Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) is often the only effective treatment for patients with hematological malignancies, but its curative potential is often limited by the development of acute or chronic graft-versus-host disease (GvHD). Although extensive immunosuppressive therapy is highly efficient in the prevention or treatment of GvHD, it greatly increases the risk for life-threatening opportunistic fungal or viral infections and the recurrence of malignant disease. The possibility to selectively deplete alloreactive T cells from donor grafts prior or after transplantation would greatly diminish the need for immunosuppressive therapy in the transplant recipient and thereby greatly improve its clinical outcome. The molecular chaperone heat shock protein of 90 kDa (Hsp90) has been previously shown to stabilize many signal transduction proteins involved in T lymphocyte activation and proliferation and is furthermore able to exert anti-apoptotic effects in different cell types. The aim of this study was therefore to investigate the possibility to selectively target activated, proliferating T cells in lymphocyte populations by inhibition of Hsp90, without compromising viability and function of non-reactive T cell populations including pathogen-specific T lymphocytes. It could be shown in this work, that activated T cells are indeed more prone to apoptotic cell death in the presence of Hsp90 inhibitors than resting cells and that treatment of mixed lymphocyte cultures with such inhibitors eliminates the proliferation of alloreactive cells. In contrast, T cells remaining in a resting state during inhibitor treatment remain viable and also display functional virus-specific responses after inhibitor removal. These data suggest, that Hsp90 could represent a novel target for selective depletion of alloreactive T cells and that application of Hsp90 inhibitors could be a potential approach to prevent or treat GvHD without impairing pathogen-specific T cell immunity. In the second part of this work, the immune responses to strictly defined antigens of the opportunistic pathogenic fungus Aspergillus fumigatus were characterized. Opportunistic fungal infections are highly prevalent in immunocompromized and immunosuppressed individuals, especially in HSCT recipients suffering from GvDH. Although antifungal treatment is permanently improved, invasive fungal infections are still often fatal. In healthy individuals clinical disease is rare, because innate and adaptive immunity act in conjunction to protect the host. Therefore one possible strategy to prevent and treat life-threatening fungal infections in immunocompromized patients is to improve host resistance by augmenting the antifungal functions of the immune system, for example by vaccination or adoptive transfer of antigen-specific T cells. Based on previous findings, the objective of this dissertation was to identify and characterize distinct immunogenic A. fumigatus antigens that could be used for clinical application like vaccination or ex vivo generation of antigen-specific T cells and to characterize the interaction of this antigen-specific lymphocytes with cells of the innate immune system. First, memory T cell responses to different recombinant A. fumigatus proteins in healthy individuals were evaluated. The majority of tested donors displayed stable CD4+ TH1 responses to the Crf1 protein, whereas responses to the other antigens tested could only be detected in a limited number of donors, qualifying Crf1 as potential candidate antigen for clinical use. It was also possible to identify an immunodominant MHC class II DRB1*04-restricted epitope of Crf1 and to generate T cell clones specific for this epitope. This Crf1-specific T cell clones could be specifically activated by dendritic cells fed with synthetic peptide, recombinant protein or germinating A. fumigatus conidia or outgrown hyphae. Interestingly, these A. fumigatus-specific T cell clones also responded to stimulation with Candida albicans, which likewise causes opportunistic infections in immunocompromized patients and encodes for a glucosyltransferase similar to A. fumigatus Crf1. It was also possible to show that supernatant harvested from activated Crf1-specific T cell cultures was able to significantly increase fungal killing by monocytes. These data indicate that the specified FHT epitope of the A. fumigatus protein Crf1 could be potentially used as antigen for vaccination protocols or for the generation of Aspergillus-specific effector T cells for adoptive transfer. / Allogene, hämatopoietische Stammzelltransplantation ist häufig die einzige, effektive Behandlungsmethode für Patienten mit hämatologischen Erkrankungen, aber deren Erfolg ist häufig durch das Auftreten einer „Graft-versus-Host“-Erkrankung (GvHD) gefährdet. Obwohl durch eine weitreichende, immunsuppressive Therapie eine GvHD erfolgreich verhindert oder behandelt werden kann, erhöht diese jedoch beträchtlich das Risiko für das Auftreten lebensbedrohender opportunistischer Virus- und Pilz- Infektionen und das Wiederauftreten der malignen Erkrankung. Die Möglichkeit der selektiven Depletion alloreaktiver T-Zellen eines Transplantates bevor oder nach der Transplantation würde die Notwendigkeit immunsuppressiver Therapien des Empfängers deutlich reduzieren und dadurch den Behandlungserfolg enorm verbessern. Für das molekulare Chaperon-Protein „Hitzeschock-Protein von 90 kDa“ (Hsp90) konnte bereits zuvor gezeigt werden, dass es viele Signal-Transduktions-Proteine, die an der Aktivierung von T-Lymphozyten beteiligt sind stabilisiert und außerdem in verschiedenen Zelltypen einen anti-apoptotischen Effekt auszuüben scheint. Deshalb war es das Ziel dieser Untersuchung festzustellen, ob es möglich ist, durch Inhibition von Hsp90 spezifisch nur die aktivierten, proliferierenden T-Zellen in einer Lymphozyten-Population zu erreichen, ohne dabei die Viabilität und Funktionalität der nicht-reaktiven T-Zell-Population, einschließlich Pathogen-spezifischen TLymphozyten, zu beeinträchtigen. