Charles University Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Biological and Medical Sciences Study program: Healthcare Bioanalytics Author: Bc. Dominika Polová Supervisor: RNDr. Klára Konečná, Ph.D. Title of thesis: Galleria mellonella in vivo model for the study of antimicrobial drug vs. pathogen interaction Background: This study focuses on establishment of the in vivo invertebrate mo- del Galleria mellonella primarily for the study of in vivo efficacy and toxicity of newly synthetized compounds with proved antiinfective potential. Major part of the study is devoted to optimization of conditions for laboratory insect rearing, determination of lethal infectious doses after infection of Galleria mellonella larvae by methicillin re- sistant Staphylococcus aureus, implementation of methodical approach for assessing the relative acute toxicity of candidate antiinfective compounds, and establishment of laboratory manuals for routine histopathological studies. Methods: In the study Galleria mellonella larvae were reared in stable laboratory con- ditions (37 ◦ C) and in the presence of rich nutrition. Sowing method was used in or- der to obtain infectious LD50. In the preliminary study we focused on acute toxicity of tested compounds and on methodology optimization leading to histopathological...

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Objectifs : Développer un traitement HIFU (High-Intensity Focused Ultrasound) des anomalies placentaires au moyen d’un transducteur torique. Les essais ont été menés à partir d’un modèle ex-vivo, puis la faisabilité, l’efficacité et l’innocuité du traitement a été évaluée sur un modèle de guenons gestantes. Les premières applications thérapeutiques envisagées à l’échelle humaine, concernent le traitement du syndrome transfuseur-transfusé (STT) et les accrétions placentaires pour lesquelles un protocole d’essai clinique a été établi. Matériels et méthodes : Un transducteur torique fonctionnant à 3 MHz et muni d’une cellule d’imagerie échographique intégrée fonctionnant à 7,5 MHz ont été utilisés. Des simulations numériques de séquences de traitement HIFU ont été menées à partir d’une étude préliminaire sur la caractérisation acoustique du tissu placentaire humain. Ces séquences ont été testées au cours d’une étude ex-vivo sur des placentas humains. Deux modèles ex-vivo ont été conçus. Dans un premier temps, un modèle de traitement extracorporis. Dans un second temps, des traitements HIFU ont été réalisés à des distances variables du transducteur, par modification de la taille du ballonnet, afin de simuler un traitement per-césarienne. Le transducteur était placé au contact de la face foetale du placenta afin de simuler la séreuse utérine. A partir des résultats issus de ces essais ex-vivo, un protocole in-vivo sur des guenons gestantes a été mené afin de valider la faisabilité, l’efficacité et l’innocuité de la réalisation de lésions HIFU dans le placenta de guenons gestantes de manière totalement non-invasive. La qualité du monitoring échographique était évaluée au cours des trois études, et corrélée à l’analyse macroscopique. Une étude histologique a également été menée. Résultats : L’atténuation placentaire a été mesurée à partir de 12 échantillons placentaires humains pour un âge gestationnel compris entre 17 et 40 semaines d’aménorrhées (SA). L’atténuation augmentait en fonction de l’âge gestationnel et était compris entre 0,072 et 0,098 Np.cm-1.MHz-1. Lors d’un premier essai ex-vivo, 33 échantillons placentaires humains ont été inclus et soumis à une séquence HIFU, le temps d’insonification était de 55 secondes, la puissance acoustique utilisée était de 90 Watts. Au total, vingt-cinq lésions élémentaires étaient produites pour un diamètre et une profondeur moyens respectifs de 7,1 ± 3,2 et de 8,0 ± 3,1 millimètres. Huit lésions HIFU ont également été produites à partir de la juxtaposition de 6 tirs, pour un diamètre et une profondeur moyenne respectifs de 23,0 ± 5,0 et 11,0 ± 4,7 millimètres. Aucune lésion située en amont de la lésion produite n’a été observée pour une épaisseur de paroi abdominale similaire à celle d’une guenon gestante (10,8 ± 1,7 millimètres). Dans un second temps, 8 placentas humains pour un âge gestationnel compris entre 39 et 40 SA, ont été soumis à une séquence de traitement HIFU sans interposition de paroi abdominale. Le temps d’exposition était de 75 secondes pour une puissance acoustique de 90 Watts. Les lésions placentaires ont été produites à 2 (n=4), 6 (n=4), 7 (n=4) et 8 (n=7) millimètres de la surface du placenta. Au total, 19 lésions placentaires ont été produites, pour un diamètre et une profondeur moyenne respectifs de 14,6 ± 2,1 et de 14,1 ± 2,3 millimètres. Au cours de l’étude in-vivo, 8 guenons ont été incluses pour un âge gestationnel moyen de 72 ± 4 jours. Les puissances acoustiques utilisées étaient de 65, 80, 110 et 120 Watts pour un temps de traitement de 30, 15, 20 et 20 secondes respectivement. Au total 6 lésions placentaires ont été produites à l’issu de 13 insonifications pour des diamètres moyens de 6,4 ± 0,5 mm, 7,8 ± 0,7 mm et une profondeur moyenne de 3,8 ± 1,5 mm [etc…] / Objectives: To develop a High-intensity Focused Ultrasound (HIFU) treatment for placental abnormalities. Trials were first conducted using an ex-vivo model. Then the safety, feasibility and efficacy were demonstrated using a pregnant monkey model. The first therapeutic applications for human concern the treatment of the twin-to-twin transfusion syndrome (TTTS) and placenta accreta, for which, a clinical trial has already been