No description available.

No description available.

<p>We showed previously that histone deacetylase (HDAC) inhibition with MS-275 in the context of boosting oncolytic immunotherapy can drive heightened antitumor responses, leading to increased survival in mouse intracranial melanoma models. However, it is currently unclear how the co-administration of MS-275 directly impacts tumor growth. Here, we investigated the role of MS-275 in preventing the outgrowth of antigen-deficient tumor variants as a result of suboptimal treatment protocols. By adoptively transferring tumor antigen-specific memory T cells (Tm) that were expanded <em>in vivo</em> with recombinant Vesicular Stomatitis Virus (VSV-gp33), we observed complete regression of 5-day old, intradermal B16-gp33 tumors (B16-F10 overexpressing the LCMV GP33-41 epitope); however, the tumors relapsed within a month of treatment. Relapsing tumor explants were able to grow in mice that were prophylactically immunized with recombinant Adenovirus (Ad-gp33), indicating that the tumor could no longer be recognized. Strikingly however, there was zero tumor recurrence if MS-275 was co-administered with Tm and VSV-gp33, suggesting that MS-275 may prevent the emergence and/or escape of antigen loss variants. Such a benefit is lost if the administration of the drug is delayed as little as five days post VSV treatment, suggesting that its synergistic effects coincide with early immune responses and oncolytic activity. Furthermore, transplantation studies of relapsing tumor explants showed that combination treatment was unable to provide tumor protection, confirming that the mechanisms by which MS-275 prevents tumor recurrence are unlikely through direct up-regulation of antigen presentation in low- or non-antigen-expressing variants <em>in vivo</em>. Indeed, CD4 depletion in the absence of MS-275 resulted in sustained tumor regression, implying that immunoregulatory cells such as CD4+ Treg play a prominent role in sustaining tumor regression. Moreover, MS-275 modulates the phenotypic status of tumor-infiltrating MDSCs toward the differentiation of inflammatory macrophages. Taken together, the data suggests that combination therapy with HDACi with oncolytic immunotherapy mediates a synergized immune attack against the tumor through subversion of immunomodulatory mechanisms.</p> / Master of Science in Medical Sciences (MSMS)

[ES] Esta tesis doctoral titulada "El microambiente tumoral inflamatorio como objetivo en el diseño de nanoconjugados para el tratamiento del cáncer de mama avanzado" se centra en la evaluación de un nuevo inhibidor del inflamasoma (MM01) como herramienta química para estudiar el papel del inflamasoma en modelos de inflamación y cáncer. El capítulo I incluye una descripción general del sistema inmune, los inflamasomas dependientes de ASC y el papel que juegan en el desarrollo de enfermedades. También se profundiza en el papel de los inflamasomas y de la proteína ASC en la progresión del cáncer de mama. Además, se incluyen conceptos básicos de nanotecnología, nanomedicina y polímeros terapéuticos. Finalmente, se abordan las ventajas de utilizar nanomedicinas como terapia, las interacciones de las nanomedicinas con los sistemas biológicos, los nanofármacos descritos en la literatura, así como sus posibilidades de traslación a la práctica clínica. En los capítulos de resultados, delineamos un novedoso mecanismo de acción para MM01, un modulador de la actividad del inflamasoma recientemente identificado: la inhibición de la oligomerización del ASC y el subsiguiente procesamiento reducido de la pro-caspasa-1 y la inhibición de la actividad de la caspasa-1. Demostramos que MM01 interrumpe el proceso de oligomerización de ASC asociado a la actividad de varios inflamasomas e inhibe la liberación de IL-1ß y la piroptosis en varios modelos celulares de inflamación. MM01 también reduce la infiltración de neutrófilos y la acumulación de citoquinas pro-inflamatorias en un modelo in vivo de peritonitis. Dada la implicación de la función de ASC en múltiples complejos del inflamasoma, el tratamiento con MM01 puede representar un enfoque terapéutico eficaz para tratar aquellas enfermedades en las que está implicada la activación de múltiples inflamasomas. Teniendo en cuenta los resultados obtenidos, empleamos nuestro inhibidor del inflamasoma, MM01, para estudiar el papel del inflamasoma en la progresión tumoral en diferentes modelos de cáncer de mama tanto in vitro como in vivo. Demostramos que diferentes líneas celulares de cáncer de mama responden de forma diferente al tratamiento con MM01. Desarrollamos un ensayo funcional que comprende la evaluación de la migración de las células de cáncer de mama en respuesta al secretoma pro-inflamatorio de los macrófagos M1 (estímulo inflamatorio) en presencia de MM01. Ciertas líneas celulares (como la línea celular EO771) mostraron un aumento de la migración en respuesta al estímulo inflamatorio y una disminución de la migración en respuesta al tratamiento con MM01; sin embargo, también identificamos líneas celulares que responden negativamente al tratamiento con MM01 (como la línea celular 4T1). Por último, demostramos