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass unter dem Einfluss von Hsp90-Inhibitoren in aktivierten T-Zellen tatsächlich eher Apoptose induziert wird, als in ruhenden Zellen und dass die Behandlung von gemischten Lymphozyten-Kulturen mit diesen Inhibitoren die Proliferation von alloreaktiven Zellen verhindert. Im Gegensatz dazu bleiben TZellen, die zum Zeitpunkt der Inhibitor-Behandlung in einem ruhenden Zustand waren überlebensfähig und zeigen zudem nach Entfernung des Inhibitors immer noch Virusspezifische Immunantworten. Wie diese Daten zeigen, könnte Hsp90 ein neues Angriffsziel für die selektive Depletion von alloreaktiven T-Zellen sein und Hsp90- Inhibitoren deshalb möglicherweise für die Vorbeugung oder Behandlung von GvHD eingesetzt werden, ohne dabei die pathogen-spezifische Immunität zu beeinträchtigen. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden die Immunantworten auf definierte Antigene das opportunistisch pathogenen Pilzes Aspergillus fumigatus charakterisiert. Opportunistische Pilzinfektionen sind eine häufige Begleiterscheinung bei Personen mit beeinträchtigtem Immunsystem und immunsupprimierten Patienten, vor allem bei Patienten die sich einer allogenen Stammzell-Transplantation unterziehen müssen und unter einer GvHD leiden. Trotz ständiger Verbesserung der Behandlungsmöglichkeiten, verlaufen invasive Pilzinfektionen häufig immer noch tödlich. Gesunde Menschen erkranken nur äußerst selten symptomatisch, da sowohl die angeborene als auch die erworbene Immunabwehr dazu beitragen, eine akute Infektion effektiv zu verhindern. Eine Möglichkeit, lebensbedrohliche Pilzinfektionen bei immunsupprimierten Patienten zu verhindern könnte deshalb die Stärkung der Immunabwehr durch Verbesserung der Funktionen des Immunsystems sein, beispielsweise durch Vakzinierung oder den adoptiven Transfer antigenspezifischer TZellen. Ziel dieser Arbeit war, aufbauend auf früheren Forschungsergebnissen, die Identifikation und Charakterisierung definierter immunogener A. fumigatus Antigene, die für die klinische Anwendung als Impfstoff oder für die ex vivo Generierung antigenspezifischer T-Zellen Verwendung finden könnten. Außerdem sollte die Interaktion dieser antigenspezifischen T-Lymphozyten mit den Zellen des angeborenen Immunsystems untersucht werden. Zunächst wurden hierfür die T-Zell-Antworten gesunder Spender auf verschiedene rekombinante A. fumigatus-Proteine untersucht. Die große Mehrheit der getesteten Spender reagierte auf das Protein Crf1 mit einer stabilen TH1 Antwort, während die übrigen getesteten Proteine nur in vereinzelten Spendern eine signifikante T-Zell- Antwort auslösten. Die offensichtlich weite Verbreitung von Crf1-spezifischen Gedächtnis-Zellen in der Bevölkerung lässt dieses Antigen als gut geeignet für potenzielle klinische Anwendungen erscheinen. Des weiteren wurde ein immundominantes Epitop von Crf1 identifiziert, das durch das relativ weit verbreite MHC Klasse II DRB1*04-Allel präsentiert wird. T-Zell-Klone, die spezifisch dieses Antigen erkennen, konnten mit dendritischen Zellen, die zuvor mit synthetischem Peptid, rekombinantem Protein oder ausgekeimten A. fumigatus Conidien oder Hyphen inkubiert worden waren aktiviert werden. Interessanterweise reagierten diese A. fumigatus-spezifischen T-Zell-Klone auch auf Stimulation mit Candida albicans, das ebenfalls opportunistische Infektionen in immunsupprimierten Patienten auslöst und für eine ähnliche Glucosyl-Transferase wie Crf1 in A. fumigatus codiert. Die Kultur-Überstände von aktivierten Crf1-spezifischen TZell- Klonen waren außerdem in der Lage, das Abtöten des Pilzes durch Monozyten deutlich zu verbessern. Diese Daten deuten darauf hin, dass das hier beschriebene FHT-Epitop des A. fumigatus Proteins Crf1 potenziell als Antigen für die Vakzinierung oder die Generierung von Aspergillus-spezifischen Effektor-T-Zellen für den adoptiven Transfer geeignet sein könnte.

Staphylococcus aureus ist einer der häufigsten Erreger von nosokomialen Infektionen. Diese grampositiven Bakterien verursachen neben harmlosen oberflächlichen Hautinfektionen auch lebensbedrohliche Systeminfektionen. Ein großes Problem in der Therapie von S. aureus-Infektionen stellen die zunehmenden Multiresistenzen dar. Die Entwicklung neuer Antibiotika wird zukünftig wahrscheinlich nicht ausreichen, da immer wieder neue Resistenzen der Bakterien zu erwarten sind. Es besteht daher dringender Bedarf an der Entwicklung alternativer Therapieformen im Kampf gegen multiresistente Problemkeime wie S. aureus. Eine Möglichkeit besteht in der Immuntherapie, zum Beispiel durch Gewinnung von monoklonalen Antikörpern gegen geeignete Targetstrukturen von S. aureus. Ziel dieser Arbeit war es, zunächst zwei Proteine IsaA und IsaB herzustellen, um diese Proteine für Immunisierungsstudien zu nutzen. Zunächst wurde das gereinigte IsaA-Protein verwendet, um ein Kaninchen zu immunisieren. Mit den daraus gewonnenen Antikörpern wurden dann erste Tierversuche begonnen, um die Bedingungen für den therapeutischen Einatz von gegen IsaA-gerichteten Antikörpern zu ermitteln und die Wirksamkeit einer Antikörper-Behandlung zu evaluieren. Für die Herstellung der gewünschten Proteine wurden die Gensequenzen zunächst aus verschiedenen S. aureus-Stämmen mittels PCR amplifiziert und in den kommerziellen Expressionsvektor pQE30 kloniert. Die amplifizierte Gensequenz stammt aus den klinischen Stämmen 418 (IsaA) bzw. 134 (IsaB). Nach der Klonierung wurden geeignete Expressions- und Reinigungsstrategien entwickelt. Dabei wurden folgende Bedingungen als optimal für Wachstum und Überexpression herausgearbeitet: IsaA: Induktion der Überexpression mit 100 µM IPTG, 3 h Wachstum bei 37°C. IsaB: Induktion der Überexpression mit 100 µM IPTG, 4 h Wachstum bei 37°C. Es stellte sich auch heraus, dass IsaA zunächst in nur unzureichender Quantität vorhanden bzw. exprimiert worden war. Die Vermutung, dass IsaA überwiegend im Pellet in sogenannten Einschlusskörpern (inclusion bodies) eingeschlossen war, erklärte dieses Phänomen. Das Protein konnte erfolgreich aus dem Pellet isoliert werden. Die Produktion und Aufreinigung beider Proteine IsaA und IsaB unter optimierten Bedingungen ergab, dass beide Proteine nun in ausreichender Menge und Konzentration für die folgende Immunisierung und die weiteren Arbeiten vorlagen. Aus Kaninchen, die mit IsaA immunisiert wurden, konnten polyklonale Antikörper gewonnen werden, die die Grundlage für einen ersten Tierversuch mit 24 Ratten bildeten. Hierbei zeigte sich, dass die Tiere, die mit 1.000.000.000 Bakterien infiziert worden waren deutlich stärkere