips, tant en el nombre de cèl·lules T, B, macròfags i DC com en el seu estat d’activació. Les proporcions de cèl·lules T reguladores tampoc no es veien modificades com a conseqüència de l’hemideleció de la CDK11. No obstant això, l’efecte protector davant l’apoptosi de l’hemideleció de la CDK11 era dependent de la infiltració limfocítica, ja que els ratolins NOD/SCID CDK11 HTZ i WT no presentaven diferents nivells d’apoptosi beta cel·lular entre ells. A més a més, la diabetogenicitat dels leucòcits derivats dels ganglis limfàtics pancreàtics de ratolins HTZ era la mateixa en transferències adoptives a ratolins NOD/SCID, comparada amb la diabetogenicitat dels leucòcits derivats del ratolins WT. Segons aquests resultats, es pot concloure que l’hemideleció de la CDK11 protegeix els ratolins NOD de la diabetis autoimmune in situ i de manera independent del cicle cel·lular, i inhibeix la mort de la cèl·lula beta quan la infiltració limfocítica ataca els illots dels ratolins NOD. Llavors la repressió de l’expressió de la CDK11 prèvia al debut diabètic de la T1D respondria a un mecanisme protector davant l’apoptosi induïda per inflamació. / La diabetes de tipo 1 (T1D) es una enfermedad autoinmune donde las células beta pancreáticas productoras de insulina son atacadas por el sistema inmune propio, lo que provoca la deficiencia de la producción de insulina (insulinopenia) y la aparición de la enfermedad. En este trabajo de investigación se da a conocer una de las dianas moleculares de las células beta responsable de la muerte de estas como consecuencia del ataque linfocítico. La expresión de la CDK11 sufre una reducción en las células endocrinas de los islotes pancreáticos durante el ataque autoinmune en el modelo murino NOD (non obese diabetic) de T1D. El gen que codifica para la CDK11 tiene 2 productos génicos en humanos: p58 y p110 (p130 en el ratón). La CDK11p110 está implicada en la transcripción y splicing del mRNA y se expresa a lo largo de todo el ciclo celular de manera ubicua. La CDK11p58 se expresa solo durante la mitosis (fase G2/M) y está implicada en los procesos apoptóticos. Ante estos hechos, se ha estudiado la relación causal entre la reducción de la CDK11 y el debut diabético en el ratón NOD. Se generó el ratón NODCDK11HTZ que tenía un alelo de la CDK11 eliminado, y, por lo tanto, era hemideficiente en CDK11. Los ratones HTZ presentaban una incidencia acumulativa de diabetes inferior comparada con los ratones WT, y esta mejora en el fenotipo diabético venía determinada por una resistencia de las células beta pancreáticas a la apoptosis inducida por la infiltración linfocitaria. El conjunto de la fisiología del islote pancreático no parecía que estuviera alterado por la hemideleción de la CDK11, ya que las pruebas de IPGTT y IPITT, así como las fluctuaciones de calcio intracelular, no se veían modificadas en los ratones HTZ. Además, no se veían cambios en las poblaciones del infiltrado linfocítico, tanto en el número de células T, B, macrófagos y DC como en su estado de activación. Las proporciones de la células T reguladoras tampoco se veían modificadas como consecuencia de la hemideleción de la CDK11. No obstante, el efecto protector frente a la apoptosis de la hemideleción de la CDK11 dependía del infiltrado linfocítico, ya que los ratones NOD/SCID CDK11 HTZ y WT no presentaban distintos niveles de apoptosis beta celular entre ellos. Por último, la diabetogenicidad de los leucocitos derivados de los ganglios linfáticos pancreáticos de ratones HTZ era la misma en transferencias adoptivas a ratones NOD/SCID, comparada con la diabetogenicidad de los leucocitos derivados de los ratones WT. Según estos resultados, se puede concluir que la hemideleción de la CDK11 protege a los ratones NOD de la diabetes autoinmune in situ y de forma independiente del ciclo celular, e inhibe la muerte de la célula beta cuando el infiltrado linfocítico ataca los islotes de los ratones NOD. Entonces la represión de la expresión de la CDK11 previa al debut diabético de la T1D respondería a un mecanismo protector frente a la apoptosis inducida por inflamación. / Type 1 diabetes (T1D) is an autoimmune disease in which insulin-producing beta pancreatic cells are attacked by the body’s own immune system, leading to an insulin production deficiency (insulinopenia) and the appearance of the disease. This thesis unveils one of the molecular targets involved in beta cell apoptosis caused by lymphocytic attack. CDK11 expression is reduced in the endocrine cells of the islets of Langerhans during the autoimmune attack in the murine model NOD (Non