la eficacia de este experimento funcional in vivo demostrando que el tratamiento con MM01 redujo el tamaño del tumor en el modelo ortotópico EO771 pero aumentó el tamaño del tumor y la metástasis pulmonar en el modelo ortotópico 4T1. Estos dos modelos, que recapitulan respuestas contradictorias al tratamiento con nuestro inhibidor del inflamasoma, podrán utilizarse en el futuro para determinar biomarcadores que predigan la respuesta. Por último, desarrollamos una estrategia sintética para obtener un nuevo nanomedicamento que mejora la solubilidad y la orientación tumoral del MM01 en un modelo de cáncer de mama. Implementamos un enfoque híbrido de conjugación-complejación que comprende la conjugación de ß-ciclodextrina con un ácido lineal poli-L-glutámico (PGA) (L-PGA-ßCD) para proporcionar la capacidad de atrapar MM01 dentro de los anillos de ciclodextrina. El nanosistema obtenido mostró una mejor solubilidad en soluciones acuosas en comparación con la forma libre de MM01. Nuestro nanosistema demostró una mejor eficacia en un modelo ortotópico de cáncer de mama al producir una mayor reducción del tamaño del tumor en aquellos ratones tratados con la nanomedicina L-PGA-CD-MM01. / [CA] Aquesta tesi doctoral titulada "El microambient tumoral inflamatori com a objectiu en el disseny de nanoconjugats per al tractament del càncer de mama avançat" se centra en l'avaluació d'un nou inhibidor del inflamasoma (MM01) com a eina química per a estudiar el paper del inflamasoma en models d'inflamació i càncer. El capítol I inclou una descripció general del sistema immune, els inflamasomas dependents de ASC i el paper que juguen en el desenvolupament de malalties. També s'aprofundeix en el paper dels inflamasomas i de la proteïna ASC en la progressió del càncer de mama. A més, s'inclouen conceptes bàsics de nanotecnologia, nanomedicina i polímers terapèutics. Finalment, s'aborden els avantatges d'utilitzar *nanomedicinas com a teràpia, les interaccions de les nanomedicines amb els sistemes biològics, els nanofármacs descrits en la literatura, així com les seues possibilitats de translació a la pràctica clínica. En els capítols de resultats, delineem un nou mecanisme d'acció per a MM01, un modulador de l'activitat del s*inflamasoma recentment identificat: la inhibició de la oligomerización del ASC i el subsegüent processament reduït de la pro-caspasa-1 i la inhibició de l'activitat de la caspasa-1. Vam demostrar que MM01 interromp el procés de oligomerización de ASC associat a l'activitat de diversos inflamasomas i inhibeix l'alliberament de IL-*1ß i la piroptosis en diversos models cel·lulars d'inflamació. MM01 també redueix la infiltració de neutròfils i l'acumulació de citocines pro-inflamatòries en un model in vivo de peritonitis. Donada la implicació de la funció de ASC en múltiples complexos del *inflamasoma, el tractament amb MM01 pot representar un enfocament terapèutic eficaç per a tractar aquelles malalties en les quals està implicada l'activació de múltiples *inflamasomas. Tenint en compte els resultats obtinguts, emprem el nostre inhibidor del *inflamasoma, MM01, per a estudiar el paper del *inflamasoma en la progressió tumoral en diferents models de càncer de mama tant in vitro com in vivo. Vam demostrar que diferents línies cel·lulars de càncer de mama responen de forma diferent del tractament amb MM01. Desenvolupem un assaig funcional que comprén l'avaluació de la migració de les cèl·lules de càncer de mama en resposta al secretoma pro-inflamatori dels macròfags M1 (estímul inflamatori) en presència de MM01. Unes certes línies cel·lulars (com la línia cel·lular EO771) van mostrar un augment de la migració en resposta a l'estímul inflamatori i una disminució de la migració en resposta al tractament amb MM01; no obstant això, també identifiquem línies cel·lulars que responen negativament al tractament amb MM01 (com la línia cel·lular 4T1). Finalment, vam demostrar l'eficàcia d'aquest experiment funcional in vivo demostrant que el tractament amb MM01 va reduir la grandària del tumor en el model ortotòpic EO771 però va augmentar la grandària del tumor i la metàstasi pulmonar en el model ortotòpic 4T1. Aquests dos models, que recapitulen respostes contradictòries al tractament amb el nostre inhibidor del *inflamasoma, podran utilitzar-se en el futur per a determinar biomarcadors que prediguen la resposta. Finalment, desenvolupem una estratègia sintètica per a obtindre un nou nanomedicament que millora la solubilitat i l'orientació tumoral del MM01 en un model de càncer de mama. Implementem un enfocament híbrid de conjugació-complexació que comprén la conjugació de ß-ciclodextrina amb un àcid lineal *poli-L-glutàmic (PGA) (L-PGA-ßCD) per a proporcionar la capacitat d'atrapar MM01 dins dels anells de ciclodextrina. El nanosistema obtingut va mostrar una millor solubilitat en solucions aquoses en comparació amb la forma lliure de MM01. El nostre nanosistema va demostrar una millor eficàcia en un model ortotòpic de càncer de mama en produir una major reducció de la grandària del tumor en aquells ratolins tractats amb la nanomedicina L-PGA-CD-MM01. / [EN] This PhD thesis entitled "The inflammatory