MELO, Priscila Bezerra dos Santos. Indução à embriogênese somática e identificação de marcadores ISSR em antúrio. 2016. 98 f. Dissertação (Mestrado em Fitotecnia)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2016. / Submitted by Anderson Silva Pereira (anderson.pereiraaa@gmail.com) on 2017-01-09T18:32:24Z No. of bitstreams: 1 2016_dis_pbsmelo.pdf: 1915586 bytes, checksum: ca8ba64498bc085612866056110e7aef (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2017-01-11T17:14:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_dis_pbsmelo.pdf: 1915586 bytes, checksum: ca8ba64498bc085612866056110e7aef (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-11T17:14:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_dis_pbsmelo.pdf: 1915586 bytes, checksum: ca8ba64498bc085612866056110e7aef (MD5) Previous issue date: 2016 / Anthurium is an important ornamental species for floriculture's agribusiness. Thus, it is very important to ensure the success of its cultivation. The use of biotechnology allows the development of effective techniques for in vitro propagation. One of these techniques is the somatic embryogenesis. However, beyond these efforts, another technique that can effectively contribute to the success of Anthurium cultivation, is the characterization of anthurium's cultivars, by means of molecular markers. Therefore, the study was divided into two experiments. Experiment 1: The objective was to establish an induction protocol for somatic embryogenesis for the anthurium's cultivars Jureia and Luau, using nodal segments as explants. It was studied the effect of the interaction among the factors cultivar, growth regulator type and concentration on oxidation (%) and formation of embryogenic calli (%). The scanning electron microscopy (SEM) was used to identify whether the structures formed from the explants showed embryogenic characteristics. The evaluations about oxidation showed that Jureia is the most sensitive cultivar, and that the medium added with NAA is more prone to oxidation. As for the formation of embryogenic calli, it was found that Luau has more embryogenic potential and it was established the following protocol for induction of somatic embryogenesis for the two studied cultivars: nodal segments must be maintained for 75 days, in the dark, in the medium ESA (Pierik 1976 modified) supplemented with 7.5 mM of NAA. Experiment 2: The objective was the selection of ISSR markers for molecular characterization of anthurium's cultivars Sublime, Luau, Jureia and Maré, using leaf samples of in vitro established plants, from indirect organogenesis, and samples of embryogenic calli. The DNA extraction was made, showing a genetic material of good quality. The PCR of the 18 ISSR markers was made and the reaction products were visualized by electrophoresis. The revealed fragments in the agarose gel were transformed into binary data [1- presence of band; 0 - absence of band], allowing the classification of the samples in terms of genetic distance in a dendrogram. It was found that all the ISSR used showed polymorphism, being effective to characterization of the anthurium's samples studied. Cultivar-specific markers were identified. It was found that Sublime is the cultivar genetically most stable and Maré the most unstable. These results provide new perspectives for the in vitro propagation, and are useful for breeding and protection of the studied anthurium's cultivars. / O antúrio é uma importante espécie ornamental para o agronegócio da floricultura. Assim, é importante garantir o sucesso de seu cultivo. O uso da biotecnologia permite o desenvolvimento de técnicas eficientes de propagação in vitro. Uma dessas técnicas é a embriogênese somática. Porém, além destes esforços, uma das técnicas que pode contribuir efetivamente para o sucesso do cultivo do antúrio é a caracterização das cultivares da espécie, por meio de marcadores moleculares. Assim, o estudo foi dividido em dois experimentos. Experimento 1: Objetivou-se estabelecer um protocolo de indução à embriogênese somática para as cultivares de antúrio Jureia e Luau, utilizando como explantes segmentos nodais. Estudou-se o efeito da interação entre os fatores cultivar, tipo e concentração do regulador de crescimento sobre a oxidação (%) e formação de calos embriogênicos (%). Utilizou-se microscopia eletrônica de varredura (MEV) para identificar se as estruturas formadas a partir dos explantes apresentavam características embriogênicas. Constatou-se que a cultivar Jureia é mais sensível e o meio adicionado de ANA mais propenso à oxidação. Quanto à formação de calos embriogênicos, constatou-se que a cultivar Luau tem maior potencial embriogênico e estabeleceu-se o seguinte protocolo de indução à embriogênese somática, para as duas cultivares estudadas: segmentos nodais devem permanecer 75 dias, no