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Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais, Florianópolis, 2012 / Made available in DSpace on 2013-06-25T23:20:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 310712.pdf: 11497274 bytes, checksum: 9be2a6dd9911452e1ca39b405e9f333d (MD5) / Com uso intensivo de mão-de-obra, tecnologia e capital, a cultura do alho no Brasil tem viabilizado a pequena e média propriedade nas principais regiões produtoras, sendo portanto, de grande importância sócio-econômica. O alho (Allium sativum L.), por ser propagado vegetativamente, facilita a disseminação de patógenos, como vírus, favorecendo o aparecimento de doenças complexas, pelo acúmulo de diferentes espécies virais numa mesma planta, acarretando diminuição da produtividade e da qualidade do produto. Uma das técnicas mais utilizadas para limpeza clonal de alho é a cultura de meristemas. Apesar de muito utilizada para eliminação de viroses, percebe-se que há uma deficiência nos protocolos atualmente utilizados no que se refere à qualidade da semente produzida. Isto pode estar ligado aos fatores fisiológicos, fitossanitários e, principalmente, à inexistência de estudos para o desenvolvimento de protocolos de limpeza clonal mais eficientes. O presente trabalho teve como objetivos: (i) estudar o padrão de organização morfológica da bulbificação em alho, descrevendo os efeitos dos fatores envolvidos nesse processo; (ii) estudar a morfogênese de plantas de alho in vitro através de avaliações de componentes de meios de cultura e de fatores ambientais que afetam a indução de bulbos; (iii) avaliar as alterações de substâncias endógenas durante o crescimento das plantas e seus efeitos sobre o processo de bulbificação; e (iv) desenvolver um método de crioterapia para remoção do complexo viral do alho a partir do estabelecimento de um protocolo de criopreservação. No Capítulo I, além de um estudo do padrão morfológico da bulbificação, é apresentada uma revisão atualizada dos temas abordados no trabalho com o referencial teórico e as informações disponíveis até o presente. Para o estudo da morfogênese de plantas de alho in vitro foram avaliados os efeitos de tipos e concentrações de reguladores de crescimento e de carboidratos, de períodos de vernalização dos explantes, e os efeitos dos regimes de temperatura e fotoperíodo sobre a diferenciação de gemas de bulbos. As dosagens dos níveis endógenos de Ácido Absíciso e açúcares solúveis totais foram realizadas por testes imunoenzimático-ELISA e pela técnica colorimétrica fenol-sulfúrico, respectivamente. O desenvolvimento do protocolo de criopreservação foi efetuado mediante exposição de ápices caulinares nas soluções de vitrificação PVS2 e PVS3. Posteriormente, a solução com melhor desempenho foi utilizada para crioterapia. A crioterapia foi comparada com os métodos tradicionais de limpeza de vírus em alho. Os resultados aqui apresentados mostram evidências de que plantas de alho cultivadas in vitro também apresentam respostas morfogenéticas para a diferenciação e desenvolvimento de bulbilhos do tipo termo-fotoperiódico dependente. Ficou evidenciado que o tempo de exposiçaõ ao frio reduz a sensibilidade ao fotoperíodo para a indução da bulbificação. Os resultados sugerem a participação do Ácido Abscísico e dos carboidratos solúveis, respectivamente, como agentes inibidores e indutores da bulbificação, em resposta à estímulos climáticos como temperatura e fotoperíodo. Para identificar a real importância desses compostos nesse processo, sugere-se um estudo minucioso da histodiferenciação de bulbos para identificar com maior precisão o momento exato da diferenciação durante a ontogênese das plantas. A solução de vitrificação PVS3 proporcionou a maior taxa de sobrevivência de explantes criopreservados, e foi utilizada no tratamento de crioterapia para erradicação do complexo viral do alho. Entre os diferentes métodos de limpeza de vírus avaliados neste trabalho, a crioterapia de ápices caulinares, associada ou não com a termoterapia, apresentou a maior taxa de eliminação de Onion yellow dwarf virus (OYDV), Garlic common latent virus (GCLV) e, principalmente de Leek yellow stripe virus (LYSV), ausente em 100% das amostras sobreviventes. A imunolocalização de OYDV revelou a presença do vírus em quase todas as partes do ápice caulinar, incluindo a porção distal do domo meristemático e os primórdios foliares. A distribuição dessa espécie de vírus em tecidos de ápices caulinares de alho pode estar associada com o desenvolvimento de plasmodesmos e sua capacidade de dar suporte a sua circulação. Apoiado nessas observações, sugere-se que Onion yellow dwarf virus (OYDV) invade eficientemente as células de ápices caulinares de alho. Os resultados obtidos a partir desse trabalho de tese ampliam a base científica e permitem aprofundar a compreensão dos fatores associados a morfogênese de plantas de alho in vitro. O estabelecimento de um protocolo completo de criopreservação de alho se configura em uma ferramenta para erradicação de viroses em plantas de alho e, sobretudo, para o estabelecimento de um programa de conservação de germoplasma dessa espécie. <br> / Abstract : With the intensive use of labor, technology and capital, the culture of garlic in Brazil has enabled the small and medium property in the main producing regions, thus being of a high socio-economic relevance. Garlic (Allium sativum L.), due to its vegetative propagation, facilitates the spread of pathogens, such as virus, favoring the outbreak of complex diseases, due to the accumulation of different virus species in the same plant. That entails the decrease of productivity and a decrease of the quality of the product. One of the most used techniques for pathogen removal from garlic is the culture of meristems. Even though it is widely used to eliminate viruses, it is easy to perceive that there are deficiencies in the protocols involving the quality of the produced seeds. This may be related to physiological and phytosanitary factors, and also to the lack of studies developing more efficient protocols for pathogen removal. This study has the following objectives: (i) to study the pattern of the morphological organization of garlic bulbing, describing the effects of the factors involved within the process; (ii) to study the morphogenesis of in vitro garlic plants through assessments of the components of the growing medium and the environmental factors that affect bulbing induction; (iii) to assess the changes of endogenous substances during the growth of the plants and their