Das Induzieren und Aufrechterhalten einer tumor-protektiven Immunität sind wesentliche Ziele in der Immuntherapie des Neuroblastoms. Eine Erhöhung der Anzahl von tumor-infiltrierenden Leukozyten könnte ein Weg sein, um dieses Ziel zu erreichen. Fractalkine ist ein besonderes TH1 CX3C Chemokin, welches sowohl Adhäsion und Migration von Leukozyten vermittelt. Gerichtetes IL-2 (ch14.18-IL-2) wurde durch eine genetische Fusion von anti-GD2 Antikörper mit IL-2 hergestellt, damit IL-2 spezifisch in das Mikromilieu von Neuroblastomen gebracht werden kann. In dieser Arbeit habe ich die Hypothese getestet, dass Gentherapie mit dem Chemokin Fractalkine (FKN) eine wirksame Antineuroblastom-Immunantwort induziert, welche durch gerichtetes IL-2 amplifiziert wird. Zu diesem Zweck wurden NXS2-Zellen genetisch verändert, damit sie murines FKN produzieren (NXS2-FKN). Transkription und Expression des mFKN Gens konnte in NXS2-FKN Zellen und Tumorgewebe gezeigt werden. Die chemotaktische Eigenschaft von FKN wurde sowohl in vitro als auch in vivo gezeigt. FKN zeigte eine Reduktion des Primärtumorwachstums, welches durch gerichtetes IL-2 mit nicht-kurativen Dosen von ch14.18-IL-2 deutlich verbessert wurde. Ferner wurden experimentelle Lebermetastasen nur in den Mäusen komplett eradiziert, welche die Kombinationstherapie erhalten haben. Die Mechanismen, welche an dieser Antitumorantwort beteiligt sind, schließen eine wirksame T-Zell-Aktivierung (Hochregulation von CD69, CD25, und von TNF-alpha und INF-gamma), sowie eine Erhöhung der tumorspezifischen CTL-Aktivität mitein. Die Depletion von CD4+ und CD8+ T-Zellen in vivo hat diesen therapeutischen Effekt aufgehoben, was die essentielle Rolle von T-Zellen in diesem immuntherapeutischen Ansatz unterstreicht. Zusammenfassend konnte ich zum ersten Mal zeigen, dass Chemokin-Gentherapie mit FKN durch gerichtetes IL-2 amplifiziert wird, was eine Kombination dieser beiden Strategien zur adjuvanten Therapie beim Neuroblastom nahe legt. / Induction and maintenance of tumor-protective immunity are the major goals of neuroblastoma immunotherapy. Enhancing the amount of tumor infiltrating leukocytes might be a way to achieve these goals since they may be associated with residual evidence of the ineffective immune response. Fractalkine is a unique TH1 CX3C chemokine known to induce both adhesion and migration of leukocytes mediated by a membrane-bound and a soluble form, respectively. Targeted IL-2 (ch14.18-IL-2) was constructed by anti-GD2 antibody fused with IL-2 so that IL-2 can be directed into the microenvironment of neuroblastoma tumor. Here, I tested the hypothesis that chemokine gene therapy with fractalkine (FKN) induces an effective anti-neuroblastoma immune response amplified by targeted IL-2. NXS2 cells were engineered to stably produce murine FKN (NXS2-FKN). Transcrip- tion and expression of the mFKN gene in NXS2-FKN cells and tumor tissue were demonstrated. The chemotactic activity of FKN expressed by NXS2 cells was determined both in vitro and in vivo. Importantly, NXS2-FKN exhibited a reduction in primary tumor growth, which was boosted by targeted IL-2 using non-curative doses of ch14.18-IL-2. Furthermore, experimental liver metastases were completely eradicated in mice receiving the combination therapy, demonstrating the induction of a long-lived tumor protective response. The mechanisms involved in antitumor response included effective T cell activation as indicated by the up-regulation of T-cell activation markers (CD69, CD25) and proinflammatory cytokines (TNF-alpha, INF-gamma) as well as the enhancement of tumor specific CTL activity. The depletion of CD4+ and CD8+ T cells in vivo abrogated the therapeutic effect supporting the crucial role of T cells in this immunotherapeutic approach. In summary, I demonstrated for the first time that chemokine gene therapy with FKN is amplified by targeted IL-2 suggesting a combination of both strategies as an adjuvant therapy for neuroblastoma.

Die spezifische adoptive Immuntherapie ist ein hoffnungsvoller Ansatz zur Behandlung von Tumoren. Die aufwendige individuelle Bereitstellung primärer Effektorlymphozyten könnte durch den Einsatz etablierter tumorantigenspezifischer Effektorzellinien vermieden werden. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob sich ein Tumortargeting der humanen Natürlichen Killer-(NK)-Zellinie YT durch den Gentransfer chimärer Immunglobulin-T-Zellrezeptoren (cIgTCRs) erreichen läßt. Die cIgTCR-Konstrukte wurden aus single-chain-Fv-Fragmenten (scFv), dem IgG1-Fc-Teil und der CD3-Zeta-Signalkette erzeugt. Die scFv-Fragmente wurden aus den humanisierten Antikörpern BW431/26 und HuM195, die spezifisch für das karzinoembryonale Antigen (CEA) bzw. CD33 sind, konstruiert und zeigten als scFv-hFc-Fusionsproteine eine spezifische Bindung an Tumorzellen. Die YT-Zellen wurden mit den cIgTCR-Genkonstrukten über Elektroporation transfiziert und über immunologische Verfahren angereichert. In-vitro-Studien ergaben eine spezifische Lyse von CEA+ Kolonkarzinomzellinien durch die scBW431/26-hFcZeta+ YT-Zellen. Die Zytotoxizität korrelierte mit der Expression des cIgTCR-Antigens auf den Tumorzellen und wurde durch zirkulierendes CEA nicht gehemmt. Die scHuM195-hFcZeta+ YT-Zellen zeigten eine spezifische Lyse der CD33+ myeloischen Leukämiezellinie KG1. Die Bestrahlung wurde zur Wachstumsbegrenzung der YT-Zellen eingesetzt. Die spezifische Zytotoxizität der scBW431/26-hFcZeta+ YT-Zellen gegenüber CEA+ Tumorzellen war einen Tag nach Bestrahlung unverändert. Die Koinjektion von CEA+ Tumorzellen mit bestrahlten scBW431/26-hFcZeta+ YT-Zellen führte zu einer signifikanten Hemmung des Tumorwachstums in NOD/SCID-Mäusen. Die cIgTCR+ YT-Zellen zeigten in vitro eine geringe Sensibilität gegenüber allogenen Blutlymphozyten. Die Ergebnisse zeigen, daß die Zytotoxizität der NK-Zellinie YT tumorantigenspezifisch durch cIgTCR-Gentransfer erweitert wird und ein Potential zur Behandlung minimaler Tumorerkrankungen besteht. / The specific adoptive immunotherapy is a promising strategy for cancer treatment. The utilization of established tumor antigen specific effector cell lines could bypass the expendable individual preparation and often limited specificity of primary effector lymphocytes. This study investigated the tumor targeting of the human Natural Killer (NK) cell line YT by gene transfer of chimeric immunoglobulin T cell receptors (cIgTCRs). The cIgTCR constructs were generated of single chain antibody fragments (scFv), the IgG1 Fc part and the CD3 Zeta chain. The scFv fragments were constructed of the humanized antibodies BW431/26 and HuM195 with specificity for the carcinoembryonic antigen (CEA) and CD33, respectively, and showed as scFv-Fc fusion proteins a specific binding to tumor cells. YT cells were transfected with the cIgTCR gene constructs by electroporation and enriched by immunological cell separation. In vitro studies revealed a specific lysis of CEA+ colon carcinoma cell lines by scBW431/26-hFcZeta+ YT cells. The cytotoxicity correlated with the expression of the cIgTCR antigen on the tumor cells and was not inhibited in the presence of soluble CEA. The scHuM195-hFcZeta+ YT cells mediated a specific lysis of the CD33+ myeloic leukemia cell line KG1. The irradiation was used to limit the growth of the YT cell line. The specific cytotoxicity of the scBW431/26-hFcZeta+ YT cells against CEA+ tumor cells was unaltered one day after irradiation. The coinjection of CEA+ tumor cells and irradiated scBW431/26-hFcZeta+ YT cells led to a significant growth inhibition in NOD/SCID mice. The cIgTCR+ YT cells showed a low susceptibility to the cytotoxicity of allogeneic blood lymphocytes in vitro. The results demonstrated that the cytotoxicity of the human NK cell line YT can be specifically extended to tumor antigens by cIgTCR gene transfer. The employment of receptor gene modified YT cells could be a useful tool for the adoptive immunotherapy of minimal tumor diseases.

