Made available in DSpace on 2014-10-09T12:54:53Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:06:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 12796.pdf: 440348 bytes, checksum: 5d7b85c92d4b0bf453b89e0590595d61 (MD5) / Dissertacao (Mestrado Profissionalizante em Lasers em Odontologia) / IPEN/D-MPLO / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN/CNEN-SP; Faculdade de Odontologia, Universidade de Sao Paulo, Sao Paulo

Apesar do amplo e histórico uso de produtos da biodiversidade brasileira com fins medicinais, pouco se sabe sobre o destino destes produtos após a sua absorção no organismo; quais são os produtos de metabolismo formados, sua toxicidade e cinética de eliminação. Neste trabalho foi estudado o metabolismo in vitro do diterpeno ácido caurenoico. Este terpeno está amplamente distribuído no reino vegetal tendo sua ocorrência destacada em dois dos maiores produtos fiterápicos consumidos pela população brasileira: o óleo de copaíba (Copaifera ssp.) e o xarope de guaco (Mikania glomerata e Mikania leavigata). Entre as principais reações do metabolismo em humanos, as reações de oxidação mediadas pelo citocromo P450(CIP450) têm um papel chave na detoxificação de xenobióticos. O objetivo deste trabalho foi estudar modelos biomiméticos in vitro das reações realizadas pelo CIP450 utilizando metaloporfirinas e reagentes de salen como catalisadores. Foram empregados sete catalisadores em meio homogêneo: Cloreto de 5,10,15,20-tetraquis(pentafluorofenil)porfirina ferro e manganês III (FeTFPP) e (MnTFPP), Cloreto de 5,10,15,20-tetraquis(2,6-diclorofenil)porfirina ferro e manganês III (FeTDCPP) (MnTDCPP), Cloreto de (R,R)-(-)N,N\'-bis(3,5-di-terc-butil-salicilideno)- 1,2-diaminociclo-hexil manganês III (R-Salen), Cloreto de (S,S)-(-)N,N\'-bis(3,5-di-tercbutil- salicilideno)-1,2-diaminociclo-hexil manganês III (S-Salen) e o Cloreto de 5,10,15,20- tetraquis(fenil)porfirina ferro III (FeTPP). Como doadores de oxigênio foram avaliados o iodosilbenzeno (PhIO), peróxido de hidrogênio (H2O2), terc-butil-hidroperóxido (TBHP) e (ácido 3-cloro-peroxibenzoico (MCPBA). Nos sistemas estudados foi observada a formação predominante de três produtos de oxidação: Um derivado epoxidado, um mono- e um di-hidroxilado, que tiveram sua estrutura proposta com base na análise do seu perfil de fragmentação em espectrometria de massas e comparação com dados previamente publicados na literatura. Foi observado que a natureza do oxidante influencia de forma mais pronunciada tanto a reatividade como a formação dos produtos. Foram avaliados também os catalisadores FeTFPP e o cloreto de 5,10,15,20-tetraquis-(4-N-metilpiridil)porfirina ferro III( FeTMPyP) imobilizados em suportes inorgânicos. A utilização destes catalisadores imobilizados resultou na maior reatividade do ácido caurenoico com a formação dos mesmos três produtos, mas em maior proporção em relação ao substrato. Por fim, foi realizada a catalise em meio biológico utilizando microssomas de ratos. Neste sistema foi gerado somente um produto que apresentou espectro de massas e tempo de retenção similar ao derivado di-hidroxilado obtido nas reações que utilizaram metaloporfirinas. Este trabalho trouxe evidências da rota de metabolismo de um importante produto natural, além de reforçar a capacidade de metaloporfirinas em realizar catálises biomiméticas, que serão úteis para a geração de metabólitos de fase um para estudos pré-clínicos. / In spite of the widespread and historical use of products of the Brazilian biodiversity for medical purposes, little is known about the fate of these products after their absorption into the organism; which are the products of metabolism, their toxicity and elimination kinetics. In this master thesis the in vitro metabolism of the diterpene kaurenoic acid was studied. This terpene is widely spread in the plant kingdom. Its presence can especially be highlighted in two of the most consumed phytotherapeutics by the brazilian population: the copaíba oil (Copaifera ssp.) and the guaco syrup (Mikania glomerata and Mikania leavigata. Among the principal metabolic reactions in humans, the oxidation reactions catalyzed by cytochrome P450 (CYP450) have a key role in the detoxification of xenobiotics. The objective of this thesis was the study of in vitro biomimetic models of the reactions carried out by CYP450 using metalloporphyrins and salen catalysts as analogs of the CYP450. Seven catalysts were applied in a homogeneous medium: 5,10,15,20-tetrakis(pentafluorophenyl)porphyrin iron and manganese III chloride (FeTFPP) and (MnTFPP), 5,10,15,20-tetrakis(2,6-dichlorophenyl)porphyrin iron and manganese III chloride (FeTDCPP) and (MnTDCPP), (R,R)-(-)N,N-bis(3,5-di-tertbutylsalicylidene)- 1,2-diaminocyclohexyl manganese III (R-Salen) chloride, (S,S)-(-)N,Nbis( 3,5-di-terc- butylsalicylidene)-1,2-diaminocyclohexyl manganese III (S-Salen) chloride and 5,10,15,20-tetrakis(phenyl)porphyrin iron III chloride (FeTPP). As oxygen donors iodosylbenzene (PhIO), hydrogen peroxide (H2O2), tert-butyl hydroperoxide (TBHP) and metachlorperoxybenzoic acid (MCPBA) have been tested. In the majority of the systems the formation of three predominant oxidation products was observed: An epoxidated, a mono- and a dihydroxylated derivative, of which the chemical structure was proposed based on the analysis of the mass spectrometric fragmentation pattern. It was observed that the nature of the oxidant influences more markedly the reactivity as well as the formation of the products. The catalysts FeTFPP and 5,10,15,20-tetrakis- (4-N-methyl pyridine)porphyrin iron III chloride (FeTMPyP) immobilized with inorganic supports were assessed as well. Using these immobilized catalysts, a higher proportion of oxidation products of the kaurenoic acid was observed. Finally, the oxidation of kaurenoic acid was assessed using rat microsomes. In this system only one product was produced that showed a similar mass spectrum and retention time as the dihydroxylated derivative obtained in the reactions using metalloporphyrins.This thesis showed evidences of the route of metabolization of an important natural product, and additionally reinforces the capacity of metalloporphyrins in attaining biomimetic catalysis.

