Seafood products are a common consumer choice and a variety of cooking methods are used in seafood preparation. Although often cooked, products such as shrimp and salmon remain some of the most common carriers of foodborne disease. Cooking these products at elevated temperatures efficiently reduces foodborne disease causing pathogens to a safe level, but applying too much heat to seafood products can produce an overcooked, low quality food. It is necessary to investigate the cooking processes used in seafood preparation and establish appropriate consumer cooking parameters that optimize both the quality and microbial safety of the products. To achieve these goals, this study develops mathematical models for the inactivation of Salmonella sp., change in quality attributes, and the product heating profiles during the cooking process for shrimp and Atlantic salmon. Studies were performed to monitor the product heating profile during the baking and boiling of shrimp and the baking and pan-frying of salmon. Product color, texture, moisture content, mass loss, and pressed juice were evaluated during the cooking processes as the products reached the internal temperature recommended by the FDA. Studies were also performed on the inactivation of Salmonella cocktails in homogenized and non-homogenized shrimp and salmon. To effectively predict inactivation during cooking, the Bigelow, Fermi distribution, and Weibull distribution models were applied to the homogenized data. Minimum cooking temperatures necessary to destroy Salmonella sp. in shrimp and salmon were also determined. The heating profiles of the two products were modeled using the finite difference method. Temperature data directly from the modeled heating profiles was then used in the kinetic modeling of quality change and Salmonella inactivation during cooking. It was concluded that consumers need to judge the doneness of both shrimp and Atlantic salmon by the lightness factor (CIE L*) of the core region of both products. The core region's lightness factor, which a consumer may consider as opaqueness, more accurately represented the thermal doneness than the external qualities. The FDA's current recommendations for a 3 log reduction for intact seafood products and homogenized seafood products were each analyzed. Results were in agreement with the recommended 68°C plus 15 seconds for homogenized products. For intact products, shrimp inactivation results were in agreement with the recommended 63°C plus 15 seconds, but intact salmon achieved only a 2 log reduction by the temperature-time combination. It was also found that predictive models can effectively describe the survival data for two Salmonella cocktails. The Weibull distribution model, which takes into account any tailing effect in survival data, fit the survival data of Salmonella in shrimp acceptably. The Fermi distribution model, which incorporates any shouldering effect in data, was an acceptable fit for the inactivation data for salmon. Using three-dimensional slab geometry for salmon fillets and two-dimensional frustum cone geometry for shrimp resulted in acceptable model predictions of thermal distributions for the cooking methods studied. The temperature data attained directly from the modeled heating profiles was effectively used in the predictive quality and inactivation models. Agreeable first-order kinetic models were formulated for Î L and Î C color parameters in shrimp and salmon. Other kinetic models formulated were for texture change in salmon and pressed juice in both salmon and shrimp. Using a fixed inactivation level of 3 logs and a fixed quality of 95% best quality, optimal cooking conditions were determined that both provide a high quality product and assure microbial safety. Based on the specific cooking methods in this study, the optimal boiling times for extra jumbo and colossal sized shrimp were 100 seconds and 159 seconds, respectfully. The optimal oven baking times were 233 seconds for extra jumbo shrimp and 378 seconds for colossal shrimp. For Atlantic salmon, the optimal oven baking time was 1132 seconds and the optimal pan frying time was 399 seconds. / Master of Science