Obese Diabetic) of T1D. CDK11 has two gene products in humans: p58 and p110 (p130 in mouse). CDK11p110 is involved in mRNA transcription and splicing and is expressed ubiquitously throughout the cell cycle. CDK11p58 is expressed only during mitosis (G2/M phase) and is involved in apoptotic procedures. Faced with these events, the causal relationship between CDK11 reduction and diabetes onset in the NOD mouse has been studied. The NODCDK11HTZ mouse, which had one CDK11 allele deleted and was therefore CDK11 hemideficient, was produced. HTZ mice had a reduced accumulative diabetes incidence compared with WT mice, and this improvement in the diabetic phenotype incidence was determined by a resistance of beta pancreatic cells to apoptotic cell death induced by the lymphocytic infiltrate. Overall islet physiology did not seem to be altered by the hemideletion of CDK11 gene, because IPGTT and IPITT tests, as well as intracellular calcium flux, were not modified in HTZ mice. Moreover, the lymphocytic infiltrate populations presented the same number of T, B macrophages and DCs in both genotypes, as well as the same activation level. Furthermore, T regulatory cell ratios were not modified as a consequence of CDK11 hemideletion. However, the protective effect against apoptosis by CDK11 hemideletion required the lymphocytic infiltrate, since NOD/SCID CDK11 HTZ and WT mice did not show different betacell apoptotic levels. Finally, pancreatic lymph node leucocyte diabetogenicity of HTZ mice was the same as WT mice when they were adoptively transferred to NOD/SCID mice. Bearing these results in mind, it can be concluded that CDK11 hemideletion protects NOD mice from autoimmune diabetes in situ in a cell cycle-independent manner, inhibiting beta cell death when the lymphocytic infiltrate attacks the islets of Langerhans of NOD mice. Therefore, CDK11 downregulation prior to T1D onset corresponds to a protective mechanism against inflammation induced beta cell apoptosis.

L'objectiu general d'aquest treball va ser analitzar l'efecte de diferents components de la ració sobre la funcionalitat intestinal del bestiar porcí. Concretament, es va aprofundir sobre l'estudi de l'estructura i sistema immunitari intestinals, tant durant la fase crítica del deslletament (experiments I i II) com en el període d'adaptació a l'engreix (experiments III i IV).A l'experiment I es van comparar garrins recent deslletats respecte germans seus mantinguts amb la mare. Els garrins deslletats, que van tenir un menor creixement. mostraven una atròfia de les vellositats i una hiperplàsia de les criptes a nivell del jejú. Al cec, aquests animals presentaven un menor nombre de les cèl·lules caliciformes a les criptes, que s'acompanyava d'una resposta inflamatòria i una major renovació epitelial. En general, les alteracions degeneratives i inflamatòries observades podrien limitar la capacitat digestiva i absortiva dels garrins recent deslletats i justificar el seu menor ritme de creixement.A l'experiment II es va avaluar la incorporació d'alguns additius a la dieta de deslletament. Concretament, el plasma porcí assecat per polvorització (SDPP; 6%) i un preparat comercial d'extractes de plantes que contenia carvacrol, cinamaldehid i oleoresina de capsicum (XT; 0.03%), respecte una dieta control. La incorporació del SDPP va incrementar la eficiència alimentària dels garrins, alhora que reduí els percentatges de poblacions cel·lulars immunitàries en la sang i en els teixits limfoides associats a l'intestí (placa de Peyer ileal i ganglis limfàtics ileocòlics), així com el nombre de limfòcits a la mucosa, suggerint una menor activació del sistema immunitari. En canvi, l'addició de XT a la dieta, tot i que va modular les poblacions leucocitàries a nivell intestinal i sistèmic, ho va fer de forma poc consistent. A l'experiment III es va avaluar la incorporació de diferents tipus de fibra alimentària en la dieta d'engreix: blat de moro mòlt de forma grollera (GRO; 54%), polpa de remolatxa (POLPA; 8%) o segó de blat (SEGÓ; 10%) com a font de midó resistent, o polisacàrids no amilacis solubles o insolubles, respectivament, respecte una dieta control. La incorporació de fibra va incrementar el pes del tracte gastrointestinal i especialment del seu contingut. En un inici, totes les dietes amb més fibra van provocar cert grau de colitis i un increment de l'activitat de les cèl·lules immunitàries enfront a mitògens bacterians. Tanmateix, amb el temps, la dieta POLPA va reduir la presència de cèl·lules immunitàries a la mucosa del colon, facilitant l'adaptació dels porcs d'engreix a la