established. Materials and Methods: A toroidal HIFU transducer, with an integrated ultrasound imaging probe was used. Numerical simulations have allowed identifying HIFU treatment parameters based on a preliminary experiment measuring the acoustic attenuation of human placentae. These HIFU parameters were tested during an ex-vivo study on human placentae. Two models were used. First, an extracorporis model of treatment was developed. Second, a percesarean model was developed. HIFU lesions were performed at different distances from the transducer, by adjusting the quantity of water between the transducer and tissues. The transducer was placed in contact with the fetal side of the placenta in order to simulate the uterine serosa. Using the results of these studies, an in-vivo study was conducted in a pregnant monkey model. The aim was to evaluate the feasibility, the efficacy and the harmlessness of the HIFU treatment applied to the placenta non invasively. The ultrasound monitoring was assessed during these three studies, and was correlated to the macroscopic examination. A histological study was also performed. Results: The placental attenuation was measured using 12 placental samples for a gestational age from 17 to 40 weeks of gestation (WG). The attenuation coefficient increased according to the gestational age, and was ranged from 0,072 to 0,098 Np.cm-1.MHz-1. During the first experimental ex-vivo study, 33 human placental samples were included and treated with HIFU. The treatment parameters were an exposure time of 55 seconds and an acoustic power of 90 Watts. Twenty-five HIFU singles lesions were created with an average diameter and depth of 7.1 ± 3.2 and 8.0 ± 3.1 millimeters, respectively. Eight HIFU lesions were also created by juxtaposing 6 single HIFU lesions. The average diameter and depth of these juxtaposed lesions were 23.0 ± 5.0 and 11.0 ± 4.7 millimeters, respectively. No secondary lesion was observed in overlying abdominal tissues. The thickness of these intervening tissues was similar to a pregnant monkey (10.8 ± 1.7 millimeters). In a second set of experiments, 8 human placentae for a gestational age ranging between 39 and 40 weeks were treated without intervening tissues. The time of exposure was 75 seconds and the acoustic power was 90 Watts. The placental lesions were created at 2 (n=4), 6 (n=4), 7 (n=4) and 8 (n=7) millimeters from the surface of the placenta. In total, 19 placental lesions were created with an average diameter and depth of 14.6 ± 2.1 and 14.1 ± 2.3 millimeters, respectively. Eight pregnant monkeys were included in the in-vivo experiments. The average gestational age was 72 ± 4 days. The placenta was treated non-invasively with acoustic powers of 65, 80, 110 and 120 Watts for a time of exposure of 30, 15, 20 and 20 seconds, respectively. In total, 6 placental lesions were created from 13 insonifications. The average diameters and depths of these lesions were 7.8 ± 0.7 and 3.8 ± 1.5 mm, respectively. No significant variation in maternal or fetal parameters was observed. All placental lesions appear hyperechoic in sonograms and well correlated with the macroscopic measurements. The ultrasound monitoring was better invivo when compared with ex-vivo results. The histological examination demonstrated a well delimited lesion of coagulation in all cases

Le mélanome métastatique est le cancer de la peau le plus agressif. Bien que son taux d’incidence soit inférieur à 1%, plus de 75% des décès associés à un cancer de la peau lui sont attribués. Au cours des dernières années, de nouvelles stratégies thérapeutiques ont permis d’améliorer la survie des patients. Cependant, des mécanismes de résistance à ces traitements se développent dans la majorité des cas, conduisant à une phase de rechute, et une survie à 5 ans inférieure à 20%. Des modèles d’étude expérimentaux sont nécessaires afin de comprendre les mécanismes impliqués dans l’apparition de ces résistances et développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Différents modèles in vitro sont actuellement utilisés pour le développement de drogues anti-tumorales, tels que celui du sphéroïde. Bien qu’il permette de reproduire l’organisation tridimensionnelle d’une tumeur, l’absence de microenvironnement tumoral empêche l’étude des interactions entre les cellules tumorales et celui-ci alors que ces facteurs jouent un rôle primordial dans la croissance tumorale et le développement de métastases. Dans ce contexte, mes travaux ont porté sur le développement et la caractérisation d’un modèle ex vivo de mélanome humain complet permettant l’étude de l’évolution d’une tumeur dans le tissu sain et l’évaluation de composés pharmacologiques. Les travaux réalisés ont tout d’abord conduit au développement d’un modèle de cancer cutané basé sur la combinaison d’un modèle de sphéroïde de lignée cellulaire de mélanome humain et du modèle de peau humaine ex vivo NativeSkin®, développé par la société Genoskin. Une procédure a été développée et validée pour permettre l’implantation reproductible d’un sphéroïde dans le derme des explants de peau. Parallèlement, j’ai développé une approche d’imagerie in situ par microscopie à feuille de lumière après transparisation des modèles. J’ai également développé une stratégie d’analyse d’images permettant la caractérisation quantitative de l'évolution du sphéroïde implanté en 3 dimensions et de suivre la dispersion des cellules du tumorales au sein de l’explant de peau. La caractérisation histologique du modèle implanté a révélé de façon très inattendue une perte progressive de l’intégrité du sphéroïde après