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La majorité des gastroentérites non-bactériennes sont causées par les norovirus, qui se transmettent principalement par les surfaces, les aliments et l’eau. La plupart des désinfectants domestiques sont inefficaces contre ces virus à l’exception de l’acide hypochloreux qui, cependant, perd une partie de son activité et génère des sous-produits toxiques en présence de matières organiques. Des méthodes de désinfection alternatives, efficaces et plus sécuritaires sont aujourd’hui nécessaires pour lutter contre la propagation des norovirus. Ce projet de recherche a porté sur deux approches prometteuses, les acides peroxycarboxyliques et les lumières pulsées. Dans un premier temps, quatre acides peroxycarboxyliques ont été évalués en fonction de leur concentration et du temps de contact. Les acides monoperoxycarboxyliques, à savoir les acides peracétique et perpropionique, ont été les plus efficaces en réduisant la charge virale d’environ 4 log10 après un traitement de 50 mg L-1 pendant 5 minutes. Ces molécules ont conservé cette activité contre des norovirus déposés sur de l’acier inoxydable et du PVC, propres ou sales, ainsi qu’immobilisés dans un biofilm artificiel. Dans le cas de l’acide peracétique, les expérimentations ont démontré que cette inactivation résultait principalement de dommages causés sur l’ARN viral, probablement par l’intermédiaire de radicaux libres. À forte concentration, les protéines de la capside étaient aussi altérées. Dans un deuxième temps, les norovirus ont été traités par une lumière pulsée (200 à 1000 nm ; 0,69 J cm-2 par impulsion). Trois impulsions (1,6 seconde) ont diminué la charge virale d’environ 4 log10 dans tous les milieux testés (tampon salin, eaux dures, minérale et usées) à l’exception des eaux turbides. A la turbidité maximum (1000 NTU), la réduction était de 2.4 log10. Cette technologie est aussi efficace pour la désinfection de surfaces propres, même en présence d’un biofilm artificiel (4 log10 après 7 impulsions), mais est affectée par la présence de matières protéiques. Nous avons démontré que les lumières pulsées inactivaient les norovirus en induisant des dommages à la fois sur l’ARN viral et l’intégrité des particules. En conclusion, ces résultats attestent l’efficacité de ces techniques et contribuent à une meilleure compréhension de leur principe d'action. / The majority of non-bacterial gastroenteritis is caused by norovirus, which is transmitted primarily through surfaces, food and water. Most household disinfectants are ineffective against these viruses with the exception of the bleach which, however, loses partially its activity and generates toxic residues in the presence of organic matter. Alternative, effective and safer methods of disinfection are necessary to hamper the spread of norovirus. This research project focused on two promising approaches, namely peroxycarboxylic acids and pulsed light. On the one hand, four peroxycarboxylic acids were evaluated based on their concentration and contact time. Monoperoxycarboxylic acids, namely peracetic and perpropionic acids, were the most effective by reducing the viral load of about 4 log10 after a treatment with 50 mg L-1 for 5 minutes. These molecules maintained their activity against noroviruses attached on stainless steel and PVC, clean or dirty, and entrapped in an artificial biofilm. In the case of peracetic acid, we showed that this inactivation was mainly due to damages on the RNA, probably through free radicals. At high concentrations, the capsid was also altered. On the other hand, noroviruses were treated with pulsed light (200-1000 nm; 0.69 J cm 2 per pulse). Three pulses (1.6 seconds) decreased viral load of approximately 4 log10 in all media tested (buffered saline, hard water, mineral water and sewage treatment effluent) with the exception of turbid water. At the maximum turbidity (1000 NTU), the reduction was 2.4 log10. This technology is also effective to disinfect clean surfaces even in the presence of an artificial biofilm (4 log10 after 7 pulses), but is affected by the presence of proteinaceous material. We demonstrated that the pulsed light inactivated norovirus by inducing damage to both the RNA and the integrity of the particles. In conclusion, these results demonstrate the effectiveness of these approaches and contribute to a better understanding of their mechanism of action.