effects on the bulbing process; and (iv) to develop a method of cryotherapy for viral complex removal in garlic, upon the establishment of a protocol for cryopreservation. In chapter I, alongside the study of the morphological pattern of bulbing, it is presented an updated review of the topics tackled within this work, with the theoretical framework and the information available up to the present. For the study of morphogenesis of in vitro garlic plants, it was carried out an assessment of the effects of different types and concentrations of growth regulators and carbohydrates, of the periods of vernalization of plantlets, and the effects of temperature regimes and photoperiods affecting the differentiation of bulb buds. The dosage of the endogenous levels of abscisic acid and total soluble sugars were carried out through immunoenzymatic-ELISA tests and through the colorimetric phenolsulfuric technique, respectively. The development of the protocol for cryopreservation was carried out through the exposure of the shoot tips to the vitrification solutions PVS2 and PVS3. Later, the solution with the best performance was used for cryotherapy. Cryotherapy were compared to the traditional methods for virus removal in garlic. The results reported here evidence that garlic plants grown in vitro also present morphogenetic answers to the differentiation and development of thermo- and photoperiod- dependent bulbils. It also became evident that the time of exposure to cold decreases the sensitivity to the photoperiod for bulbing induction. The results suggest that the abscisic acid and the soluble carbohydrates participate, respectively, as inhibiting agents and bulbing inductors, in response to climatic stimuli such as temperature and photoperiod. To identify the actual relevance of those compounds within this process, it is suggested a thorough study of bulb histodifferentiation in order to identify more precisely the exact moment of differentiation during the ontogeny of the plants. The solution of vitrification PVS3 provided a higher survival rate of cryopreserved plantlets, and it was used in the cryotherapy treatment to eradicate the viral complex from the garlic. Among the different methods for virus removal assessed in this work, the cryotherapy of garlic shoot tips, whether associated with thermotherapy or not, showed a higher frequency in the elimination of the Onion yellow dwarf Virus (OYDV), the Garlic common latent virus (GCLV) and mainly the Leek yellow stripe virus (LYSV), which was absent in 100% of the surviving samples. The immunolocalization of OYDV showed the presence of the virus in almost all parts of the shoot tip, including the distal portion of the meristematic dome and the leaf primordia. The distribution of this species of virus in shoot tip tissues of garlic may be associated with the development of plasmodesms and with its capability to give support to their circulation. Upon these observations, it is suggested that the Onion yellow dwarf virus (OYDV) efficiently invades the cells of the garlic shoot tips. The results achieved by this research project broaden the scientific basis and allow the deepening of the comprehension of the factors associated with the morphogenesis of in vitro garlic plants. The establishment of a complete protocol for the cryopreservation of garlic is a tool for the eradication of viruses in garlic plants and, above all, for the establishment of a program for preserving germplasm of this species.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / In vitro cultured bovine embryos are susceptible to oxidative stress caused by high oxygen concentration, that contributes to free radicals formation. Therefore, antioxidant defense systems are needed to neutralize the reactive oxygen species and their harmful effects. The aim of this study was to evaluate the addition of different concentrations (100, 250 and 500μM) of ascorbic acid (AA) antioxidant to in vitro maturation (IVM, 9 replications) or culture (IVC, 8 replications) media of bovine embryos (Chapter 1). The concentration that provided greatest embryonic development rate and better embryo quality was added to in vitro maturation and/or culture media at different gaseous atmospheres (Chapter 2, 10 replications). Media without antioxidant served as control-groups. Cumulus-oocyte complexes obtained from bovine ovaries at the slaughterhouse were randomly distributed in groups and matured in TCM-199 with addition of pFSH, bLH and 10% estrus cow serum (ECS), for 22 to 24h, in an incubator at 39°C and 5% CO 2 in air and saturated humidity. The in vitro production was performed using 20-40 oocytes/group in 400μL of medium in 4-well dishes (Chap. 1) and 13-32 oocytes/group in 200μL drops of medium under mineral oil (Chap. 2). The in vitro fertilization (D0) was performed with Bos taurus taurus frozen semen selected by Swim-up (Chap. 1) and Percoll gradient (Chap. 2) with 1x106 spermatozoa/mL in TALP-Fert with heparin and PHE, for 18 to 22h, at the same IVM conditions. The presumptive zygotes were in vitro cultured in SOFaaci medium with 5% ECS under mineral oil, in the bag system at 5% CO2, 5% O2 and 90% N2 and saturated humidity (Chap. 1 and 2), or in an incubator at 5% CO2 in air and saturated humidity (20% O2 in air; Chap 2). To analyze the percentage of embryos on D2, D7 and D9 a randomized block delineation was used, having as blockade criteria the collection day (Chap. 1). In Chap. 2, the cleavage rate on D2 was analyzed considering the effects of AA addition on maturation and culture and the interaction between the two factors. The embryonic development data on D7 and D9 were analyzed after arc sine square root transformation and considered the effects of AA presence on maturation and culture, the gaseous atmosphere and the interaction among these factors, taking into account the routine day in the analyses model. Blastocyst cell number was obtained after base 10 logarithmic transformation of data, using 8 (Chap. 1) and 10 replications (Chap. 2), with a significance level of 5%. In Chapter 1, the cleavage rate and embryonic development on D7 were similar (P>0.05) among the different AA concentrations added to IVM or IVC. However, the 100μM AA addition to IVC tended (P<0.07) to show higher blastocyst production (32.3%) when compared to the 500μM group (19.7%). The blastocyst production on D9 increased significantly when 100μM AA were added to IVM (P<0.05) compared to control-group (38.7 vs 29.0%), or on IVC (P<0.01) compared to 500μM concentration (28.1 vs 14.1%). The blastocyst cell