tumor microenvironment as a target in the design of nanoconjugates for the treatment of advanced breast cancer" focuses on the evaluation of a novel inflammasome inhibitor (MM01) as a chemical tool to study the role of the inflammasome in models of inflammation and cancer. Chapter I includes an overview of the immune system, ASC-dependent inflammasomes and the role they play in disease development. It also delves into the role of inflammasomes and ASC protein in breast cancer progression. In addition, basic concepts of nanotechnology, nanomedicine and therapeutic polymers are included. Finally, the advantages of using nanomedicines as therapeutics, the interactions of nanomedicines with biological systems, the nanodrugs described in the literature, as well as their translation possibilities to clinical practice are discussed. In the results chapters, we delineate a novel mechanism of action for MM01, a recently identified modulator of inflammasome activity: inhibition of ASC oligomerization and subsequent reduced pro-caspase-1 processing and inhibition of caspase-1 activity. We demonstrate that MM01 disrupts the ASC oligomerization process associated with the activity of several inflammasomes and inhibits IL-1ß release and pyroptosis in several cellular models of inflammation. MM01 also reduces neutrophil infiltration and pro-inflammatory cytokine accumulation in an in vivo model of peritonitis. Given the involvement of ASC function in multiple inflammasome complexes, treatment with MM01 may represent an effective therapeutic approach to treat those diseases in which multiple inflammasome activation is involved. Considering the results obtained, we employed our inflammasome inhibitor, MM01, to study the role of the inflammasome in tumor progression in different breast cancer models both in vitro and in vivo. We demonstrate that different breast cancer cell lines respond differently to MM01 treatment. We developed a functional assay involving the assessment of breast cancer cell migration in response to the pro-inflammatory M1 macrophage secretome (inflammasome stimulus) in the presence of MM01. Certain cell lines (such as the EO771 cell line) showed increased migration in response to the inflammatory stimulus and decreased migration in response to MM01 treatment; however, we also identified cell lines that respond negatively to MM01 treatment (such as the 4T1 cell line). Finally, we demonstrated the efficacy of this functional experiment in vivo by showing that MM01 treatment reduced tumor size in the orthotopic EO771 model but increased tumor size and lung metastasis in the orthotopic 4T1 model. These two models, which recapitulate conflicting responses to treatment with our inflammasome inhibitor, may be used in the future to determine biomarkers predictive of response. Finally, we developed a synthetic strategy to obtain a novel nanomedicine that enhances the solubility and tumor targeting of MM01 in a breast cancer model. We implemented a hybrid conjugation-complexation approach comprising the conjugation of ß-cyclodextrin to a linear poly-L-glutamic acid (PGA) (L-PGA-ßCD) to provide the ability to trap MM01 within the cyclodextrin rings. The obtained nanosystem showed improved solubility in aqueous solutions compared to the free form of MM01. Our nanosystem demonstrated improved efficacy in an orthotopic breast cancer model by producing a greater reduction in tumor size in those mice treated with the L-PGA-CD-MM01 nanomedicine. / Soriano Teruel, P. (2023). Inflammatory Tumor Microenvironment as target in the design of nanoconjugates for the treatment of advanced breast cancer [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/192498

Introduction: Malignant Melanoma (MM), caused by UV radiation-induced DNA damage, is the most invasive form of skin cancer and has an increasing incidence worldwide. The hallmarks of MM include the presence of reactive oxygen species (ROS) and excessive proliferation of tumour cells. Many treatments are available or under investigation as anticancer therapeutics such as cell therapy, immunotherapy, gene therapy and nanotechnology-based strategies but they all have severe complications and side effects that limit their wider use. Methods: The present in vitro study has evaluated the genotoxic and cytotoxic effects of Se and CBSC-derived exosomes, individually and in combination, on lymphocytes from MM patients and healthy controls, and on the CHL-1 melanoma cell line. The comet assay and cell counting kit-8 (CCK-8) assay were used to measure genotoxicity and cytotoxicity, respectively, in all cell types. Molecular mechanisms underlying the observed effects were explored using transcriptional and protein expression profiling of key cell cycle and apoptosis genes, by employing the RT qPCR and Western blotting techniques. Conclusion: Selenium displays antioxidant and genoprotective effects in human lymphocytes, especially in MM patients. Both Se (10 μM) and CBSC-derived exosomes (120 μL) are well tolerated in lymphocytes, but show significant genotoxicity and cytotoxicity towards the CHL-1 cell line, with combined administration exhibiting a synergistic effect.