nova dieta. En canvi, en la dieta SEGÓ la resposta inflamatòria va ser més prolongada, amb una important immunomodulació de les poblacions leucocitàries intestinals i amb increments dels macròfags sistèmics. Els canvis observats amb dieta GRO sobre l'estructura i sistema immunitari intestinals van ser marginals.Per últim, a l'experiment IV es van estudiar els efectes de la fibra alimentària, però a més llarg termini, amb l'administració prolongada (14 setmanes) i copiosa de midó resistent (25-35% de midó cru de patata; MCP), de fermentació butirogènica, en porcs d'engreix, com a potencial model animal per a nutrició humana. Els resultats indicaven que la fermentació del MCP incrementa la sulfatació de les mucines del colon, i redueix els índexs de dany cel·lular com la excreció de magnesi i la proliferació cel·lular en el colon. Alhora, la dieta rica en midó resistent va reduir la proporció de limfòcits T a sang i a l'epiteli del colon, l'apoptosi en la mucosa i els teixits limfoides intestinals, així com la presència de nòduls limfàtics a la mucosa. En conjunt, aquests resultats suggereixen una major integritat i protecció de la mucosa del colon, així com una menor activació limfocitària en els animals alimentats amb MCP. / The main objective of this PhD dissertation was to study the effect of several dietary components on the intestinal functionality in pigs; in particular, on the intestinal morphology and immunology during the stressful postweaning period (experiments I and II), as well as the adaptation period to the growing diet (experiments III and IV).Experiment I compared early-weaned piglets with matching piglets that remained with the sow. Growth performance was lower in weaned piglets. These animals showed villus atrophy and crypt hyperplasia in the jejunum, and lower numbers of goblet cells and increased inflammatory response and epithelial cell renewal in the caecum. As a whole, the observed inflammatory and degenerative alterations could limit the absorptive and digestive capacities of the early weaned piglets, and could help to explain its lower growth rate. In experiment II several dietary additives in the weaning diets, such as, a 6% spray-dried porcine plasma (SDPP; 6%) and a plant extract comercial additive which contains carvacrol, cinnamaldehyde and capsicum oleoresin (XT; 0.03%) were evaluated. Dietary SDPP increased feed efficiency of piglets. SDPP diet reduced the presence of lymphocytes in the mucosa and percentages of immune cell subsets in blood and in gut-associated lymphoid tissues (ileal Peyer's patches and ileocolic lymph node), suggesting lower activation of the immune system of the piglets. The plant extract mixture was also capable of modifying intestinal and systemic leukocyte cells, albeit in an inconsistent manner.In experiment III the influence of different types of dietary fibre in the diet of growing pigs: the coarse milled corn (CC; 54%), the sugar beet pulp (SBP; 8%) and the wheat bran (WB; 10%) as a source of resistant starch, or soluble or insoluble nonstarch polysaccharides, respectively, was evaluated. Compared to the control diet, diets with higher dietary fibre provoked an increase in the gastrointestinal tract weights and their contents. Initially, fibrous diets produced certain degree of colitis in pigs, with an increase in the immune cell activity against bacterial mitogens. However, in time, SBP diet reduced the presence of immune cells in the colonic mucosa, favouring the adaptation of the pigs to the growing diet. Conversely, in the WB group, the inflammatory response was longer, with a wider immunomodulation of intestinal leucocyte subsets and a higher numbers of blood macrophages. The changes observed in intestinal morphology and immunology in CC diet were marginal. Experiment IV aimed to assess the digestive consequences of a long-term intake of a dietary fibre. Growing pigs were used as the animal model and were meal-fed for 14 weeks on a diet containing a high amount of resistant starch (25-35% raw potato starch; RPS), which stimulates the formation of butyrate. RPS fermentation increased colonic mucin sulfatation and reduced indices associated with damage to intestinal epithelial cells, such as crypt cell hyperproliferation and magnesium excretion. Moreover, RPS diet reduced proportion of blood and intraepithelial T lymphocytes, apoptosis in intestinal mucosal tissues, and the presence of mucosal lymphoid nodules in the colon. As a whole, these results suggest that long term ingestion of RPS could improve integrity of colonic mucosa and induce lower immune reactivity.