O presente trabalho teve por objetivo desenvolver tecnologia in vitro e associá-la à mutagênese, e avaliar plantas V 5 e V6 quanto aos caracteres agronômicos de produção em área de ocorrência da doença fusariose, visando ao melhoramento genético da pimenta-do-reino para obtenção de plantas tolerantes e/ou resistentes à doença fusariose. A aplicação das técnicas in vitro iniciou-se através da obtenção de plantas doadoras de explantes, a partir de estacas em casa-de-vegetação e, de sementes e embriões zigóticos in vitro. O processo de micropropagação foi desenvolvido a partir de gemas de plantas obtidas in vitro através do estabelecimento de condições adequadas de cultivo em meios de cultura apropriados para multiplicação de gemas, enraizamento e obtenção de "plantlets", e de tipo de substrato para aclimatação e formação de mudas. Após a definição deste processo, gemas de plantas de casa-de-vegetação foram submetidas a diferentes tratamentos de assepsia e as sobreviventes micropropagadas. Seleção in vitro foi estabelecida ao cultivar isolados patogênicos do fungo Fusarium solani f. sp. piperis em meio Czapek-Dox e, através da curva de crescimento foi estabelecido o período de 28 dias de cultivo mais adequado para obtenção de filtrado da cultura do fungo. Diferentes concentrações de filtrado e formas de esterilização foram testadas em meio de cultura de multiplicação de gemas e determinou-se a concentração de 55% do filtrado do fungo (v/v) sob a esterilização por duas autoclavagens, adequada para causar 100% de mortalidade de gemas susceptíveis à doença. Simultaneamente, testes de radiossensitividade foram desenvolvidos através da irradiação gama em gemas in vitro e a dose de 20Gy foi escolhida para indução de mutações. As gemas irradiadas que passaram por vários ciclos de multiplicação e sobreviveram ao agente seletivo, filtrado de cultura do fungo, estão sendo clonadas para serem submetidas à seleção artificial com esporos do fungo em casa-de-vegetação, seleção natural em campo de ocorrência da doença e avaliação agronômica. Testes indicaram, a concentração de 2x10 6 esporos/ml em suspensão e a aplicação no solo do fungo adequada para seleção em casa-de-vegetação. As plantas V5 e V6 avaliadas em campo quanto a mortalidade e caracteres de produção apresentaram performance semelhante às plantas da cultivar original quanto à média de comprimento de espiga (8,4 cm), peso (4,42g) e número de frutos (40 frutos) por espiga, peso de 100 frutos (10,67g) e rendimento de pimenta preta (> 30%). Entretanto, melhores resultados para a média de produção de pimenta verde (3.290g) e sobrevivência em área de ocorrência da fusariose. As análises por componentes principais e variáveis canônicas apresentaram divergência genética entre as plantas originadas por estacas que sofreram irradiação gama e aquelas da cultivar original. / The purposes of the present work were to develop in vitro technology, associating it with mutagenesis, and to evaluate the V5 and V6 plants based on agronomical characters of production in Fusarium incidence areas, aiming at the genetic improvement of black pepper to obtain tolerant and/or resistant plants to the disease. The use of in vitro techniques started with the production of explant donor plants from greenhouse-grown cuttings and from seeds and in vitro zygotic embryos. The micropropagation process was developed using young shoots of in vitro plants by establishment of proper growing conditions in culture media for multiplication, rooting and production of plantlets, and by determining a suitable substrate type for acclimatization and growing of plantlets. After the process was defined, young shoots obtained from greenhouse grown plants underwent different aseptic treatments and the surviving plantlets were micropropagated. In vitro selection was carried out by cultivating pathogenic isolates of Fusarium solani f. sp. piperis in Czapek-Dox medium and, by using a growing curve, the most suitable growing period (28 days) for obtaining the fungus culture filtrate was defined. Different filtrate concentrations and sterilization techniques were tested in culture medium for young shoot multiplication. A concentration of 55% (v/v) of fungus filtrate under sterilization by double autoclavation was considered adequate to cause 100% mortality of fusariosis susceptible young shoots. Simultaneously, radiosensitivity tests were carried out through gamma irradiation of in vitro young shoots and dose of 20Gy was selected for mutation induction. Irradiated young shoots which underwent several multiplication cycles and survived the selective agent, fungus culture filtrate, are being cloned in order to be submitted to artificial selection with the fungus spores in greenhouse, to natural selection in a disease incidence area and to agronomical evaluation. These tests indicated that the concentration of 2x10 6 spores/ml in suspension and the application of the fungus on soil were appropriate for greenhouse selection. The V5 and V6 plants evaluated in field conditions for mortality and production characters showed similar performance to the original cultivar plants regarding average height (8.4 cm), weight (4.42g) and number of fruits (40 fruits) per spike, weight of 100 fruits (10.67g) and black pepper yield (>30%). However, better results were observed for average green pepper production (3,290g) and survival rates in a fusariosis incidence area. Analyses of principal components and canonic variables evidenced genetic divergence between plants grown from gamma-irradiated cuttings and the original cultivar ones.