implantation, associée à une diminution rapide de la prolifération des cellules le constituant et l’apoptose massive des cellules situées à sa périphérie. Ce phénomène a été observé de façon similaire lors de l’implantation de sphéroïdes produits à partir de différents types cellulaires. Afin de comprendre ces résultats, j’ai étudié l’implication potentielle de différents paramètres dans l’induction de la mortalité cellulaire observée tels que les conditions d’implantation, les facteurs synthétisés par le modèle et la contrainte mécanique exercée par le derme. Les résultats obtenus suggèrent que les facteurs sécrétés par les modèles après implantation du sphéroïde ont un effet antiprolifératif sur les sphéroïdes de mélanome et qu’ils induisent la mortalité des cellules situées à sa périphérie. Par ailleurs, l’application d’une contrainte mécanique extérieure sur les sphéroïdes de mélanome entraîne la perte de la cohésion de leur structure. Enfin, l’implantation de sphéroïdes dans le derme de biopsies de peau préalablement desséchées, induisant une perte de la viabilité cellulaire, a conduit à des résultats opposés à ceux observés avec de la peau normale : la structure des sphéroïdes reste cohésive et la prolifération des cellules est maintenue en périphérie du sphéroïde sans qu’aucune apoptose massive ne soit observée. L'ensemble de ces travaux semble suggérer que la mortalité du sphéroïde pourrait être, en partie, la conséquence d’une contrainte mécanique exercée par la peau sur le sphéroïde et/ou de facteurs produits par la peau durant sa culture. Ces données ouvrent des perspectives intéressantes dans le domaine de l’ingénierie tissulaire pour l’évaluation pharmacologique de composés thérapeutiques. / Malignant melanoma is the most aggressive form of skin cancer. Although it only occurs in less than 1%, it is responsible for more than 75% of skin cancer-related deaths. Furthermore, melanoma incidence has constantly increased during the last decades. New therapies such as targeted therapy and immunotherapy have emerged over the past years, significantly improving the overall survival rates of patients with advanced melanoma stages. However, resistance to those treatments develops in most cases, leading to relapse with a 5-years survival of those patients under 20%. Experimental models are needed in order to better understand the molecular events underlying these resistance mechanisms, and to develop new therapeutic strategies. MultiCellular Tumor spheroid is an increasingly recognized 3D in vitro model for pharmacological evaluation. Although this model accurately reproduces the 3D architecture, cell-cell interaction and cell heterogeneity found in microtumor in vivo, spheroids lack tumor-microenvironment interactions, which play a key role in tumor growth and metastasis development. In this context, the aim of my project was to develop and characterize a fully ex vivo human melanoma model for the study of tumor growth within the skin and the evaluation of antitumor drugs. Our approach relies on the combination of human melanoma cell lines grown in Multicellular Tumor Spheroids and the NativeSkin® model, an ex vivo human skin model produced by the biotechnology company Genoskin. Hence, I developed and validated a method to reproducibly implant one spheroid into the dermal compartment of skin explants cultured ex vivo. In parallel I have developed in situ imaging strategies based on light-sheet microscopy (SPIM, “Selective Plane Illumination Microscopy”) after optical clearing of the implanted skin biopsies. I also developed analytic methods to allow for the quantitative characterization of the spheroids evolution in 3 dimensions as well as tumor cells dispersal within the dermis of skin explants. Histological characterization of the implanted models over time revealed a progressive loss of the spheroids integrity after implantation associated with a rapid decrease in cell proliferation and massive apoptosis of the cells located in the peripheral layers. These results were shared by implanted spheroids made from different cell types. Further experiments were conducted in order to better understand these results and evaluate the impact of different parameters on the implanted microtumors viability such as the implantation procedure conditions, factors synthesized by the model after spheroid implantation and external mechanical stress. Results suggest that factors produced by the implanted models have an antiproliferative effect on melanoma spheroids and induce mortality in the peripheral layers of the spheroids. Moreover, results show that mechanical stress applied on melanoma spheroids induces loss of their cohesion. Finally, implantation of spheroids within the dermis of previously dessicated biopsies for 7 days, causing loss of skin cells viability, led to opposite results than in normal skin: spheroids maintain both a cohesive structure and proliferation in the peripheral cells without any massive apoptosis. Overall, this work led to the validation of a methodology to reproducibly implant spheroids into an ex vivo skin explant and the setup of an optical clearing technique necessary for in situ imaging of the implanted spheroid. Histological characterization unexpectedly revealed spheroids cells death following their implantation. Results suggest that this mortality could be partly related to mechanical stress exerted on the spheroids by the skin and/or by factors produced by the skin during culture. These data open new perspectives in the research field of tissue engineering for antitumoral pharmacology.