number was similar (P>0.05) among the different AA concentrations and the control-group. In Chapter 2, there was no effect of interaction (P>0.05) among the factors studied (AA on IVM, AA on IVC and atmosphere of culture) on D2, D7 and D9. Cleavage rate and embryonic development on D7 and D9 did not differ (P>0.05) between groups with and without antioxidant addition, independently of the gaseous atmosphere. However, a greater cell number was observed in hatched blastocysts (P<0.05) when the AA was included in the culture medium. The results indicate that 100μM ascorbic acid concentration can be used during IVM or IVC to increase embryo production, especially on D9, and improve the quality of hatched blastocysts, independently of the culture gaseous atmosphere. / Embriões bovinos cultivados in vitro são susceptíveis ao estresse oxidativo causado pela alta concentração de oxigênio, que contribui para a formação de radicais livres. Por isso, sistemas antioxidantes de defesa são necessários para neutralizar as espécies reativas de oxigênio e seus efeitos prejudiciais. Este estudo teve como objetivo avaliar a adição de diferentes concentrações (100, 250 e 500μM) do antioxidante ácido ascórbico (AA) aos meios de maturação (MIV, 9 repetições) ou cultivo (CIV, 8 repetições) in vitro de embriões bovinos (Capítulo 1). A concentração que propiciou maior taxa de desenvolvimento embrionário e melhor qualidade dos embriões foi adicionada aos meios de maturação e/ou cultivo in vitro em diferentes atmosferas gasosas (Capítulo 2, 10 repetições). Meios sem antioxidante serviram como grupos-controle. Complexos cumulus-oócitos obtidos de ovários de frigorífico foram distribuídos aleatoriamente em grupos e maturados em TCM-199 adicionado de pFSH, bLH e 10% de soro de vaca em estro (SVE), por 22 a 24h, em estufa a 39°C e 5% CO 2 em ar e umidade saturada. Para a produção in vitro foram utilizados 20-40 oócitos/grupo em 400μL de meio em placa de quatro poços (Cap. 1) e 13-32 oócitos/grupo em gotas de 200μL de meio sob óleo mineral (Cap. 2). A fecundação in vitro (D0) foi conduzida com sêmen congelado Bos taurus taurus selecionado por Swim-up (Cap. 1) e gradiente de Percoll (Cap. 2), com 1x106 espermatozóides/mL em TALP-Fert com heparina e PHE, por 18 a 22h, nas mesmas condições da MIV. Os prováveis zigotos foram cultivados in vitro em meio SOFaaci com 5% de SVE sob óleo mineral, no sistema de bolsas gaseificadas (bag system) a 5% CO2, 5% O2 e 90% N2 e umidade saturada (Cap. 1 e 2), ou em estufa a 5% CO2 em ar e umidade saturada (20% O2 em ar; Cap. 2). Para analisar a porcentagem de embriões no D2, D7 e D9 utilizou-se o delineamento blocos ao acaso, tendo como critério de bloqueio o dia da coleta (Cap. 1). No Cap. 2, para analisar a taxa de clivagem no D2 foram considerados os efeitos da adição do AA na maturação, adição do AA no cultivo e a interação entre os dois fatores. Os dados do desenvolvimento embrionário no D7 e D9 foram analisados após transformação arcoseno raiz quadrada e foram considerados os efeitos da presença do AA na maturação, presença do AA no cultivo, a atmosfera gasosa e a interação entre esses fatores, considerando o dia de realização da rotina no modelo de análise. Para contagem de células dos blastocistos os dados foram analisados após transformação logarítmica de base 10, sendo utilizadas 8 repetições (Cap. 1) e 10 repetições (Cap. 2), com nível de significância de 5%. No Capítulo 1, a taxa de clivagem e o desenvolvimento embrionário no D7 foram similares (P>0,05) entre as diferentes concentrações de AA adicionadas na MIV ou CIV. Entretanto, a adição de 100μM de AA no CIV apresentou tendência (P<0,07) de maior produção de blastocistos (32,3%) quando comparado ao grupo com 500μM (19,7%). A produção de blastocistos no D9 aumentou significativamente quando 100μM de AA foi adicionado na MIV (P<0,05) comparado ao grupo-controle (38,7 vs 29,0%), ou no CIV (P<0,01) comparado com a concentração de 500μM (28,1 vs 14,1%). O número de células por blastocisto foi similar (P>0,05) entre as diferentes concentrações de AA e o grupo-controle. No Capítulo 2, não houve efeito da interação (P>0,05) entre os fatores estudados (AA na MIV, AA no CIV e atmosfera de cultivo) sobre o D2, D7 e D9. A taxa de clivagem e o desenvolvimento embrionário no D7 e D9 não diferiram (P>0,05) entre os grupos com e sem antioxidante, independentemente da atmosfera gasosa. No entanto, maior número de células foi observado nos blastocistos eclodidos (P<0,05) quando o AA foi incluído no meio de cultivo. Os resultados indicam que a concentração de 100μM de ácido ascórbico pode ser utilizada durante a MIV ou CIV para incrementar a produção embrionária, especialmente no D9, além de melhorar a qualidade dos blastocistos eclodidos, independentemente da atmosfera gasosa de cultivo.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:25:25Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-03-28Bitstream added on 2014-06-13T18:26:27Z : No. of bitstreams: 1 000736004.pdf: 627827 bytes, checksum: 411ff86dc11bb8a1a240b7427a561cdf (MD5) / A maturação in vitro (MIV) é considerada uma das etapas mais desafiadoras da produção in vitro (PIV) de embriões bovinos. O meio de MIV deve fornecer condições necessárias para que a maturação citoplasmática e nuclear ocorra de modo próximo ao fisiológico. As gonadotrofinas hipofisárias são essenciais para que o oócito adquira (in vivo) a competência para ser fertilizado; entretanto, se as gonadotrofinas (hipofisárias ou coriônicas) são essenciais, na MIV, as concentrações a serem utilizadas ainda são controversas. Os objetivos, com este estudo, foram estabelecer concentrações otimizadas de gonadotrofinas coriônicas (eCG e hCG) para a substituição daquelas comumente utilizadas de FSH e LH; comparar o efeito de baixas concentrações de eCG e/ou de hCG, isoladamente ou em conjunto com gonadotrofinas hipofisárias; e analisar a necessidade da utilização do FSH e do LH, individualmente, na PIV de embriões livre de suplementação proteica. Complexos cumulus-oócito (CCOs) obtidos de ovários de vacas provenientes de abatedouro, foram selecionados e utilizados em três experimentos: 1) CCOs maturados em meio MIV com seis concentrações distintas de eCG (0; 0,015; 0,15; 1,3; 1,5 e 4 UI mL-1 ) dando origem aos grupos experimentais (C+; E1; E2; E3; E4 e E5, respectivamente), e seis concentrações distintas de hCG (0; 0,05; 0,5; 0,67; 2 e 5 UI mL-1), originando também seis grupos experimentais (C+; H1; H2; H3; H4 e H5, respectivamente); 2) Meio MIV com concentrações mínimas funcionais de eCG e hCG obtidas