Infektionszeichen aufwiesen als diejenigen, die mit 100.000.000 Bakterien infiziert worden waren. Weiterhin wurde deutlich, dass die Tiere, die Serum (mit Antikörper gegen IsaA) erhalten hatten, gegenüber den Vergleichstieren mit Placebo einen deutlichen Vorteil hinsichtlich Infektionszeichen und Immunantwort hatten. Somit belegen die tierexperimentiellen Ergebnisse in dieser Arbeit erstmalig den therapeutischen Nutzen von Antikörpern gegen IsaA. IsaA ist demnach ein geeignetes Target für eine Immuntherapie gegen S. aureus. / Staphylococcus aureus is one of the most common pathogens of nosocomial infections. These grampositive bacteria not only cause harmless superficial skin infections but also life threatening systemic infections. A huge problem in therapy of S. aureus infections is the increasing rate of multiresistance. The development of new antibiotics will probably not be sufficient in the future because new resistance in bacteria is to expect. Therefore there is urgent need for alternative therapies fighting multiresistant bacteria such as S. aureus. One approach is immunotherapy, e.g. by production of monoclonal antibodies against adequate targets of S. aureus. The purpose of this paper was to produce two proteins, IsaA and IsaB, to use these for immunisation studies. First purified IsaA was used to immunise a rabbit. The extracted antibodies were used for early animal experiments to evaluate conditions for the therapeutic use and efficiency of antibodies against IsaA. For production of the wanted proteins gene sequences from various S. aureus strains were amplified by PCR and cloned into pQE30, a commercial expression vector. The amplified gene sequences come from strain 418 (IsaA) and strain 134 (IsaB). After cloning appropriate conditions for expression and purifiing were elaborated: IsaA: induction of overexpression with 100 µM IPTG, 3 h growth at 37°C. IsaB: induction of overexpression with 100 µM IPTG, 4 h growth at 37°C. First IsaA emerged to be present respectively expressed of low quantity only. The presumption that IsaA was predominantly enclosed in so called inclusion bodies explained this phenomenon. The protein could successfully isolated from the pellet. Production and purification of both proteins IsaA and IsaB under optimised conditions led to sufficient quantitiy and concentration for the immunisation following and further research. From a rabbit, immunised with IsaA, polyclonal antibodies were obtained and provided a basis for the first animal experiment with 24 rats. It showed that animals infected with 1.000.000.000 bacteria had considerably more signs of infection than those infected with 100.000.000 bacteria. It could also be shown that animals treated with serum (with antibodies against IsaA) had clear advantage regarding signs of infections and immune response compared to those animals treated with placebo. These results of the animal experiment document the therapeutic benefit of antibodies against IsaA for the first time. Therefore IsaA is an adequate target for immunotherapy against S. aureus.

Die Bienen-/Wespengiftallergie ist auf der einen Seite eine potentiell lebensbedrohliche IgE-vermittelte Allergiekrankheit, in Deutschland neben den Nahrungsmittelallergien die häufigste Ursache für eine tödlich verlaufende Anaphylaxie. Auf der anderen Seite steht mit der Bienen-/Wespengift-spezifischen Immuntherapie (SIT) gerade für diese Allergie seit Jahrzehnten eine hochwirksame kausale Therapie zur Verfügung. Placebokontrollierte Studien mit unbehandelten Patienten sind daher aus ethischen Gründen nicht vertretbar. Neue Erkenntnisse zur Sicherheit dieser Therapieform können nur aus der Verlaufsbeobachtung standardisiert behandelter Patientenkollektive gewonnen werden. Der besondere Wert der hier analysierten großen Patientenserie liegt vor allem darin, dass alle Patienten in einer Allergieambulanz (der Klinik und Poliklinik für Dermatologie, Venerologie und Allergologie) betreut wurden. Im gesamten Behandlungszeitraum aller 679 Patienten wurde die Diagnostik und Therapie der Bienen-/Wespengiftallergie hoch standardisiert durchgeführt und nicht verändert. Die dadurch gleichbleibende Betreuung garantierten Qualität, Umfang und Homogenität der Dokumentation und damit die Vergleichbarkeit der retrospektiv erfassten Daten über den gesamten Zeitraum 1988 bis 2008. Für die besonders wichtige Verlaufsbeobachtung nach Ende der spezifischen Immuntherapie (SIT) wurden zusätzlich 616 der 679 Patienten aus Unterfranken und Umgebung direkt telefonisch befragt. Die bekannten charakteristischen Merkmale von Patienten mit Bienen-/Wespengiftallergie zeigten sich auch in dem untersuchten Kollektiv. Imkertätigkeit ist die wahrscheinlichste Erklärung warum Bienengiftallergiker jünger und häufiger männlich sind. Die prognostisch bedeutsamen Schweregrade der allergischen Indikatorstichreaktion (das Stichereignis mit der schwersten anaphylaktischen Reaktion vor SIT) unterscheiden sich zwischen Bienen- und Wespengiftallergikern dagegen nicht. In den diagnostischen Untersuchungen vor und auch am Ende der SIT waren die Schwellenwertkonzentrationen des Intrakutan- und Pricktests bei Bienengiftallergikern im Vergleich zu den Wespengiftallergikern signifikant niedriger, die spezifischen IgE-Serumspiegel höher. Die Wirksamkeit der SIT mit Bienengift betrug 89,0 %. Nur 11,0 % der Patienten (8 von 73 Patienten mit erneutem Bienenstich) hatten nach Beginn der SIT erneut eine / The study analyzed patients with a bee venom allergy or a wasp venom allergy who had a specific immunotherapy for at least 3 years. Differences between bee and wasp venom allergy, safety and effectiveness of the immunotherapy and differences between patients with or without a tolerated sting (after immunotherapy) were investigated.

Das Projekt „Balanced Lethal System in Salmonella typhi Ty21a“ der AG Bakterielle Tumortherapie des MSZ zielt auf die Entwicklung eines Vakzinstammes, der in der humanen Krebstherapie zum Einsatz kommen soll. Ziel dieser Arbeit war das zuvor etablierte Balanced Lethal System in Salmonella typhi Ty21a zu optimieren. / The aim of this project is to develop a bacterial vaccine that will be used in cancer immunotherapy. The aim of this dissertation was to improve the established balanced lethal system in Salmonella typhi Ty21a.