Submitted by Cássia Santos (cassia.bcufg@gmail.com) on 2015-03-27T14:27:58Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Laís Cristina da Silva - 2014.pdf: 4002977 bytes, checksum: c54a0aa96c3be46a95b8df8e9a407c1d (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-03-27T15:49:49Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Laís Cristina da Silva - 2014.pdf: 4002977 bytes, checksum: c54a0aa96c3be46a95b8df8e9a407c1d (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-27T15:49:49Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Laís Cristina da Silva - 2014.pdf: 4002977 bytes, checksum: c54a0aa96c3be46a95b8df8e9a407c1d (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2014-09-29 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The main predictive models of absorption of potential new drugs in preclinical stage are focused on the gastrointestinal mucosa, given the predominance of this pathway in drug administration. Often, the fraction absorbed (Fa) can be predicted in ex vivo models (p.e. Ussing chambers), in vitro (p.e. Caco-2 cells monolayers), intestinal perfusion studies in situ and in vivo absorption. In the present study, from an adaptation of Snapwell ™ inserts, a new ex vivo model to evaluate the permeability of substances passively absorbed is proposed. High permeable drugs (metoprolol, caffeine and theophylline) and low permeable drugs (atenolol, ranitidine and cimetidine) were maintained in an incubator at 37 ° C under constant stirring (60 rpm) and carbogenic atmosphere (5% CO2). The viability of the jejunal membrane (52 Ω.cm2 ± 8.0) was observed remaining above 20 Ω.cm2 for 120 min incubation, under all conditions evaluated, including the addition of co-solvents (1% DMSO and 1% EtOH). Values of apparent permeability coefficients obtained (Papp) were characteristic of ex vivo permeation studies (3.8 to 12.6 x10-6 cm / s). Strong correlation was observed between the data obtained here versus data intestinal perfusion in vivo (r = 0.89), as well as the fraction absorbed in humans (r = 0.85), reported in the literature. Additionally, the model features high sensitivity and accuracy compared to other commonly used models in classification permeability of substances. In line, we can infer that the MTSSNAPWELL model demonstrates, yet, potential application in studies of screening for selection of low molecular weight, such as potential phytochemicals, as well as their synthetic analogues evaluated with low amount of sample (ca 10 mg). / Os principais modelos preditivos da absorção de potenciais novos fármacos na etapa pré-clinica são focados na mucosa gastrointestinal, haja vista a predominância desta via na administração medicamentosa. Frequentemente, a fração absorvida (Fa) pode ser predita em modelos ex vivo em câmaras de Ussing, in vitro em monocamadas de células Caco-2, perfusão intestinal in situ e estudos de absorção in vivo. No presente estudo, a partir de uma adaptação do aparato Snapwell™, um novo modelo ex vivo de avaliação da permeabilidade para substâncias absorvidas por difusão passiva é proposto. Substâncias de alta (metoprolol, cafeína e teofilina) e baixa (atenolol, ranitidina e cimetidina) permeabilidade, foram mantidos em incubadora à 37OC, sob agitação constante (60 rpm) e atmosfera carbogênica (5% CO2). A viabilidade da membrana jejunal (52 ± 8,0 Ω.cm2) foi observada mantendose acima de 20 Ω.cm2 por até 120 min de incubação, sob todas condições avaliadas incluindo a adição de co-solventes (DMSO 1% e EtOH 1%). Os valores de coeficientes de permeabilidade aparente obtidos (Papp) mostraram-se característicos de estudos ex vivo de permeação (3,8 – 12,6 x10-6 cm/s). Forte correlação foi observada entre os dados aqui obtidos versus dados de perfusão intestinal in vivo (r = 0,89), assim como da fração absorvida em humanos (r = 0,85), relatados na literatura. Adicionalmente, o modelo apresenta elevada sensibilidade e precisão frente aos demais modelos comumente utilizados na classificação da permeabilidade de substâncias. Em consonância, pode-se inferir que o modelo MTSSNAPWELL demonstra, até o momento, potencial aplicação em estudos de screening para seleção de moléculas de baixo peso molecular, tais como potenciais fitofármacos, assim como seus análogos sintéticos avaliados com baixa quantidade de amostra (c.a. 10 mg).