L'immunothérapie, en particulier l'utilisation d'inhibiteurs de PD-1 et de PD-L1, a révolutionné le traitement du cancer. Cependant, son efficacité varie, certains patients présentant une réponse limitée ou une rechute, souvent liée à une forte expression de PD-L1 dans le microenvironnement tumoral. Des recherches récentes suggèrent que les effecteurs de la voie Hippo, YAP et TAZ, pourraient jouer un rôle crucial dans la régulation de l'expression de PD-L1 dans les cellules cancéreuses, y compris celles du sein et du poumon. La voie Hippo, qui contrôle la survie cellulaire, la prolifération et la taille des organes, agit par l'inhibition médiée par la kinase Lats1/2 de YAP/TAZ. Lorsqu'ils ne sont pas phosphorylés, YAP/TAZ se déplacent vers le noyau, affectant l'expression de gènes tels que PD-L1 et PD-1. De plus, les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG), y compris le récepteur de type 1 à l'angiotensine II (AT1), ont été identifiés comme des modulateurs potentiels de la réponse immunitaire dans le cancer. Cette étude vise à développer et valider de nouveaux biosenseurs basés sur la BRET pour observer l'activité de la voie Hippo en suivant le mouvement de YAP et de TAZ du cytoplasme au noyau et pour évaluer la capacité de ces capteurs à surveiller différents signaux stimulants, y compris la stimulation AT1R, offrant ainsi des aperçus de nouvelles stratégies thérapeutiques en immuno-oncologie. L'immunothérapie est apparue comme une approche révolutionnaire pour pallier les limites des traitements anticancéreux traditionnels, introduisant des médicaments ciblant les points de contrôle immunitaires, tels que les inhibiteurs de PD-1 (protéine de mort cellulaire programmée 1) et de PD-L1 (ligand de mort cellulaire programmée 1). Cependant, certains patients présentent une réponse inadéquate ou une rechute après traitement, notamment ceux avec une expression accrue de PD-L1 dans le microenvironnement tumoral. En conséquence, la modulation de PD-1 et de PD-L1 émerge comme une branche potentielle des thérapies immuno-basées. Des investigations récentes suggèrent que les effecteurs de la voie Hippo, YAP et TAZ, pourraient influencer la réponse immunitaire en régulant transcriptionnellement PD-L1 dans diverses cellules cancéreuses, y compris celles du sein et du poumon. Mécanistiquement, la kinase Lats1/2 inhibe YAP/TAZ par phosphorylation directe, les séquestrant dans le cytoplasme, tandis que YAP/TAZ non phosphorylés se transloquent dans le noyau, médiatisant la sortie transcriptionnelle de gènes tels que PD-L1 et PD-1. La signalisation des RCPG a été proposée comme un modulateur 4 potentiel de la réponse immunitaire au cancer, avec le récepteur de type 1 à l'angiotensine II (AT1) suggéré comme un médicament combiné potentiel pour les traitements en immunooncologie. Par conséquent, ce travail vise à développer et valider de nouveaux biosenseurs basés sur la BRET pour évaluer la voie Hippo en surveillant la translocation de YAP et de TAZ du cytoplasme au noyau et pour évaluer la capacité de ces capteurs à surveiller différents signaux stimulants, y compris la stimulation AT1R. Cette étude visait à développer et à valider des biosenseurs pour surveiller l'activité de la voie Hippo en évaluant la translocation de YAP et de TAZ à l'aide du transfert d'énergie de résonance bioluminescente améliorée (ebBRET). Des défis techniques ont entravé la validation complète sous différents stimuli, mais la manipulation de la densité cellulaire a validé la fonctionnalité du capteur. L'identification du récepteur AT1 comme un modulateur de la relocalisation de YAP médiée par les RCPG souligne la nécessité d'explorer l'interaction entre la signalisation des RCPG et la voie Hippo. La sélection minutieuse des activateurs et la validation complète sont cruciales pour élucider le réseau régulateur de YAP/TAZ dans le développement du cancer. / Immunotherapy, particularly the use of PD-1 and PD-L1 inhibitors, has revolutionized cancer treatment. However, its effectiveness varies, with some patients showing limited response or relapse, often linked to high PD-L1 expression in the tumor microenvironment. Recent research suggests that the Hippo pathway effectors, YAP and TAZ, may play a crucial role in regulating PDL1 expression in cancer cells, including breast and lung cancers. The Hippo pathway, which controls cell survival, proliferation, and organ size, operates through the Lats1/2 kinase-mediated inhibition of YAP/TAZ. When not phosphorylated, YAP/TAZ move to the nucleus, affecting the expression of genes like PD-L1 and PD-1. Furthermore, G protein-coupled receptors (GPCRs), including the Angiotensin II type 1 (AT1) receptor, have been identified as potential modulators of the immune response in cancer. This study aims to develop and validate novel BRET-based biosensors to observe the Hippo pathway's activity by tracking the movement of YAP and TAZ from the cytoplasm to the nucleus and to assess various stimulatory signals, including AT1R stimulation, offering insights into new therapeutic strategies in immuno-oncology Immunotherapy has emerged as a revolutionary approach to address the limitations of traditional cancer treatments, introducing drugs that target immune checkpoints, such as PD-1 (Programmed Cell Death Protein 1) and PD-L1 (Programmed Cell Death Ligand 1) inhibitors. Yet, some patients exhibit inadequate response or experience relapse post-treatment, especially those with heightened PD-L1 expression in the tumor microenvironment. Consequently, modulation of PD-1 and PD-L1 has emerged as a potential branch of immuno-based therapies. Recent investigations propose that the Hippo pathway effectors, YAP and TAZ, may influence the immune response by transcriptionally regulating PD-L1 in various cancer cells, including breast and lung cancer. Mechanistically, Lats1/2 kinase inhibits YAP/TAZ through direct phosphorylation, leading to their sequestration in the cytoplasm, while unphosphorylated YAP/TAZ translocate to the nucleus, mediating the transcriptional output of genes such as PD-L1 and PD-1. G proteincoupled receptors (GPCRs) signaling has been proposed as a potential modulator of the immune response to cancer, with the Angiotensin II type 1 (AT1) receptor suggested as a potential combination drug for immune-oncology treatments. Therefore, this work aims to develop and validate new BRET-based biosensors to evaluate the Hippo pathway by monitoring the 6 translocation of YAP and Taz from the cytoplasm to the nucleus and to evaluate the ability of these sensors to monitor different stimulatory signals, including AT1R stimulation. This study aimed to develop and validate biosensors for monitoring Hippo pathway activity by assessing YAP and TAZ translocation using enhanced bioluminescence resonance energy transfer (ebBRET). Technical challenges hindered comprehensive validation under different stimuli, yet cell density manipulation validated sensor functionality. Identification of AT1 receptor as a modulator of GPCR-mediated YAP relocalization underscores the need to explore GPCR-Hippo pathway interplay. Meticulous activator selection and comprehensive validation are crucial for unraveling YAP/TAZ's regulatory network in cancer development.