Cancer cells frequently escape from immune surveillance by down-regulating two important components of the immune defence: antigen-presenting MHC and costimulatory molecules. Therefore several novel anti-tumour compounds that aim to assist the immune system in recognising and fighting cancer are currently under development. Recombinant bispecific antibodies represent one group of such novel therapeutics. They target two different antigens and recruit cytotoxic effector cells to tumour cells. For cancer immunotherapy, bispecific T cell-engaging antibodies are already well characterised. These antibodies target a tumour-associated antigen and CD3ε, the constant molecule of the T cell receptor complex. On the one hand, this study presents the development of a bispecific antibody targeting CD3ε and the rhabdomyosarcoma-associated fetal acetylcholine receptor. On the other hand, it describes a novel two-part trispecific antibody format for the treatment of leukaemia and other haematological malignancies in the context of haematopoietic stem cell transplantation (HSCT). For HSCT, an HLA-identical donor is preferred, but very rarely available. In an HLA-mismatched setting, the HLA disparity could be exploited for targeted cancer treatment. In the present study, a two-part trispecific HLA-A2 × CD45 × CD3 antibody was developed for potential cases in which the patient is HLA-A2-positive, but the donor is not. This holds true for about half the cases in Germany, since HLA-A2 is the most common HLA molecule found here. Combinatorial targeting of HLA-A2 and the leucocyte-common antigen CD45 allows for highly specific dual-antigen restricted tumour targeting. More precisely, two single-chain antibody constructs were developed: i) a single-chain variable fragment (scFv) specific for HLA-A2, and ii) a scFv against CD45, both linked to the VL and the VH domain of a CD3ε-specific antibody, respectively. It turned out that, after the concomitant binding of these constructs to the same HLA-A2- and CD45-expressing cell, the unpaired variable domains of a CD3ε-specific antibody assembled to a functional scFv. In a therapeutic situation, this assembly should exclusively occur on the recipient’s blood cancer cells, leading to T cell-mediated cancer cell destruction. In this way, a relapse of disease might be prevented, and standard therapy (radiation and chemotherapy) might be omitted. For both approaches, the antibody constructs were periplasmically expressed in E. coli, purified via His tag, and biochemically characterised. Their binding to the respective targets was proven by flow cytometry. The stimulatory properties of the antibodies were assayed by measuring IL-2 release after incubation with T cells and antigen-expressing target cells. Both the bispecific antibody against rhabdomyosarcoma and the assembled trispecific antibody against blood cancer mediated T-cell activation in a concentration-dependent manner at nanomolar concentrations. For the trispecific antibody, this effect indeed proved to be dual antigen-restricted, as it could be blocked by prior incubation of either HLA-A2- or CD45-specific scFv and did not occur on single-positive (CD45+) or double-negative (HLA-A2- CD45-) target cells. Furthermore, antibodies from both approaches recruited T cells for tumour cell destruction in vitro. / Krebszellen entgehen der Immunüberwachung oftmals dadurch, dass sie zwei wichtige Komponenten der Immunabwehr, nämlich antigenpräsentierende MHC- und kostimulatorische Moleküle, herunter regeln. Zurzeit befindet sich daher eine Reihe neuartiger Anti-Krebs-Substanzen in der Entwicklung, die darauf abzielen, das Immunsystem beim Erkennen und Bekämpfen von Krebs zu unterstützen. Rekombinante bispezifische Antikörper stellen eine Gruppe solch neuartiger Therapeutika dar. Sie erkennen zwei unterschiedliche Antigene und rekrutieren gezielt zytotoxische Effektorzellen zu Tumorzellen. Zur Krebsimmuntherapie sind BiTE-Antikörper (bispecific T cell engager) bereits gut untersucht. Diese Antikörper sind gegen ein tumorassoziiertes Antigen sowie gegen CD3ε, das konstante Molekül des T Zell-Rezeptor-Komplexes, gerichtet. Diese Arbeit beschreibt zum einen die Entwicklung eines bispezifischen Antikörpers, der CD3ε und den mit Rhabdomyosarkom assoziierten fetalen Acetylcholinrezeptor erkennt. Zum anderen präsentiert sie ein neues, zweiteiliges trispezifisches Antikörperformat, das zur Behandlung von Leukämie und anderen bösartigen Erkrankungen des blutbildenden Systems im Zusammenhang mit hämatopoetischer Stammzelltransplantation (HSZT) genutzt werden könnte. Für eine HSZT wird ein HLA-identischer Spender bevorzugt. Dieser steht jedoch nur sehr selten zur Verfügung. In Fällen mit nur einer Unstimmigkeit in den HLA-Merkmalen zwischen Patient und Spender könnte diese HLA-Unstimmigkeit nun zur gezielten Krebsbehandlung ausgenutzt werden. In dieser Arbeit wurde ein trispezifisches HLA-A2 × CD45 × CD3 Antikörperkonstrukt speziell für solche Fälle entwickelt, in denen der Patient HLA-A2-positiv ist, der Spender jedoch nicht. Dies trifft in Deutschland auf ungefähr die Hälfte aller Fälle zu, da HLA-A2 hier als häufigstes HLA-Molekül vorkommt. Mit der Kombination aus HLA-A2 und dem Pan-Leukozytenmarker CD45 (leucocyte-common antigen) als Ziel, wird eine hochspezifische, von zwei Antigenen abhängige, zielgerichtete Tumoransteuerung (tumour targeting) möglich. Genauer gesagt wurden zwei Einzelketten-Antikörperkonstrukte entwickelt: i) ein HLA A2-spezifisches single-chain variable fragment (scFv) und ii) ein CD45-spezifisches scFv, jeweils verbunden mit der VL- bzw. der VH-Domäne eines CD3ε-spezifischen Antikörpers. Es stellte sich heraus, dass nach gleichzeitiger Bindung der beiden Konstrukte an dieselbe HLA-A2- und CD45-exprimierende Zelle sich die beiden einzelnen, ungepaarten variablen Domänen eines CD3ε-spezifischen Antikörpers zu einem funktionellen scFv zusammenfügen. Dieses Zusammenfügen sollte in einer therapeutischen Situation ausschließlich auf den Blutkrebszellen des Empfängers geschehen, was zur T-Zell-vermittelten Zerstörung der Krebszellen führen würde. Auf diese Weise könnte ein Rückfall der Erkrankung vermieden und eventuell sogar auf die Standardtherapie (Bestrahlung und Chemotherapie) verzichtet werden. Für die beiden beschriebenen Ansätze wurden die Antikörperkonstrukte periplasmatisch in E. coli exprimiert, über einen His-Tag aufgereinigt und biochemisch charakterisiert. Ihre Bindung an die jeweiligen Zielantigene wurde mittels Durchflusszytometrie nachgewiesen. Die stimulatorischen Eigenschaften der Antikörper wurden durch eine Messung der IL-2-Freisetzung nach Inkubation zusammen mit T-Zellen und antigenexprimierenden Zielzellen untersucht. Sowohl der gegen Rhabdomyosarkom gerichtete BiTE-Antikörper, als auch der zusammengefügte trispezifische Antikörper gegen Blutkrebs vermittelten konzentrationsabhängig eine T Zellaktivierung bei nanomolaren Konzentrationen. Für den trispezifischen Antikörper erwies sich dieser Effekt tatsächlich als abhängig von zwei Antigenen, da er durch eine vorausgehende Inkubation mit entweder einem HLA-A2- oder einem CD45-spezifischen scFv-Fragment geblockt werden konnte und nicht auf Zellen auftrat, die nur ein Antigen (CD45+) oder keins von beiden (HLA-A2- CD45-) tragen. Darüber hinaus rekrutierten die Antikörper beider Ansätze T-Zellen zur Zerstörung von Tumorzellen in vitro.