Bei der adjuvanten Immuntherapie soll das Immunsystem von Tumorpatienten gezielt gegen Mikrometastasen aktiviert werden, die nach der operativen Entfernung des Primärtumors im Körper verbleiben. Tumor-assoziierte Antigene (TAA) spielen dabei die zentrale Rolle. Um der Heterogenität eines Tumors in der Expression einzelner TAAs Rechnung zu tragen, werden in modernen Vakzinierungsstrategien Pools von verschiedenen TAAs eingesetzt. Für das Mammakarzinom sind aber bislang nur wenige TAAs bekannt. Auf der Suche nach unbekannten Genen mit Mamma- bzw. Mammakarzinom-restringierter Expression in der Transkriptomdatenbank GeneExpress® wurde ein EST gefunden, das nur in 2 % der getesteten weibl. Normalgewebe ohne Mamma mit einer marginalen mittleren Expression von 16 FE (Fluoreszenzeinheit) detektiert wurde, aber in 63 % der Mammanormalgewebe (159 FE) und in 61 % der Mammakarzinome (339 FE) exprimiert wurde. Das korrespondierende UniGene-Cluster gab erste Hinweise auf die Zugehörigkeit dieses neuen Gens zu der Cytochrom P450 (CYP) Familie. Durch computergestützte Homologievergleiche mit verwandten Mitgliedern dieser Familie in Kombination mit RT-PCR konnte die cDNA-Sequenz dieses neuen CYP ermittelt werden: Durch Amplifikation der Gesamtlängen-cDNA wurden drei Transkripte in der Mammakarzinomzelllinie SK-BR-3 gefunden, die von zwei neuen CYP Genen stammen, CYP4Z1 und dem Pseudogen CYP4Z2P. Die cDNA von CYP4Z1 kodiert für ein 505 As großes Protein, das aufgrund von Homologien einer neuen Subfamilie innerhalb der CYP4 Familie zugeordnet werden kann. Sowohl die Sequenz als auch die vorhergesagte Sekundärstruktur zeigen alle charakteristischen Merkmale eines funktionellen Mitglieds dieser Familie. Aufgrund einer Nonsensemutation in Exon 8 kodiert die cDNA von CYP4Z2P (1436 bp) für ein verkürztes, nichtfunktionelles P450 von 340 As, das zu 96% identisch mit P450 4Z1 ist. Außerdem wurde in SK-BR-3 eine Spleißvariante von CYP4Z1 identifiziert. CYP4Z1 (50,8 kb) und CYP4Z2P (57,3 kb) liegen auf Chromosom 1p33-p34.1 und bestehen aus 12 Exons mit konservierten Exon-Intron-Grenzen. CYP4Z2P ist aus einer inversen Duplikation von CYP4Z1 hervorgegangen. Mittels Realtime RT-PCR mit cDNA von 17 Normalgeweben von gepoolten Spendern und von Mammakarzinomen konnte die auf Brustdrüsengewebe restringierte Expression beider Gene demonstriert werden: Die Expression von CYP4Z1 war in Mammakarzinomgewebe 3,6-mal höher als in Mammanormalgewebe, 60-mal höher als in Lunge und 84-mal höher als in Leber. Alle anderen getesteten weibl. Normalgewebe zeigten eine noch geringere Expression. Ein ähnlich stringentes Expressionsprofil ergab die Analyse von CYP4Z2P, allerdings mit einer deutlich niedrigeren Expressionsstärke. Das Mamma-restringierte Expressionsverhalten von CYP4Z1 wurde durch einen ?Cancer-Profiling-Array? (241 Tumor-/Normalgewebepaare von 13 Gewebetypen) bestätigt. Damit konnte gezeigt werden, dass CYP4Z1 bei 52 % der getesteten 50 Brustkrebspatientinnen im Tumor versus peritumoralem Normalgewebe überexprimiert war. Mit einem spezifischen Kaninchen-Antiserum konnte die Expression von P450 4Z1 Protein sowohl in CYP4Z1-transduzierten Zelllinien als auch in Mammagewebeproben mittels Western-Blot nachgewiesen werden. Konfokale Laser-Scanning Mikroskopie von MCF-7 Zellen, die das Fusionsprotein CYP4Z1-EGFP exprimierten, und die subzelluläre Fraktionierung der CYP4Z1-Transduktanten zeigten P450 4Z1 als integrales Membranprotein des endoplasmatischen Retikulums (ER). Für die Lokalisation und die Zurückhaltung im ER ohne Recycling aus dem Prä-Golgiapparat sind die ersten 32 As erforderlich, was Studien mit unterschiedlichen Deletionsmutanten aus der N-terminalen Sequenz von 4Z1 zeigten. Die Entdeckung eines neuen Mamma-spezifisch exprimierten P450 Enzyms eröffnet neue Möglichkeiten sowohl in Hinsicht auf eine Immuntherapie von Brustkrebs als auch für die Entwicklung neuer Chemotherapeutika, die spezifisch durch P450 4Z1 am Tumorort umgesetzt werden können.

Die vorliegende Arbeit beinhaltet die Generierung und Evaluation von Natürlichen Killerzellen, die EGFRvIII-positive und SDF-1alpha sekretierende primäre Glioblastomzellen aufspüren, erkennen und effizient abtöten können. Die Kombination der gelenkten Zytotoxizität mit einer optimierten Migration von Effektorzellen des Immunsystems wird auf Grundlage der in dieser Arbeit gewonnenen Daten als ein vielversprechender Ansatz für eine zukünftige Therapie des primären Glioblastoms vorgeschlagen.