La compréhension du lien entre alimentation et santé est un challenge majeur pour les domaines des sciences de l'aliment et de la nutrition. L'effet d'un aliment sur la santé étant conditionné par son passage et sa déstructuration dans le tube digestif, explorer cette question implique donc nécessairement de progresser dans la compréhension du processus de digestion. L'œuf est un produit apprécié dans le monde entier et compte parmi les aliments les plus nutritifs pour l'Homme. La fraction blanc d'œuf, solution aqueuse de protéines, est un ovoproduit très utilisé par l'industrie alimentaire en raison de ses propriétés fonctionnelles et nutritionnelles. De plus, la possibilité de générer des structures d'aliment très différentes selon les modalités du traitement technologique, sans avoir à en modifier la composition, fait du blanc d'œuf un aliment modèle réaliste particulièrement intéressant. Cette étude a été menée dans l'objectif d'étudier l'impact des caractéristiques structurales de matrices protéiques agrégées et gélifiées sur leur déstructuration au cours de la digestion. Un modèle in vitro de digestion gastro-intestinale, permettant un suivi temporel, a été combiné avec un modèle in vivo (porcin), plus proche de la réalité physiologique et permettant un suivi spatio-temporel de la digestion. Dans le cas du blanc d'œuf, la structuration de la matrice protéique s'est avérée avoir une influence non seulement sur les aspects quantitatifs de la digestion comme le degré d'hydrolyse des protéines, mais également sur les aspects qualitatifs comme la nature des peptides libérés. De même in vivo, les niveaux de bioaccessibilité pourraient être impactés par les différences relatives aux caractéristiques structurales des matrices gélifiées. A l'échelle moléculaire, cette étude suggère ainsi que les changements structuraux induits par les traitements thermiques, variables selon les conditions du milieu, rendent accessibles aux enzymes digestives des zones variables des protéines. A l'échelle micro- et macroscopique, les caractéristiques structurales des gels impactent également le déroulement de la digestion. / Understanding the relationship between health and diet is a major challenge in Food Science and Nutrition. As the impact of a food product on health depends on its journey and breakdown in the gastrointestinal tract, exploring this question necessarily implies increasing our knowledge of the food digestion process. Eggs are popular worldwide and are among the most nutritious foods for humans. The egg white fraction, an aqueous protein solution, is an egg product widely used in the food industry because of its unique functional and nutritional properties. In addition, the ability to generate very different food structures depending on the technological process without modifying its composition, makes egg white a very interesting and realistic food model. The aim of the study was to investigate the impact of structural characteristics of aggregated and gelled protein matrices on their breakdown during digestion. An in vitro model of gastrointestinal digestion, enabling temporal tracking, was combined with an in vivo model (pig), closer to physiological reality and enabling spatio-temporal mapping of digestion. For egg white, the structural characteristics of the protein matrix were found to have an influence not only on the quantitative aspects of protein digestion such as the degree of hydrolysis, but also on the qualitative aspects such as the nature of the peptides released. Similarly, the in vivo bioaccessibility levels could be impacted by differences relating to the structural characteristics of the gelled matrices. At the molecular scale, this study suggests that the structural changes induced by heat treatments, depending on physicochemical conditions, render a number of protein regions accessible to digestive enzymes. At the micro- and macroscopic scale, the structural characteristics of the gels also impact the digestion process.

Observational learning (OL) occurs when an individual contacts reinforcement as a direct result of discriminating the observed consequences of other individuals' responses. Individuals with autism spectrum disorder (ASD) may have deficits in observational learning and previous research has demonstrated that teaching a series of prerequisite skills (i.e., attending, imitation, delayed imitation, and consequence discrimination) can result in observational learning. We sequentially taught these prerequisite skills for three young children with ASD across three play-based tasks. We assessed the direct and indirect effects of training by assessing OL before and after instruction across tasks and task variations (for two participants) during both in-vivo and video-model probes using a concurrent multiple-probe design. All participants acquired the prerequisite skills and demonstrated observational learning during probes of directly-trained tasks. Generalization results varied across participants. Observational learning generalized to one untrained task for one participant. For the other two participants, observational learning generalized to variations of the trained tasks but not to untrained tasks. Generalization additionally occurred during the in-vivo probes for both participants for whom we assessed this response. Implications of these findings, as well as directions for future research, are discussed.