Wilms tumor protein 1 (WT1) is a suitable target to develop an immunotherapeutic approach against high risk acute myeloid leukemia (AML), particularly their relapse after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT). As an intracellular protein traversing between nucleus and cytoplasm, recombinant expression of WT1 is difficult. Therefore, an induction of WT1-specific T-cell responses is mostly based on peptide vaccination as well as dendritic cell (DC) electroporation with mRNA encoding full-length protein to mount WT1-derived peptide variations presented to T cells. Alternatively, the WT1 peptide presentation could be broadened by forcing receptor-mediated endocytosis of DCs. In this study, antibody fusion proteins consisting of an antibody specific to the human DEC205 endocytic receptor and various fragments of WT1 (anti-hDEC205-WT1) were generated for a potential DC-targeted recombinant WT1 vaccine. Anti-hDEC205-WT1 antibody fusion proteins containing full-length or major parts of WT1 were not efficiently expressed and secreted due to their poor solubility and secretory capacity. However, small fragment-containing variants: anti-hDEC205-WT110-35, anti-hDEC205-WT191-138, anti-hDEC205-WT1223-273, and anti-hDEC205-WT1324-371 were obtained in good yields. Since three of these fusion proteins contain the most of the known immunogenic epitopes in their sequences, the anti-hDEC205-WT191-138, anti-hDEC205-WT1223-273, and anti-hDEC205-WT1324-371 were tested for their T-cell stimulatory capacities. Mature monocyte-derived DCs loaded with anti-hDEC205-WT191-138 could induce ex vivo T-cell responses in 12 of 16 blood samples collected from either healthy or HSC transplanted individuals compared to included controls (P < 0.01). Furthermore, these T cells could kill WT1-overexpressing THP-1 leukemia cells in vitro after expansion. In conclusion, alongside proving the difficulty in expression and purification of intracellular WT1 as a vaccine protein, our results from this work introduce an alternative therapeutic vaccine approach to improve an anti-leukemia immune response in the context of allogeneic HSCT and potentially beyond. / Für die Entwicklung eines immuntherapeutischen Ansatzes zur Behandlung von hoch Risikopatienten mit akuter myeloischer Leukämie (AML) und insbesondere zur Vorbeugung von Rezidiven nach allogener Stammzelltransplantation (SZT) stellt das Wilms-Tumor-Protein 1 (WT1) ein geeignetes Angriffsziel dar. Die rekombinante Expression von WT1, welches als Transkriptionsfaktor vom Zytosol in den Zellkern transloziert, gestaltet sich äußerst schwierig. WT1-spezifische T-Zellantworten werden daher hauptsächlich mittels Peptidvakzinierung oder Transfektion dendritischer Zellen (DC) mit mRNA, welche das vollständige WT1-Protein kodiert, herbeigeführt. Letzterer Ansatz bietet den Vorteil, dass passierenden T-Zellen eine größere Vielfalt an WT1-Peptidvarianten präsentiert werden kann. Eine verbesserte Peptidpräsentation kann außerdem über eine Optimierung der Rezeptor-vermittelten Endozytose der DCs erzielt werden. Ziel der folgenden Arbeit war es, ein rekombinantes DC-gerichtetes WT1-Vakzin zu entwickeln. Dazu wurden anti-hDEC205-WT1-Fusionsproteine, bestehend aus einem Antikörper gegen den humanen DEC205-Endozytoserezeptor und verschiedenen WT1-Fragmenten, konstruiert. Während sich Fusionsproteine, die das vollständige WT1-Protein oder große Teile dessen beinhalteten, aufgrund ihrer schlechten Löslichkeit und schwachen Sekretion kaum exprimieren und aufreinigen ließen, lieferte die Produktion der Fusionsproteine mit kürzeren WT1-Fragmenten, anti-hDEC205-WT110-35, anti-hDEC205-WT191-138, anti-hDEC205-WT1223-273 und anti-hDEC205-WT1324-371, sehr gute Ausbeuten. Da letztere drei Proteine die meisten bislang bekannten immunogenen WT1-Peptide in ihrer Sequenz enthalten, wurde anschließend ihre Fähigkeit zur T-Zellstimulation untersucht. Dabei konnte in 12 von 16 Blutproben, die entweder von gesunden Spendern oder SZT-Patienten stammten, gezeigt werden, dass mit anti-hDEC205-WT191-138 beladene, reife, aus Monozyten generierte DCs ex vivo signifikant stärkere T-Zellantworten auslösen als die jeweils mitgeführten Kontrollen (P < 0.01). Nach Expansion waren die so aktivierten WT1-spezifischen T-Zellen sogar in der Lage, die WT1-überexprimierende AML-Zelllinie THP-1 in vitro zu lysieren. In der vorliegenden Arbeit konnten daher nicht nur die bereits bekannten Schwierigkeiten der WT1-Expression und Aufreinigung bestätigt werden, sondern darüber hinaus konnte eine alternative therapeutische Vakzinierungsmethode zur Optimierung der anti-leukämischen Immunantwort im Rahmen einer allogenen SZT entwickelt werden.