Die vorliegende Arbeit beinhaltet die Generierung und Evaluation von Natürlichen Killerzellen, die EGFRvIII-positive und SDF-1alpha sekretierende primäre Glioblastomzellen aufspüren, erkennen und effizient abtöten können. Die Kombination der gelenkten Zytotoxizität mit einer optimierten Migration von Effektorzellen des Immunsystems wird auf Grundlage der in dieser Arbeit gewonnenen Daten als ein vielversprechender Ansatz für eine zukünftige Therapie des primären Glioblastoms vorgeschlagen.

Background: Patients diagnosed with melanoma frequently search the internet for treatment information, including novel and complex immunotherapy. However, health literacy is limited among half of the German population, and no assessment of websites on melanoma treatment has been performed so far. Objective: The aim of this study was to identify and assess the most visible websites in German language on melanoma immunotherapy. Methods: In accordance with the common Web-based information-seeking behavior of patients with cancer, the first 20 hits on Google, Yahoo, and Bing were searched for combinations of German synonyms for “melanoma” and “immunotherapy” in July 2017. Websites that met our predefined eligibility criteria were considered for assessment. Three reviewers independently assessed their quality by using the established DISCERN tool and by checking the presence of quality certification. Usability and reliability were evaluated by the LIDA tool and understandability by the Patient Education Materials Assessment Tool (PEMAT). The Flesch Reading Ease Score (FRES) was calculated to estimate the readability. The ALEXA and SISTRIX tools were used to investigate the websites’ popularity and visibility. The interrater agreement was determined by calculating Cronbach alpha. Subgroup differences were identified by t test, U test, or one-way analysis of variance. Results: Of 480 hits, 45 single websites from 30 domains were assessed. Only 2 website domains displayed a German quality certification. The average assessment scores, mean (SD), were as follows: DISCERN, 48 (7.6); LIDA (usability), 40 (2.0); LIDA (reliability), 10 (1.6); PEMAT, 69% (16%); and FRES, 17 (14), indicating mediocre quality, good usability, and understandability but low reliability and an even very low readability of the included individual websites. SISTRIX scores ranged from 0 to 6872 and ALEXA scores ranged from 17 to 192,675, indicating heterogeneity of the visibility and popularity of German website domains providing information on melanoma immunotherapy. Conclusions: Optimization of the most accessible German websites on melanoma immunotherapy is desirable. Especially, simplification of the readability of information and further adaption to reliability criteria are required to support the education of patients with melanoma and laypersons, and to enhance transparency.

Bei der adjuvanten Immuntherapie soll das Immunsystem von Tumorpatienten gezielt gegen Mikrometastasen aktiviert werden, die nach der operativen Entfernung des Primärtumors im Körper verbleiben. Tumor-assoziierte Antigene (TAA) spielen dabei die zentrale Rolle. Um der Heterogenität eines Tumors in der Expression einzelner TAAs Rechnung zu tragen, werden in modernen Vakzinierungsstrategien Pools von verschiedenen TAAs eingesetzt. Für das Mammakarzinom sind aber bislang nur wenige TAAs bekannt. Auf der Suche nach unbekannten Genen mit Mamma- bzw. Mammakarzinom-restringierter Expression in der Transkriptomdatenbank GeneExpress® wurde ein EST gefunden, das nur in 2 % der getesteten weibl. Normalgewebe ohne Mamma mit einer marginalen mittleren Expression von 16 FE (Fluoreszenzeinheit) detektiert wurde, aber in 63 % der Mammanormalgewebe (159 FE) und in 61 % der Mammakarzinome (339 FE) exprimiert wurde. Das korrespondierende UniGene-Cluster gab erste Hinweise auf die Zugehörigkeit dieses neuen Gens zu der Cytochrom P450 (CYP) Familie. Durch computergestützte Homologievergleiche mit verwandten Mitgliedern dieser Familie in Kombination mit RT-PCR konnte die cDNA-Sequenz dieses neuen CYP ermittelt werden: Durch Amplifikation der Gesamtlängen-cDNA wurden drei Transkripte in der Mammakarzinomzelllinie SK-BR-3 gefunden, die von zwei neuen CYP Genen stammen, CYP4Z1 und dem Pseudogen CYP4Z2P. Die cDNA von CYP4Z1 kodiert für ein 505 As großes Protein, das aufgrund von Homologien einer neuen Subfamilie innerhalb der CYP4 Familie zugeordnet werden kann. Sowohl die Sequenz als auch die vorhergesagte Sekundärstruktur zeigen alle charakteristischen Merkmale eines funktionellen Mitglieds dieser Familie. Aufgrund einer Nonsensemutation in Exon 8 kodiert die cDNA von CYP4Z2P (1436 bp) für ein verkürztes, nichtfunktionelles P450 von 340 As, das zu 96% identisch mit P450 4Z1 ist. Außerdem wurde in SK-BR-3 eine Spleißvariante von CYP4Z1 identifiziert. CYP4Z1 (50,8 kb) und CYP4Z2P (57,3 kb) liegen auf Chromosom 1p33-p34.1 und bestehen aus 12 Exons mit konservierten Exon-Intron-Grenzen. CYP4Z2P ist aus einer inversen Duplikation von CYP4Z1 hervorgegangen. Mittels Realtime RT-PCR mit cDNA von 17 Normalgeweben von gepoolten Spendern und von Mammakarzinomen konnte die auf Brustdrüsengewebe restringierte Expression beider Gene demonstriert werden: Die Expression von CYP4Z1 war in Mammakarzinomgewebe 3,6-mal höher als in Mammanormalgewebe, 60-mal höher als in Lunge und 84-mal höher als in Leber. Alle anderen getesteten weibl. Normalgewebe zeigten eine noch geringere Expression. Ein ähnlich stringentes Expressionsprofil ergab die Analyse von CYP4Z2P, allerdings mit einer deutlich niedrigeren Expressionsstärke. Das Mamma-restringierte Expressionsverhalten von CYP4Z1 wurde durch einen ?Cancer-Profiling-Array? (241 Tumor-/Normalgewebepaare von 13 Gewebetypen) bestätigt. Damit konnte gezeigt werden, dass CYP4Z1 bei 52 % der getesteten 50 Brustkrebspatientinnen im Tumor versus peritumoralem Normalgewebe überexprimiert war. Mit einem spezifischen Kaninchen-Antiserum konnte die Expression von P450 4Z1 Protein sowohl in CYP4Z1-transduzierten Zelllinien als auch in Mammagewebeproben mittels Western-Blot nachgewiesen werden. Konfokale Laser-Scanning Mikroskopie von MCF-7 Zellen, die das Fusionsprotein CYP4Z1-EGFP exprimierten, und die subzelluläre Fraktionierung der CYP4Z1-Transduktanten zeigten P450 4Z1 als integrales Membranprotein des endoplasmatischen Retikulums (ER). Für die Lokalisation und die Zurückhaltung im ER ohne Recycling aus dem Prä-Golgiapparat sind die ersten 32 As erforderlich, was Studien mit unterschiedlichen Deletionsmutanten aus der N-terminalen Sequenz von 4Z1 zeigten. Die Entdeckung eines neuen Mamma-spezifisch exprimierten P450 Enzyms eröffnet neue Möglichkeiten sowohl in Hinsicht auf eine Immuntherapie von Brustkrebs als auch für die Entwicklung neuer Chemotherapeutika, die spezifisch durch P450 4Z1 am Tumorort umgesetzt werden können.