escuro, em meio ESA (Pierik 1976, modificado) suplementado com 7,5 μM de ANA. Experimento 2: Objetivou-se a seleção de marcadores ISSR para caracterização molecular das cultivares de antúrio Sublime, Luau, Jureia e Maré, a partir de amostras de folhas oriundas de plantas estabelecidas in vitro, obtidas de organogênese indireta, e de amostras de calos embriogênicos. Foi realizada a extração de DNA das amostras coletadas, revelando DNA de boa qualidade. Foi feita a PCR de18 marcadores ISSR e os produtos da reação foram visualizados por eletroforese. Os fragmentos revelados no gel de agarose foram transformados em dados binários [1– presença de banda; 0 – ausência de banda], possibilitando agrupar as amostras em termos de distância genética em um dendrograma. Constatou-se que os marcadores ISSR utilizados apresentaram polimorfismo, sendo eficientes para caracterizar as amostras de antúrio estudadas. Foram identificados marcadores cultivar-específicos. Sublime revelou-se como a cultivar geneticamente mais estável, e Maré, como a mais instável. Estes resultados proporcionam novas perspectivas para a propagação in vitro, bem como são úteis para o melhoramento genético e proteção da identidade genética das cultivares de antúrio estudadas.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-05-18T16:45:23Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1608119 bytes, checksum: 4bfe7cf50a62d7c65e4e1a64b88c1ac7 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-18T16:45:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1608119 bytes, checksum: 4bfe7cf50a62d7c65e4e1a64b88c1ac7 (MD5) Previous issue date: 2012-03-08 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Plantas do gênero Pfaffia estão entre as principais espécies medicinais comercializadas no Brasil, sendo suas propriedades medicinais atribuídas a substâncias presentes nas raízes. É grande a necessidade o desenvolvimento de protocolos que viabilizem a propagação em larga escala dessa espécie para garantia de suprimento de material propagativo, em qualidade e quantidade. Sendo assim, esse trabalho objetivou o desenvolvimento de protocolos para a produção rápida e em larga escala da espécie e promover a tuberização das raízes de plantas cultivadas in vitro, uma vez que esse é o principal órgão comercializado. Para a promoção de multibrotações axilares in vitro, segmentos nodais dos acessos 04 e 13 foram inoculados em frascos com meio MS acrescido com 0,5 mg L -1 de BA + ANA, em diferentes fontes de carbono (0,1M, 0,2 M ou 0,3 M de glicose ou sacarose), por 30 dias de cultivo. Foi avaliado o número de brotos produzidos, sendo observado a formação e coloração dos calos. Para viabilização da produção in vitro de 20-E, segmentos nodais dos acessos 4 e 13 foram inoculados em recipientes tipo Magentas ® contendo meio MS com diferentes fontes de carbono (glicose a 0,1 M e 0,2 M; sacarose a 0,1 M ou 0,2 M; a combinação de sacarose + glicose 0,1 M ou 0,2 M) e sem fonte de carbono (controle), e ensacados em saco plástico com filtro bacteriológico, por 30 dias de cultivo. Foram avaliados o comprimento médio das plantas, a massa seca da parte aérea e raízes, verificando-se a porcentagem de 20-E na massa seca de folhas e raízes nos diferentes tratamentos e realizou-se analise mocromorfometrica das folhas. Para promoção da tuberização in vitro, segmentos nodais dos acessos 22 e 43 foram inoculados em frascos de vidro contendo meio MS acrescido com diferentes combinação de regulador de crescimento (0,5 mg.L -1 de BA; 0,5 BA + AIB; 0,5 BA + 1,0 DE AIB; 0,5 AIB) e sem regulador de crescimento (controle) por 10 dias. Após, os explantes foram transferidos para frascos contendo 0,2 M de sacarose por 30 dias de cultivo. Foram avaliados a porcentagem de cobertura do fundo do frasco por raízes, massa seca da parte aérea e raízes. No experimento de multibrotações, foi observada a formação de calos na base dos explantes em todos os tratamentos, sendo a coloração dos calos do acesso 13 variando de branco a verde claro e dos brotos de verde claro a róseo. No acesso 4, a coloração dos calos variou de branco a verde escuro arroxeado. A característica de formação de multibrotações se mostrou genótipo-dependente, sendo o acesso 04 superior ao acesso 13 quando cultivado em glicose ou sacarose a 0,1 M (35 e 43 brotos/explantes). Para o teor de 20-E também foram observados efeitos significativos entre os acessos e as fontes de carbono, sendo do acesso 13 as maiores médias tanto para raízes quanto folhas (1,02 e 1,07%). As maiores médias para o comprimento da planta, massa seca das raízes e parte aérea foi observada para o acesso 13. Na análise micromorfométrica das folhas em ambas as faces, o número de células epidérmicas, estômatos, e densidade estomática foram superiores no acesso 13 em relação ao acesso 04. O protocolo proposto para