Les cellules souches de gliomes (CSG), une sous-population de cellules tumorales, seraient en partie responsables de l’échec des traitements des gliomes de par leur résistance et leur capacité régénérative. Le mécanisme alternatif (ALT) de maintenance des télomères, basé sur la recombinaison homologue et non pas sur la télomérase, est détecté dans environ 30% des gliomes humains suggérant que des stratégies thérapeutiques spécifiquement dirigées contre ALT pourraient avoir un intérêt thérapeutique. Dans ce travail, nous avons poursuivi la caractérisation du premier exemple de CSG humaines ayant un phénotype ALT, les cellules TG20. Nous avons montré que malgré leur très fort taux de recombinaison, les télomères de ces cellules continuaient à assurer leur fonction de protection des chromosomes. Nous avons vérifié que les cellules TG20 conservaient leur capacité à générer des tumeurs intracérébrales après des transplantations sériées chez les souris immunodéprimées tout en gardant un phénotype ALT. Ces résultats confirment à la fois les propriétés de cellules souches cancéreuses des cellules TG20 et la capacité de ALT à assurer la maintenance des télomères nécessaire à l’autorenouvellement et au fort taux de prolifération des CSG in vivo. La greffe intracérébrale de cellules TG20 chez des souris immunodéprimées représente donc un bon modèle d’étude préclinique des gliomes ALT. Nous avons ainsi montré qu’un traitement précoce par un ligand des G-quadruplexes télomériques, 360B, juste après la greffe de cellules TG20, était capable d’inhiber le développement tumoral suggérant l’intérêt de l’utilisation de ligands des G-quadruplexes pour cibler spécifiquement les CSG ALT. Une étude des profils d'expression transcriptomique des cellules TG20 et de plusieurs lignées de CSG humaines exprimant la télomérase, nous a conduit à nous intéresser aux rôles de deux lysine acétyl transférases homologues, PCAF (P300/CBP Associated Factor) et GCN5 (General Control Nonderepressible 5) dans la régulation de la recombinaison télomérique des cellules ALT. Nous avons montré que les inhibitions de ces deux protéines ont des effets opposés sur le mécanisme ALT. Nous proposons qu’une balance d’expression de PCAF et GCN5 régule la maintenance des télomères dans les cellules ALT via le contrôle du turnover de TRF1 ce qui pourrait constituer la base d’une nouvelle stratégie thérapeutique vis-à-vis des gliomes ayant un phénotype ALT. / Glioma stem cells (GSC), a subpopulation of tumor cells, are partly responsible for the failure of treatment of gliomas because of their resistance and regenerative capacity. The mechanism of alternative lengthening of telomere (ALT), based on homologous recombination, is detected in approximately 30 % of human gliomas. Therefore, therapeutic strategies directed specifically against ALT may have a therapeutic value. In this work, we further characterized the first model of human ALT GSC, the TG20 cells. We showed that despite their very high rate of recombination, the telomeres were still capable of fulfilling their protective function of chromosomes. We verified that the TG20 cells retained their ability to generate intracerebral tumors after serial transplantations in immunocompromised mice, while preserving an ALT phenotype. These results confirm the cancer stem properties of TG20 cells and the ability of ALT to ensure telomeres maintenance, which is required for the self-renewal and the high proliferation rate of GSC in vivo. Intracerebral grafts of TG20 cells in immunocompromised mice represent thus a good preclinical model for studying ALT gliomas. We have shown that treatment with a ligand of telomeric G-quadruplexes, the 360B, at an early stage of TG20 tumor engraftment, was able to inhibit tumor growth, showing the interest of the use of G-quadruplex ligands to specifically target ALT GSC. Transcriptomic profiling of TG20 cells and several other GSC telomerase-positive lines, incited us to study the roles of two homologous lysine acetyl transferases, PCAF (p300/CBP Associated Factor) and GCN5 (General Control Nonderepressible 5), in the regulation of telomeric recombination in ALT cells. We showed that the inhibition of these two proteins has opposite effects on the ALT mechanism. We propose that a balance of expression of PCAF and GCN5 regulates the telomere maintenance in ALT cells by controlling the turnover of TRF1. This model could serve for the development of new therapeutic strategies targeting ALT gliomas.

Ce travail de thèse comporte deux volets ayant pour trait commun l’analyse a posteriori d’une épidémie d’infection invasive à méningocoque (IIM) survenue en Normandie entre 2003 et 2012 et liée à l’expansion d’un clone hypervirulent particulier (B:14:P1.7,16/ST-32 ). Le premier travail (publié dans Virulence : Sevestre et al 2018 ;9 :923-929) s’est focalisé sur les déterminants de la virulence de « B14 » en comparant 6 isolats identifiés les uns d’IIM, les autres de portage pharyngé sain (ces derniers exprimant ou non la capsule). Apparemment identiques selon le typage classique (immunotypage et génotypage par MLST), ces 3 groupes bactériens se sont révélés distincts après analyse génomique et comparaison gène par gène (plus de 600 gènes au profil génétique variable entre les groupes) conduisant à identifier le rôle majeur de l’acquisition du fer dans la virulence et en particulier celui du système HmbR, un récepteur de l’hémoglobine. Dans un modèle murin (souris transgéniques rendues sensibles à l’infection humaine) les 3 groupes de souches sont aussi apparus distincts, avec une hiérarchie des marqueurs d’infectiosité (titres bactériens, taux de cytokines). La restauration du système HmbR (souches de