Même si les traitements thermiques ou la désinfection par les oxydants ont démontré leur efficacité virucide, les mécanismes liés à la perte du caractère infectieux ne sont pas connus. Ceci pose un réel problème d’interprétation de la présence de génome viral en matière de risque infectieux dans les aliments. Ce travail de thèse a pour objectif d’étudier l’évolution des propriétés de surface (charge et hydrophobie) de virus modèles, bactériophage MS2 et norovirus murin, au cours de l’inactivation par la chaleur, l’hypochlorite de sodium et l’ozone. Pour nos deux virus, nous démontrons l’existence d’une température critique au-delà de laquelle la particule virale se déstructure en libérant son génome. Un simple traitement à la RNase permettrait alors de ne détecter que des virus infectieux par biologie moléculaire. Le traitement thermique implique aussi une augmentation de l’hydrophobie soulignant des modifications conformationnelles de la capside. L’hypochlorite de sodium ne modifie que peu les propriétés de surface mais des phénomènes d’oxydation ont lieu au niveau de la capside puisque la charge du bactériophage MS2 est légèrement modifiée. Ces modifications diminuent la résistance thermique du virus. Nous démontrons un effet synergique de l’hypochlorite de sodium et la chaleur sur le bactériophage MS2 (inactivation, RNase et hydrophobie). Quant à l’ozone gazeux, nous soulignons son intérêt pour le traitement virucide des aliments fragiles. Ainsi, ce travail précise les mécanismes d’inactivation des virus et ouvre de nouvelles perspectives tant pour discriminer les virus infectieux et non-infectieux que pour proposer l’exploration de nouveaux traitements technologiques / Although heat treatments or disinfections by oxidants have proven their virucidal efficiencies, mechanisms related to the loss of infectivity are not known. This statement could lead to a misinterpretation of the presence of viral genome on infection risk for humans in food matrices. This thesis aimed to study the evolution of surface properties (charge and hydrophobicity) for model viruses, bacteriophage MS2 and murine norovirus, during the heat, sodium hypochlorite and ozone inactivations. For both viruses, the existence of a critical temperature beyond which the viral particle was disrupted and released its genome was demonstrated. Simple treatment with RNase would then only detect infectious virus by molecular biology. The heat treatment also involved a transient increase in the hydrophobicity which highlighted conformational changes of the viral capsid. Sodium hypochlorite slightly modified the surface properties but oxidation phenomena occurred onto capsid since the bacteriophage MS2 charge has changed a little. These changes decreased the thermal resistance of the virus. Synergistic effects of both sodium hypochlorite and heat were observed on the inactivation of MS2 phages, the sensitivity of their genome to RNases and the increase in hydrophobicity of remaining infectious particles. Regarding gaseous ozone, we underlined its interest in the case of virucidal treatment of fragile food matrices. Therefore, this work specified the virus inactivation mechanisms and opened up new perspectives to discriminate infectious from non-infectious viruses but also to propose the exploration of new technological processes

La Déficience Intellectuelle liée au chromosome X (X-LID), anciennement appelée RMLX (retard mental lié au chromosome X) est une pathologie fréquente (3 % de la population) et handicapante. Cette déficience se manifeste par la réduction de la capacité à comprendre les informations nouvelles ou complexes, des difficultés d’acquisition de nouvelles compétences et l’échec dans la gestion de sa vie en toute autonomie ; celle-ci est souvent accompagnée par un dysmorphisme corporel. Cette pathologie s’installe dès l’enfance (avant l'âge de 18 ans) et a des répercussions sur le développement de l’individu (QI<70). La pathogénie de la déficience intellectuelle reste obscure et dans 50 % des cas, la cause n’est pas connue. Dix pour-cent (10 %) des cas de la déficience intellectuelle seraient liés à des gènes localisés sur le chromosome X, avec une mutation transmise par les mères et affectant principalement les garçons. Parmi les 931 gènes du chromosome X, seulement 114 gènes ont été identifiés comme gènes de déficience intellectuelle. Le dernier (le gène SSR4) fut caractérisé en mars 2014. À l’heure des technologies du séquençage de haut débit, le laboratoire de génétique moléculaire de l’hôpital Necker de Paris s'est doté d’une plateforme d’identification de mutation génétique humaine par séquençage à haut débit permettant le diagnostic des maladies rares. L’objectif de mon travail de thèse était d’appliquer l’approche du séquençage à très haut débit (technique SOLiD) dans l’identification de nouveaux gènes de la déficience intellectuelle liée au chromosome X chez des familles ayant des garçons atteints de déficience intellectuelle non-syndromique, d’identifier les mutations des gènes qui sont déjà connus et d’en discuter la corrélation génotype-phénotype. L’approche que j’ai utilisée dans cette étude est le diagnostic génétique par séquençage à haut débit de l’exome du chromosome X de vingt sujets appartenant à dix familles (X-LID) françaises. La procédure consiste à capturer l’exome du chromosome X des patients atteints, à l’enrichir par la technologie Rain-Dance, puis à le séquencer dans notre plateforme avec un séquenceur à haut débit de la technologie SOLiD5500 afin d’analyser les résultats et pour ne retenir que les nouvelles mutations et commenter leur pouvoir pathogène. Cette étude a mis en évidence de nouvelles mutations dans 21 gènes, dont neuf gènes ne sont pas encore décrits parmi les gènes X-LID et a révélé l’importance de l’hétérogénéité génétique tout en relevant la