no experimento anterior, resultando em sete grupos experimentais: sem quaisquer gonadotrofinas; apenas eCG (0,015 UI mL-1); apenas hCG (0,05 UI mL-1); eCG mais hCG; eCG mais LH; hCG mais FSH; e SFB com FSH (0,5 μg mL-1) e LH (5 μg mL-1); e 3) MIV na presença de FSH (0,5 μg mL-1) ou LH (5 μg mL-1) sem nenhuma suplementação proteica. Os CCOs maturados foram fertilizados e... / The in vitro maturation (IVM) is considered one of the most challenging steps of in vitro production (IVP) of bovine embryos. The IVM medium must provide the conditions required for nuclear and cytoplasmic maturation to occur similarly to physiological. The pituitary gonadotropins are essential components that enable oocytes for fertilization (in vivo), but as the gonadotropins (pituitary or chorionic) are essential for IVM, their employed concentrations are still indefinite. We aimed to establish optimal concentrations of chorionic gonadotropin (eCG and hCG) to replace those of FSH and LH commonly used; to compare the effect of low concentrations of eCG and/or hCG alone or in combination with pituitary gonadotropins; and to analyze how necessary is the use of FSH and LH, individually, on the IVP of embryos free from any protein source. Cumulus-oocyte complexes (COCs), obtained from ovaries of slaughterhouse were selected and used in three experiments: 1) COCs matured on the IVM medium with six different concentrations of eCG (0, 0.015, 0.15, 1.3; 1.5 and 4 IU ml-1) yielding the experimental groups (C +, E1, E2, E3, E4 and E5, respectively) and six different concentrations of hCG (0, 0.05, 0.5, 0, 67, 2 and 5 IU ml-1), also yielding six experimental groups (C +, H1, H2, H3, H4 and H5, respectively); 2) IVM medium with minimal concentrations functional of eCG and hCG obtained in the previous experiment, resulting in seven groups: without any gonadotropin; only eCG (0.015 IU mL-1); only hCG (0.05 IU mL-1); eCG plus hCG, eCG plus LH; hCG plus FSH; FCS with FSH (0.5 mg ml-1) and LH (5 mg ml-1); and 3) IVM in the presence of FSH (0.5 mg mL-1) or LH (5 mg ml-1), without protein supplementation. The matured COCs were fertilized and cultured in incubator (38.3 °C, 5% CO2 and maximum humidity). Embryo development was evaluated in terms of cleavage, blastocyst and hatching rates (at 72, 168 and 240 hours post-insemination, ...

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:11Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-05-05Bitstream added on 2014-06-13T19:05:29Z : No. of bitstreams: 1 leal_ls_dr_botfmvz.pdf: 1424462 bytes, checksum: bbd9bf26b7adb5dc3b7bb266434ac12a (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Pesquisadores do mundo inteiro têm investigado a função de fatores e eventos biológicos envolvidos na foliculogênese e no processo de maturação ovocitária in vitro em várias espécies, com o intuito de aprimorar tecnologias de produção e manipulação de embriões. O objetivo do presente estudo foi avaliar: a morfometria ovariana; os aspectos morfométricos e ultra-estruturais dos folículos ovarianos; os fatores que influenciam a recuperação, qualidade ovocitária e taxas de maturação nuclear in vitro; as concentrações de progesterona e insulina plasmáticas e os níveis de hormônios esteróides (estradiol e progesterona) e IGF-I no líquido folicular, em búfalas e vacas. Amostras de sangue e os ovários de 86 búfalas (33 gestantes e 53 não gestantes) e de 95 vacas (36 gestantes e 59 não gestantes) foram colhidos em abatedouros. Os ovários foram transportados ao laboratório em solução salina acrescida de penicilina e estreptomicina a 36ºC. As dimensões ovarianas foram mensuradas com o auxílio de paquímetro e balança digitais. Para a maturação ovocitária in vitro, os complexos cumulus oophorus (CCOs) foram recuperados por aspiração folicular, selecionados e cultivados em meio TCM-199 suplementado com 10% de soro fetal bovino, piruvato de sódio, FSH, LH, estradiol, cisteamina e gentamicina, por 22 a 24 horas, a uma temperatura de 38,5ºC, em atmosfera úmida com 5% de CO2 em ar. Para as técnicas de histologia clássica e microscopia eletrônica de transmissão foram processados 10 e 5 ovários de cada espécie, respectivamente. As concentrações de progesterona, insulina, estradiol e IGF-I nas amostras de sangue e fluido folicular foram determinadas por procedimento de radioimunoensaio, utilizando-se kits comerciais. Na análise histológica, verificou-se... / Researchers around the world have investigated the function of biological factors and events during folliculogenisis and in the process of in vitro maturation of oocytes in several species in order to improve technologies of embryo production and manipulation. The aim of the present study was to evaluate: ovarian morphometry; morphological and ultrastructural aspects of ovarian follicles; factors affecting the recovery and competence of oocytes and in vitro nuclear maturation; plasma progesterone and insulin concentrations; progesterone, estradiol and IGF-I in follicular fluid, in bubaline and bovine species. Blood samples and ovaries of 86 buffaloes (33 pregnant and 53 non pregnant) and 95 cows (36 pregnant and 59 non pregnant) were collected at slaughterhouses. The ovaries were transported to the laboratory in saline solution enriched with penicillin and streptomycin at 36ºC. The ovarian dimensions were measured using digital paquimeter and balance. For in vitro maturation process, cumulus-oocyte complexes (COCs) were recovered by follicular aspiration, selected and matured in TCM 199 supplemented with 10% fetal calf serum, sodium pyruvate, LH, FSH, estradiol, gentamicin and cysteamin. In vitro maturation was carried out at 38.5ºC under a controlled gas atmosphere of 5% CO2 in humidified air for 22-24 hours. For classical histology and transmission electron microscopy, 10 and 5 ovaries of each species respectively were processed. Progesterone, insulin, estradiol and IGF-I concentrations of blood and follicular fluid were determined by use of radioimmunoassay and commercial kits. In histological evaluation, the diameters of follicles and oocytes increased according to follicular development. Ultrastructural characterization of bubaline and bovine ovarian follicles showed a differentiated cell apparatus for substrate metabolization, ...(Complete abstract click electronic access below)