indução de raízes tuberiformes foi ineficaz, entretanto, plantas do acesso 43 apresentaram maior massa seca da parte aérea em relação ao acesso 22 e sendo dos tratamentos com 0,5 mg.L -1 de BA as maiores médias para massa seca da parte aérea e raízes. Não houve efeito significativo nos acessos e reguladores de crescimento para porcentagem de enraizamento e dos acessos para massa seca das raízes. Em conformidade com os resultados, esses servirão para auxilio de pesquisas futuras sobre Pfaffia glomerata. / Plants of the genus Pfaffia are among the most traded medicinal species in Brazil whose medicinal properties are attributed to substances present in the roots. There is a great need for developing protocols to enable the large-scale propagation of this species and assure supply of large amounts of high quality propagation material. Thus, this study aimed to develop protocols for the rapid and large scale production of Pfaffia species and promote root tuberization of plants grown in vitro, since this is the main traded part. For in vitro axillary bud proliferation, nodal segments of the accessions 4 and 13 were inoculated in Magenta ® boxes containing MS medium supplemented with 0.5 mg L -1 BA + NAA, in different carbon sources (0.1 M, 0.2 M or 0.3 M of glucose or sucrose), for 30 days in culture. The number of shoots produced was recorded and the formation and color of calli were evaluated. To promote in vitro production of 20-E, nodal segments of accessions 4 and 13 were inoculated into Magenta ® boxes containing MS medium with different carbon sources (0.1 M and 0.2 M glucose; 0.1 M or 0.2 M sucrose; and the combination of sucrose + 0.1 M or 0.2 M glucose) and a control without carbon source, and bagged in plastic bags with bacteriological filter, for 30 days of culture. The mean length of plants, dry mass of shoots and roots, the percentage of 20-E in the dry mass of leaves and roots of the different treatments were evaluated and the micro-morphometric analysis of leaves was performed. To promote the tuberization in vitro of roots, nodal segments of accessions 22 and 43 access were inoculated in glass jars containing MS medium supplemented with different combinations of growth regulators (0.5 mg l -1 BA; 0.5 BA + AIB; 0.5 BA + 1.0 AIB; 0.5 AIB) and without growth regulators (control), for 10 days. The explants were then transferred to jars containing 0.2 M sucrose for 30 days of culture. The percentage of the bottom of the jar that was covered by roots, the dry mass of shoots and dry mass of roots were evaluated. In the experiment of axillary bud proliferation, there was formation of callus at the base of the explants in all treatments, and the color of the calli of accession 13 ranged from white to light green and the color of shoots from light green to pinkish. For accession 4, the color of the calli varied from white to dark green and purple. The characteristic axillary bud proliferation proved genotype-dependent: accession 4 was superior to accession 13 when grown on glucose or sucrose 0.1 M (35 and 43 shoots/explant). The content of E-20 also showed significant effects between the accessions and the carbon sources: accession 13 showed the highest means for both roots and leaves (1.02 and 1.07%). The highest means for plant height, dry mass of roots and shoots were recorded for accession 13. In the micromorphometric analysis of both sides of the leaves, the number of epidermal cells, stomata, and stomatal density were higher in the accession 13 compared with the accession 04. The protocol proposed for tuber induction was ineffective, however, plants of accession 43 had higher shoot dry mass in relation to accession 22. The treatments with 0.5 mg.L -1 BA provided the highest means for dry mass of shoots and roots. There was neither significant effect of accession and growth regulator on percentage of rooting nor effect of accession on root dry mass. The results of this study will serve to guide future research on Pfaffia glomerata. / Dissertação antiga

LOPES NETO, José Joaquim. Bioacessibilidade e biodisponibilidade de compostos fenólicos de sementes de Triplaris Gardneriana Wedd (Polygonaceae). 2017. 