Le système immunitaire est divisé en deux réponses : innée et adaptative. Dans la réponse adaptative, les principaux acteurs sont les cellules T CD8 et CD4, dont l'activation est médiée par le complexe antigène-récepteur (TCR) et la génération de signaux intracellulaires. L'intensité du signal est contrôlée par l'affinité du ligand impliquant la kinase p56lck et la protéine adaptatrice SLP-76. Les souris dépourvues de SLP-76 sont bloquées dans leur développement thymique, ce qui rend difficile l'évaluation de l'importance de l'adaptateur, dans la fonction des cellules T périphériques. Récemment, le laboratoire Rudd a généré une souris knock-in (KI) avec une forme de SLP-76 mutée au niveau d'un seul résidu, K56, ayant des cellules T périphériques normales. Cette mutation empêche SLP-76 de se lier au complexe de pore nucléaire (CPN). L'objectif de ce mémoire est de comprendre le rôle de SLP-76, plus particulièrement du mutant K56E dans le contrôle de certains aspects de la fonction des cellules T périphériques. K56E sur un fond transgénique OT1, a montré une déficience partielle de la fonction et du métabolisme des cellules T en réponse à des ligands peptidiques d'ovalbumine de poulet, de différentes affinités. Plus précisément, les voies de la glycolyse et de la phosphorylation oxydative en ont été altérées. Dans l'ensemble, l'altération des fonctions et du métabolisme des lymphocytes T chez le mutant K56E confirme l'existence d'un lien entre le SLP-76 et le métabolisme des lymphocytes T, ce qui pourrait avoir des implications importantes dans le développement de thérapies ciblant la fonction des lymphocytes T. / The immune system is divided into two responses: innate and adaptive. In the adaptive response, the main players are CD8 and CD4 T-cells whose activation is mediated by ligation of the antigen-receptor complex (TCR) and its generation of intracellular signals. The strength of signal is controlled by the affinity of the ligand in a process that involves upstream kinases such as p56lck and downstream targets such as the adaptor protein SLP-76. Mice lacking SLP-76 are blocked in thymic development, making it difficult to assess the importance of the adaptor in peripheral T-cell function. Recently, the Rudd lab generated a knock-in (KI) mouse with a form of SLP-76 mutated at a single residue K56 which shows a normal peripheral T-cell compartment. The mutant prevents SLP-76 binding to the nuclear pore complex (NPC). The object of this dissertation is to understand role of SLP-76 and specifically the K56E mutant in the control of aspects of peripheral Tcell function. The K56E mutant on an OT1 TCR transgenic background showed a partial impairment of T-cell function and metabolism in response to chicken ovalbumin peptide ligands of different affinities. Specifically, both glycolysis and oxidative phosphorylation pathways were impaired in response to peptide ligand activation. Overall, the impairment of T-cell function and metabolism in the K56E mutant supports a link between SLP-76 and T-cell metabolism which may have important implications in the development of therapies targeting T-cell function.

This report presents a deep learning based approach for segmenting and characterizing tumor cell deaths using images provided by the Önfelt lab, which contain NK cells and HL60 leukemia cells. We explore the efficiency of convolutional neural networks (CNNs) in distinguishing between live and dead tumor cells, as well as different classes of cell death. Three CNN architectures: MobileNetV2, ResNet-18, and ResNet-50 were employed, utilizing transfer learning to optimize performance given the limited size of available datasets. The networks were trained using two loss functions: weighted cross-entropy and generalized dice loss and two optimizers: Adaptive moment estimation (Adam) and stochastic gradient descent with momentum (SGDM), with performance evaluations based on metrics such as mean accuracy, intersection over union (IoU), and BF score. Our results indicate that MobileNetV2 with cross-entropy loss and the Adam optimizer outperformed other configurations, demonstrating high mean accuracy. Challenges such as class imbalance, annotation bias, and dataset limitations are discussed, alongside potential future directions to enhance model robustness and accuracy. The successful training of networks capable of classifying all identified types of cell death, demonstrates the potential for a deep learning approach to identify different types of cell deaths as a tool for analyzing immunotherapeutic strategies and enhance understanding of NK cell behaviors in cancer treatment.