portage capsulées « Off » dérivées en « On ») a restauré le pouvoir invasif in vitro et chez l’animal. Si le fer était déjà connu comme facteur de virulence pour différentes espèces bactériennes, l’originalité ici est d’avoir identifié le rôle de la variation de phase du gène hmbR au sein d’un même clone épidémique, permettant l’adaptation au portage, condition sine qua non de la transmission d’individu en individu. Le second travail (publié dans Vaccine : Sevestre et al 2017 ;35 :4029-4033) s’est intéressé à la durabilité et à l’ampleur de la protection vaccinale du MenBvac®, vaccin à base de vésicules de membranes externes (Outer Membrane Vesicles, OMV) utilisé jadis pour contrôler l’épidémie. Ceci a pu être réalisé grâce à deux cohortes d’enfants vaccinés par un schéma à 4 doses et prélevés pour les uns 1 an après la dernière dose et pour les autres 4 an après. L’immunogénicité (étude de l’activité bactéricide du sérum vis-à-vis du clone ciblé) s’est avérée de durabilité moyenne avec 48% des enfants protégés à 1 an et 31% à 4 ans, un résultat en phase avec les données de la littérature sur les vaccins OMV. Un effet bactéricide fut observé très au-delà de « B14 », du fait d’une immunité croisée aux souches avec une homologie au moins partielle de la porine PorA (principal déterminant antigénique des vaccins OMV) soit pour le MenBvac® 15% des clones virulents B actuellement circulants en France, un résultat davantage original car ayant jusqu’alors que peu investigué. / This thesis work includes two studies which both contribute to analyze a posteriori an outbreak of invasive meningococcal diseases (IMD) that had occurred in Normandy from 2003 to 2012 due to the expansion of a single hypervirulent clone (B:14:P1.7,16/ST-32 ). The first work (published in Virulence: Sevestre et al 2018 ;9 :923-929) focused on the virulence determinants of “B14” by comparing 6 isolates, either from IMD or from asymptomatic carriage (these latter expressing or not the capsule). Apparently identical on the basis of classical typing methods (immunotyping and MLST genotyping), these 3 groups of isolates were markedly different by whole genome analysis and on gene by gene comparison (more than 600 genes presenting a variable genetic profile). This analysis leaded to identify the crucial implication of iron acquisition in virulence and in particular the place of the HmbR system, an hemoglobin receptor. In a murine model (transgenic mice made susceptible to infection), these 3 groups also appeared separated, with a distinct infectivity hierarchy (bacterial counts, levels of cytokines). The restoration of the HmbR system in the capsulated carriage isolates (switch from Off phase to On phase) also restored their invasiveness in vitro and in vivo. Even if iron is already known to be a determining factor in the virulence of many bacterial species, our results clearly indicate the importance of the hmbR phase variation among clonal epidemic isolates, allowing adaptation to carriage, sine qua non condition for people to people transmission. The second work (published in Vaccine: Sevestre et al 2017 ;35 :4029-4033) concerned the durability and the cross-protection of the MenBvac®, an OMV vaccine (Outer Membrane Vesicles), used in the past to control the outbreak. This work has been done thanks to 2 cohorts of children vaccinated with 4 doses and sampled either 1 year or 4 years after the last dose. The efficacy (serum bactericidal activity against the epidemic strain) was short lasting, with 48% of children protected after 1 year and 31% after 4 years, a result in accordance with OMV literature. A bactericidal effect was observed far beyond “B14”, by cross-immunity with strains harboring homologies, even partials of the porin PorA (main antigenic determinant in OMV vaccine), indicating a coverage for 15% of virulent isolates B circulating in France, an original result as until then not so far investigated.

Un défi majeur en oncologie clinique est de caractériser avec précision la réponse des patients aux agents thérapeutiques. Actuellement, il n'existe pas de modèles et de tests fiables capable de reproduire précisément une tumeur primaire dans toute sa complexité. Or, ce paramètre est essentiel pour mettre en œuvre une stratégie de médecine personnalisée capable d'identifier le régime de traitement le plus approprié pour un patient particulier dans un délai cliniquement pertinent. Pour répondre à ce besoin, notre groupe a développé un nouveau modèle 3D ex vivo qui repose sur la micro-dissection d'un échantillon de tumeur (MDT) d'un patient et l'utilisation de technologies microfluidiques pour maintenir la viabilité du tissu et le microenvironnement tumoral naturel afin d’évaluer la sensibilité aux traitements dans un délai adapté à la prise de décision clinique. Cette approche permettrait de sélectionner les thérapies les plus efficaces tout en réduisant l'administration de traitements inefficaces associés à des effets secondaires indésirables, ainsi que les coûts de prise en charge des patients. Des travaux précédemment publiés par notre équipe ont montré que la viabilité des cellules cancéreuses situées dans notre modèle de tumeur ex vivo pouvait être caractérisée par microscopie confocale sur l’intégralité du MDT ou par cytométrie de flux sur les MDTs après dissociation enzymatique des cellules. Cependant, ces techniques présentent des limitations en termes de résolution visuelle pour la microscopie confocale et de sensibilité et information spatiale pour la cytométrie de flux. Nous proposons ici d’associer notre modèle 3D de MDTs en microfluidiques à des techniques d’immuno-histopathologie, dans le but d’offrir une évaluation moléculaire, spatiale et