95 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica)- Universidade Federal do Ceará, 2017. / Submitted by Weslayne Nunes de Sales (weslaynesales@ufc.br) on 2017-07-10T12:20:53Z No. of bitstreams: 1 2017_dis_jjlopesneto.pdf: 1657114 bytes, checksum: 3ec381c68cd046900e25b007ed35226a (MD5) / Approved for entry into archive by Weslayne Nunes de Sales (weslaynesales@ufc.br) on 2017-07-11T11:56:07Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_dis_jjlopesneto.pdf: 1657114 bytes, checksum: 3ec381c68cd046900e25b007ed35226a (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-11T11:56:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_dis_jjlopesneto.pdf: 1657114 bytes, checksum: 3ec381c68cd046900e25b007ed35226a (MD5) Previous issue date: 2017 / Triplaris gardneriana Wedd is a plant species from Brazilian semiarid region with seeds rich in phenolic compounds and high antioxidant capacity.The consumption of fruits and vegetables has been associated to low incidence of chronic diseases caused by oxidative stress. Among the food components capable of combating excess free radicals arethe phenolic compounds, with antioxidant capacity, which have been extensively studied. However, the total quantity of these substances present in foods does not necessarily reflect the bioactive amount absorbed and metabolized by the body. In this context, the present work aimed the development of an ethanolic extract obtained from the seeds of T. gardneriana (EETg), and from this, to evaluate its antioxidant activity through different methodologies, to investigate the bioaccessibility of EETg by determination of phenolic composition before and after in vitro digestion as well as to estimate its indirect bioavailability by chemical analysis of plasma and urine in rodents after oral administration. In general, EETg presented levels of antioxidant activity by DPPH, ABTS.+, FRAP and TBARS tests comparable to those described in specialized literature. The bioaccessibility indexes of phenolic compounds in EETg were 48.65 and 69.28% in the presence and absence of enzymes, respectively. Among the identified phenolics classes, flavonoids, represented by galloylated procyanidins, proved to be more bioaccessible (81.48 and 96.29% in the post-intestinal phase with and without enzymes, respectively). The oral administration in Wistar rats resulted in a significant decrease in plasma total antioxidant capacity (TAC) by FRAP assay 4 h after beginning the experiment. As to urine analysis, an increase in TAC by DPPH and FRAP was observed from 1 and 4 h after administration, respectively. UPLC-QTOF analysis of urine detected 2 metabolites originated from the degradation of phenolic compounds: hippuric acid and phenylacetil glycine. These results suggest that phenolic compounds in T. gardneriana, despite their antioxidant potential, are unstable under gastrointestinal conditions, being flavonoids the components with higher bioaccessibility; besides that, they showed limited bioavailability due to their rapid biotransformation and urinary elimination. / Triplaris gardneriana Wedd é uma espécie vegetal do semiárido brasileiro com sementes ricas em compostos fenólicos e alta capacidade antioxidante. O consumo de frutas e vegetais tem sido associado à baixa incidência de doenças crônicas causadas por estresse oxidativo. Dentre os componentes alimentares capazes de combater o excesso de radicais livres, os compostos fenólicos, de caráter antioxidante, têm sido bastante estudados.Contudo, a quantidade total destas substâncias presente nos alimentos não reflete necessariamente a porção bioativa absorvida e metabolizada pelo organismo. Neste contexto, o presente trabalho objetivou o desenvolvimento de um extrato etanólico obtido a partir das sementes de T. gardneriana(EETg),e a partir deste,caracterizar sua composição fenólica, avaliar sua atividade antioxidante através de diferentes metodologias, além deinvestigar a bioacessibilidade in vitro dos polifenóis presentes em EETg após digestão gastrointestinal simulada e estimar a biodisponibilidade indireta dos mesmos a partir da análise química do plasma e urina em roedores após sua administração oral. Em linhas gerais, EETg apresentou níveis de atividade antioxidante pelos ensaios DPPH, ABTS.+, FRAP e TBARS comparáveis àqueles descritos naliteratura especializada. Os índices de bioacessibilidade de compostos fenólicos em EETg foram de 48,65 e 69,28% na presença e ausência de enzimas, respectivamente. Dentre as classes fenólicas identificadas, os flavonoides, representados porprocianidinas acrescidas de grupos galoil, mostraram-se mais bioacessíveis (81,48 e 96,29% na fase pós-intestinal com e sem enzimas, respectivamente). A administração oral de EETg em ratos Wistar resultou em uma significativa diminuição da capacidade antioxidante total (CAT) do plasma pelo ensaio FRAP 4 h após o início do experimento. Para as amostras de urina, um aumento naCAT pelos testes DPPH e FRAP foi observado a partir de 1 e 4 h após a administração, respectivamente. Análises por UPLC-QTOF daurina detectou 2 metabólitos oriundos da degradação de compostos fenólicos: ácido hipúrico e fenilacetil glicina. Estes resultados sugerem que os compostos fenólicos deT. gardneriana, apesar do seu potencial antioxidante, são instáveis em condições gastrointestinais, sendo flavonoides os componentes com maior bioacessibilidade. Além disto, mostraram biodisponibilidade limitada devido à sua rápida biotransformação e eliminação urinária.