Las defensinas son moléculas efectoras de la inmunidad innata con un amplio espectro antimicrobiano e importantes efectos inmunomoduladores. Dentro de su amplio espectro se incluye la inactivación del VIH, actuando directamente sobre el virus y también sobre las células diana. Nosotros hipotetizamos que las células dendríticas (DC) producirían alfa defensinas 1-3, lo que les permitirá inactivar al virus antes o después de su captura y hacer una presentación más eficiente a la célula CD4 sin producir su infección. Esta hipótesis predice que existirá una variabilidad interindividual en la producción de estas defensinas, lo que podrá constituir un factor de resistencia/susceptibilidad frente a la infección por VIH y su evolución a SIDA.En nuestros resultados encontramos que las DC inmaduras producen y secretan alfa-defensina 1-3 y que esta producción disminuye tras la maduración de las DC con distintos agentes madurativos. Además, las citocinas pro-inflamatorias y la infección viral aumentan la producción de defensinas, mientras que el tratamiento de las células con estrógeno la disminuye. Por otro lado, las alfa-defensinas 1-3 son capaces de modular la maduración y diferenciación de las DC e inducen la secreción de IL-8 de forma dosis-dependiente. Por último, el análisis de los pacientes infectados por VIH reveló que las DC de estos pacientes producen mayores niveles de alfa-defensinas 1-3 que los controles sanos. Además, dentro del grupo de infectados, aquellos que controlan espontáneamente la infección son los mayores productores. Se encontró asimismo una correlación positiva con los niveles de células T CD4 y una asociación entre mayores niveles de alfa-defensinas 1-3 secretadas por DC y una menor progresión de la enfermedad.En conclusión, una mayor producción de alfa-defensinas 1-3 por las DC de pacientes infectados por VIH será un factor protector frente a la evolución de la enfermedad. / Defensins are natural peptides with potent anti-HIV activity. In humans two subfamilies exist,beta- and alpha-defensins. Alpha-Defensins 1-3 are mainly secreted by neutrophils, although other leukocytes also produce them. Besides their direct antimicrobial effect, alpha-defensins1-3 also exert immunomodulory activities, chemoattracting leukocytes and inducing cytokines and chemokines production.We hypothesis that dendritic cells (DC) would produce alpha-defensins 1-3. The greater the production of alpha-defensins 1-3 by DC the greater the capacity to damage the HIV prior to and after its internalization and to perform a more efficient presentation to CD4+ T cells without infection. This hypothesis predicts a differential inter-individual expression of ¦Á-defensins1-3 by dendritic cells, which could be another resistance/susceptibility factor to HIV infection and AIDS progression.In our results we found that immature DC produce and secrete alpha-defensins 1-3 and this production was down-regulated after DC maturation with different maturative agents. Defensins production was up-regulated by pro-inflammatory cytokines and viral infection and strongly down-regulated by estrogen. In addition, alpha-defensins 1-3 were able to interfere with the maturation and differentiation of DC with opposite dose dependent effects. Moreover, alpha-defensins 1-3 induce a dose dependent IL-8 secretion by DC. The analysis of HIV-infected patients revealed that immature DC from HIV-infected patients secreted significantly higher levels of alpha-defensins 1-3 than healthy controls. Within the HIV-infected group, this production was statistically increased in untrated HIV-infected patients that spontaneously control the infection while in untreated viremic and treated HIV-infected patients the production was not significantly increased. The levels ofalpha-defensins 1-3 secreted by immature DC positively correlated with CD4 T cell counts in the controllers group, but not in viremic non-controllers and treated patients. HIV-infected patients with higher alpha-defensins 1-3 secretion by immature DC showed a slower disease progression, measured as no decrease in the number of CD4+ T- cells below 350 cell/mm3, lower increase in plasmatic viral load and no initiation of treatment over time.In conclusion, increased production of alpha-defensins 1-3 by dendritic cells in HIV-infected individuals is associated with a slower disease progression.