Le glioblastome (GBM) représente environ 50 % des gliomes, le type de tumeur cérébrale le plus répandu. Sa forte agressivité se traduit par un faible et inquiétant taux de survie médian de 8 mois. La résistance intensive aux traitements actuels du GBM souligne la nécessité d'approches innovantes. Malgré l'essor récent d’immunothérapies ces dernières années, le GBM présente plusieurs attributs qui entravent l’efficacité de ces thérapies. Les cellules Natural Killer (NK) possèdent d’intéressantes propriétés anti-tumorales qui encouragent leur utilisation en tant que source prometteuse de thérapie cellulaire adoptive pour relever les défis posés par le GBM. Ce projet est une collaboration avec Scott McComb (National Research Center, Ottawa), dont l'équipe a développé des vecteurs lentiviraux de récepteurs antigéniques chimériques (CARs) ciblant EGFRvIII et HER2, respectivement exprimés dans 30 % et surexprimés dans 80 % des cas de GBM. Nous proposons d’adapter ces constructions aux domaines activateurs transmembranaires et intracellulaires optimisés pour la signalisation des cellules NK. L’objectif est d'optimiser la stabilité de l'expression CAR dans les cellules NK. Cela permettra d'augmenter durablement l'efficacité et la spécificité de la cytotoxicité cellulaire de cellules cancéreuses EGFRvIII+ et HER2+. Des vecteurs lentiviraux codant pour le rapporteur eGFP sous 5 promoteurs différents ont été produits. Des cellules NK primaires activées ont été modifiées par transduction lentivirale et triées en fonction de l'expression du transgène afin d'enrichir la population de cellules modifiées. Nos données suggèrent que la séquence régulatrice minimale UCOE pourrait conférer à elle seule une expression stable et robuste du transgène dans les cellules NK pendant 12 semaines. Ce promoteur a ensuite été incorporé dans les constructions CAR-NK pour optimiser la stabilité d’expression du CAR. L’efficience des CAR anti-EGFRvIII et des CAR anti-HER2 ont été évaluées in vitro en utilisant la lignée cellulaire U87 dérivée du GBM dans des tests de cytotoxicité. Parmi les constructions sélectionnées, CAR-F269 et sdCAR-HER2-6 ont montré une cytotoxicité significativement améliorée par rapport aux cellules NK non modifiées contre des cibles spécifiques de l'antigène. L'amélioration de la cytotoxicité observée avec sdCAR-HER2-6 était positivement corrélée à l'intensité de l'expression de HER2 dans les cellules cibles. Ce projet représente une preuve de principe qui suggère le potentiel de la thérapie CAR-NK comme une voie prometteuse dans la lutte contre le GBM et d'autres tumeurs solides. / Glioblastoma (GBM) accounts for approximately 50% of gliomas, the most prevalent type of brain tumor. Its high aggressiveness results in a worrying poor median survival rate of 8 months. Intensive resistance to current treatments for GBM highlights the need for innovative approaches. Despite recent growth in immunotherapies, GBM exhibits several hallmarks that hinder effectiveness of such therapies. Natural killer (NK) cells display interesting anti-tumoral properties that encourage their use as a promising adoptive cell therapy source to address the GBM challenges. This project is a collaboration with Scott McComb (National Research Center, Ottawa), whose team developed lentiviral vectors coding for chimeric antigen receptors (CARs) targeting EGFRvIII and HER2, which are respectively expressed in 30% and overexpressed in 80% of GBM cases. We propose to adapt these constructs to transmembrane and intracellular activator domains which are optimized for NK cell signaling. The objective is to optimize the stability of CAR expression in NK cells. This will allow for a sustained increase in killing efficacy and specificity of EGFRvIII+ and HER2+ cells. First, lentiviral vectors encoding the eGFP reporter under 5 different promoters were produced. Activated primary NK cells were modified by lentiviral transduction and sorted for transgene expression to enrich the population of modified cells. Our data suggest that the minimal regulatory sequence UCOE may confer alone a stable and robust transgene expression in NK cells for 12 weeks. The UCOE promoter was then incorporated into CAR-NK constructs to optimize the stability of CAR expression. The efficiency of anti-EGFRvIII CARs and anti-HER2 CARs were evaluated in vitro using the GBM-derived U87 cell line in cytotoxicity assays. Among the screened constructs, CAR-F269 and sdCAR-HER2-6 exhibited significantly enhanced cytotoxicity against antigen-specific targets, in comparison to unmodified NK cells. The enhancement of cytotoxicity observed with sdCAR-HER2-6 was found to positively correlate with the intensity of HER2 expression in the target cells. This project represents a proof of principle that suggests the potential of CAR-NK therapy as a promising avenue of in the fight against GBM.

[ES] En esta tesis, buscamos profundizar en el estudio del microambiente inmunitario del tumor (TME), lo que resultaría en una mejor caracterización del contexto inmunológico de los pacientes y la búsqueda de nuevos biomarcadores en el cáncer de pulmón. Se emplearon cultivos derivados de pacientes con cáncer de pulmón, y líneas celulares comerciales para ensayos de formación de tumoresferas y condiciones adherentes como control. Se analizó la expresión génica de diversos factores inmunorreguladores, observándose una mayor expresión de la mayoría de ellos en las tumoresferas en comparación con las células adherentes. Junto con la secreción, la Galectina-3 (GAL3 o LGALS3 cuando se referencian la proteína o el gen, respectivamente) se seleccionó como la molécula que podría tener una fuerte implicación en la modulación del TME. Los análisis proteicos confirmaron que la GAL3 aumentaba en las tumoresferas de cultivos de adenocarcinoma (ADC) y