Introdução A Fertilização in Vitro (FIV) é o principal tratamento para casais inférteis e tem como etapa inicial o processo de indução da ovulação. Os fármacos utilizados para o estímulo ovariano contêm variadas combinações de hormônios (FSH, LH e hCG). Os mais utilizados no nosso meio são a gonadotrofina menopausal humana (hMG) e hormônio folículo estimulante recombinante (FSHr). Eles diferem na sua composição, tendo o hMG os hormônios FSH e LH em iguais proporções além de uma pequena parcela de hCG, enquanto o FSHr contém apenas o FSH. Sabe-se que a interação do LH e do FSH é fundamental para o ciclo ovulatório espontâneo, no entanto, já se comprovou a efetividade do rFSH na estimulação ovariana da FIV. Os estudos são controversos em relação a taxas de gestação e outros desfechos relacionados ao estímulo ovariano, como dose de gonadotrofinas utilizadas, número de oócitos capturados, número de embriões e qualidade embrionária. Grande parte dos ensaios clínicos, publicados até então, pesquisou as diferenças entre essas duas medicações tendo como desfecho principal a taxa de gravidez ou o número de nascidos vivos após a FIV. No entanto, analisando com cuidado, vemos que a grande maioria desses estudos não recrutou um número suficiente de pacientes para detectar uma diferença estatisticamente significativa nesses desfechos. Ainda, os poucos estudos que arrolaram um número importante de pacientes se declararam patrocinados pela indústria farmacêutica, o que torna a análise de seus resultados prejudicada por um importante conflito de interesse. Objetivo Comparar as gonadotrofinas rFSH e hMG no protocolo de fertilização in vitro com o antagonista do GnRH tendo como desfecho principal a qualidade embrionária. Os desfechos secundários incluídos foram número e tamanho de folículos ao final da indução da ovulação, dose de gonadotrofina utilizada, número de oócitos capturados, número de embriões e taxas de gestação. Método Foi realizado um estudo randomizado onde foram recrutadas 168 mulheres com indicação de FIV. Foram randomizadas 85 pacientes para o uso de FSHr e 83 para o uso de hMG. Os embriões foram transferidos entre o terceiro e o quinto dia após a fertilização in vitro. O escore de graduação embrionário (GES) foi realizado através de avaliação de todos os embriões por 3 vezes, nos tempos: 16 – 18 horas, 25 – 27 horas e 64 – 67 horas, sempre pelo mesmo embriologista. Para pontuação do GES, avaliaram-se: citoplasma, morfologia pronuclear, fragmentação, alinhamento nucleolar, posição do corpo polar, número de blastômeros/morfologia e simetria. Resultados O escore total embrionário não diferiu entre os dois grupos (214.01 x 170.43, rFSH e hMG respectivamente, P = 0.13) , no entanto encontramos um escore de melhor embrião significativamente mais alto no grupo do FSHr (77,33 x 65,07 P = 0,03). Também foi estatisticamente maior o número de embriões nesse mesmo grupo (4,17 x 3,26 p=0,04). Não houve diferença na dose de gonadotrofinas, no número de folículos ao final da indução, no número de oócitos capturados ou nas taxas de gestação. Conclusão Concluímos que o tipo de gonadotrofina utilizada para o estímulo ovariano pode ter um impacto na qualidade embrionária. Esse achado pode ser relacionado à presença do LH, hipótese que deve ser explorada em novos estudos, para melhor compreensão e otimização do estímulo ovariano na FIV.

Tesis

In vitro experiments were conducted using leaf explants from organically grown Petunia x hybrida &lsquo`Blue Picotee&rsquo' cultured on media prepared from organic hydroponic solutions, Murashigi and Skoog (MS) vitamins and benzyladenine. Explants cultured on MS regenerated the best. Explants cultured on Aqua Power produced shoots, had higher weights and lower necrosis than on other organic media. The Aqua Power results were not repeatable. In testing Aqua Power, Earth Juice and Peaceful Valley at ⅓, ⅔ and full concentrations, the explants on Aqua Power were 100% necrotic at all concentrations. Explants on Earth Juice and Peaceful Valley were chlorotic but had the best growth, measured by weight and necrosis, at the lowest concentration. Shoot organogenesis occurred on explants at all concentrations on Peaceful Valley. When using liquid petunia extract media, no shoots regenerated. On these media, the highest explant weights were with 7.5 g&middotL-1 agar and necrosis decreased as agar concentration increased.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:35Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-10-27. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:26:28Z : No. of bitstreams: 1 Publico-345a.pdf: 1816571 bytes, checksum: 3cd8170b13b85dc5e511b312040bc45b (MD5). Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:26:28Z : No. of bitstreams: 2 Publico-345a.pdf: 1816571 bytes, checksum: 3cd8170b13b85dc5e511b312040bc45b (MD5) Publico-345b.pdf: 1901908 bytes, checksum: 3ac1cf59ef395016dc0b44813e1d9c3f (MD5) / Introducao: Os fatores envolvidos no desenvolvimento e maturacao folicular, assim como no desenvolvimento embrionario podem ser determinantes das causas da infertilidade. A qualidade do oocito e grau de maturacao sao diretamente dependentes do microambiente folicular, e afetam as etapas subsequentes desde a fertilizacao ate o desenvolvimento embrionario. A avaliacao dos componentes do fluido folicular (FF), e sua relacao com os resultados dos ciclos de fertilizacao in vitro (FIV) podem elucidar fatores envolvidos nas falhas e sucessos deste processo. Materiais e Metodos: Este estudo avaliou 132 amostras de FF e soro de pacientes submetidas a ciclos de injecao intracitoplasmatica de espermatozoide (ICSI), as quais foram analisadas para as concentracoes de IL ]8, IL ]1ƒÀ, IL ]6, IL ]10, TNF, IL ]12p70, LIF, VEGF, FSH, estradiol, progesterona, inibina ]B e hormonio anti ]mulleriano (AMH). Estes fatores foram correlacionados com a resposta ao estimulo ovariano controlado (EOC), resultados laboratoriais e clinicos dos ciclos de ICSI. As analises foram realizadas por metodo de regressao linear ou logistica multipla, e ajustados para as variaveis intervenientes. Resultados: Observamos que a presenca de IL ]1ƒÀ serica teve um efeito positivo nas taxas de implantacao e aumentou 15 vezes as chances de gestacao. Ja as concentracoes intrafoliculares de citocinas foram correlacionadas com a qualidade dos oocitos e embrioes correspondentes as amostras de FF. A presenca de IL ]12 intrafolicular foi preditiva da falha de fertilizacao, enquanto as concentracoes de IL ]8 e LIF afetaram negativamente a qualidade embrionaria. Conclusoes: Desta forma, os resultados obtidos neste estudo permitem concluir que a composicao do FF em pacientes submetidas ao EOC afeta a qualidade de oocitos e embrioes e subsequentes resultados clinicos dos ciclos de ICSI. Outros estudos sao necessarios para complementar os achados aqui apresentados e, elucidar os complexos mecanismos associados ao ambiente folicular e o potencial de desenvolvimento de oocitos e embrioes. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2016-05-11T13:01:08Z (GMT). No. of bitstreams: 2 renata_muno_ioc_dout_2015.pdf: 22524697 bytes, checksum: 16fdbd8ff7f73d5a41adaa269ff4a04a (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Toxoplasma gondii, agente etiológico da toxoplasmose, é um parasito intracelular obrigatório que infecta qualquer célula nucleada. Os felídeos são os únicos hospedeiros definitivos no ciclo de vida deste parasito, e suas células epiteliais intestinais são o nicho exclusivo para o desenvolvimento do ciclo sexuado do protozoário. A liberação de oocistos nas fezes de felinos contaminam o meio ambiente e este é o principal fator que explica a distribuição mundial da toxoplasmose. A infecção dos hospedeiros intermediários por oocistos, como aves e mamíferos de sangue quente, incluindo o homem, leva à formação de cistos teciduais, ampliando a transmissão do parasito, por meio do consumo de carne crua ou mal cozida. Os mecanismos que regem a diferenciação do T. gondii em células epiteliais e o conhecimento limitado do ciclo sexuado do parasito são as principais justificativas para o desenvolvimento desta tese. O emprego de células de felinos para o estudo da interação do T. gondii é pioneiro, criando novos campos de investigação sobre os aspectos da interação do parasito no hospedeiro definitivo. Assim, linhagens celulares oriundas do epitélio renal de felinos (CRFK) e de macaco verde (Vero), epitélio intestinal de ratos (IEC-6) e cultura primária de enterócitos de felinos (CEIF) foram utilizadas como modelo experimental da infecção pelo T. gondii. O desenvolvimento intracelular do parasito variou com a origem da célula epitelial e também com a relação parasito:célula hospedeira utilizada nos ensaios in vitro. As células de felino, CRFK, foram mais susceptível à infecção por bradizoítos do que as linhagens epiteliais de outras origens A formação de cistos in vitro foi observada nas células CRFK e Vero ao se utilizar a relação de 1:10 (bradizoíto:célula hospedeira). Culturas de CEIF tiveram sua natureza epitelial revelada pela presença de citoqueratina, expressão de fosfatase alcalina intestinal, presença de microvilosidades e junções intercelulares. A infecção de CEIF com bradizoítos de T. gondii cepa ME49 demonstrou que a carga parasitária foi decisiva para o destino intracelular do parasito: a relação de 1:5 favoreceu a proliferação de taquizoítos e o ciclo lítico; 1:10 foi determinante para o estabelecimento