Orientador : Simone Liliane Kirszenzaft Shepherd / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-02T01:37:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Marques_DanieladeArgollo_D.pdf: 13743066 bytes, checksum: b4c285d96ebd5478c86422fcc44e938a (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: As plantas do gênero Artemisia se constituem numa rica fonte de sesquiterpenos, os quais têm recebido grande atenção dos pesquisadores devido a sua diversidade química e biológica. A contínua investigação da presença de compostos secundários de interesse bem como de protocolos eficientes para a viabilização e otimização da produção em larga escala dos mesmos são extremamente recomendados e necessários para a exploração desta rica fonte de novos agentes quimioterapêuticos e agriculturaís. A planta alvo deste estudo foi o florido CPQBA 2/39 x PL5 da espécie Artemisía annua, o qual foi obtido pelo programa de melhoramento genético da MEDIPLANT e do CPQBA. Com a finalidade de se manter algumas características desejáveis deste genótipo superior, tais como alta produção de biomassa e de artemisinina, um sesquiterpeno com ação antimalárica, o presente trabalho teve início a partir de um único explante meristemático, o qual foi excisado de uma única planta matriz do híbrido melhorado cultivada nos campos experimentais do CPQBA. Após o desenvolvimento do explante meristemático selecionado, este foi micropropagado até a obtenção de um banco de material homogêneo in vitro com número adequado de plantas sadias, as quais serviram como fontes de explantes para os experimentos posteriores. Foram desenvolvidas metodologias para a iniciação, estabelecimento e cultivo de raízes tanto normais como transformadas com duas cepas de Agrobacterium rhizogenes (15834 e 8196). A confirmação do caráter transgênico das raízes foi obtida por "Dot Blot", um método rápido e eficiente de triagem que permitiu uma análise molecular qualitativa. Estudos relacionados com a formação de calos e a morfogênese in vitro das raízes transformadas obtidas com ambas as cepas também foram realizados. Os extratos dos materiais vegetais foram analisados por cromatografia gasosa acoplado a um espectrômetro de massas (CGIEM) de acordo com metodologia analítica e de alta sensibilidade para detecção de terpenos que foi desenvolvida por pesquisadores do CPQBAlUNICAMP. Os extratos dos calos obtidos bem como das raízes transformadas e normais estabelecidas e cultivadas em diferentes meios de cultura e sobre diferentes condições fotoperiódicas foram analisados quimicamente para a avaliação de alguns terpenos de interesse, tais como: artemisinina e ácido artemisinínico, além de dois outros compostos com forte atividade antiulcerogênica: dihídro-epideoxí-artenuína B edeoxiartemisinína. Os resultados destas análises revelaram que nenhum dos terpenos mencionados estavam presentes nos extratos dos calos e das raízes transformadas analisadas. Os cromatogramas dos extratos das raízes normais cultivadas em meio MS líquido desprovido de fitorreguladores revelaram a presença do composto antiulcerogêníco dihídro-epideoxi artenuína B e de um outro composto ainda não identificado. Pelas características do padrão de ttacionamento do espectro obtido por CG/EM, podemos sugerir que este composto não identificado é também um terpeno, no entanto a confirmação desta hipótese deverá ser objetivo de trabalhos futuros. As condições fotoperiódícas de cultivo influenciaram na produção destes dois terpenos, sendo que a produção do composto não identificado foi inversamente proporcional à produÇão de dihídro-epideoxí-artenuína B, ou seja, sob condição de escuro contínuo, quando díhidro-epideoxi-artenuína B foi intensamente produzido, o composto não identificado foi detectado em pequenas proporções, e, sob fotoperíodo de 16 horas, o inverso ocorreu. A quantificação de dihídro-epideoxi-artenuína B por Cromatografia gasosa acoplado a um Detector de Ionização de Chamas (CG/DIC) revelou um aumento de aproximadamente cinco vezes na produção deste composto pelas raízes normais cultivadas sob condição de escuro contínuo em relação às raÍzes cultivadas na presença de 16 horas de luz. A presença de auxína no meio MS mantido sob condições de 16 horas de luz resultou em alta produção do composto não identificado pelas raizes normais, enquanto que a produção de dihidro-epideoxi-artenuína B não foi detectada nestas raízes através das metodologias empregadas. Os terpenos de interesse também foram estudados quanto as suas atividades antimicrobianas através de ensaios bioautográficos. Para os testes biológicos foram utilizados os seguintes microrganismos: Bacillus subtilis, Salmonella hoterasuis, Micrococcus luteus, Rhodococcus equi, Escherichía colí, Staphylococcus aureus, Candida albícans, Pseudomonas aeruginosa. Os resultados destes testes mostraram que nenhum dos terpenos de interesse apresentou atividade antifúngica com a linhagem de Ccmdida a/bicans. A atividade antibacteriana foi comprovada para artemisinina e para o ácido artemisinínico, com as linhagens das bactérias B. subitílís, R equí, S. aureus e E. coZi. O composto dihidro-epideoxi artenuína B apresentou atividade antibacteriana com as linhagens das bactérias B. subtil is, M luteus e S. aureus e o composto deoxiartemisinina com as linhagens B. subtilis, R equi, M luteus e S. aureus / Abstract: Plants of the Artemisia genera are a rich source of sesquíterpenes, whích have received great attentíon flOm researchers due to theírits bíologícal and chemícal diversíty. The continued investigation of the presence of secondary compounds is hígh1y recommended and necessary for the exploration of this rich source of new chemotherapeutic and agricultural agents. The plant targeted ín this study was the CPQBA 2/39 x PL5 hybrid of the A. annua specíes, obtaíned through the genetíc ímprovement plOgram of Jv1EDIPLANT and CPQBA. With the intent ofkeeping some ofthe desirable characteristícs ofthis superior genotype, such as high production of biomass and artemisinin, a sesquiterpene