possibilité de l’effet des charges mutationnelles et le rôle gènes modificateurs. Certaines nouvelles mutations, nous les avons identifiées dans des gènes connus pour leur implication dans la déficience intellectuelle et les avons publiées durant les études doctorales. Pour confirmer la causalité des nouveaux gènes ayant muté chez les familles atteintes, des études fonctionnelles supplémentaires in vivo doivent être appliquées tout en suivant les publications sur le même sujet afin de comparer avec des cas similaires. / X linked Intellectual deficiency (X - LID); formerly X-LMR (X Linked Mental Retardation) is a common pathology (3 % of the population). Intellectual Deficiency (ID) is the most frequent cause of serious handicap in children and young adults. Defining features of ID include an overall intelligence quotient (IQ) of less than 70 together with associated functional deficits in adaptive behavior (such as daily living, social and communication skills), which manifest before18 years of age. ID pathogenesis remains obscure and 50% of cases have no known cause. Ten percent of the intellectual intellectual deficiency would be related to genes located on the X chromosome, and subsequently inherited by affected boys. Among the 931 genes of the X chromosome, only 114 genes have been identified as X-LID genes. The last (SSR4 gene) was characterized in March 2014. At the time of the Next Generation Sequencing (NGS), the laboratory of molecular genetics of Necker hospital in Paris is equipped with a platform for the identification of human genetic mutation by high-throughput sequencing for the diagnosis of rare diseases. The objective of my thesis work was to seek new genes for X linked intellectual deficiency in families with non-syndromes cognitive disorder affected boys and to identify mutations in the genes that are already known and to discuss the genotype, phenotype correlation. The approach that I have used in this study is genetic diagnosis by high-throughput sequencing of chromosome X exomes of 20 subjects belonging to ten X-LID French families. The procedure is to capture and enrich the exome of the X chromosome of patients, then to sequence it in our platform with a high throughput sequencer of SOLid technology then analyze the results and retain that new mutations to discuss their pathogenity. This study has highlighted new mutations in 21 genes, including nine that are not yet described among the X-LID genes. Some new mutations, we identified in genes known through their involvement in cognitive impairment were published during my doctoral studies. To confirm causality of new genes that were found mutated in families, additional studies in vivo must be applied while following the literature to make comparisons with similar cases.

Ce travail vise à étudier l'intérêt duchauffage micro-ondes pour l'inactivation desenzymes dans les jus de fruit, à travers desapproches numériques et aussi expérimentales.En premier lieu, une étude sur les propriétésdiélectriques des jus de fruits modèles est menée,démontrant leur forte sensibilité à la température,à la fréquence et à la composition du produit. Dansune seconde partie, l'inactivation de la peroxydaseest étudiée par chauffage conventionnel et lesdonnées sont ajustées par un modèle cinétique dupremier ordre. Dans la troisième et principalepartie de ce travail, un modèle tridimensionnel,résolu par éléments finis, est proposé pour simulerle chauffage par micro-ondes du jus, en couplantélectromagnétisme, transfert de chaleur etécoulement, avec la cinétique d'inactivation de laperoxydase précédemment déterminée.Cette simulation permet de prédire la distributionspatiale de la température, le profil d’écoulementet l'inactivation de la peroxydase. L’accord entre lemodèle et les expériences est très satisfaisant, cequi confirme la pertinence de l’approche. Dans ladernière partie, les réactivations de la peroxydaseaprès chauffage conventionnel et micro-ondessont évaluées et comparées. Enfin, l’éventuelleexistence d’effets non thermiques des microondesest discutée via des expériencesadditionnelles. En conclusion, ces travauxmontrent tout l’intérêt de la simulation numériquecomme outil de compréhension du processusmultiphysique du chauffage par micro-ondes pourl’inactivation des enzymes, ce qui peut êtreparticulièrement intéressant pour la conception etl’optimisation de traitements micro-ondes. / This work aims at studying the use ofmicrowave heating for enzyme inactivation in fruitjuices by means of numerical and experimentalapproaches. In the first part, a study on thedielectric properties of model fruit juices isconducted, evidencing their high dependence onthe temperature, frequency and composition of theproduct. Then in the second part, the inactivation ofperoxidase is studied using conventional heatingand the data are fitted by a first order kinetic model.In the third and main part of this work, a threedimensionalfinite element model is developed tosimulate the microwave heating of juices, couplingelectromagnetics, heat transfer and fluid flow aswell as the peroxidase inactivation kineticspreviously determined.As a result, spatial temperature distribution, flowpattern and peroxidase inactivation are obtained.The model is experimentally validated and goodagreement is observed, confirming the relevanceof the approach. Finally, in the last part, thepotential peroxidase reactivations afterconventional and microwave heating areassessed and compared. Also, the possibleexistence of non-thermal effects of microwaves isdiscussed thanks to additional experimentations.In conclusion, this work shows the large interest ofcomputer simulation as a tool for understandingthe multiphysics process of microwave heating forenzyme inactivation, which can be particularlyinteresting for further design of optimizedmicrowave processing.