da cistogênese; e estruturas semelhantes a esquizontes foram identificadas quando a carga de 1:20 foi utilizada. A análise morfológica da infecção por períodos de 1 a 9 dias apontou diferentes estágios do parasito em células intestinais de felinos, semelhantes aos observados em estudos in vivo. Explorar esta nova linha de pesquisa, num campo ainda limitado aos ensaios de infecção experimental de gatos e preencher as lacunas no conhecimento da biologia do T. gondii em enterócitos de felinos é inovador e desafiador. Novas perspectivas se abrem, nos estudos dos aspectos moleculares que possam governar esta interação, contribuindo para o desenvolvimento de novas estratégias de intervenção de uma das principais rotas de disseminação da toxoplasmose / Toxoplasma gondii, the etiologic agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular parasite that infects any nucleated cell. The felines are the only definitive hosts in the life cycle of this parasite, being the intestinal epithelial cells, the unique niche for the development of protozoan sexual cycle. The release of oocysts in the feces of cats contaminates the environment and is the main factor explaining the worldwide distribution of toxoplasmosis. The infection by oocysts of intermediate hosts, such as warm-blooded birds and mammals, including man, leads to the formation of tissue cysts, promoting the increase in the parasite transmission through the consumption of raw or undercooked meat. The mechanisms involved in T. gondii differentiation in epithelial cells and the knowledge of the parasite sexual cycle are still unclear, justifying the development of this thesis. The use of feline cells for study the T. gondii interaction is pioneer, evaluating novel fields of research on aspects of the parasite relationship in definitive host. Therefore, cell lines derived from feline epithelial kidney (CRFK) and Green Monkey epithelial kidney (Vero), rat intestinal epithelial (IEC-6) and primary cultures of feline intestinal epithelial cells (FIEC) were used as an experimental model for T. gondii infection. The intracellular parasite development was dependent on the epithelial cell source and on parasite: host cell used in in vitro assays. The feline cells, CRFK, were more susceptible to bradyzoites infection than epithelium from other sources. In vitro cyst formation was observed in CRFK and Vero cells by using the ratio 1:10 (bradyzoite: host cell). CEIF cultures had their epithelial nature revealed by presence of cytokeratin, intestinal alkaline phosphatase expression, presence of intercellular junctions and microvilli. The interaction FIEC-T. gondii bradyzoites ME49 strain demonstrated that the parasite load is crucial to definy the Apicomplexan intracellular destiny: a ratio of 1:5 favored the tachyzoites proliferation and the lytic cycle; 1:10 was crucial to the establishment of cystogenesis; and schizont-like structures were identified when the load 1:20 was used. Morphological analysis of the infection for periods of 1-9a days pointed to the different parasite stages in the cats gut, as previous observed in in vivo studies. To explore this novel research line, a still limited field for experimental infection to cats and to fill gaps in the knowledge of T. gondii biology in cat’s enterocytes is exciting and poorly described. New perspectives are open to study molecular aspects involved in this interaction, contributing to the development of alternative intervention strategies of this crucial route of toxoplasmosis spread. / 2017-07-26

TESSAROLO, L. D. Estudo in vitro da atividade tripanocida de nanopartículas de benzonidazol em carbonato de cálcio sobre cepa y de Trypanosoma cruzi. 2016. 83 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas) - Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2016. / Submitted by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2016-05-24T12:51:25Z No. of bitstreams: 1 2016_dis_lstessarolo.pdf: 3165613 bytes, checksum: 6ddc54bf2a20e523a76900a0fe202bd4 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2016-05-24T12:51:34Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_dis_lstessarolo.pdf: 3165613 bytes, checksum: 6ddc54bf2a20e523a76900a0fe202bd4 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-24T12:51:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_dis_lstessarolo.pdf: 3165613 bytes, checksum: 6ddc54bf2a20e523a76900a0fe202bd4 (MD5) Previous issue date: 2016-02-18 / The Chagas disease is a major public health problem, affecting about 6 million people worldwide and causes high morbidity and mortality in affected populations. The benznidazole (BZ), the drug used in the treatment has limited effectiveness and cause serious adverse