mostraba patrones de localización y expresión diferencial. Las vesículas extracelulares procedentes de tumoresferas exhibieron niveles altos de LGALS3. Además, revelamos que la GAL3 podría desempeñar un papel crucial como molécula inmunomoduladora en el TME, modulando la inmunosupresión a través de las células T reguladoras (TREGS). Esto se confirmó en muestras tumorales de pacientes, dónde los niveles de expresión altos de LGALS3, se correlacionaron con mayores niveles de TREGS, sugiriendo que los tumores pueden reclutar esta población a través de la GAL3. Posteriormente, se evaluaron los roles pronósticos y diagnósticos de la GAL3 soluble (sGAL3) y otros factores inmunorreguladores (sICOSL, sFGL1, sGAL1, sMICA, sMICB, sCD276) en una cohorte de 94 pacientes con cáncer de pulmón en estadios tempranos resecables (cohorte test). sFGL1, sGAL3 y su combinación mostraron una eficacia diagnóstica óptima para nuestros pacientes. El análisis de supervivencia demostró que, en la sub-cohorte de ADC, los pacientes con niveles altos de sGAL3 experimentaron una supervivencia libre de recaída (SLR) (p=0,048) y una supervivencia global (SG) más corta (p=0,021), mientras que no se observó ninguna asociación en la sub-cohorte de pacientes con carcinoma de células escamosas. El análisis multivariante indicó que sGAL3 podría ser un biomarcador pronóstico independiente para SLR y SG. La expresión génica de nuestro panel de factores inmunoreguladores también se analizó en un grupo independiente de 661 pacientes de TCGA (cohorte de validación), confirmando el valor pronóstico independiente de LGALS3 en la sub-cohorte de ADC para SLR (p=0,021) y SG (p=0,004). El papel diagnóstico, predictivo y pronóstico de estos factores se evaluó en muestras de plasma en el momento basal (PRE) y en la evaluación de la primera respuesta (FR) en una cohorte de 52 pacientes con cáncer de pulmón en estadio avanzado tratados en primera línea con pembrolizumab. sFGL1, sGAL3 y su combinación de nuevo ofrecieron una eficacia diagnóstica óptima para esta cohorte de pacientes. Los niveles de sGAL3 en FR y sMICB en PRE y FR se asociaron con un beneficio clínico en toda la cohorte y en la subcohorte de ADC. sCD276 también se asoció con la respuesta global en toda la cohorte y en la sub-cohorte de ADC. sMICB en FR se identificó como un biomarcador independiente para la supervivencia libre de progresión (SLP) en toda la cohorte y para SLP y SG en la sub-cohorte de ADC. Además, sGAL3 en PRE se encontró como un biomarcador independiente para SLP y SG en toda la cohorte y en FR se identificó como biomarcador independiente para SG en la sub-cohorte ADC. Una disminución en los niveles de sGAL3 en los pacientes en tratamiento se asoció con una reducción en la SG en toda la cohorte. En conclusión, nuestros hallazgos proporcionan información diagnóstica, pronóstica y predictiva relevante del rol de la GAL3 y otros factores inmunoreguladores para los pacientes con cáncer de pulmón y sirven como base para el desarrollo de nuevos biomarcadores y terapias. / [CA] En aquest estudi, busquem profunditzar en l'estudi del microambient immunològic del tumor (TME), el que resultaria en una millor caracterització del context immunològic dels pacients i la recerca de nous biomarcadors en el càncer de pulmó. S'utilitzaren cultius de llarg termini establits a partir de pacients amb càncer de pulmó en etapa primerenca, i línies cel·lulars comercials per a assajos de formació de tumorsferes per a l'enriquiment de cèl·lules mares canceroses i condicions adherents com a control. S'analitzà l'expressió gènica de diversos factors immunoreguladors, i es va observar una major expressió de la majoria d'ells en les tumorsferes en comparació amb les cèl·lules adherents. Juntament la secreció, la Galectina-3 (GAL3 o LGALS3 quan es fa referència a la proteïna o al gen, respectivament) es va seleccionar com la molècula que podria tindre una forta implicació en la modulación del TME. Els anàlisis proteics van confirmar que la GAL3 augmentava consistentment en les tumorsferes de cultius d'adenocarcinoma de pulmó (ADC) i mostrava patrons de localització i expressió diferencial. Les vesícules extracel·lulars precedents de les tumorspheres també van exhibir nivells alts de LGALS3. Vam revelar que la GAL3 podria jugar un paper crucial com a molècula immunomoduladora expressada i secreta en el TME, modulant la immunosupressió a través de les cèl·lules T reguladores (TREGS). Això es va confirmar en mostres tumorals de pacients amb nivells d'expressió elevats de GAL3, que a més tenien majors nivells de TREGS. Posteriorment, es van avaluar els rols pronòstics i diagnòstics de la GAL3 soluble (sGAL3) i altres factors immunoreguladors (sICOSL, sFGL1, sGAL1, sMICA, sMICB, sCD276) en una cohort de 94 pacients amb càncer de pulmó en estadi primerenc (cohort de test). sFGL1, sGAL3 i la seua combinació van mostrar una eficàcia diagnòstica òptima en la nostra cohort. A més, l'anàlisi de supervivència de Kaplan-Meier va demostrar en la subcohort de ADC en estadi primerenc, que els pacients amb nivells alts de sGAL3 van experimentar una supervivència lliure de recaiguda (SLR) (p=0,048) i una supervivència global (SG) més curta (p=0,021), però no en la de carcinoma de cèl·lules escamoses. L'anàlisi multivariant va indicar que sGAL3 podria ser un biomarcador independent del pronòstic per a SG i SLR. L'expressió gènica de tots aquests factors immunoreguladors també es va analitzar en un grup independent de 661 pacients de TCGA (cohort de validació), confirmant el valor pronòstic independent de LGALS3 en la subcohort de ADC per a SLR (p=0,021) i SG (p=0,004). El paper diagnòstic, predictiu i pronòstic d'aquests factors immunoreguladors també es va avaluar en el moment basal (PRE) i en l'avaluació de la primera resposta (FR) en una cohort de 52 pacients