Die Entwicklung von Autoimmunerkrankungen wird durch eine Vielzahl verschiedener Faktoren verursacht, darunter gewisse Umwelteinflüsse, genetische Veranlagungen oder Virusinfektionen. So vielfältig die Ursprünge von Autoimmunerkrankungen sind, so divers sind die daraus resultierenden Erkrankungen, wodurch die Entwicklung zuverlässiger Therapien erschwert wird. Obwohl verschiedene Behandlungsmöglichkeiten existieren, welche die Symptome bei Autoimmunerkrankungen wie neuroinflammatorischer Multipler Sklerose (MS) mildern können, z.B. mit monoklonalen Antikörpern (mAk), wirken die meisten Medikamente breit und unspezifisch. Dies beeinträchtigt die Funktionalität des Immunsystems, was wiederum zu einem höheren Risiko für bakterielle und virale Infektionen, maligne Erkrankungen oder sekundäre Autoimmunität führen kann. Andere Therapieansätze untersuchen daher Möglichkeiten einer Antigen-abhängigen Immuntoleranz-Induktion. Allerdings befinden sich diese noch in den frühen Entwicklungsphasen und deren klinische Wirksamkeit muss noch bewiesen werden. Alternativ hat es sich in der onkologischen Immuntherapie als erfolgreich erwiesen, entweder natürliche oder gentechnisch veränderte Immunzellen zu aktivieren. Bisher wurden humane T-Zellen, welche mit Hilfe chimärer Antigenrezeptoren (CAR) mit ausgewählter Spezifität ausgestattet sind, sehr erfolgreich in der Klinik gegen Tumorerkrankungen genutzt. Basierend auf diesen klinischen Erfolgen stellt sich die Frage, ob CAR T-Zellen auch zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen eingesetzt werden können. Herkömmlichen CAR T-Zellen mangelt es jedoch sowohl an Flexibilität als auch an Kontrollierbarkeit, da sie mit einem CAR gegen ein einzelnes Antigen ausgestattet sind und in Gegenwart des Zielantigens dauerhaft aktiviert und nicht kontrollierbar sind. Um Limitationen konventioneller CARs zu überwinden, wurden universelle Adapter-CARs (UniCARs, RevCARs) in der Gruppe von Prof. Bachmann entwickelt. Die modulare UniCAR-Plattform besteht aus universell einsetzbaren UniCAR T-Zellen und anpassbaren antigenspezifischen Zielmodulen (TMs). Die Bindungseinheit des UniCAR basiert auf einem mAk mit Spezifität gegen ein Peptidepitop, das Teil des TMs ist und welches spezifisch an Zielantigene auf Tumorzellen bindet. Das TM fungiert als Adaptermolekül, das eine Vernetzung der UniCAR T-Zelle mit der Zielzelle herstellt. Nach der Vernetzung mit der Zielzelle über das TM wird die UniCAR T-Zelle aktiviert, so dass die Zielzelle eliminiert wird. Eine vor Kurzem vorgenommene Modifikation der extrazellulären UniCAR-Domäne führte zu der Reverse CAR (RevCAR)-Plattform, welche die Spezifität und Sicherheit noch weiter erhöhen sowie tonische Signale konventioneller CARs reduzieren soll. Dabei wurde die extrazelluläre mAk-basierte UniCAR-Domäne mit dem Peptidepitop des TM ausgetauscht. Eines der am besten untersuchten Autoantigene bei neuroinflammatorischen Erkrankungen ist das Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG). Dieses Protein befindet sich ausschließlich im zentralen Nervensystem an der abaxonalen Membran der nervenschützenden Myelinscheide. Obwohl neuroinflammatorische Erkrankungen wie MS hauptsächlich durch T-Zellen verursacht werden, wurden bei MS-Patienten auch Autoantikörper gegen MOG nachgewiesen, was auf die Beteiligung autoreaktiver B-Zellen an der Verschlimmerung der Krankheit hinweist. Diese Ergebnisse werden durch die wirksame Behandlung von MS-Patienten mit anti-CD20-mAks belegt. In dieser Arbeit wurde MOG als erstes Modell-Zielantigen für das Retargeting von CAR-modifizierten T-Zellen gegen anti-MOG-Ak-exprimierende humane Zellen verwendet. Ziel dieser Arbeit war neue TMs basierend auf der extrazellulären Domäne des MOG Antigens zu entwickeln, die dazu dienen, UniCAR oder RevCAR T-Zellen zur Eliminierung von anti-MOG Ak-exprimierenden Zielzellen zu aktivieren. Zur Bestimmung des optimalen MOG-Antigen TM-Formats wurden für die UniCAR-Plattform ein monovalentes (25 kDa) und ein bivalentes MOG-Antigen TM (50 kDa) entwickelt. Die Wirksamkeit des UniCAR-Systems wurde in vitro demonstriert. Es konnte dabei gezeigt werden, dass beide TMs bereits nach einer kurzen Inkubationszeit von 8 Stunden eine TM-spezifische Lyse Anti-MOG scFv-exprimierender menschlicher Zelllinien durch UniCAR-T-Zellen vermitteln. Darüber hinaus war es möglich, das zytotoxische Potential der UniCAR-T-Zellen durch die Dosierung der TMs zu kontrollieren. Um zu überprüfen, ob der Effekt basierend auf der UniCAR-Platform gegen anti-MOG scFv-exprimierende Zielzellen noch gesteigert werden kann, wurde ein monovalentes MOG-Antigen RevTM für die RevCAR-Plattform entwickelt. In Kombination mit RevCAR-T-Zellen übertraf die Anwendung des RevTM beide UniCAR TMs hinsichtlich Bindungsaffinität und dosisabhängiger Zytotoxizität gegen zwei anti-MOG scFv-exprimierende Zelllinien in vitro. Außerdem war die Freisetzung proinflammatorischer und T-Zellwachstum-fördernder Zytokine im Vergleich zu UniCAR T-Zellen höher und ausgeprägter. Weiterhin wurde die Funktionalität des RevCAR-Systems gegen anti-MOG-scFv-exprimierende Zielzellen in vivo bewiesen. Zusammenfassend kann geschlussfolgert werden, dass die modularen Adapter-CAR T-Zell-Plattformen neben der Krebsimmuntherapie auch bemerkenswertes Potential für die Behandlung von MOG-assoziierten Autoimmunerkrankungen hat. Damit konnte ein erster Grundstein dafür gelegt werden, CAR T-Zellen auf die Anwendung in Autoimmunerkrankungen zu übertragen, um zukünftig gezielt fehlerhafte Immunzellen zu beseitigen, die nachweislich zur Verschlimmerung von Autoimmunerkrankungen beitragen.:Table of contents I List of abbreviations VI 1 Introduction 1 1.1 The human immune system 2 1.2 B cells and antibodies 3 1.2.1 Antibody structure 3 1.2.2 Tolerance induction 4 1.2.3 B cell activation 5 1.2.4 B cell functions in autoimmune diseases 6 1.3 Multiple sclerosis – an example for neuroinflammatory demyelination diseases 8 1.3.1.1 Disease phenotypes 9 1.3.1.2 Immunopathogenesis 9 1.3.2 Autoantigen myelin oligodendrocyte glycoprotein 11 1.4 Immunotherapy 14 1.4.1 Monoclonal antibody therapy 14 1.4.2 Chimeric antigen receptor therapy 16 1.4.2.1 UniCAR and RevCAR T cell system 18 1.4.2.2 CAR T cells in autoimmune diseases 22 1.5 Objectives 23 2 Materials and Methods 25 2.1 Materials 25 2.1.1 Consumables 25 2.1.2 Devices and software 27 2.1.3 Chemicals and reagents 32 2.1.4 Buffers and solutions 36 2.1.5 Enzymes and enzyme buffers 38 2.1.6 Kit systems 39 2.1.7 Plasmid vectors 39 2.1.8 Oligonucleotides 41 2.1.9 Antibodies 41 2.1.10 Basic media, additives, and recombinant proteins 43 2.1.11 Composition of culture media 44 2.1.12 Bacterial strain 46 2.1.13 Cell lines 46 2.1.14 Mouse strain 47 2.2 Methods 47 2.2.1 Molecular biological and microbiology methods 47 2.2.1.1 DNA digestion with restriction enzymes 47 2.2.1.2 Dephosphorylation of vectors 48 2.2.1.3 Agarose gel electrophoresis 48 2.2.1.4 Isolation and purification of