Le développement embryonnaire précoce des mammifères femelles s’accompagne de l’inactivation transcriptionnelle d’un de leurs deux chromosomes X. Cet évènement est initié suite à l’expression mono-allélique de l’ARN non codant Xist, qui est contrôlée par de nombreux éléments cis-régulateurs présents dans le centre d’inactivation du chromosome X (Xic) – tel son anti-sens répresseur Tsix. Mon travail de thèse a consisté à développer des approches permettant d’appréhender le paysage structural dans lequel s’exerce cette régulation. La caractérisation de l’architecture tridimensionnelle du Xic, par des techniques basées sur la capture de conformation chromosomique (3C) et l’hybridation in situ en fluorescence (FISH), m’a permis de mettre en évidence que les promoteurs respectifs de Xist et Tsix sont engagés dans des interactions physiques intimes avec des loci distaux, localisés au sein du Xic, et de montrer qu’au moins certaines de ces régions exercent un effets régulateurs à longue-distance. Les éléments du Xic contactés par les régions promotrices de Xist et de Tsix sont en outre fondamentalement différents, chacune engageant des associations chromosomiques sur plusieurs centaines de kilobases dans leur direction 5’ respective.Ce travail a également permis de révéler des propriétés insoupçonnées de l’architecture chromosomiques. En effet, le Xic apparaît scindé en plusieurs sous-régions, couvrant chacune entre 200kb et 1Mb, à l’intérieur desquelles les interactions chromosomiques sont préférentiellement établies. L’existence de ces domaines d’interaction s’intègre avec d’autres propriétés structurales du génome, tels la composition de la chromatine sous-jacente et l’association à la lamine nucléaire, mais n’apparaît pas en dépendre directement. En étudiant la dynamique de la conformation chromosomique du Xic au cours de la différenciation cellulaire, j’ai pu constater la robustesse de cette organisation, sauf sur le chromosome X inactif, qui se distingue par la perte des contacts chromosomiques préférentiels détectables sur son homologue actif.Enfin, j’ai pu mettre en évidence que la variabilité du repliement général du chromosome X amène à un instant donné chaque allèle de Tsix à contacter physiquement des jeux de séquences distales différents, suggérant que l’environnement structural instantané de chacun de ces allèles à l’orée de l’activation mono-allélique de Xist est différent. Ce travail, combinant des approches à l’échelle de la population cellulaire d’une part et de la fibre de chromatine unique d’autre part, apporte une nouvelle vision du paysage structural et régulateur dans lequel s’inscrit le contrôle de l’activité transcriptionnelle de Xist, et fourni de nouvelles perspectives concernant les principes fondamentaux de l’organisation topologique des chromosomes chez les mammifères. / Early development of female mammals is accompanied by transcriptional inactivation of one of their two X chromosomes. This event is initiated following mono-allelic expression of the Xist non-coding RNA – what is achieved by the interplay of numerous cis-regulatory elements present within the X inactivation center (Xic), such as its repressive antisense Tsix. Our work aimed at throwing light on the structural landscape that underlies such long-range regulation. Characterization of the three-dimensional architecture of the Xic, by the means of Chromosome Conformation Capture (3C)-based techniques and in situ fluorescence hybridization (FISH), revealed that the respective promoters of Xist and Tsix contact many distal genomic elements within the Xic, and that at least one of such interacting region exerts long-range cis-transcriptional control. Noticeably, Xist and Tsix promoters associate with different sets of elements in their respective 5’ direction that are spread out over several hundreds of kilobases These experiments also revealed unforeseen properties of chromatin architecture. Indeed, the Xic appears to be partitioned in several sub-regions, each spanning between 200kb and 1Mb, inside which chromosomal interactions are preferentially established. The existence of these interaction domains integrates with other structural features of the genome, such as underlying chromatin composition and association with the nuclear lamina, but does not seem to directly