In Deutschland erkranken jährlich etwa 500.000 Menschen an Krebs, wovon circa 12.000 die Diagnose „Leukämie“ gestellt bekommen [1]. Unter den Leukämien weist die akute myeloische Leukämie (AML) die ungünstigste Prognose auf, sodass hier erheblicher Forschungsbedarf besteht. Zusätzlich schnitten viele potentielle Therapeutika, die sich in bisherigen präklinischen Testsystemen als vielversprechend erwiesen haben, in klinischen Studien schlecht ab [8]. Ziel dieser Arbeit war daher die Etablierung eines 3D in vitro Blutgefäß-/Gewebemodells als verbessertes präklinisches System zur Testung von Therapeutika, die zur erfolgreichen Behandlung von Leukämien beitragen sollen. Das 3D Blutgefäßmodell bestand aus humanen primären Endothelzellen, welche als Monolayer auf der Serosaseite einer dezellularisierten, porzinen, intestinalen Kollagenmatrix (SIS-Ser) wuchsen. Nach 14-tägiger Zellkultur wurden dem Versuchsansatz entsprechend nichtadhärente THP-1 Zellen (AML-M5-Zelllinie) und Tipifarnib oder entsprechende Kontrolllösungen beziehungsweise bimolekulare Antikörperkonstrukte mit PBMCs als Effektorzellen hinzupipettiert. Nach 5-tägiger Inkubation mit Tipifarnib beziehungsweise 24-stündiger Behandlung mit Antikörperkonstrukten wurde der therapiebedingte Anstieg der Apoptoserate in den malignen THP-1 Zellen mittels durchflusszytometrischer Analyse der Modellüberstände ermittelt. Zum Ausschluss verbliebener und durchflusszytometrisch zu analysierender Zellen wurde, stellvertretend für alle Suspensionszellen, eine Anti-CD13/DAB-Färbung durchgeführt, welche negativ ausfiel. Mögliche Kollateralschäden am Endothel wurden mittels histologischen Färbemethoden an Gewebeparaffinschnitten untersucht. In der Durchflusszytometrie zeigte Tipifarnib sowohl im 2D als auch im 3D Modell äquivalente, dosisabhängige und antileukämische Auswirkungen auf die THP-1 Zellen. Bei Applikation der Antikörperkonstrukte ließ lediglich die Kombination beider Hemibodies signifikante Effekte auf die THP-1 Zellen erkennen. Dabei zeigten sich bei konstanten Konzentrationen der Antikörperkonstrukte im 3D Modell deutlich höhere Apoptoseraten (58%) als im 2D Modell (38%). Stellt man Vergleiche von Tipifarnib mit den T-Zell-rekrutierenden Antikörperkonstrukten an, so ließen sich im 2D Modell ähnliche Apoptoseraten in den THP-1 Zellen erzielen (jeweils 38% bei Anwendung von 500 nM Tipifarnib). In den 3D Modellen erzielten jedoch die niedriger konzentrierten Antikörperkonstrukte bei kürzerer Inkubationsdauer eine noch höhere spezifische Apoptoserate in den THP-1 Zellen (im Mittel 58%) als 500 nM Tipifarnib (mittlere Apoptoserate 40%). Bezüglich der Nebenwirkungen ließ sich im 3D Modell nach Applikation von Antikörperkonstrukten kein wesentlicher Einfluss auf das Endothel erkennen, während Tipifarnib/DMSO als auch die mit DMSO versetzten Kontrolllösungen zu einer dosisabhänigen Destruktion des ursprünglichen Endothelzellmonolayers führten. Damit stellt die hier beschriebene, hoch spezifische, Hemibody-vermittelte Immuntherapie einen vielversprechenden Ansatz für zukünftige onkologische Therapien dar. Mithilfe des etablierten humanen 3D in vitro Modells konnte im Vergleich zur konventionellen Zellkultur eine natürlichere Mikroumgebung für Zellen geschaffen und die Auswirkungen der Testsubstanzen sowohl auf maligne Zellen, als auch auf die Gefäßstrukturen untersucht werden. / In Germany every year about 500,000 people contract cancer whereof about 12,000 have leukemia [1]. Among all types of leukemia, acute myeloid leukemia (AML) has the worst prognosis so that there is an increased need for research. In addition many potential therapeutic agents, which had been very promising in previous preclinical tests, subsequently performed poorly in clinical studies [8]. The aim of this work was to establish a 3D in vitro blood vessel /tissue model as an enhanced preclinical test system for therapeutic agents, which could contribute to successful treatment of leukemia. The 3D blood vessel model consists of human primary endothelial cells growing as a monolayer on the serosa site of a decellularized porcine intestinal collagen matrix (called SIS-Ser). After 14 days in cell culture non-adherent THP-1 cells (AML-M5) and Tipifarnib or control solution, or other bimolecular antibody constructs and PBMC as effector cells were added to the experimental setting. After 5 days treatment with Tipifarnib or 24 hours with antibody constructs the therapy related effects on THP-1 cells were observed by flow cytometric analysis of the model remants. For exclusion of adherent suspension cells on the matrix an anti CD-13/DAB labeling was carried out, which was negative. Damaging effects on endothelial cells were assessed by histological staining of paraffin sections. In 2D as well as in 3D tipifarnib showed equivalent dose-dependent antileukemic effects on THP-1 by flow cytometry. After application of antibody constructs only the combination of both hemibodies showed significant effects on THP-1. While having constant concentrations in 2D and 3D the antibody constructs resulted in higher apoptotic rate in 3D (58%) than in 2D (38%). In comparison to tipifarnib, the t-cell recruting antibody constructs resulted in a similar apoptotic rate in THP-1 in 2D (38% when using 500 nM tipifarnib) whereas they had higher specific effects on THP-1 in 3D by a shorter incubation period and lower concentrations (58% versus 40% after incubation with 500 nM tipifarnib). Concerning side effects, the hemibodies had no significant influence on the endothelial monolayer whereas tipifarnib/DMSO and DMSO alone led to damage in a dose-dependent manner. So highly specific hemibody- mediated immunotherapy shows a promising approach for future cancer treatment. With this human 3D in vitro model a more natural mico-environment was created for the cells in comparison to conventional cell cultures and it is was possible to investigate the anti-leukemic effects of therapeutic drugs as well as their impact on the endothelial monolayer.