quantitative de la réponse de la tumeur au traitement. Pour cela, nous avons optimisé une procédure de lithographie en paraffine de nos systèmes microfluidiques, permettant la production de blocs de micro-étalages micro-réseaux de tissus micro-disséqués (MDTMA). afin de permettre une coloration morphologique du tissu et un marquage de protéines spécifiques pour analyser l'architecture tissulaire, la prolifération et l’apoptose cellulaire au sein des échantillons traités. En outre, nous avons montré que le modèle ex vivo est comparable et corrélé au système de modèle de souris in vivo de référence pour l'essai de chimio-sensibilité. Suite à l’optimisation de ce modèle, nous avons collecté 25 échantillons de tumeurs de patientes atteintes de cancer de l’ovaire, pour réaliser des MDTs et des cultures de cellules primaires afin de comparer les profils transcriptomiques de ces deux modèles avec celui de la tumeur d’origine, et d'analyser les réponses aux traitements et le microenvironnement tumoral. Les données transcriptomiques obtenues par micropuces ARN nous ont permis d'effectuer une analyse bio-informatique des voies de signalisation incluant un groupement hiérarchique non supervisé. Nos résultats montrent que les MDT à chaque point de temps (jour 0, 8 et 15) sont génétiquement similaires à la tumeur primaire par opposition aux cultures cellulaires primaires, et que les principales voies dérégulées sont impliquées dans la réponse cellulaire au stress. Nous avons observé une viabilité élevée des cellules au sein des MDT sur une période de culture de 15 jours. En outre, nous avons déterminé qu'un régime de chimiothérapie (carboplatine et paclitaxel) consistant en une induction thérapeutique de 10 heures suivie d'une période de récupération de 14 heures était idéal pour caractériser la réponse au traitement. Notre analyse de prédiction de la réponse des patients montre que nous avons une corrélation positive élevée d'une efficacité de 95 % entre la réponse ex vivo et la réponse clinique pour les patients appariés. En général, nos résultats suggèrent que notre technique fournit un modèle plus sophistiqué et précis pour récapituler la réponse de la tumeur primaire dans un laps de temps cliniquement adapté, et pourrait servir de plateforme pour tester de nouvelles thérapeutiques, et d'outil d'orientation clinique pour la réponse des patients. / A major challenge in clinical oncology is the inability to accurately predict the patients’ response to therapeutic agents. Currently, there are no reliable models and assays available that reiterate the immense complexity of a primary tumor. These factors are important to implement a personalized medicine strategy capable of identifying the most suitable treatment regimen for a particular patient in a clinically relevant timeframe. To answer this need, our group has developed a novel ex vivo 3D model that relies on the micro-dissection of a patient’s tumor specimen and the utilization of microfluidic technologies to monitor drug sensitivity within a time-frame suitable for clinical decision-making. This approach would allow for better selection of effective therapies and limit the administration of ineffective treatments, further improving treatment outcome of patients while reducing cost and drug-induced toxicities. Previously published work studied that the viability of cancer cells located within the tumor was characterized using two imaging modalities: confocal microscopy and flow cytometry. However, each technique has its own disadvantage, limiting their ability to molecularly characterize the effect of therapeutic agents on cancer cells. Thus, we hypothesize that our 3D ex vivo tumor-derived model coupled to a pathology-like tool would allow for a more comprehensive approach to evaluate tumor response to treatment, providing a readout system to closely mirror the patient’s response, and evaluating molecular mechanisms involved in response to drugs. To address this hypothesis, we optimized a paraffin-embedding lithography procedure allowing the production of micro-dissected tissue micro-array (MDTMA) block to allow morphological and protein-specific staining to analyze the cellular integrity and tissue architecture of treated samples. In addition, we showed that ex vivo model is comparable and correlated to the gold standard in vivo mouse model system for chemosensitivity assay. Moreover, we collected, following informed consent, 25 post-surgical OC patient tumor samples, to form micro-dissected tissues (MDTs), and primary cell cultures for micro-array analysis and characterization of the TME and response prediction. The micro-array data allowed us to perform unsupervised hierarchical clustering and pathway analysis showing that the MDTs at each time-point (day 0, 8 and 15) are genetically similar to the primary tumor as opposed to the primary cell cultures and that main deregulated pathways are involved in cellular response to stress. We observed a high viability of cells within MDTs over a culture period of 15 days. In addition, we determined that a treatment regimen consisting of a 10-hour therapy induction followed by a 14-hour recovery period was ideal for characterizing carboplatin treatment response. Our response prediction analysis of patients shows that we have a high positive correlation of 95% efficiency between ex vivo and clinical response for matched patients. In general, our results suggest that our ex vivo drug response model provides a more sophisticated model to recapitulate primary tumor response in a clinically suitable timeframe that can be exploited further serving, in part, as a platform to test new therapeutics and as a clinical guidance tool for patient response.