depend on them. By analyzing chromosome conformation of the Xic during cell differentiation we document the robustness of this organizational principle, with the noticeable exception of the inactive X chromosome that assumes a folding pattern that is more random than its active homolog. Finally we also bring evidence that variability in the folding pattern of the two X chromosomes in the same cell brings each Tsix allele in association with different sets of chromosomal partners at a given moment, suggesting that the instantaneous structural environment of each allele at the onset of mono-allelic Xist up-regulation is different.By combining approaches at the scale of cell populations on the one hand, and at the single chromatin fiber level on the other, this study provides a first vision of the structural landscape in which Xist regulation takes place, and brings new insights concerning fundamental properties of chromosome organization in mammals.

Orientadores: Carlos Francisco Sampaio Bonafé, Marcelo Lancellotti / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-21T08:59:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Souza_AncelmoRabelo_M.pdf: 2604011 bytes, checksum: 68977693022bd1bef29d71963a2562d5 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Mycobacterium abscessus é um importante patógeno de origem hospitalar que contamina materiais cirúrgicos e biofarmacêuticos. Estes quando mal esterilizados tornam-se agentes infectantes gerando graves patologias nas pessoas que os utilizam. A crescente incidência desse patógeno, as dificuldades de tratamento, a gravidade clínica e, a dificuldade de esterilizar fômites contaminados com este patógeno motivou a investigação de processos alternativos de esterilização. Atualmente, utiliza-se a alta pressão hidrostática como método bastante adequado para reduzir a carga microbiana e esterilizar materiais hospitalares e biofarmacêuticos que são sensíveis à autoclave. Desta forma, investigou-se a inativação de M. abscessus induzida por pressão em diferentes condições de temperatura e de pH visando progredir em direção a um método de esterilização. De acordo com os resultados obtidos, tratamentos a 250 MPa não inativaram significativamente (5 a 8 ordens de magnitude) a bactéria em até 90 min a 20°C. Entretanto em -15°C a inativação foi completa. O tratamento a 250 MPa a 60ºC por 45 min promoveu significativa inativação bacteriana de até 9 unidades logarítmicas, incluindo o teste com PVC. Além disso, extremos de pH (4 ou 9) também diminuíram acentuadamente o número de bactérias tratados por alta pressão (250 MPa), com inativação completa após 45 min. Assim, este trabalho torna-se de suma importância, uma vez que aponta para o melhoramento de protocolos de descontaminação de fômites hospitalares / Abstract: Mycobacterium abscessus is an important hospital-acquired pathogen which induces infections from medical surgical and biopharmaceutical materials. The increasing incidence of this pathogen, the difficulties of treatment and clinical seriousness motivates the investigation of alternatives in sterilization processes. High hydrostatic pressure is a very adequate method for reducing microbial load and for sterilization of hospital materials and biopharmaceutical that are sensitive to autoclaving. We investigated the pressure-induced inactivation of M. abscessus combined with different temperatures and pH conditions aiming improvements toward a sterilization methodology. According to our findings, treatment at 250 MPa did not inactivate the bacteria significantly (5 to 8 orders of magnitude) up to 90 min at 20 oC, nevertheless at -15°C the inactivation was complete. The treatment at 250 MPa and 60ºC or above by 45 min promoted significant bacteria inactivation, at least 9 logarithmic units, including the test PVC. Extremes of pH values (4 or 9) also decrease very much the bacteria number induced by pressure (250 MPa), with complete inactivation at 45 min. The better knowledge of the effect of high hydrostatic pressure in micobacteria may contribute to improvements in the decontamination of medical materials and pharmaceuticals / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Skewed X chromosome inactivation has been often studied as a possible factor that influences manifestation of X-linked diseases