Este trabalho teve como objetivo investigar o efeito do estresse hiperosmótico ou hiposmótico agudo, in vitro, sobre o metabolismo da glicose em brânquias anteriores e posteriores, hepatopâncreas e músculo da mandíbula do caranguejo Neohelice granulata. Foi avaliada a captação de 2-Deoxi-D-1-14C-Glicose, a formação de 14CO2 a partir da oxidação de 14Cglicose e a síntese de glicogênio a partir de 14C-glicose em todos os tecidos estudados. Não foram constatadas diferenças significativas na captação de 2-Deoxi-D-1-14C-glicose em nenhum dos tecidos estudados. Nas brânquias anteriores, brânquias posteriores e no hepatopâncreas, o estresse hiperosmótico reduziu significativamente, em relação ao grupo controle, a formação de 14CO2 a partir de 14C-glicose. Entretanto, o estresse hiposmótico reduziu a formação de 4CO2 a partir de 14C-glicose somente no hepatopâncreas. Nos outros tecidos, o estresse hiposmótico não alterou a formação de 4CO2 a partir da oxidação de 14Cglicose. No estresse hiposmótico, a capacidade de síntese de glicogênio a partir de 14C-glicose aumentou, significativamente, no hepatopâncreas e nas brânquias anteriores. Contudo, nas brânquias posteriores, este estresse não alterou, de forma significativa, a formação de 14Cglicogênio. Os resultados mostram que o estresse hiperosmótico aumentou a capacidade de síntese de 14C-glicogênio somente no hepatopâncreas. Já, nos outros tecidos, não foram verificadas alterações significativas. No músculo mandibular, o estresse osmótico agudo (hiposmótico e hiperosmótico), in vitro, não alterou, significativamente, nenhum dos parâmetros metabólicos determinados neste estudo. Nossos resultados sugerem que os mecanismos responsáveis pela redução regulatória do volume celular (RVD) ou pelo aumento regulatório do volume celular (RVI), após o estresse osmótico agudo, in vitro, não alteram a captação de glicose pelos tecidos de N. granulata. Estes resultados apontam para um controle endócrino ou de outros fatores endógenos sobre a captação de glicose, via GLUTs, nos tecidos de N. granulata, visto que, a alteração de volume tissular, decorrente do estresse agudo, in vitro, não foi capaz de modificar significativamente a captação de 2-DG. Nas brânquias anteriores, não foi verificada alteração na capacidade de oxidação de glicose no choque hiposmótico, contudo, a síntese de 14C-glicogênio aumentou significativamente neste tecido. Este resultado sugere que durante o estresse hiposmótico agudo, a glicose livre intracelular seria utilizada na síntese de glicogênio em resposta à modificação de volume celular. Em brânquias posteriores, não foi constatada alteração significativa da formação de 14CO2 e de síntese de 14C-glicogênio a partir de 14C-glicose em resposta ao estresse hiposmótico agudo, in vitro. Como, nas brânquias, a atividade de oxidação de glicose é bastante elevada, quando comparada àquela verificada nos outros tecidos, a atividade basal de oxidação seria suficiente para suprir a energia necessária ao processo osmorregulatório, durante o estresse osmótico agudo, in vitro. O estresse hiperosmótico agudo, in vitro, diminuiu, de forma marcante, a formação de 14CO2 a partir de glicose no hepatopâncreas e nas brânquias anteriores e posteriores, contudo, não alterou a oxidação no músculo. No hepatopâncreas de N. granulata, os resultados do presente trabalho sugerem que a resposta ao estresse hiperosmótico, in vitro, seria semelhante àquela verificada durante o choque hiposmótico: a diminuição da oxidação de glicose levaria a um redirecionamento deste substrato para a via de síntese de glicogênio. A submissão do tecido muscular ao estresse hiposmótico ou hiperosmótico agudo, in vitro, não alterou de forma significativa as vias do metabolismo da glicose investigadas no presente trabalho. Assim, as alterações de volume celular não seriam suficientes para ativar ou inibir as diferentes vias envolvidas na utilização da glicose neste tecido. Concluindo, a alteração do volume celular decorrente do estresse osmótico agudo, in vitro, alterou o fluxo de carbonos nos tecidos hepatopancreático e branquial de N. granulata, sugerindo a participação do metabolismo de carboidrato no processo regulatório de volume celular em tecidos de caranguejos.

A individualização do tratamento é o desafio atual no campo da reprodução assistida. Fatores prognósticos clássicos como idade ou testes de avaliação da reserva ovariana não são suficientes para predizer completamente a resposta das pacientes à indução da ovulação. Essa tese investiga se polimorfismos do receptor do Hormônio Folículo Estimulante ou do receptor do Hormônio Anti-Mulleriano influenciam na resposta ovariana à administração de uma dose padrão de gonadotrofinas para Fertilização In Vitro numa população caucasiana francesa altamente selecionada. Para avaliação correta da resposta à indução da ovulação, usamos parâmetros clássicos como número de oócitos recuperados ou embriões obtidos e também a relação entre o número de folículos que atingem a maturidade ao final do ciclo de indução e o número basal de folículos antrais – taxa de maturação folicular. Como resultados, apresentamos que a presença do alelo G para o receptor do Hormônio Anti Müllleriano está associado com um número menor de oócitos recuperados na punção ovariana. Já o polimorfismo do receptor do FSH Ser 680, apesar de associado com um nível de FSH basal mais elevado, não altera a taxa de maturação folicular. Esses dados podem ajudar, no futuro, a escolha correta do melhor protocolo de indução da ovulação assim como a dose de gonadotrofina a ser utilizada. / Tailoring for a single patient the use of controlled ovarian stimulation is the next challenge in the field of reproductive technology. Classic prognostic factors such as age or ovarian reserve tests have shown to be limited to predict patient’s response towards ovulation induction. This thesis searches to investigate if whether FSH or AMH receptor polymorphisms influence ovarian response to standard gonadotropins administration in a high selected French Caucasian population. In order to correctly evaluate the real ovarian response of each patient, we make use of classical parameters like the number of oocytes retrieved or number of embryos obtained at the end of an IVF cycle, and also the relationship between the number of follicles that reach maturity criteria and the total number of pre antral follicles – follicular output rate. Our results show that the presence of the G allele in the AMH receptor is associated with a lower number of oocytes retrieved. In addition, although FSHR Ser680 genotype is associated with higher basal FSH levels, this polymorphism as well as the Ala307 does not influence the follicular output rate. Our data can help to choose the best protocol and initial dose of gonadotrophin for ovulation induction in the future.