with antímalarial plOperties, the present study began with a síngle meristematíc explant, excísed from a síngle ímplOved hybrid matrix plant cultívated ín CPQBA's experimental fields. Afier the development of the selected meristematic explant, it was micropropagated until an in vitro homogenous material bank was obtained with a adequa te number of healthy plants, which served as explant sources for later experiments. Methodologies were developed for the estabIíshment and cultivation of roots, both normal and transformed wíth two straíns of Agrobacterium rhizogenes (15834 and 8196). The confirmation of the transgenic nature of the roots was obtained by the "Dot Blot" technique, a fast and efficient screening method that allows a qualitative molecular analysis. Studíes related to the formatíon of callus and the in vitro morphogenesís of the transformed lOots obtaíned wíth both straíns were also undertaken. The plant material extracts were I analyzed by Gasos Chrmatography acopladed to Spectrum Mass (GCIMS) according to the analytical methodology incorporating high sensitivity terpene detection developed by CPQBAlUNICAMP researchers. The callus extracts as weIl as the transformed and normal roots establíshed and cultívated ín different culture media under different photoperiodic condítions were chemicaIly analysed for evaluation of relevant terpenes, such as: artemisinin, artemisiníc acid, as well as two other compounds wíth strong antíulcerogenic actívity: dihydro-epideoxi-artenuin B and deoxiartemisinin. The analysis of results revealed that none of the afore mentíoned terpenes were present in the callus extracts or transformed roots. The chromatograms of the extracts taken úom normal roots cultivated in MS liquid medium deprived of phytoregulators revealed the presence of the antiulcerogenic compound dihydro epideoxi-artenuin B and another as yet unidentified compound. The characteristics of the mass fractíoning pattem observed on GC/MS suggest that this unidentífied compound is also a terpene, however confirmation of this hypothesis requises further studies. Photoperiod during cultívatíon ínfluenced the productíon of both these terpenes, wíth the productíon of the unidentified compound beíng inversely proporcional to the production of dihidro-epideoxi artenuin B. Under continuous darkness dihidro-epideoxi-artenuin B was intensely produced and the unidentified compound present in small proportions, whereas the inverse ocurred in a 16 hour photoperiod The quantificatíon of dihydro-epídeoxi-artenuin B by Gasos Chromatography acopladed to Flame Ionization Detector (CG/FID) revealed as approximately fivefold increase in the production of this compound by normal roots cultívated under continuous darkness compared to roots cultivated in the presence of 16 hour of light. The presence of auxin in the MS medium maintained under 16 hour of light resulted in substantial production of the unidentífied compound by normal roots, while the production of dihidro epideoxi-artenuin B was not detected in these roots by the methods employed. The relevant terpenes were also studied with regard to their antimicrobial properties through bíoautographic tests. For such tests the foIIowíng microorganisms were used: o....I Baci/lus subtilis, Salmonella choterasuis, Micrococcus luteus, Rhodococcus equi, Escheríchía colí, Staphylococcus aureus, Candída albícans, Pseudomonas aerugínosa. The results of these tests showed that none of the relevant terpenes presented antifungaI activíty wíth the Candida albicans líne. The antíbacterial activíty was confirmed for rtemisinin and artemisinic acid, using B. subti/is, R equi, S. aureus, and E. co/i Unes. The compound dihydro-epídeoxi-artenuin B showed antíbacterial actívity with the bacterial lines B. subítílis, M [uteus, and S. aureus and the compound deoxiertemisinin with the Unes B. subitilis, R. equi, M [uteus, and S. aureus / Doutorado / Doutor em Biologia Vegetal

Orientador: Simone Liliane Kirszenzaft Shepherd / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-03T22:35:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Kajiki_FatimaOdahara_D.pdf: 9625534 bytes, checksum: b759904477dc5eb6981456b7e7a086a2 (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: Várias espécies do gênero Baccharis têm sido usadas na medicina popular. Efeitos farmacológicos de muitas delas já foram comprovados, e, nos últimos anos, os compostos químicos de mais de 60 espécies foram identificados. No entanto, são raros os estudos biotecnológicos em espécies deste gênero. B. tridentata e B. dracunculifolia são plantas nativas, aromáticas e produzem óleo essencial, no qual os sesquiterpenos em maior concentração são: nerolidol, espatulenol e b-cadineno. Recentemente, foi comprovado o efeito inibitório do nerolidol no crescimento de Plasmodium falciparum, o mais perigoso agente causador da malária. Devido a alta mortalidade causada por esta doença e ao fato deste parasita estar se tomando resistente aos medicamentos convencionais, pesquisas com plantas que apresentam potencial terapêutico são importantes. Com a finalidade de obter rapidamente um grande número de plantas com as mesmas características da planta mãe, foram desenvolvidos protocolos de micropropagação para as duas espécies. A micropropagação de B. tridentata foi estabelecida através de ápices caulinares de uma única planta, permitindo a formação de um banco de plantas homogêneas (done) que foram utilizadas como fonte de explantes para os experimentos posteriores. Foi desenvolvido o protocolo de aclimatação para esta espécie, com 80% de sobrevivência das plantas deste done no ambiente ex-vitro. Já para B. dracunculifolia, devido a intensa oxidação dos explantes, a micropropagação foi possível somente através da germinação de sementes. A forte recalcitrância ao cultivo in vitro dificultou o prosseguimento dos experimentos com esta espécie. A espécie B. tridentata cresce em pequenas cavidades nas superficies rochosas do Planalto do ltatiaia. A peculiaridade deste habitat