El objetivo de esta Tesis ha consistido en estudiar diversos aspectos de la biología de los macrófagos, células clave en el desarrollo de la respuesta inmunitaria. Los macrófagos se caracterizan por ser células que en los tejidos se encuentran proliferando y manteniendo su viabilidad gracias a la presencia de factores de crecimiento. Sin embargo, cuando reciben un estímulo activador, ya sea el IFN-gamma, principal activador endógeno de los macrófagos o bien el LPS, componente de las bacterias Gram negativas, dejan de proliferar y pasan a activarse y a desarrollar sus funciones características, como son la expresión de citocinas proinflamatorias (como el TNF-alfa Il-1beta, IL-6), la producción de NO o bien la expresión de las moléculas del MHC II. En algunos casos, por ejemplo en ausencia de factores de crecimiento o bien estimulados con LPS, los macrófagos experimentan apoptosis o muerte celular. Este trabajo se ha centrado en estudiar las diferentes vías de señalización que participan en las distintas respuestas de los macrófagos (como proliferación, activación, supervivencia y apoptosis). En este sentido se ha demostrado que la vía de señalización de MEK/ERK es esencial para los procesos de proliferación y activación, aunque lo hace con una cinética distinta. Mientras que estímulos proliferativos generan un pico corto y rápido de activación, estímulos que inducen la activación de los macrófagos como por ejemplo el LPS, la cinética de activación de estas quinasas es más tardía. Esta cinética de activación de ERK diferencial nos permite discernir entre estímulos proliferativos y activadores. Además se ha demostrado que el IFN-gamma, aunque no activa a las quinasas ERK, induce un alargamiento en el tiempo de la activación de estas quinasas a través de la inhibición de la expresión de MKP-1 inducida por factores de crecimiento. El alargamiento de actividad de ERK, inhibe la expresión de c-myc, proteína indispensable para la progresión del ciclo celular y por tanto inhibe la proliferación de los macrófagos. Por otro lado, hemos demostrado que la vía de señalización de PI-3K/AKT es la responsable de la expresión de p21Waf1 y responsable de la respuesta de supervivencia de los macrófagos debida a factores de crecimiento y otros agentes. También hemos visto que la ciclosporina, un inmunosupresor ampliamente utilizado para evitar el rechazo de los transplantes, inhibe la actividad de ERK inducida por el M-CSF lo que produce un bloqueo de la proliferación. Este efecto es independiente de la fosfatasa Calcineurina, principal diana de la ciclosporina.Además, también se ha analizado como el entorno celular puede afectar a las respuestas de proliferación y activación de los macrófagos. Se ha demostrado que un aumento de adhesión producido por la decorina y fibronectina inhibe la proliferación de los macrófagos a través de la expresión de p27Kip1 y la prolongación de la actividad ERK. La decorina aumenta la activación de los macrófagos a través del secuestro del TGF-beta? producido de forma endógena por estas células. Por ultimo el LPS, aunque es un buen activador de los macrófagos, induce apoptosis en determinadas situaciones, por ejemplo cuando dicha estimulación se produce de forma incorrecta, es decir, en ausencia de IFN-gamma o bien debido a dosis elevadas de LPS, responsables del shock séptico. La apoptosis inducida por el LPS se produce a través de dos vías de señalización independientes. Una primera vía mas temprana debida a la secreción autocrina de TNF-alfa y una segunda vía mas tardía, basada en la producción de NO. La apoptosis de los macrófagos inducida por el LPS se da principalmente a través de la producción de TNF-alfa que esta regulada mayoritariamente por PKC-epsilon a través de la modulación de la actividad JNK.