Este estudo foi realizado com o objetivo de 1) determinar a eficácia de duas temperaturas (370 C e 390 C) e três intervalos de tempo (48, 72 e 96h) comumente usados na maturação in vitro (MIV) de ovócitos caninos, 2) verificar o efeito de hormônios heterólogos: hormônio folículo estimulante (FSH) 0,5µg/ml, estradiol 20µg/ml e somatotropina humana (hST) 1µg/ml; e o efeito de proteínas: 0,4 % albumina sérica bovina (BSA), 10 % de soro de vaca em estro inativado (SVE), e 10 % soro de cadela em estro inativado (SCE) na maturação nuclear de ovócitos caninos, 3) observar a influência da condição reprodutiva das doadoras de ovários (folicular, diestro, anestro, piometra, e prenhez) sobre os índices de maturação in vitro ovocitária, 4) verificar a habilidade para fecundação in vitro de ovócitos coletados de fêmeas em diferentes estágios do ciclo estral, previamente maturados in vitro e adicionalmente, examinar sua capacidade de desenvolvimento embrionário in vitro. O meio de maturação usado nos experimentos foi TCM-199 suplementado com 25 mM Hepes/l (v/v) com 10 % de soro de vaca em estro inativado (SVE), 50 µg/ml de gentamicina, 2,2 mg/ml de bicarbonato de sódio, 22 µg/ml de ácido pirúvico, 1 µg/ml de estradiol, 0,5 µg/ml de FSH e 0,03 UI/ml de hCG. O meio de maturação era modificado de acordo com a proposta experimental apresentada. Os resultados do primeiro experimento não mostraram diferença estatística no índice de meiose de ovócitos maturados à 37oC ou à 39oC em quaisquer dos intervalos testados (48, 72, 96 horas), embora a proporção de ovócitos que alcançaram metáfase II a 37oC após 72 horas da maturação in vitro, mostrasse uma tendência estatística à significância (p = 0,064), quando comparada àquela dos ovócitos maturados à 39oC. Foi concluído que temperaturas de 37oC e 39oC são similares para maturação in vitro de ovócitos de cadelas. No segundo experimento deste estudo, os índices mais elevados (p < 0,05) de retomada da meiose após 72 horas de maturação in vitro foram obtidos, quando TCM 199 era suplementado com 0,4 % de BSA. Uma influência positiva sobre a aquisição de metáfase II (MII) foi observada com a suplementação de 1µg/ml de hST no meio de maturação. Ao contrário, ovócitos maturados em TCM 199 com 10 % de soro de cadela em estro não se desenvolveram até o estádio de MII. Os resultados deste experimento mostraram que a suplementação de proteínas e de hormônios ao TCM-199 não facilitam as etapas finais da maturação in vitro de ovócitos de cadelas.No terceiro experimento, os resultados de maturação dos ovócitos não mostraram diferença estatística na progressão do material nuclear até o estádio de MII entre os ovócitos provenientes de cadelas em várias condições reprodutivas (fase folicular: 5,4 %; diestro: 4,2 %; anestro: 4,4 %; piometra: 8,1 % e prenhez: 4,7 %). A retomada da meiose mostrou índices de 24,6 % na fase folicular, 19,6 % no diestro, 16,4 % no anestro, 37,1 % na piometra e 29,2 % na prenhez. Índices positivos e mais elevados de resíduo acima do valor esperado foram observados para as condições de piometra e de prenhez nos estádios de metáfase/anáfase I (MI/AI). Nossos resultados indicam que a maturação nuclear in vitro de ovócitos caninos não é influenciada pela condição reprodutiva in vivo da fêmea no momento da coleta ovariana. No experimento de fecundação in vitro (FIV), 888 ovócitos selecionados através de sua qualidade morfológica superior foram distribuídos em 3 grupos de acordo com o estágio do ciclo estral da doadora em: a) folicular, b) anestro, c) luteal . Após período de 48 horas de maturação a 37oC em TCM 199 suplementado com 25 mM Hepes/l (v/v), com 10 % soro de vaca em estro inativado (SVE), 50 µg/ml de gentamicina, 2,2 mg/ml de bicarbonato de sódio, 22 µg/ml de ácido pirúvico, 20 µg/ml de estradiol, 0,5 µg/ml de FSH, 0,03 UI/ml hCG e 1 µg/ml de hST, os ovócitos eram fecundados in vitro (2x106 espermatozóides/ml) por um período de 24 horas. A percentagem de ovócitos nucleados desenvolvendo-se em embriões foi de 10,1 % (27/ 267). O índice de clivagem (2-8 células) após cinco dias da FIV foi similar nas fases reprodutivas (folicular, anestro, e luteal). Contudo, o índice geral de fecundação foi superior nos ovócitos oriundos de cadelas nos estágios folicular (42,4 %) e anestro do ciclo (34,3 %) comparativamente àqueles provenientes da fase luteal (18,6 %) (p < 0,001). Além disso, foi verificada influência da fase folicular sobre o desenvolvimento de pronúcleos, com os índices nesta fase (24,2 %) sendo estatisticamente diferentes daqueles observados no anestro e na fase luteal (9,6 % e 3,7 %, respectivamente) (p < 0,004). Não foi estabelecida correlação entre a proporção de espermatozóides capacitados ou com reação acrossômica e formação pronuclear e/ou percentagem de clivagem. Em resumo, conclui-se que: a) ovócitos caninos podem ser maturados in vitro de forma similar às temperaturas de 39oC e 37o. b) a adição de hormônios (FSH, estradiol, hST) e proteínas (BSA, SVE, SCE) ao meio TCM 199 não eleva os índices de maturação nuclear até o estádio de MII de ovócitos caninos maturados in vitro. c) em cães, a seleção de ovócitos com base na coleta dentro de um estágio específico do ciclo estral não deve ser usada para prever índices de meiose ou habilidade para desenvolvimento embrionário in vitro. d) ovócitos caninos maturados, fecundados e cultivados in vitro podem se desenvolver a zigotos com até 8 células.