levou-nos a realizar alguns estudos fisiológicos in vitro, visando contribuir para a compreensão de alguns mecanismos de adaptação desta espécie, além de permitir o aperfeiçoamento do protocolo de micropropagação. Foram avaliados os efeitos da variação do pH inicial, da fonte preferencial de nitrogênio e da concentração de alguns macronutrientes no crescimento. Após 31 dias de cultivo, o crescimento das plantas resultou em acidificação do meio, com pH final de 3,5. Este clone apresentou maior crescimento (altura e massa de matéria seca) com fonte de nitrogênio constituída de mistura de NO3-+NH/, quando comparado com NO3- ou NH/ fornecidos isoladamente. O aumento do peso seco das raízes foi favorecido pela diminuição da concentração de magnésio no meio. Estudos recentes têm demonstrado que as culturas de partes aéreas podem constituir fonte viável de compostos secundários úteis, principalmente aqueles produzidos em estruturas altamente diferenciadas, como os tricomas glandulares (TG). Entretanto, plantas cultivadas in vitro apresentam, em geral, menor produção destes compostos, quando comparadas com aquelas cultivadas em campo. Esta baixa produção do cultivo in vitro tem sido relacionada com o menor grau de diferenciação. Este presente trabalho investigou os efeitos de alguns fatores microambientais, nutricionais e fitohormonais na diferenciação de algumas estruturas foliares, especialmente os TG, de um clone de B. tridentata cultivado in vitro. As plantas cultivadas in vitro apresentaram TG morfologicamente semelhantes aos da planta da casa de vegetação e do clone aclimatado. A utilização do tampão de algodão no frasco de cultura (em substituição ao PVC utilizado comumente como vedação) resultou em maior diferenciação das células paliçádicas do mesofilo. Neste tratamento, foi observado espaço subcuticular formado pela distensão da cutícula dos TG, sugerindo a secreção de material. O uso da vedação de algodão alterou o microambiente do frasco de cultura (diminuição da umidade e alteração das trocas gasosas) e provavelmente, favoreceu a diferenciação destas estruturas foliares. Outra alternativa para aumentar a produção de compostos acumulados nos TG é através do aumento da densidade destas estruturas (número de TG/mm2). Desta forma, investigamos o efeito dos mesmos fatores microambientais, nutricionais e fitohormonais, acima mencionados na densidade dos tricomas, em folhas adultas do clone de B. tridentata cultivado in vitro. Plantas cultivadas em casa de vegetação e clone aclimatado apresentaram maior densidade de TG do que o clone cultivado in vitro. Nos três casos a densidade dos TG foi maior na epiderme superior. Entre os tratamentos aplicados às plantas cultivadas in vitro, foi constatada interação altamente significativa da concentração de sacarose e fotoperiodo. A maior densidade foi favorecida pela luz contínua e 3% de sacarose. Embora o número de TG/mm2 (otimizado) obtido in vitro tenha sido menor do que o apresentado pelas plantas cultivadas em casa de vegetação e pelo done adimatado, ele foi significativo, principalmente se considerarmos o curto tempo de cultivo (31 dias). Portanto, há possibilidade de melhorar estes resultados, aumentando o tempo de exposição aos tratamentos / Abstract: Several species of the genus Baccharis have been used in folk medicine. Pharmacological effects of many of them were confirmed, and, in the last years more than 60 species have been investigated chemically. However, biotechnological studies are rare. B. tridentata Vahl. and B. dracunculifolia De. are native, aromatic plants and they produce essential oil, in which nerolidol, sphatulenol and b-cadinene are major sesquiterpenes. Recently, was demonstrated the inhibitory effect of nerolidol on the growth of Plasmodium falciparum, the most dangerous species that causes malaria. Due the high mortality caused by this disease and the fact of this parasite is becoming resistant to conventional drugs, researches with plants that present therapeutic potential are very important. With the purpose of obtaining a great number of plants with the same characteristics of parents plants, and quicky, micropropagation protocols were developed. The micropropagation of B. tridentata was stablished through shoot apex of a single plant, allowing the formation of homogeneous plant bank (done), with served as explant sources for later experiments. The acc1imatization of micropropagated plants was successful with 80 % of survival in the ex-vitro environrnent. For B. dracunculifolia, due to intense oxidation of explants, the micropropagation was only possible through the germination of seeds. The strong recalcitrant behaviour to the in vitro culture hindered to following the experiments ofthis species. Plants of B. tridentata grow in small cavities on the rocky surfaces of the Itatiaia Plateau. The peculiarity of this habitat took us to accomplish some in vitro physiological studies, seeking understanding adaptation mechanisms of this species, besides allowing the improvement of the micropropagation protocol. We verified the effects of the initial pH variation, the preferential nitrogen source and the concentration of some macronutrients on the growth. After 31 days of in vitro culture, the growth of done resulted in media acidification, with final pH as 3,5. The clone presented larger growth (heigth and dry matter) with NO3 +NH/ mixture, when compared with NO3- or NH4 -r supplied separately. The decrease of magnesium concentration in the culture media favoured the increment of dry matter by roots. Recent studies have demonstrated that shoot cultures can be a viable source of useful secondary compounds, mainly those produced in highly differentiated structures, as glandular trichomes (TG). However, in vUro cultured plants present, in general, smaller production compared with greenhouse grown plants. The lower production feature of in vitro cultured plants has been related with little differentiation degree. This present work investigated some microenvironrnentals, nutritional