El procesamiento y la presentación de antígenos es un mecanismo clave en el desarrollo de la respuesta inmunitaria. En el presente trabajo, se ha estudiado la regulación de los genes tap1 y lmp2. Estos genes codifican proteínas cuyas funciones son vitales para la presentación antigénica de proteínas endógenas a través del MHC de clase I. La proteína lmp2 forma parte de un complejo multiproteico conocido como proteosoma, cuya función es la degradación de proteínas citosólicas dando lugar a la formación de péptidos. La proteína tap1 está implicada en el transporte de los péptidos al interior retículo endoplasmático, para su posterior carga en las moléculas de histocompatibilidad de clase I. Ambas proteínas son codificadas por genes que comparten una misma región promotora en sentidos opuestos.Los resultados confirman que la inducción de la expresión de los genes murinos tap1 y lmp2 mediada por el IFN-gamma tiene lugar en células de diferentes linajes y ocurre entre una y tres horas post-activación. El análisis de otros estímulos inductores de la expresión de tap1 y lmp2 demostró patrones de expresión diferentes del obtenido con el IFN-gamma. El LPS induce la expresión de tap1 y lmp2 a las seis horas de activación y el TNF-alfa a las 24 horas. En nuestros experimentos, observamos, en macrófagos derivados de médula ósea mantenidos en medio de cultivo en ausencia de suero (situación de estrés), una inducción de la expresión de los genes tap1 y lmp2. Esta inducción tiene lugar aproximadamente a las 24 horas del estímulo, siguiendo un patrón de inducción semejante al observado tras la activación con el TNF-alfa.Utilizando cicloheximida, un inhibidor de la síntesis proteica, se comprobó que la inducción de tap1 y lmp2 por el IFN-gamma no es dependiente de la síntesis proteica. Los tránscritos de ARN son altamente estables, ya que sus niveles no decaen de forma rápida en presencia de actinomicina D, que actúa bloqueando la transcripción. La elevada estabilidad de los ARNm indica que el IFN-gamma no modifica la vida media del ARN, sino que actúa a nivel de la transcripción de los dos genes.Se determinó utilizando ratones knock out para STAT1 que este factor de transcripción está implicado en la señal de transducción por el IFN-gamma, el LPS y el TNF-alfa. Sin embargo, la expresión de tap1 y lmp2 inducida por el IFN-alfa/beta es independiente de STAT1. Las cajas reguladoras GAS e IRF-1 son esenciales en la inducción de la expresión de tap1 y lmp2 mediada por el IFN-gamma. En cambio, sólo la caja GAS está implicada en la inducción de ambos genes por el LPS. Finalmente, las cajas IRF-1 y NFB son esenciales en el caso de la activación mediada por el TNF-alfa.Los estímulos inhibidores TGF-beta y los glucocorticoides, inhiben la expresión de los genes tap1 y lmp2 inducida por el IFN-. Nuestros resultados demuestran también que la expresión de PU.1 en los fibroblastos murinos, mediante la transfección de un vector de expresión que codifica para esta proteína, inhibe la expresión de los genes tap1 y lmp2 inducida por IFN-gamma. Posiblemente, debido a la localización de una caja PU.1 dentro de la caja GAS, el factor de transcripción PU.1 puede afectar a la transcripción de los ARNm para tap1 y lmp2 En resumen, en este trabajo hemos determinado la regulación de los genes tap1 y lmp2 implicados en la presentación antigénica a través de las moléculas del MHC de clase I. Existen citocinas que son capaces de inducir mientras que otras inhiben la expresión de tap1 y lmp2. Las vías de señalización comparten elementos comunes como STAT1, así como regiones promotoras implicadas en la regulación génica.