DNA fragments from agarose gels 48 2.2.1.5 Ligation of DNA fragments 49 2.2.1.6 Heat-shock transformation of competent E. colis 49 2.2.1.7 Plasmid mini preparation 49 2.2.1.8 Plasmid midi preparation 50 2.2.1.9 Determination of DNA concentration 50 2.2.1.10 DNA sequencing 50 2.2.2 Cell biology methods 50 2.2.2.1 Cultivation of eukaryotic cells 50 2.2.2.2 Freezing and thawing cultured cells 51 2.2.2.3 Determination of cell number 52 2.2.2.4 Lentiviral transduction of eukaryotic cells 52 2.2.2.5 Immunofluorescence labeling 54 2.2.2.6 Flow cytometry and analysis of flow cytometry data 55 2.2.2.7 Isolation of human peripheral blood mononuclear cells 57 2.2.2.8 Isolation of T cells from PBMCs with magnetic-activated cell sorting 58 2.2.2.9 Stimulation of isolated human T cells 58 2.2.2.10 Engraftment of T cells with chimeric antigen receptors 59 2.2.3 Methods of protein biochemistry 59 2.2.3.1 Isolation of target module constructs 59 2.2.3.2 Dialysis of purified target module constructs 60 2.2.3.3 Discontinuous Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis 60 2.2.3.4 Determination of concentration and immunochemical detection of target module constructs 62 2.2.3.5 Determination of binding affinities of target modules using enzyme-linked immunosorbent assay 63 2.2.4 In vitro functional studies 64 2.2.4.1 T cell activation and exhaustion assay 65 2.2.4.2 Luciferase assay (cytotoxicity assay) 65 2.2.4.3 Determination of cytokine concentration 65 2.2.5 In vivo functionality studies 66 2.2.5.1 Evaluation of tumor killing in vivo 66 2.2.5.2 Optical imaging of luciferase-expressing tumors in vivo 67 2.2.6 Statistical evaluation 67 3 Results 68 3.1 Design and generation of novel MOG target modules 68 3.1.1 MOG target module constructs 68 3.1.2 Expression of target modules 69 3.2 Establishment of scFv MOG-presenting cell models 72 3.3 Binding properties of MOG target modules 74 3.3.1 Determination of binding affinity between anti-MOG antibody and MOG target modules with enzyme-linked immunosorbent assay 74 3.3.2 Determination of binding affinity between anti-MOG receptor-expressing cell lines and MOG target modules with flow cytometry 75 3.4 Generation of human CAR-expressing T cells and binding of MOG target modules 80 3.4.1.1 Genetic modification of human T cells for UniCAR expression 81 3.4.1.2 Genetic modification of human T cells for RevCAR expression 83 3.5 Redirection of UniCAR T cells in vitro 85 3.5.1 Activation of redirected UniCAR T cells 85 3.5.2 Cytokine profile of redirected UniCAR T cells 87 3.5.3 Elimination of scFv MOG-positive target cells by UniCAR T cells 89 3.5.3.1 Time-dependent retargeting of scFv MOG-positive target cells by UniCAR T cells 89 3.5.3.2 Efficacy of UniCAR target modules 91 3.6 Redirection of RevCAR T cells in vitro 92 3.6.1 Activation of redirected RevCAR T cells 92 3.6.2 Cytokine profile of redirected RevCAR T cells 95 3.6.3 Elimination of scFv MOG-positive target cells by RevCAR T cells 99 3.6.3.1 Time-dependent retargeting of scFv MOG-positive target cells using RevCAR T cells 99 3.6.3.2 Efficacy of RevCAR target module 101 3.7 Investigation of RevCAR T cell-mediated cytotoxicity in vivo 103 4 Discussion 105 4.1 Structure and purification of MOG target modules 106 4.2 Expression and purification of target modules 107 4.3 Binding properties of MOG target modules 107 4.4 In vitro cytotoxic potential of UniCAR and RevCAR T cells redirected by MOG target modules 110 4.4.1 Target module-specific redirection of UniCAR T cells to scFv MOG-expressing target cells 110 4.4.2 Target module-specific redirection of RevCAR T cells to scFv MOG-expressing target cells 112 4.5 Future prospective 116 5 Summary 119 6 Zusammenfassung 121 7 References 124 List of figures 145 List of tables 147 Acknowledgement 148

Die adoptive T-Zell-Therapie (ATT) ist eine sich schnell entwickelnde Immuntherapie, die bei Patienten, die an verschiedenen Krebsarten leiden, eine positive klinische Reaktion anzeigt. Eine Variante der ATT ist eine T-Zellen-Rezeptor (TCR)-Gentherapie, bei der Patienten-T-Zellen mit krebsspezifischen TCRs ausgestattet werden. Die Herstellung der TCR-erzeugten T-Zellen ist schnell und robust und erfordert eine geringe Anfangsmenge an Patienten-T-Zellen. Der Mangel an verfügbaren krebsspezifischen TCRs, die auf verschiedene Moleküle des menschlichen Leukozytenantigens (HLA) der Klasse I beschränkt sind, schließt jedoch viele Patienten von der Krebsbehandlung aus. Die Generierung einer krebsspezifischen TCR-Bibliothek, die aus gut definierten TCRs besteht, könnte die Zahl der Patienten, die an klinischen Studien teilnehmen, erhöhen. Das Ziel dieser Doktorarbeit war es, Epstein-Barr-Virus (EBV)-spezifische TCRs zu identifizieren und zu isolieren, um eine EBV-spezifische TCR-Bibliothek als ein nützliches Werkzeug der TCR-Gentherapie bei der Behandlung von EBV-bedingten Krebserkrankungen zu generieren. Insgesamt wurden neun EBV-spezifische TCRs von EBV-positiven Spendern isoliert und charakterisiert, die verschiedene pHLA-Komplexe von EBV-Latentmembranproteinen (LMP1, LMP2A) und Kernprotein (EBNA3C) erkannten. Zusätzlich wurde ein neuartiges immunogenes LMP1-Epitop (QQNWWTLLV) entdeckt, das auf HLA-C*15:02 beschränkt ist. Definierte EBV-spezifische TCRs können als Grundlage für die EBV-spezifische TCR-Bibliothek verwendet werden, die eine wertvolle Quelle von TCRs für die schnelle Generierung von EBV-spezifischen T-Zellen zur Behandlung von Krebspatienten mit verschiedenen HLA-Typen darstellt. / Adoptive T cell therapy (ATT) is a fast developing immunotherapy indicating positive clinical response in patients suffering from different type of cancers. One type of the ATT is a T cell receptor (TCR) gene therapy, which involves endowing patient T cells with cancer-specific TCRs. Manufacturing of the TCR-engineered T cells is fast and robust, requiring small initial amount of patient T cells. However, lack of available cancer-specific TCRs restricted to various human leukocyte antigen (HLA) class I molecules eliminates many patients from cancer treatment. Generation of a cancer-specific TCR library consisting of well-defined TCRs could increase the number of patients enrolled in clinical trials. The aim of this PhD thesis was to identify and isolate Epstein-Barr virus (EBV)-specific TCRs in order to generate the EBV-specific TCR library as a useful tool of the TCR gene therapy for treatment of EBV-related malignancies. In total, nine EBV-specific TCRs of EBV-positive donors that recognized various pHLA complexes of EBV latent membrane proteins (LMP1, LMP2A) and nuclear protein (EBNA3C) were isolated and characterized. Additionally, a novel immunogenic LMP1 epitope (QQNWWTLLV) restricted to a HLA-C*15:02 was discovered. Defined EBV-specific TCRs can be used as a basis for the EBV-specific TCR library, which provides a valuable source of TCRs for rapid generation of EBV-specific T cells to treat cancer patients with different HLA types.