Der Erfolg der allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation (HSZT) als Immuntherapie basiert neben den Minorantigendifferenzen zwischen Spender und Empfänger entscheidend auf einer spendervermittelten Immunität gegen tumorassoziierte Antigene (TAA), über deren Herkunft und Frequenz bei gesunden Blutspendern die derzeitige Studienlage kaum Informationen bietet. Da für viele klinisch relevante TAA eine Expression im fetalen und plazentaren Gewebe bekannt ist, wurde in dieser Arbeit die Schwangerschaft als möglicher Auslöser dieser T-lymphozytären Gedächtnisimmunantworten im Sinne eines Tumor- und Transplantationsmodells untersucht. Hierfür wurden insgesamt 114 gesunde Blutspender in drei Subgruppen aus 38 Frauen mit negativer Schwangerschaftsanamnese, 38 Frauen mit positiver Geburtenanamnese und 38 Männern in einer Querschnittsstudie betrachtet, daneben wurden 44 Frauen longitudinal während und nach ihrer ersten Schwangerschaft untersucht. Dabei wurden die CD8-positiven T-Lymphozyten der Probanden isoliert, mit Peptiden der vier klinisch relevanten TAA HER2/neu (human epidermal growth factor receptor 2), MUC1 (Mucin 1), PRAME (preferentially expressed antigen of melanoma) und WT1 (Wilms tumor protein 1) stimuliert und die Produktion von IFN-γ-mRNA mittels RT-qPCR gemessen. Daneben wurden zum Vergleich durchflusszytometrische und ELISPOT-basierte Verfahren durchgeführt. Bei den gesunden Blutspendern konnten CD8-positive Gedächtnisimmunantworten von niedriger und/oder hoher funktioneller Avidität gegen alle vier untersuchten TAA gemessen werden: Die Frequenz der dabei als „positiv“ definierten Immunantworten betrug bei HER2/neu 5 %, bei MUC1 14 %, bei PRAME 7 % und bei WT1 15 %. Männer wiesen insgesamt höhere absolute Level der Immunantworten gegen die untersuchten TAA auf, was auf eine testikuläre Expression dieser Antigene zurückzuführen sein könnte. In der Longitudinalanalyse bei den erstschwangeren Frauen ließen sich die stärksten Immunantworten zu Beginn der Schwangerschaft nachweisen, so dass es hier zu einem „Boost“ präexistenter TAA-spezifischer Autoimmunität zu kommen scheint. Durch das immunsuppressive hormonelle Milieu im Verlauf der Schwangerschaft und den Verlust der Zielantigene der feto-plazentaren Einheit durch die Geburt und Nachgeburt scheint diese Immunität aber nicht zu persistieren. Dadurch erklärt sich auch die Beobachtung, dass Frauen mit einer positiven Geburtenanamnese keine stärkeren Immunantworten gegen die untersuchten TAA aufwiesen als Frauen mit einer negativen Schwangerschaftsanamnese. Die Schwangerschaft hinterlässt diesbezüglich also ohne die Anwesenheit der vermittelnden Antigene keinen regelhaft bleibenden Effekt. Diese Resultate decken sich mit Beobachtungen aus der Tumorimmuntherapie, bei denen Vakzinierungen gegen TAA zwar eine kurzfristige Immunität generieren konnten, die aber nicht persistierte. Im Rahmen der HSZT kann eine solche TAA-spezifische Immunität vom Spender auf den Empfänger transferiert werden und vermag dann aufgrund des proinflammatorischen Immunmilieus sehr wohl zu expandieren und in einem begrenzten Ausmaß auch zu persistieren. Dementsprechend ergeben sich aus den in dieser Arbeit gewonnenen Resultaten relevante Implikationen für die allogene und in geringerem Ausmaß die autologe HSZT, daneben aber auch für innovative Tumortherapien wie die Immuncheckpoint-Blockade, da die Persistenz von tumorspezifischer Immunität letztendlich hochrelevant für eine langfristige Tumorkontrolle und damit für ein tumorfreies Überleben ist. Das vorliegende Modell trägt somit zum Verständnis der komplexen immunregulatorischen Vorgänge bei der Tumorkontrolle bei. Ob die hierbei aufgezeigten Immunantworten generell zu einer verbesserten TAA-spezifischen Immunrekonstitution und konsekutiv zu einem besseren klinischen Ergebnis beitragen, bleibt offen und wird in klinischen Studien geklärt werden müssen. / Efficacy of allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) as immunotherapy is mediated by donor-derived immunity against both minor histocompatibility antigens and tumor-associated antigens (TAAs). However, so far little is known about the origin and frequency of immunity against the latter in healthy blood donors. Since expression in fetal and placental tissues is known for many TAAs with clinical relevance, we investigated the pregnancy as a potential trigger for these memory-type T cell immune responses. In a cross-sectional analysis, we examined a total of 114 healthy blood donors including 38 nulligravidous women, 38 primi- or multiparous women and 38 men. In a longitudinal analysis, we investigated a total of 44 women at four time points during and after their first pregnancy. Donors’ positively isolated CD8-positive T cells were pulsed with peptides of four TAAs with known clinical relevance and placental expression: HER2/neu (human epidermal growth factor receptor 2), MUC1 (Mucin 1), PRAME (preferentially expressed antigen of melanoma) und WT1 (Wilms tumor protein 1). Quantitative reverse-transcription polymerase chain reaction was applied to detect interferon-γ (IFN-γ) mRNA after this stimulation. Additionally, CD8-positive T cells were analyzed by flow cytometry and IFN-γ ELISPOT assays. In healthy blood donors, CD8-positive memory-type T cell immune responses of low and/or high avidity could be detected against all four analyzed TAAs. Frequency of positive immune responses varied from 5 % (HER2/neu) and 7 % (PRAME) to 14 % (MUC1) and 15 % (WT1). Higher absolute levels of immune responses were found in healthy men, likely due to testicular expression of the analyzed antigens. In healthy primigravidous women, strongest immune responses could be shown during pregnancy to disappear after delivery and completion of nursing. Therefore, it can be assumed that expression of TAAs in the fetoplacental unit is leading to a “boost” of pre-existing immunity against these antigens. However, these immune responses seem to be short-lived due to both permissive hormonal environment evolving during pregnancy and loss of the fetoplacental unit as driving target after delivery. Accordingly, no association between history of prior deliveries and stronger immune responses against the analyzed TAAs was observed in this work. The results of our study are in line with observations made in tumor immunotherapy where immunity against TAAs could be generated by vaccination strategies, but showed no long-lasting persistence. Nevertheless, the shown TAA-specific immunity could be transferred into recipients after allogeneic HSCT, where a proinflammatory environment provides capability for homeostatic expansion and persistence of these immune responses. Taken together, the findings of this work provide implications for both allogeneic and autologous HSCT. Furthermore, our results could also gain relevance for innovative immunotherapies such as immune checkpoint inhibitors since persistence of tumor-specific immunity is highly important for control of the malignant disease and consecutively for long-term survival. Whether TAA-specific immune responses as shown in our study could contribute to an improved immune reconstitution after allogeneic HSCT and consecutively to a better long-term outcome remains unclear and needs to be clarified in clinical trials.