and phytohormonals factors in the differentiation of clone leaf structures, especially glandular trichomes. TG of tissue cultured plants were morphologically similar to that of greenhouse grown plants and acc1imated clone. The use of cotton lid in the culture vessel (in substitution to pvc closure) resulted in larger differentiation of palisade mesophyll cells. In this treatment, a subcuticular space formed by the detachment of cuticle were observed on the glandular trichomes, suggesting the production of secretory material. The use of cotton lid changes the vessel microenvironrnent (decrease of the humidity and increase of gaseous exchange) and probably, enhanced the leaf structures differentiation. Another altemative to increase the production of TG produced compounds is through the increase of the density of these structures (number of TG/mm2). This way, we investigated the effect of the same microenvironrnentaI, nutritional and phytohormonals factors, in the density of trichomes, in adult leaves of tissue cultured clone. Greenhouse grown plants and acc1imated clone presented larger density of TG than in vitro cultured plants. The density of TG was always larger in adaxial epidermis. Among the treatments applied to the in vitro cultured clone, there was highly significant interation of the sucrose concentration and photoperiod on the trichomes number. The largest density was favoured by the continuous light and 3% of sucrose. Although the best results of TG density obtained in the tissue cultured plants has been smaller than greenhouse grown plants and acclimated clone, the in vitro results were significant, mainly, if consider the short time of culture (31 days). Thus, there is possibility to improve these results increasing the time of exposure to the treatment / Doutorado / Doutor em Biologia Vegetal

Made available in DSpace on 2014-06-12T22:59:16Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo8473_1.pdf: 76061 bytes, checksum: b43dfcb81d17f303bce9d8e39519b5fc (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2001 / O amálgama predominou como material restaurador direto durante muitas décadas, porém a estética tem sido exigida cada vez mais, não só pelos profissionais, como também pelos pacientes. As resinas compostas vêm sofrendo inúmeras alterações para preencher os requisitos de um bom material restaurador para dentes posteriores, porém um dos problemas clínicos é a infiltração marginal sendo várias as técnicas estudadas com o objetivo de minimizar tal problema sobretudo na região de dentina. Portanto, o objetivo deste trabalho consistiu em estudar, in vitro , a efetividade do vedamento marginal proporcionado por um sistema adesivo associado ao amálgama e/ou resina composta compactável para restaurar cavidades classe II, avaliando-se o grau de infiltração marginal tanto nas interfaces esmalte/material, dentina/material quanto na interface dos materiais restauradores. A amostra consistiu de 45 molares humanos hígidos. Os dentes foram distribuídos em 3 grupos: grupo 1 amálgama (GS® 80); grupo 2 resina composta compactável (Filtek® P60); grupo 3 amálgama / resina composta compactável. O adesivo dentinário empregado foi Single Bond® (3M). Após 48 horas as restaurações foram polidas e os espécimes preparados para a termociclagem que foi realizada em água destilada perfazendo um total de 500 ciclos de 20 segundos cada, nas temperaturas de 5°C e 55°C (±5°C). Os corpos de prova foram submersos por 24 horas em solução de fucsina básica a 0,5%, lavados, incluídos em resina epóxica e secionados longitudinalmente de mesial para distal. As superfícies foram avaliadas quanto ao grau de infiltração marginal e a análise estatística demonstrou que na interface esmalte/material a resina composta Filtek® P60 foi capaz de reduzir de forma significativa a infiltração marginal; nenhum material foi capaz de reduzir a infiltração na interface dentina/material; comparando-se as interfaces dentro do mesmo grupo, o único que apresentou diferença significativa foi a resina composta; a técnica mista não foi eficiente em reduzir a infiltração marginal e nenhum material restaurador evitou 100% a infiltração marginal

Abstract Cytochromes P450 (P450, CYP) are a superfamily of enzymes that participate especially in the oxidative metabolism of various xenobiotics and endogenous compounds. The major goal of this study was to characterise suitable methods for routine preclinical in vitro testing of new chemical entities (NCE) and to test the methods for the affinity screening of selected drugs. In vitro methods used involve the utilisation of human liver microsomes for studies with P450-selective reference inhibitors, inhibitory antibodies and cDNA-expressed enzymes in cytochrome P450-catalysed activities and for studying the reactions of selegiline and entacapone. In this project, the CYP-catalysed oxidative in vitro biotransformation of selegiline into its primary metabolites desmethylselegiline and l-methamphetamine and the transformation of entacapone into its in vitro metabolite N-desethylentacapone were studied. The affinities of selegiline, desmethylselegiline, l-methamphetamine, entacapone, candesartan, eprosartan, irbesartan, losartan and valsartan to P450 enzymes were also elucidated, and the selectivity of tranylcypromine as a CYP2A6-selective reference inhibitor was characterised. The most important findings were that the methodology developed during this work is suitable for preclinical in vitro testing of NCEs and that the results obtained for the studied compounds are in line with the available in vivo data. By the in vitro testing methodology, it is possible to target the in vivo interaction studies to the relevant groups of compounds. The in vitro methods presented in this thesis could also make the early phases of drug development more cost-effective. Further, the number of animals used for in vivo testing in preclinical metabolism and interaction studies can be markedly reduced by effectively using this methodology.