Die Therapiemöglichkeiten für Pferde, die an Culicoides-Hypersensitivität (Sommerekzem) leiden, sind heute noch oft unbefriedigend. Sie reduzieren sich größtenteils auf symptomatische Behand-lungen und auf die Vermeidung der allergieauslösenden Allergene. Es existieren Studien, bei denen rekombinante Proteine in ihrer Wirksamkeit auf die Culicoides-Hypersensitivität beim Pferd untersucht wurden. Für die spezifische Immuntherapie gibt es in der Veterinärmedizin bislang keine oralen Präparate für eine mögliche sublinguale Therapie. Am Beispiel der Culicoides-Hypersensitivität soll letztlich ein Verfahren für die spezifische Immuntherapie entwickelt werden, bei dem die Peptide sowohl zur Diagnostik als auch Therapie allergischer Erkrankungen in der Veterinärmedizin genutzt werden können. In der vorliegenden Studie wurden erste Schritte in diese Richtung unternommen. Dafür wurden eine intrakutan zu applizierende Darreichungsform und eine für das Pferd neuartige, sublingual zu applizierende Arzneiform eingesetzt. Ausgewählte, synthetisch hergestellte Peptide von Mücken der Gattung Culicoides wurden bezüglich ihres Potentials für die spezifische Immuntherapie hinsichtlich der Sicherheit bei ihrer Anwendung im Pferd und Nutzung in der serologischen Diagnostik untersucht. Sieben ausgewählte Peptide, bestehend aus 30-35 Aminosäuren, wurden für in-vitro und in-vivo-Untersuchungen an gesunden (n=6) und an Sommerekzem erkrankten (n=12) Pferden eingesetzt. Nach einer Testphase auf die Verträglichkeit an klinisch gesunden Pferden, wurden die an Culicoides-Hypersensitivität erkrankten Tiere randomisiert in zwei Gruppen (intradermale und sublinguale Arzneiform) eingeteilt. Sie bekamen im Sonner, bei möglicher natürlicher Culicoides-Exposition die jeweilige Arzneiform über 21 Wochen hinweg verabreicht. Während dieser Zeit fanden in regelmäßigen Abständen Kontrollen des Gesundheitszustandes der Tiere statt, bei denen insbesondere klinische Symptome, Blutbilder und die Bildung spezifischer Antikörper erfasst wurden. Das Hautbild der Tiere wurde in Woche 1, 13 und 25 mithilfe eines Sommerekzem-Scores beurteilt. Die zwölf häufigsten vom Ekzem betroffenen Stellen am Pferde-körper wurden hierbei unabhängig voneinander bewertet. Die Besitzer der Tiere wurden mithilfe eines Fragebogens nach ihrer Meinung zur Entwicklung bzw. Ausprägung der klinischen Symptome und dem Befinden ihres Pferdes befragt. Zur Detektion spezifischer Antikörper im Serum der Tiere, unter Verwendung rekombinanter Pepti-de als Antigen, konnten für IgE und die IgG-Isotypen IgG1, IgG3/5 und IgG4/7 direkte bzw. indirekte ELISA etabliert werden. Des Weiteren wurde ein kommerzielles ELISA-Kit verwendet, um den Verlauf der IgE-Gesamtkonzentration während der Studienlaufzeit zu untersuchen. Aufgrund der geringen Studienteilnehmerzahl und vieler nicht verwendbarer Daten aus den ELISA Untersuchungen wurde die statistische Auswertung auf deskriptive Analysen beschränkt. Beide Applikationsarten wurden von den Studienteilnehmern gut toleriert und vertragen. Die Verabreichung der Sublingualtablette konnte durch die zuvor geschulten Pferdebesitzer eigenständig durchgeführt werden. Zu Beginn der Studie betrug der Dermatitisgrad 14 Punkte in der intradermalen Gruppe bzw. 13,67 Punkte in der sublingualen Gruppe. Am Ende der Studienlaufzeit lag der durchschnittliche Dermatitisgrad bei 40,33 bzw. 38,50 Punkten. Damit verschlechterte er sich während der Studienlaufzeit. Der Gehalt an gesamtem IgE im Serum der Probanden sank während des Untersuchungszeitraumes über beide Gruppen hinweg von 2,7 U/l auf 2,1 U/l. Bei den Tieren der Intradermalen Applikationsgruppe reduzierte sich das freie IgE dabei um 0,8 U/l und in der Sublingualen Gruppe um 0,3 U/l. Die Peptid-basierten ELISA zur spezifischen Serologie verschiedener Serum-Antikörperklassen waren nicht valide auswertbar. Die Untersuchungen zu peptidspezifischen IgE ergaben individuelle Verlaufsformen. Da keine Kontrollgruppe ohne Peptid-Applikation eingeschlossen wurde und die Studie in der Saison mit unkontrollierter, natürlicher Culicoides-Exposition durchgeführt wurde, ist keine Aussage zur Wirksamkeit der Behandlung auf klinische oder serologische Parameter möglich. Die entwickelte Sublingualtablette war durch ihre Form, Stabilität und Handhabung gut anwendbar und kann als Applikationsmethode in der Veterinärmedizin in Erwägung gezogen werden. Die synthetischen Peptide waren für den Einsatz in-vivo unschädlich und einsetzbar. Es bleibt zukünftigen Untersuchungen vorbehalten, ihr diagnostisches und therapeutisches Potential zur An-wendung bei Culicoides-Hypersensitivität und gegebenenfalls weiteren allergisch bedingten Erkrankungen des Pferdes weiter zu evaluieren. Aufgrund von limitierenden Faktoren, wie der sehr kleinen Zahl an Studienteilnehmern, dem Fehlen einer Placebogruppe und der Durchführung während der Expositionszeit hat die vorliegende Arbeit insgesamt präliminären Charakter.:Inhaltsverzeichnis Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen 1 Einleitung 2 Literaturübersicht 2.1 Allergie 2.1.1 Allergene 2.1.1.1 Charakteristika von Allergenen (Was macht eine Substanz zum Allergen) 2.1.1.2 Kreuzreaktivitäten 2.1.2 Typ-I-Allergie 2.1.2.1 Produktion sensibilisierender Antikörper bei Erstkontakt 2.1.2.2 Ausbildung allergischer Reaktionen bei Folgekontakt 2.1.3 Immunglobulin-System des Pferdes 2.1.4 Potenzielle Bedeutung der IgG-Isotypen bei verschiedenen Erkrankungen 2.2 Das Sommerekzem des Pferdes 2.2.1 Epidemiologie, Ätiologie und Pathogenese 2.2.2 Bedeutende Allergene 2.2.3 Diagnostische Ansätze 2.2.3.1 In-vivo-Test (Intradermal Test) 2.2.3.2 In-vitro-Tests 2.2.3.3 Nachweis von IgE 2.2.3.4 Funktionelle in-vitro-Tests 2.2.4 Therapeutische Ansätze 2.2.4.1 Vermeidung Allergenkontakte, medikamentöse Therapieversuche 2.2.4.2 