The plasma membrane is one of the most thoroughly studied and at the same time most complex, diverse, and least understood cellular structures. Its function is determined by the molecular composition as well as the spatial arrangement of its components. Even after decades of extensive membrane research and the proposal of dozens of models and theories, the structural organization of plasma membranes remains largely unknown. Modern imaging tools such as super-resolution fluorescence microscopy are one of the most efficient techniques in life sciences and are widely used to study the spatial arrangement and quantitative behavior of biomolecules in fixed and living cells. In this work, direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM) was used to investigate the structural distribution of mem-brane components with virtually molecular resolution. Key issues are different preparation and staining strategies for membrane imaging as well as localization-based quantitative analyses of membrane molecules. An essential precondition for the spatial and quantitative analysis of membrane components is the prevention of photoswitching artifacts in reconstructed localization microscopy images. Therefore, the impact of irradiation intensity, label density and photoswitching behavior on the distribution of plasma membrane and mitochondrial membrane proteins in dSTORM images was investigated. It is demonstrated that the combination of densely labeled plasma membranes and inappropriate photoswitching rates induces artificial membrane clusters. Moreover, inhomogeneous localization distributions induced by projections of three-dimensional membrane structures such as microvilli and vesicles are prone to generate artifacts in images of biological membranes. Alternative imaging techniques and ways to prevent artifacts in single-molecule localization microscopy are presented and extensively discussed. Another central topic addresses the spatial organization of glycosylated components covering the cell membrane. It is shown that a bioorthogonal chemical reporter system consisting of modified monosaccharide precursors and organic fluorophores can be used for specific labeling of membrane-associated glycoproteins and –lipids. The distribution of glycans was visualized by dSTORM showing a homogeneous molecule distribution on different mammalian cell lines without the presence of clusters. An absolute number of around five million glycans per cell was estimated and the results show that the combination of metabolic labeling, click chemistry, and single-molecule localization microscopy can be efficiently used to study cell surface glycoconjugates. In a third project, dSTORM was performed to investigate low-expressing receptors on cancer cells which can act as targets in personalized immunotherapy. Primary multiple myeloma cells derived from the bone marrow of several patients were analyzed for CD19 expression as potential target for chimeric antigen receptor (CAR)-modified T cells. Depending on the patient, 60–1,600 CD19 molecules per cell were quantified and functional in vitro tests demonstrate that the threshold for CD19 CAR T recognition is below 100 CD19 molecules per target cell. Results are compared with flow cytometry data, and the important roles of efficient labeling and appropriate control experiments are discussed. / Die Plasmamembran gehört zu den am meisten untersuchten, gleichzeitig aber auch zu den komplexesten, vielfältigsten und am wenigsten verstandenen biologischen Strukturen. Ihre Funktion wird nicht nur durch die molekulare Zusammensetzung bestimmt, sondern auch durch die räumliche Anordnung ihrer Bestandteile. Selbst nach Jahrzehnten intensiver Forschung und der Veröffentlichung dutzender Membranmodelle und Theorien bleibt die genaue strukturelle Organisation der Plasmamembran ein Rätsel. Moderne Bildgebungsverfahren wie etwa die hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie gehören mittlerweile zu den effizientesten Techniken der Lebenswissenschaften und werden immer öfter verwendet, um die räumliche Anordnung als auch die Anzahl von Biomolekülen in fixierten und lebenden Zellen zu studieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die hochauflösende Mikroskopie-Methode dSTORM (direct stochastic optical reconstruction microscopy) angewendet, um die räumliche Verteilung von Membranmolekülen mit annähernd molekularer Auflösung zu untersuchen. Schwerpunkte dieser Arbeit sind dabei verschiedene Präparations- und Färbemethoden für die mikroskopische Untersuchung von Zellmembranen sowie lokalisationsbasierte quantitative Analysemethoden von Membranmolekülen. Eine Voraussetzung für die räumliche als auch quantitative Analyse von Membranmolekülen ist die Vermeidung von Photoschalt-Artefakten in rekonstruierten Lokalisationsmikroskopie-Bildern. Um dies genauer zu demonstrieren, wurden die Auswirkungen von Anregungsintensität, Markierungsdichte und verändertem Photoschalten auf die räumliche Verteilung von Proteinen der Plasma- und Mitochondrienmembran in dSTORM-Bildern analysiert. Es wird gezeigt, dass eine dicht markierte Plasmamembran in Kombination mit ungeeigneten Photoschaltraten zu artifiziellen Clustern in der Membran führt. Es sind vor Allem oft die Projektionen dreidimensionaler Membranstrukturen wie etwa Mikrovilli und Vesikel dafür verantwortlich, dass lokale Unterschiede in der Lokalisationsdichte entstehen, wodurch unter Umständen Bildartefakte generiert werden können. Darüber hinaus werden alternative Mikroskopie-Methoden und Möglichkeiten, Artefakte in Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie-Bildern zu verhindern, präsentiert und ausführlich diskutiert. Ein weiteres zentrales Thema dieser Arbeit ist die räumliche Anordnung von glykosylierten Membranmolekülen. Es wird demonstriert, wie ein bioorthogonales chemisches Reportersystem bestehend aus modifizierten Monosacchariden und organischen Fluorophoren für die spezifische Markierung von Membran-assoziierten Glykoproteinen und –lipiden eingesetzt werden kann. Mittels dSTORM wird gezeigt, dass die Verteilung von Glykanen in der Plasmamembran unterschiedlicher Zelllinien homogen und frei von Clustern ist. Des Weiteren zeigt eine quantitative Analyse, dass sich in etwa fünf Millionen Glykane auf einer einzigen Zelle befinden. Die Ergebnisse demonstrieren, dass die Kombination aus metabolisch markierten Zielmolekülen, Click-Chemie und Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie effizient genutzt werden kann, um Glykokonjugate auf Zelloberflächen zu untersuchen. In einem dritten Projekt wurde dSTORM zur Untersuchung von Rezeptormolekülen auf Krebszellen verwendet. Die Expression dieser Oberflächenproteine ist so gering, dass sich nur wenige Moleküle auf einer Zelle befinden, die jedoch als Zielmoleküle in der personalisierten Immuntherapie dienen könnten. Dafür wurden primäre Tumorzellen aus dem Knochenmark von Patienten, die am Multiplen Myelom erkrankt sind, auf die Expression des CD19-Oberflächenproteins als potentielles Ziel für CAR-modifizierte T-Zellen (chimeric antigen receptor) untersucht. Es wird gezeigt, dass sich, abhängig vom untersuchten Patienten, auf einer Zelle 60 bis 1600 CD19-Moleküle befinden. Funktionale in-vitro-Experimente demonstrieren, dass weniger als 100 CD19 Moleküle ausreichen, um CD19-CAR-T-Zellen zu aktivieren. Diese Ergebnisse werden mit Durchflusszytometrie-Daten verglichen und die wichtige Rolle von Lebendzellfärbung und geeigneten Kontrollexperimenten wird diskutiert.

Zugl.: Freiburg (Breisgau), Universiẗat, Diss., 2009.