effects. The drug transport by nanoparticles has demonstrated efficacy as the controlled and targeted release of pharmacological molecules, in addition to its desirable properties such as good biocompatibility and biodegradability. The objective of this study was to evaluate the cytotoxicity of benznidazole nanoparticles of calcium carbonate (CaCO3 @ BZ) on host cells LLC-MK2; determining the trypanocidal effect on epimastigotes, trypomastigote and amastigotes of T. cruzi Y strain and comparing the effect of BZ as well as to characterize the mechanism of death. The cytotoxicity tests using the MTT method conducted with LLC-MK2 cells grown in DMEM with 10% FBS showed IC50 of 55 ug / ml for BZ @ CaCO3 and 160 g / mL for BZ. epimastigotes were cultured in LIT 10% FBS at 28 ° C in the presence of CaCO3 @ BZ for 24, 48 and 72 hours. BZ @ CaCO3 showed trypanocidal activity against epimastigotes the three treatment times (24h IC50 = 8.72 mg / ml, 48 h IC50 = 8 ug / ml, 72 h IC50 = 4.8 ug / ml) this being more significant effect the BZ (IC50 = 24h 56.7 g / ml IC50 = 48h 15.9 g / ml, 72 h IC50 = 4.3 ug / ml). trypomastigotes were obtained from LLC-MK2 cells infected supernatants, resuspended in DMEM with 2% FCS and treated for 24 h. The trypomastigotes were more likely BZ @ CaCO3 (IC50 = 1.8 ug / ml) than the BZ (IC50 = 67 ug / ml). These assays were also performed with calcium carbonate nanoparticles free drug (@ CaCO3) used as negative control. In the tests with the amastigote forms obtained by infecting LLC-MK2 cells BZ @ CaCO3 was able to reduce the% of infected cells, the number of amastigotes per infected cells and the survival rate at 24 hours of incubation. Flow cytometric assays using fluorescence markers 7-amino actinomycin D, annexin V-PE and rhodamine 123 demonstrated that the trypanocidal effect of both BZ @ CaCO3 as BZ associated death by necrosis with altered mitochondrial potential. Thus, it is concluded that the CaCO3 has BZ @ trypanocidal effect in vitro on the three forms of Trypanosoma cruzi, this being potentially greater effect than that observed for BZ. / A doença de chagas é um grande problema de saúde pública, afeta cerca de 6 milhões de pessoas em todo o mundo e causa altos índices de morbidade e mortalidade nas populações afetadas. O benzonidazol (BZ), fármaco utilizado no tratamento apresenta eficácia limitada e provoca sérios efeitos adversos. O transporte de fármacos por meio de nanopartículas tem demonstrado eficiência quanto à liberação controlada e direcionada de moléculas farmacológicas, além de apresentar propriedades desejáveis, como boa biocompatibilidade e biodegradabilidade. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a citoxicidade de nanopartículas de benzonidazol em carbonato de cálcio (BZ@CaCO3) sobre células de hospedeiras LLC-MK2; determinar o efeito tripanocida sobre as formas epimastigotas, tripomastigotas e amastigotas da cepa Y de T. cruzi e comparar ao efeito do BZ, bem como, caracterizar o mecanismo de morte. Os testes de citotoxicidade utilizando o método do MTT realizados com células LLC-MK2 cultivadas com meio DMEM a 10% de SBF demonstraram IC50 de 55 µg/mL para BZ@CaCO3 e 160 µg/mL para BZ. Formas epimastigotas foram cultivadas em meio LIT a 10% de SBF a 28ºC na presença de BZ@CaCO3 por 24, 48 e 72 horas. BZ@CaCO3 mostrou atividade tripanocida sobre formas epimastigotas nos três tempos de tratamento (CI50 24h = 8,72 µg/mL; CI50 48h = 8 µg/mL; CI50 72 h = 4,8 µg/ml) sendo esse efeito mais significativo que o do BZ (CI50 24h = 56,7 µg/mL CI50 48h = 15,9 µg/mL; CI50 72h = 4,3 µg/ml). Formas tripomastigotas foram obtidas a partir dos sobrenadantes de células LLC-MK2 infectadas, ressuspensas em meio DMEM com 2% de SBF e tratadas durante 24 h. As formas tripomastigotas foram mais susceptíveis a BZ@CaCO3 (IC50 = 1,8 µg/mL) do que ao BZ (CI50= 67 µg/mL). Esses ensaios também foram realizados com nanopartículas de carbonato de cálcio livres de fármacos (@CaCO3) utilizadas como controle negativo. Nos ensaios com as formas amastigotas obtidas por infecção de células LLC-MK2 BZ@CaCO3 foi capaz de reduzir o % de células infectadas, o número de amastigotas por células infectadas e o índice de sobrevivência em 24h de incubação. Ensaios de citometria de fluxo utilizando os marcadores de fluorescência 7- amino actinomicina D, anexina V- PE e rodamina 123 mostraram que o efeito tripanocida tanto da BZ@CaCO3 quanto do BZ está relacionado a morte por necrose com alteração do potencial mitocondrial. Assim, conclui-se que a BZ@CaCO3 apresenta efeito tripanocida in vitro sobre as três formas de Trypanossoma cruzi, sendo esse efeito potencialmente maior do que o observado para BZ.

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