Allergenspezifische Immuntherapie (ASIT) 2.2.4.3 Desensibilisierung mit nativen Allergenextrakten 2.3 Wechsel von Allergenextrakten auf die molekulare Ebene der Allergene - Bedeutung für Diagnostik und Therapie 2.4 Einsatz synthetischer Peptide in der ASIT 3 Geräte, Material und Methoden 3.1 Geräte 3.2 Material 3.2.1 Klinikbedarf 3.2.2 Laborbedarf 3.2.3 Reagenzien, Puffer und Lösungen 3.2.4 Allergene (Peptide) - Auswahl und Synthese 3.2.5 Antikörper 3.3 Tiere 3.3.1 Gesunde Kontrollgruppe 3.3.2 An Sommerekzem erkranke Studienteilnehmer 3.4 Methoden 3.4.1 Blutentnahme und weitere Verarbeitung 3.4.2 Herstellung der arzneilichen Formulierungen 3.4.2.1 Arzneiliche Formulierung für die intradermale Applikation 3.4.2.2 Arzneiliche Formulierung für die orale Applikation 3.4.3 Prüfung der Unbedenklichkeit an klinisch gesunden Pferden 3.4.3.1 Durchführung der Unbedenklichkeitsprüfung 3.4.3.2 Kontrollen des Gesundheitsstatus 3.4.4 Verabreichung der hergestellten Applikationslösungen an Patienten 3.4.4.1 In-Vivo-Test (Intradermaltest) 3.4.4.2 Intradermale Verabreichung der individuellen Peptidlösungen 3.4.4.3 Orale Verabreichung der individuellen Peptidlösungen 3.4.5 Klinische Veränderungen infolge der SIT 3.4.5.1 Dokumentation und klinische Beurteilung der Symptome 3.4.5.2 Fragebogen zur objektiven Einschätzung durch die Patientenbesitzer 3.4.6 In-Vitro-Test (ELISA) 3.4.6.1 Prinzip des ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) 3.4.6.2 Methode des eingesetzten ELISA 3.4.7 Statistik 4 Ergebnisse 4.1 Auswahl und Einsatz synthetischer Peptide für die Diagnostik und Therapie des equinen Sommerekzems 4.1.1 Arzneiliche Formulierung für den Intrakutantest 4.1.2 Arzneiliche Formulierung für die Intradermale Applikation 4.1.3 Arzneiliche Formulierung für die orale Applikation 4.2 Klinische Veränderungen infolge der SIT 4.2.1 Dermatitisgrad– Beurteilung des Hautbildes 4.2.2 Veränderte Symptomatik in der Studienlaufzeit – Einschätzung der Besitzer 4.3 Labordiagnostische Veränderungen infolge der SIT 4.3.1 Differentialblutbild 4.3.2 Ergebnisse des IgE-ELISA 4.3.3 Ergebnisse des IgG-ELISA 4.4 Vergleich der Werte des IgE ELISA mit den klinischen Symptomen (Score) 5 Diskussion 5.1 Einsatz synthetisch hergestellter Peptide in der Diagnostik und Therapie 5.2 Therapeutischer Einsatz synthetisch hergestellter Peptide für die intradermale Applikation 5.3 Etablierung einer Arzneiform für die sublinguale Therapie beim Pferd 5.4 Klinische Veränderungen in Folge der SIT 5.5 Therapiebegleitende Labordiagnostik 6 Zusammenfassung 7 Summary 7 Literaturverzeichnis 8 Anhang 8.1 Tierkarte der Vorstudie mit klinisch gesunden Pferden 8.2 Besitzereinverständniserklärung und Datenschutzerklärung am Beispiel der Intradermalen Verabreichung 8.3 Tierkarte zur Erfassung des Gesundheitsstatus und Symptomentwicklung 8.4 Protokoll zur Durchführung des Intradermaltests 8.5 Protokoll zur Evaluierung des Dermatitisscores der an SE erkankten Pferde 8.6 Fragebogen zur Besitzerbefragung am Ende der Studie 8.7 Protokoll zur Durchführung eines ELISA am Beispiel der Untersuchung auf peptidspezifisches IgE im Patientenserum 9 Danksagung / The treatment options for horses suffering from Culicoides hypersensitivity are still often unsatisfac-tory. They are mainly reduced to symptomatic treatments and avoiding the allergy-triggering aller-gens. In various studies recombinant proteins were examined for their effectiveness on Culicoides hyper-sensitivity in horses. However, there are currently no oral preparations available in veterinary medicine for specific immunotherapy. Using Culicoides hypersensitivity as an example, a process for specific immunotherapy shall ulti-mately be developed in which the peptides can be used for both, the diagnosis and therapy od allergic diseases in veterinary medicine. The present study tool the first steps in this direction. For this purpose, an intracutaneously adminis-tered dosage form and a sublingually administered dosage form, which is new for horses, were used. Selected, synthetically produced peptides from mosquitoes of the genus Culicoides were ex-amined regarding their potential for specific immunotherapy in terms of their safety after application in horses in-vivo and their use in serology. Seven selected peptides, consisting of 30-35 amino acids, were used for in-vitro and in-vivo studies on healthy (n=6) and horses suffering from Culicoides hypersensitivity (n=12). After a test phase for tolerability in clinically healthy horses, the animals suffering from Culicoides hypersensitivity were randomly divided into two groups (intradermal and sublingual dosage forms). They were administered the respective dosage form for 21 weeks during the summer season with possible natural Culicoides exposure. During this time, the animals' health status was checked at regular intervals, in particular clinical symptoms, blood counts and the formation of specific antibodies were recorded. The skin appearance of the animals was assessed at weeks 1, 13 and 25 using a dermatitis score. The twelve most common areas on the horse's body affected by eczema were evaluated inde-pendently of each other. The owners of the animals were asked using a questionnaire about their opinion on the development or severity of their horse's clinical symptoms and well-being. To detect specific antibodies in the serum of the animals, using recombinant peptides as antigen, direct and indirect ELISAs were established for IgE and the IgG isotypes IgG1, IgG3/5 and IgG4/7. Furthermore, a commercial ELISA kit was used to examine the course of the total IgE concentration during the study period. Due to the small number of study participants and numerous invalid data from the ELISA studies, the statistical analysis was limited to descriptive analyses. Both types of application