>Magister Scientiae - MSc / P53 is one of the most important tumour suppressor proteins in the body which protects the cell against the tumourigenic effects of DNA damage by initiating processes such as apoptosis, senescence and cell cycle arrest. Regulation of p53 is key — so that the abovementioned processes are not initiated inappropriately. The principle negative regulator of p53 is Murine Double Minute 2 (MDM2), a RING finger-containing protein which catalyses the attachment of lysine48-linked poly-ubiquitin chains, targeting it for degradation by the 26S proteasome. It has been found to work in conjunction with the MDM2 homologue MDMX. Retinoblastoma Binding Protein 6 (RBBP6) is a RING finger-containing protein known to play a role in mRNA 3’-end processing, as well as interacting with p53 and another crucial tumour suppressor, pRb. It has previously been shown to cooperate with MDM2 in the ubiquitination and degradation of p53 in vivo and acts as a scaffold. The objectives of this project are to investigate the proposed role of RBBP6 in the MDM2-catalysed ubiquitination of p53 using a fully in vitro ubiquitination system. Due to the difficulty of expressing full length RBBP6 in bacteria, a shortened version, dubbed "R3" was used which includes the RING finger domain but excludes the domain identified in earlier studies as the p53-binding domain. Proteins required to set up the fully in vitro p53 ubiquitination assays – including E1 and E2 enzymes, MDM2, R3, p53 and ubiquitin - were all successfully expressed in bacteria. The active 26S proteasome was successfully purified out of human cell lysates using antibodies targeting the α2-subunit. Cloning, expression and purification results showed that p53, MDM2 and R3 were not very stable proteins to work with — with degradation being initiated almost immediately after expression and purification which progressed during the downstream processing of the proteins. Although levels of intact protein were not always high, they were sufficient for in vitro assays. MDM2 and GST-R3 were both capable of poly-ubiquitinating p53 independently in "partially in vitro" assays using human cell lysate. The fully in vitro ubiquitination of p53 using MDM2 and R3 was established based on the well-known MDM2/MDMX system. When acting together R3 and MDM2 was shown to produce poly-ubiquitination which is lysine-48 linked and recognised by the 26S proteasome leading to degradation. When the proteasome inhibitor MG132 was added, the poly-ubiquitinated p53 was rescued from degradation. R3 was also shown to successfully poly-ubiquitinate p53 independently of MDM2 and also interact with p53 in vitro. These results suggest R3 to be of the same order of importance as that of MDM2 — which is known to be the most important regulator of p53. It would also rule out the proposed model of RBBP6 functioning as a scaffold as it is able to poly-ubiquitinate p53 independent of MDM2. These results allow us to better understand the mechanism in which p53 is down-regulated by E3s. / National Research Foundation (NRF)

Orientador: Nelson Rodrigues Netto Junior / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-07-20T13:56:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Neves_PauloAugusto_D.pdf: 1913506 bytes, checksum: 4bc4cfa6b4dc011c6b5a36042a0d32fc (MD5) Previous issue date: 1995 / Resumo: No período de 1990 a 1994, 331 pacientes do sexo masculino com infertilidade primária foram tratados no ambulatório da Disciplina de Urologia da Faculdade de Ciências Médicas da UNICAMP. O tratamento compreendeu uma fase inicial, denominada convencional, que incluiu o tratamento clínico e cirúrgico (varicocelectomia). Os pacientes que não engravidaram nesta fase foram a seguir encaminhados para tratamento através de reprodução assistida. O tratamento convencional incluiu 258 pacientes (77,95%) que receberam tratamento clínico através do uso de citrato de clomifeno (50 mg ao dia por via oral) ou administração de gonadotrofina coriônica humana (2000 UI por via intramuscular por semana) associada à gonadotrofina da menopausa (1000 UI por via intramuscular por semana) e acompanhados por 12 meses. Ao término deste período, quatro pacientes apresentaram gravidez (1,55%). Os outros 73 pacientes (22,05%) receberam tratamento cirúrgico (varicocelectomia) e clínico por apresentarem varicocele uni ou bilateral ao exame físico especial. Após seguimento de 18 meses, 1 O pacientes apresentaram gestação (13,70%). O resultado geral do tratamento convencional foi de 4,23%. Dentre os 317 casais que não apresentaram gestação, 63 foram tratados por reprodução assistida. Empregou-se a técnica de inseminação intra-uterina (AIH) quando foi possível recuperar inicialmente, através das técnicas de capacitação, dois ou mais milhões de espermatozóides com motilidade progressiva (graus A e B). Trinta e seis casais (57,14%) foram '1' tratados através de um a nove ciclos de AIH, num total de 131 ciclos. Observou-se 14 gestações (38,89%) com taxa de gravidez de 10,69% por ciclo. Não houve diferença estatisticamente significante quando se comparou os resultados em função do número de espermatozóides inseminados (entre dois e cinco milhões ou entre cinco e 10 milhões). Empregou-se a técnica de fertilização in vitro quando a recuperação inicial de espermatozóides foi inferior a dois milhões. Vinte e sete casais (42,86%) foram tratados por esta técnica, num total de 37 ciclos. Ocorreu gravidez em três casos (11,11 % por ciclo). com taxa de gravidez de 8,11 % Não houve diferença estatisticamente significante quando se comparou os resultados em relação ao número de espermatozóides utilizados no procedimento (entre um e dois milhões ou menos de um milhão de espermatozóides com motilidade progressiva). O resultado geral do tratamento por