in heterozygous women. Yet the association between phenotype and degree of skewing stays unclear for most disorders. Current works rely mostly on methods that are based on methyl-sensitive restriction while determining the X inactivation pattern and mainly the HUMARA assay which investigates the methylation profile in the AR gene. However those methods have some known disadvantages and therefore we are still seeking new methodical approaches. We used DNA isolated from whole blood and in some cases also buccal swabs to asses X inactivation patterns in 54 women using methylation-based methods for loci AR, CNKSR2 and RP2. Transcription-based assay was utilized to evaluate skewing of X inactivation in 32 of those women, whose samples were available for RNA extraction, using massive parallel sequencing and polymorphisms LAMP2 c.156A>T, IDS c.438C>T and ABCD1 c.1548G>A. Partly thanks to almost no stuttering during PCR the RP2 locus was the most informative in our study (71 % of women) and approximately the same number of women (69 %) were informative for the HUMARA assay. However when comparing the results of those two methods we determined difference greater than 10 % in...

Les hydrogénases sont des métalloenzymes qui catalysent la conversion réversible du dihydrogène en protons et en électrons. Durant ma thèse, je me suis focalisé sur certains aspects du fonctionnement de l’hydrogénase à [NiFe] hétérodimérique de Desulfovibrio fructosovorans. Nous avons montré que contrairement au mécanisme communément admis d’inactivation aérobie de l’enzyme, l’O2 n’est pas incorporé en tant que ligand au niveau du site actif mais agit plutôt comme un simple oxydant. Ce résultat remet en question le mécanisme proposé pour expliquer la tolérance naturelle à l’O2 de certaines hydrogénases. L’analyse à l’aide d’un modèle cinétique des voltamogrammes cycliques complexes obtenus avec 16 variants a montré que les vitesses d’(in)activation en conditions anaérobies peuvent être accélérées de plusieurs ordres de grandeurs. Nous avons aussi montré et expliqué la corrélation entre ces vitesses et la tolérance à l’O2. Nous avons étudié une série de mutants qui produisent H2 beaucoup plus lentement que l’enzyme sauvage. Nous avons montré que la vitesse de cette réaction est déterminée par celle de l’étape de diffusion du H2, qui est lente dans les mutants. Finalement, nous nous sommes intéressés à une thréonine appartenant à la voie putative de transfert des protons. Nous avons démontré que cet acide aminé est effectivement impliqué dans le transport des protons. Il joue aussi un rôle crucial dans la stabilisation des intermédiaires formés au cours du cycle catalytique et probablement dans la détermination des vitesses de transfert électronique et de diffusion à travers le canal. / Hydrogenases are metalloenzymes which catalyse the reversible conversion of dihydrogen into protons and electrons. In my work, I focused on some aspects of the catalytic mechanism of the heterodimeric NiFe hydrogenase from Desulfovibrio fructosovorans. We demonstrated that, contrary to the commonly accepted mechanism of aerobic inactivation, the attacking O2 is not incorporated as an active site ligand but rather acts as an electron acceptor. This finding calls for a re-examination of the mechanism for O2 tolerance of the natural O2 tolerant NiFe hydrogenases. We also described a simple analytical model that we used to analyse the complex voltammetric signals of 16 mutants obtained by substituting an amino acid near the active site. We demonstrated that this substitution can accelerate anaerobic inactivation and reactivation by up to three orders of magnitude. We also demonstrated and explained the correlation between these rates and O2-tolerance. We studied mutants whose H2-production activity is impaired. We found that the rate limiting step of this reaction is the diffusion of hydrogen out of the enzyme, through the hydrophobic channel. Finally, we focused on a threonine belonging to the putative proton transfer pathway. We demonstrated that this amino acid is indeed implicated in proton transport. It may also play a crucial role in the stabilization of intermediates formed during the catalytic cycle, and probably also in determining the rate of electron transfer and diffusion along the gas channel.