amb cáncer de pulmó en estadi avançat tractats en primera línia amb pembrolizumab. sFGL1, sGAL3 i la seua combinació de nou van oferir una eficàcia diagnòstica òptima per als pacients d'aquesta cohort. Els nivells de sGAL3 en FR i sMICB en PRE i FR estaven associats amb un benefici clínic durador en tota la cohort i en la subcohort de LUAD. sCD276 també es va associar amb la resposta global en tota la cohort i en la subcohort de ADC. Un anàlisi de regressió de Cox va identificar sMICB en FR com a biomarcador independent per a la supervivència lliure de progressió (SLP) en tota la cohort i per a SLP i SG en la subcohort de ADC. sGAL3 en PRE es va trobar com a biomarcador independent per a SLP i SG en tota la cohort, i sGAL3 en FR es va identificar com a biomarcador independent per a SG en la subcohort de ADC. Una disminució en FR dels nivells de sGAL3 es va associar amb una reducció en la SG en tota la cohort. En conclusió, els nostres descobriments proporcionen informació rellevant sobre el rol diagnòstic y el pronòstic de la GAL3 y altres factor inmunoreguladors per als pacients amb càncer de pulmó i serveixen com a base per al desenvolupament de nous biomarcadors i teràpies. / [EN] The complex field of immuno-oncology is constantly evolving, driven by cancer heterogeneity and the plasticity of the immune cells participating in this process. In this study we aim to delve deeper into the study of immune tumor microenvironment (TME), which will result in an improved characterization of patient`s immune contexture and the search for new biomarkers in lung cancer. In this thesis, long term patient derived lung cancer cell (PDLCC) and commercial cell lines cultures were employed for sphere-forming assays for cancer stem cells enrichment and adherent conditions for the control counterparts. Gene expression of immune-mediators was analyzed showing that expression levels of most selected genes were higher in tumorspheres compared with the adherent cells counterparts. Together with secretion, Galectin-3 (GAL3 or LGALS3 when protein or gene are referenced, respectively) was selected as the molecule that could have a strong implication in the modulation of TME. Immunoblot, flow cytometry and immunofluorescence analyses confirmed that GAL3 was consistently increased in tumorspheres from lung adenocarcinoma (LUAD) and showed differential localization and expression patterns. Extracelullar vesicles from tumorspheres also exhibited high levels of LGALS3. Next, we revealed that GAL3 could play a crucial role as an immunomodulatory molecule expressed and secreted in the TME, modulating immunosuppression through regulatory T cells (TREGS). This was confirmed in patient's tumor samples, where higher levels of LGALS3 correlated with increased TREGS, suggesting that tumors may be recruiting this population through GAL3. The prognostic and diagnostic roles of soluble GAL3 (sGAL3) and other immune-mediators (sICOSL, sFGL1, sGAL1, sMICA, sMICB, sCD276) were evaluated in a cohort of 94 early-stage lung cancer (test cohort). sFGL1, sGAL3 and its combination yielded optimal diagnostic efficacy in our patient's cohort. A Cox regression analysis revealed an association between sGAL3 and prognosis. Kaplan-Meier plots show that, in the early-stage LUAD subcohort, patients with high levels of sGAL3 experienced shorter relapse-free survival (RFS) (p=0.048) and overall survival (OS) (p=0.021), while no such association was observed in the lung squamous cell carcinoma subcohort. Multivariate analysis indicated that sGAL3 could be an independent biomarker of prognosis for OS and RFS. Gene expression of our panel of immunoregulatory mediators was also analyzed in an independent group of 661 patients from TCGA (validation cohort), confirming the independent prognostic value of LGALS3 in the LUAD subcohort for PFS (p=0.021) and OS (p=0.004). The diagnostic, predictive and prognostic role of these immune-mediators was also evaluated in plasma samples at baseline (PRE) and at first response assessment (FR) in a cohort of 52 advanced-stage lung cancer patients treated in first-line with pembrolizumab. sFGL1, sGAL3 and its combination were also found to have a diagnostic value in this clinical setting. The Mann-Whitney test revealed that sGAL3 at FR and sMICB at PRE and FR were associated with clinical benefit in the entire cohort and in the LUAD subcohort. sCD276 was also associated with objective response in the entire cohort and in the LUAD subcohort. A Cox regression analysis identified sMICB at FR as an independent biomarker for progression-free survival (PFS) in the entire cohort and for PFS and OS in the LUAD subcohort. Furthermore, sGAL3 at PRE was found to be an independent biomarker for PFS and OS in the entire cohort, and sGAL3 at FR was identified as an independent biomarker for OS in the LUAD subcohort. A decreased in the levels of sGAL3 on treatment was associated with reduction of OS in the entire cohort. In conclusion, our findings provide relevant prognostic and predictive information on the role of GAL3 and other immune-mediators for lung cancer patients and served as the basis for developing new biomarkers and therapies. / This thesis was supported by the following Spanish institutions: Centro de Investigación Biomédica en Red Cáncer (Project CB16/12/00350); Fondo de Investigación Sanitaria-Fondo Europeo de Desarrollo Regional (Projects PI15/00209, PI15/00753, PI18/00266 and IFEQ21/00194); Fundación Arnal Planelles; Generalitat Valenciana y Fondo Social Europeo (Project ACIF/2018/275): ERA-NET EURONANOMED III (Project METASTARG JTC 2018-045) / Torres Martínez, S. (2024). Characterization of Tumor Cells and Immune Microenvironment Interactions in Non Small Cell Lung Cancer. Translational implications [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/203659