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2016. / Submitted by Camila Duarte (camiladias@bce.unb.br) on 2016-09-19T16:54:13Z No. of bitstreams: 1 2016_JanicedeMirandaVasconcelosVilela.pdf: 3616352 bytes, checksum: 9412786c69d298726d117345dce621af (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-12-02T14:03:49Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_JanicedeMirandaVasconcelosVilela.pdf: 3616352 bytes, checksum: 9412786c69d298726d117345dce621af (MD5) / Made available in DSpace on 2016-12-02T14:03:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_JanicedeMirandaVasconcelosVilela.pdf: 3616352 bytes, checksum: 9412786c69d298726d117345dce621af (MD5) / O objetivo deste trabalho foi testar a viabilidade de utilização das técnicas de cultivo in vitro, cultivo em membrana corioalantoica de embriões de galinha (CAM) e autotransplante heterotópico para avaliação da do tecido ovariano de gatas. Na primeira etapa, foi comparado o cultivo de tecido ovariano fresco de gatas in vitro e em CAM para determinar se estes métodos seriam adequados para avaliar a eficácia da criopreservação de tecido ovariano. Para isso, ovários de 8 gatas foram cortados em cubos de 3 mm3, cultivados in vitro e em CAM por até 5 dias. A porcentagem de folículos primordiais na população de folículos morfologicamente normais (FMN) foi sempre maior que 80%, com exceção do dia 3 de cultivo em CAM. Não foi observado proliferação celular ao longo do cultivo. Adicionalmente, ambos os métodos mostraram um aumento do tecido conjuntivo a cada dia que o tecido permaneceu em cultivo. Foi observado vascularização durante o cultivo em CAM, porém sem associação com a viabilidade folicular. Nenhum dos sistemas foi capaz de promover crescimento e/ou desenvolvimento folicular. O autotransplante heterotópico já se mostrou eficiente em tecido ovariano fresco de gatas, por isso, na segunda etapa do experimento, este método foi utilizado para avaliar o protocolo de criopreservação de tecido ovariano felino. Quatro gatas foram submetidas a ovariohisterectomia e os ovários foram cortados e criopreservados. Após uma semana, foram autotransplantados para o tecido subcutâneo da região dorsal do pescoço e retirados após 7, 14, 28, 49 e 63 dias. A porcentagem de folículos morfologicamente normais primordiais e em crescimento nas amostras de tecido fresco (Grupo Controle) foram de 87,8% e 96,7%, respectivamente, e imediatamente após o descongelamento (Controle Crio) de 73,7% e 100%, respectivamente, e não foram significativamente diferentes entre si. Folículos em crescimento quase não foram vistos após o transplante. Nenhum FMN foi encontrado a partir de 49 dias de transplante. Nos fragmentos de Controle e Controle Crio, a maioria dos folículos (primordiais e em crescimento) apresentavam proliferação das células da granulosa. Dois folículos antrais foram encontrados aos 28 dias em uma das gatas e se mostraram vivos e proliferativos. Houve um aumento das fibras colágenas a partir dos 7 dias de transplante. A vascularização do tecido foi observada após 7 dias de transplante, e vasos sanguíneos calibrosos foram facilmente observados nos dias 49 e 63 após transplante. Houve uma grande perda folicular após o transplante de tecido ovariano de gatas previamente criopreservado. Em conclusão, o cultivo em CAM não parece promissor para tecido ovariano de felinos, mas o cultivo in vitro pode ser otimizado para melhor desenvolvimento dos folículos ovarianos de gatas e para avaliação do tecido após criopreservação. Os transplantes permanecem como a alternativa mais viável para avaliar a criopreservação. No entanto, o presente estudo mostrou que a sobrevivência folicular após criopreservação e transplante foi muito baixa, provavelmente devido à junção das injúrias causadas pela criopreservação com os danos provocados pelo período de isquemia-reperfusão do tecido nos primeiros dias de transplante. Desta forma, as técnicas de transplante e de criopreservação também devem ser otimizadas. ________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The aim of this study was to test the viability of in vitro culture (IVC), culture in the chorioallantoic membrane of chick embryos (CAM) and heterotopic autotransplantation techniques for evaluation of cat ovarian tissue. In the first stage, we compared the culture of fresh cat ovarian tissue in vitro and in CAM to determine if those methods would be suitable to evaluate the efficacy of cryopreservation of ovarian tissue. For this, ovaries from 8 queens were cut in 3 mm³ cubes, and cultured in vitro and in CAM for up to 5 days. The percentage of primordial follicles in the population of morphologically normal follicles (MNF) was always higher than 80%, with the exception of day 3 in the CAM. Cellular proliferation was not observed in culture. Additionally, both methods showed an increase in connective tissue during culture. Vascularization was observed during culture in CAM, however, there was no association with follicular viability. None of the systems were capable of promoting follicular growth and/or development. Heterotopic autotransplantation has already been demonstrated to be effective for fresh cat ovarian tissue, thus, in the second stage of this study, this method was used to evaluate ovarian tissue cryopreservation. Four queens were subjected to ovariohysterectomy and the ovaries were cut and cryopreserved. After one week, they were thawed and autografted to the subcutaneous tissue of the dorsal neck region and removed after 7, 14, 28, 49 and 63 days. The percentage of primordial and growing MNF in fresh tissue samples (Control) were 87.8% and 96.7%, respectively, and immediately after thawing (Cryo Control) were 73.7% and 96.7%, respectively, and they were not significantly different. Growing follicles were hardly seen after grafting. No MNF were found after 49 days of transplantation. In Control and Cryo Control fragments, most of the follicles (primordial and growing) presented granulosa cell proliferation. Two antral follicles were found on day 28 post-transplantation in one of the queens and they were alive and proliferative. There was an increase in connective fibers from day 7 of transplantation on. Vascularization of the tissue was observed after 7 days of grafting and calibrous blood vessels were easily observed in days 49 and 63 post-grafting. There was a great follicular loss after cryopreserved ovarian tissue transplantation. In conclusion, culture in CAM does not seem promising for cat ovarian tissue, but IVC may be optimized for better cat follicle development and evaluation of the tissue after cryopreservation. Transplantation remains the most viable alternative to evaluate cryopreservation. However, this study showed that follicular survival after cryopreservation and grafting was low, probably due to the combination of injuries caused by cryopreservation with the damages caused by ischemia-reperfusion period in the early days of the tissue transplant. Thus, the techniques of cryopreservation and transplantation must also be optimized.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2015. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2015-11-19T17:18:56Z No. of bitstreams: 1 2015_LauraVanessaMourãoGulart.pdf: 1266298 bytes, checksum: cfa73ee576ff7b692bad82afcbbcaa82 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2015-12-30T14:37:24Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_LauraVanessaMourãoGulart.pdf: 1266298 bytes, checksum: cfa73ee576ff7b692bad82afcbbcaa82 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-12-30T14:37:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_LauraVanessaMourãoGulart.pdf: 1266298 bytes, checksum: cfa73ee576ff7b692bad82afcbbcaa82 (MD5) / A produção de embriões in vitro é uma biotécnica importante para a reprodução e constitui-se como ferramenta valiosa para estudos de interações de gametas e/ou embriões e, com isso, torna-se cada vez mais excelente modelo não somente para averiguações sobre aspectos sanitários, como também relacionados a processos tóxicos e interações presentes no ambiente in vitro. O objetivo deste estudo foi testar e analisar o efeito dos diferentes meios de maturação oocitária in vitro (MEMB e MEMO) associados ou não FSH em concentrações de 1 e 10ng/ml, sobre a produção de blastocistos bovinos e a expressão de genes relacionados a competência e metabolismo embrionário (GLUT1, GLUT4, PDH, G6PDH, GAPDH, COX2, CDX, HSP70, BAX e BCL2). Em todos os experimentos, oócitos foram obtidos de abatedouro, coletados de vacas adultas e maturados em meio controle (TCM199) e meios testes (MEMO, MEMO+1FSH, MEMO+10FSH, MEMB, MEMB+1FSH, MEMB+10FSH). No Experimento 1, os oócitos foram fertilizados e cultivados até o estágio de blastocisto, avaliando e correlacionando a adição de FSH com 1ng/mL ou 10ng/mL nos meios MEMB e MEMO. No experimento 2, avaliou-se a expressão dos genes GLUT1, GLUT4, PDH, G6PDH, GAPDH, COX2, CDX, HSP70, BAX e BCL2 em embriões oriundos da maturação em meios diferentes suplementados ou não com FSH (1 ou 10ng/mL). No experimento 1, os resultados demonstraram que a dose de FSH 10ng/mL no meio MEMO+10FSH diminui a produção de embriões; e nos meios MEMO e MEMO+1FSH a produção de embriões é a mesma. Nos meios MEMB com 1FSH e 10FSH não houve diferença na produção de embriões. Já no meio MEMB sem FSH a produção de embriões foi igual ao do grupo controle TCM199. A expressão de GLUT4, GLUT1, PDH, COX2 e BAX em embriões maturados em meios de maturação controle e nos grupos de meios definidos não foi diferente. O gene G6PDH foi expresso em baixa abundância nos meios TCM199, MEMB+FSH e MEMO. Nos meios MEMB e MEMO+FSH ocorre um aumento do gene G6PDH, sendo estes semelhantes. A abundância de GAPDH nos meios TCM199 e MEMB+FSH é menor; e nos meios MEMB, MEMO e MEMO+FSH é maior. Nos genes HSP70 não há significância entre MEMB e MEMB+FSH, e sim entre MEMO e MEMO+FSH. Nos genes CDX apenas o MEMB esta elevado, o MEMO não é detectado, e no MEMO+FSH foi pouco expresso. Em relação ao BCL2 o TCM199 foi o mais abundantemente expresso e semelhante aos meios MEMO e MEMO+FSH. Já com os meios MEMB e MEMB+FSH são poucos expressos. Concluiu-se que a produção de embriões no meio MEMO foi menor que nos outros tratamentos; e o meio MEMB produz a mesma taxa de embriões que o grupo controle. A adição de FSH aos meios de maturação diminui a produção de embriões no MEMB, e leva, na maioria das vezes baixa expressão de marcadores de competência. / The production of in vitro embryos is an important biotechnical technique for reproduction and it constitutes a valuable tool for studies of interactions of gametes and / or embryos and, therefore, it becomes increasingly an excellent model not only for check ups concerning sanitary aspects, but also when it is related to toxic processes and actual interactions in the in vitro environment. The objective of this study was to test and analyze the effect of different oocyte maturation mediums in vitro (MEMB and MEMO) either associated or not FSH at concentrations of 1 and 10 ng / ml, on the production of bovine blastocysts and the expression of genes related to competence and embryonic metabolism (GLUT1, GLUT4, PDH, G6PDH, GAPDH, COX2, CDX, HSP70, BAX and BCL2). In all experiments, oocytes were obtained from a slaughterhouse, collected from adult cows and matured in control medium (TCM199) and medium tests (MEMO MEMO + 1FSH, MEMO + 10FSH, MEMB, MEMB + 1FSH, MEMB + 10FSH). In Experiment 1, the oocytes were fertilized and cultured up to the blastocyst stage, assessing and correlating the addition of FSH with 1 ng / ml or 10 ng / mL in MEMB and MEMO mediums. In experiment 2, the expression of GLUT1 gene, GLUT4, PDH, G6PDH, GAPDH, COX2, CDX, HSP70, BAX and BCL2 was evaluated in embryos from maturation in different medium either supplemented or not with FSH (1 or 10 ng / mL) . In experiment 1, the results demonstrated that the FSH dose of 10 ng / ml in the medium MEMO + 10FSH decreases the production of embryos; and in the mediums MEMO and MEMO + 1FSH the production of embryos is the same. In the MEMB medium with 1FSH and 10FSH there was no difference in embryo production. But in the MEMB medium without FSH, the embryo production was the same as the one in the TCM199 control group. The expression of GLUT4, GLUT1, PDH, COX2 and BAX in embryos matured in control maturation medium and defined medium groups was no different. The G6PDH gene was expressed in low abundance in TCM199 MB + FSH and MEMO mediums. In the MEMB and MEM + FSH mediums, an increase of the G6PDH gene happens, and they are similar. The abundance of GAPDH in TCM199 and MEMB + FSH mediums is lower; and in the MEMB, MEMO and MEMO + FSH mediums is higher. In the HSP70 genes there is no significance between MEMB and MEMB + FSH, but there is some difference between MEMO and MEMO + FSH. In the CDX genes, only the MEMB is high, MEMO is not detected, and the MEMO + FSH was little expressed. Concerning the BCL2, the TCM199 was the most expressed and it was similar to the MEMO and MEMO + FSH mediums. But with the MEMB and MEMB + FSH mediums, they are little expressed. It was concluded that the production of embryos in the MEM medium was lower than the other treatments; and the MEMB medium produces the same rate of embryos than that of the control group. The addition of FSH to the maturation mediums decreases the production of embryos in the MEMB and leads in most cases to low expression of competence markers.