were well tolerated by the study participants. The administration of the sublingual tablet could be carried out by previously trained horse owners. At the start of the study, the dermatitis score was 14 points in the intradermal group and 13.67 points in the sublingual group. At the end of the study period, the average dermatitis grades were 40.33 and 38.50 points, respectively, and deteriorated during the course of this study. The owner survey revealed a slight improvement in symptoms compared to previous years. The level of total, free IgE in the test subjects' serum fell from 2.7 U/l to 2.1 U/l during the study period. In the animals in the intradermal application group, the free IgE was reduced by 0.8 U/l and in the sublingual group by 0.3 U/l. Peptide-based ELISA to determine different serum antibody isotypes binding the peptides could not be evaluated reliably. Peptide-specific IgE revealed individ-ual variations. Due to the lack of a control group without peptide application and conduction of the study during the season with uncontrolled, natural Culicoides exposure conclusions of effectiveness regarding clinical disease or serological effects cannot be drawn. The sublingual tablet developed was easy to use due to its shape, stability and handling and can be considered as an application method in veterinary medicine. The synthetic peptides were harmless and usable for in-vivo application. It remains reserved for future studies to further evaluate its diagnostic and therapeutic potential for use in equine Culicoides hypersensitivity and possibly other allergic diseases in horses. Due to limiting factors such as the very small number of study participants, the lack of a placebo group and the implementation during the exposure period, the present work is of a preliminary nature.:Inhaltsverzeichnis Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen 1 Einleitung 2 Literaturübersicht 2.1 Allergie 2.1.1 Allergene 2.1.1.1 Charakteristika von Allergenen (Was macht eine Substanz zum Allergen) 2.1.1.2 Kreuzreaktivitäten 2.1.2 Typ-I-Allergie 2.1.2.1 Produktion sensibilisierender Antikörper bei Erstkontakt 2.1.2.2 Ausbildung allergischer Reaktionen bei Folgekontakt 2.1.3 Immunglobulin-System des Pferdes 2.1.4 Potenzielle Bedeutung der IgG-Isotypen bei verschiedenen Erkrankungen 2.2 Das Sommerekzem des Pferdes 2.2.1 Epidemiologie, Ätiologie und Pathogenese 2.2.2 Bedeutende Allergene 2.2.3 Diagnostische Ansätze 2.2.3.1 In-vivo-Test (Intradermal Test) 2.2.3.2 In-vitro-Tests 2.2.3.3 Nachweis von IgE 2.2.3.4 Funktionelle in-vitro-Tests 2.2.4 Therapeutische Ansätze 2.2.4.1 Vermeidung Allergenkontakte, medikamentöse Therapieversuche 2.2.4.2 Allergenspezifische Immuntherapie (ASIT) 2.2.4.3 Desensibilisierung mit nativen Allergenextrakten 2.3 Wechsel von Allergenextrakten auf die molekulare Ebene der Allergene - Bedeutung für Diagnostik und Therapie 2.4 Einsatz synthetischer Peptide in der ASIT 3 Geräte, Material und Methoden 3.1 Geräte 3.2 Material 3.2.1 Klinikbedarf 3.2.2 Laborbedarf 3.2.3 Reagenzien, Puffer und Lösungen 3.2.4 Allergene (Peptide) - Auswahl und Synthese 3.2.5 Antikörper 3.3 Tiere 3.3.1 Gesunde Kontrollgruppe 3.3.2 An Sommerekzem erkranke Studienteilnehmer 3.4 Methoden 3.4.1 Blutentnahme und weitere Verarbeitung 3.4.2 Herstellung der arzneilichen Formulierungen 3.4.2.1 Arzneiliche Formulierung für die intradermale Applikation 3.4.2.2 Arzneiliche Formulierung für die orale Applikation 3.4.3 Prüfung der Unbedenklichkeit an klinisch gesunden Pferden 3.4.3.1 Durchführung der Unbedenklichkeitsprüfung 3.4.3.2 Kontrollen des Gesundheitsstatus 3.4.4 Verabreichung der hergestellten Applikationslösungen an Patienten 3.4.4.1 In-Vivo-Test (Intradermaltest) 3.4.4.2 Intradermale Verabreichung der individuellen Peptidlösungen 3.4.4.3 Orale Verabreichung der individuellen Peptidlösungen 3.4.5 Klinische Veränderungen infolge der SIT 3.4.5.1 Dokumentation und klinische Beurteilung der Symptome 3.4.5.2 Fragebogen zur objektiven Einschätzung durch die Patientenbesitzer 3.4.6 In-Vitro-Test (ELISA) 3.4.6.1 Prinzip des ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) 3.4.6.2 Methode des eingesetzten ELISA 3.4.7 Statistik 4 Ergebnisse 4.1 Auswahl und Einsatz synthetischer Peptide für die Diagnostik und Therapie des equinen Sommerekzems 4.1.1 Arzneiliche Formulierung für den Intrakutantest 4.1.2 Arzneiliche Formulierung für die Intradermale Applikation 4.1.3 Arzneiliche Formulierung für die orale Applikation 4.2 Klinische Veränderungen infolge der SIT 4.2.1 Dermatitisgrad– Beurteilung des Hautbildes 4.2.2 Veränderte Symptomatik in der Studienlaufzeit – Einschätzung der Besitzer 4.3 Labordiagnostische Veränderungen infolge der SIT 4.3.1 Differentialblutbild 4.3.2 Ergebnisse des IgE-ELISA 4.3.3 Ergebnisse des IgG-ELISA 4.4 Vergleich der Werte des IgE ELISA mit den klinischen Symptomen (Score) 5 Diskussion 5.1 Einsatz synthetisch hergestellter Peptide in der Diagnostik und Therapie 5.2 Therapeutischer Einsatz synthetisch hergestellter Peptide für die intradermale Applikation 5.3 Etablierung einer Arzneiform für die sublinguale Therapie beim Pferd 5.4 Klinische Veränderungen in Folge der SIT 5.5 Therapiebegleitende Labordiagnostik 6 Zusammenfassung 7 Summary 7 Literaturverzeichnis 8 Anhang 8.1 Tierkarte der Vorstudie mit klinisch gesunden Pferden 8.2 Besitzereinverständniserklärung und Datenschutzerklärung am Beispiel der Intradermalen Verabreichung 8.3 Tierkarte zur Erfassung des Gesundheitsstatus und Symptomentwicklung 8.4 Protokoll zur Durchführung des Intradermaltests 8.5 Protokoll zur Evaluierung des Dermatitisscores der an SE erkankten Pferde 8.6 Fragebogen zur Besitzerbefragung am Ende der Studie 8.7 Protokoll zur Durchführung eines ELISA am Beispiel der Untersuchung auf peptidspezifisches IgE im Patientenserum 9 Danksagung