reprodução assistida foi de 26,98%. Concluiu-se que a reprodúção assistida deve ser o tratamento deI escolha para os pacientes com infertilidade primária, portadores ou não de varicocele, por ser mais eficaz que o tratamento convencional / Abstract: From 1990 to 1 994, 331 male patients with primary infertility were treated at the Department of Urology of the University of Campinas Medical School - UNICAMP. The initial approach included conventional medical and surgical (varicocelectomy) regimens. Patients who did not achieve pregnancy with these modalities underwent assisted reproduction therapy. The conventional treatment group included 258 patients treated medically (clomiphene citrate, 50 mg qd, or chorionic human gonadotropin, 2000 UI/week, assodated with human menopausa I gonadotropin, 1000 UI/week, administered for 12 months). A total of 4 patients achieved pregnancy (1,55%). Surgical Aof total 73 patients underwent (varicocelectomy) nd medical treatment and were followed for 18 months. Pregnancy was achieved in 10 patients (13,70%). The pregnancy rate for conventional treatment was 4.23%. A total of 317 patients did not achieve pregnancy with conventional treatment. Of these, 63 were submitted to assisted reproduction. Intrauterine insemination (AIH) was selected when initial capacitation could recover at least 2 million motile sperms (grades A and B). A total of 36 patients (57,14%) received 1 to 9 cycles of AIH, totalizing 131 cycles. Pregnancy was observed in 14 patients (38.89%) with a pregnancy rate of 10.69% per cycle. There was not statistically significant difference when the results were compared according to the number of spermatozoa inseminated (2 to 5 and 5 to 10 million sperms). In vitro fertilization (IVF) was used when the initial capacitation could recover less than 2 million motile sperms. A total of 27 patients (42.86%) were treated with 37 cycles of IVF and 3 (11.11 %) achieved pregnancy (pregnancy rate per cycle of 8.11 %). There was not statistically significant difference when the results were compared according to the number of spermatozoa used for the in vitro fertilization (1 to 2 millions or lower than 1 million motile sperm). The total pregnancy rate for assisted reproduction was 26.98%. In conclusion, assisted reproduction is the treatment of choice for mal e patients with primary infertility, with or without varicocele, in view of its higher efficacy rate compared to conventional treatment / Doutorado / Doutor em Cirurgia

MSCAGR (Animal Science) / Department of Animal Science / Soya bean (Glycine max) is a legume that is mostly cultivated for food grain which can be used as high-protein forage for grazing, haying or ensiling. The use of forage soya bean by small holder farmers is currently very limited. The objective of the current study was to evaluate the nutritive value of three trifoliate forage Soya bean cultivars (Locally denoted as 4-LF, PAN, and TGX). The study was carried out at the University of Venda where the soya beans were planted in 63 25L pots (21 pots for each cultivar) which were randomly placed on the floor of an open, wire-net protected house. Forage harvested at three growth stages (pre-anthesis, anthesis and postanthesis). Samples of the forage were analyzed for dry matter (DM), ash, crude protein (CP), neutral detergent fiber (NDF), acid detergent fiber (ADF) micro and macro minerals. Ruminal DM and CP degradability were evaluated in situ by incubation of samples within nylon bags (external dimension: 6 × 12 cm, pore size of 46 μm) in the rumen of three Bonsmara steers for 0, 6, 12, 16, 24, 48, 72, and 96 hours. Estimates of rapidly degradable fraction “a”, slowly degradable fraction “b”, constant outflow rate ‘c’ and the DM or CP degradability (p) at time (t) were estimated by fitting the degradability data into the exponential equation P = a + b (1 - e-ct) using the NEWAY computer programme. Parameters were subjected to ANOVA for a 3 X 3 factorial treatment arrangement using the General Linear Model procedures of MINITAB software (version 17 of 2014). Effective degradability ED) was estimated asED = a + bc at fractional outflow rates of k= (k +c) 2%, 5% and 8%. In vitro enzymatic DM and CP digestibility of rumen undegradable residues collected after 24 and 48-hour incubation was determined by simulating sequential gastro-small intestinal digestion. Cultivar PAN harvested post anthesis had significantly higher (p< 0.05) CP than other cultivars. The CP content increased with growth stage. Cultivar 4LF harvested preanthesis had significantly highest (p< 0.05) NDF. The cultivar had no significant effect (p> 0.05) on DM, ash, CP, NDF, ADF and minerals. Cultivar PAN harvested pre-anthesis had significantly highest (p< 0.05) Mg. The harvest stage significantly affected (p< 0.05) mineral content other than (p> 0.05) Zn and Cu. Cultivar TGX harvested pre-anthesis had significantly highest (p< 0.05) effective degradability of dry matter at k=0.08. Fraction ‘c’ and ED at k= 0.08 were lower (p> 0.05) in cultivar * growth stage interaction in dry matter degradability. Fraction ‘a’ for CP was highest (p< 0.05) for cultivar TGX harvested post-anthesis. Fraction ‘c’ was lower (p> 0.05) for cultivar 4LF harvested at anthesis stage. There was a significant effect (p< 0.05) on crude protein soluble fraction ‘c’ and effective degradability k=0.08 in cultivar and growth stage interaction. There was no significant interaction (p> 0.05) of the cultivar X growth stage on crude protein degradability at 48 hours, IVCPD at 24 and 48 hours with significant effect on crude protein degradation at 24 hours caused by cultivar TGX at pre-anthesis growth stage. In conclusion, growth stage increases the chemical composition of soya bean but does not affect digestibility. / NRF