Le genre Pneumocystis regroupe des microchampignons atypiques qui colonisent par voie respiratoire les alvéoles pulmonaires de nombreux mammifères. C’est un pathogène opportuniste qui s’avère particulièrement dangereux lorsque le système immunitaire de l’hôte est déficient (VIH, greffés) et dans ce cas il provoque une pneumonie, la pneumocytsose, fatale en absence de traitement. Du fait que les Pneumocystis spp restent des microchampignons non cultivables, il est alors impossible de manipuler directement ses gènes et la seule solution pour étudier leurs fonctions et leurs localisations, demeure leur expression en système hétérologue. Situé dans l'espace alvéolaire, Pneumocystis spp. sont exposés au stress oxydatif générés par les macrophages alvéolaires, les granulocytes neutrophiles ainsi que par les espèces réactives de l'oxygène (EROs) produits par le métabolisme respiratoire. Pour se protéger, ces micro-organismes ont développé un système spécifique de détoxification des EROs incluant les SuperOxyde Dismutases (SOD). Dans notre étude, la carence en MnSOD d'une souche de Saccharomyces cerevisiae (EG110) dépourvue du gène Scsod2 a été complétée par l'introduction d'un plasmide portant une version inductible du gène Sod2 de P. carinii (Pcsod2). Une fois exprimée la PcMnSOD était capable de complémenter le défaut de croissance de la souche EG110 qui a été exposés à la ménadione. En bref, notre étude a montré une bonne complémentation du gène Sod2 de P. carinii chez une levure déficiente en MnSOD à savoir (i) la reprise de la culture en conditions de stress oxydant, (ii) la mise en évidence de la protéine traduite (Western Blot) et (iii) l’adressage mitochondriale de la protéine hétérologue. Selon le degré d’altération du système immunitaire, les infections à P. jirovecii peuvent présenter des tableaux cliniques variés allant de la colonisation à la pneumocystose. Ces infections semblent être en grande partie liées à des déficits majeurs de l’immunité cellulaire se traduisant plus précisément par une diminution du nombre des lymphocytes TCD4 (LTCD4). Notre deuxième objectif était de parvenir à une appréciation quantitative du risque de contamination par P. carinii en fonction du degré d’immunodépression (ID) des rats exposés. Nous avons ainsi développé un modèle animal de transmission naturelle de P. carinii où des rats nude développant une pneumocystose (« rats donneurs ») sont mis en contact direct avec des rats Sprague Dawley Pneumocystis-free (« rats receveurs ») présentant différents niveaux d’ID (dexamethasone). Après 2 semaines de contact, le niveau de colonisation des rats graduellement ID est déterminé soit par comptage après coloration au Bleu de Toluidine O, soit par qPCR. Cette étude a permis tout d’abord de valider notre modèle d’ID graduelle chez le rat ; mais surtout, et pour la première fois dans un modèle expérimentale chez le rat, nous avons montré une relation inverse entre le niveau de colonisation par P. carinii et le taux de LTCD4 ou LTCD8 circulants. Enfin, nous avons réalisé la première étude épidémiologique portant sur Pneumocystis au Liban. Ce projet franco-libanais a été mis en place au vue de l’importance majeure de la colonisation par Pneumocystis chez les patients immunocompétents, en particulier chez les patients atteints de pathologies pulmonaires chroniques obstructives tels que la BPCO où la colonisation par Pneumocystis est considérée comme un facteur aggravant de la maladie. Nos résultats montrent une faible prévalence de colonisation (5.2%) et une prédominance du génotype mtLSU2 chez les patients atteints de pathologies respiratoires au Liban. De plus, dans notre cohorte de patient présentant des pathologies respiratoires variées, la BPCO semble être la seule maladie respiratoire associée à un facteur de risque de colonisation par P. jirovecii. / Pneumocystis is an opportunistic pulmonary fungal pathogen that causes Pneumocystis pneumonia (PcP) in immunocompromised individuals such as patients with HIV infection as well as those without HIV infection who are undergoing immunosuppression as a consequence of chemotherapy or organ transplantation. Pneumocystis colonization in immunocompetent individuals has recently been described by the detection of fungal DNA without signs or symptoms of pneumonia, and accumulating evidences underline its clinical importance. Pneumocystis organisms are airborne transmitted and represent a large group of species of atypical fungi that cannot be continuously grown in culture. Consequently, it is impossible to directly manipulate genes in Pneumocystis species. Located in the alveolar space, Pneumocystis organisms are exposed to oxidative burst from phagocytic alveolar macrophages and neutrophils as well as to reactive oxygen species (ROS) produced by the mitochondrial oxygen metabolism. To counteract this, microorganisms have developed a ROS detoxifying system. This includes superoxide dismutases (SOD). In the present study, the MnSOD deficiency of a Saccharomyces cerevisiae mutant strain was complemented by introducing a plasmid carrying an inducible version of the P. carinii Sod2 gene (Pcsod2). Expression of Pcsod2 revealed that the corresponding MnSOD recombinant protein could complement the growth defect in the mutant yeast strain when cells were exposed to menadione. The mitochondrial localization was confirmed by immuno-colocalization of the P. carinii recombinant MnSOD with the yeast mitochondrial Cox4 protein. These results suggest that Pcsod2 encodes an active MnSOD that is targeted to the mitochondrion. This work increases our understanding of the antioxidant defense mechanisms deployed by the Pneumocystis organisms.The adaptive host response to Pneumocystis infection involves humoral and cellular immune responses working in concert to promote the clearance of infection. Depending on the degree of alteration of the immune system, Pneumocystis infections may have various clinical presentations going from colonization to the most severe form (PcP).These infections appear to be largely related to major deficits in cellular immunity and are more closely reflecting a decrease in the number of CD4 T lymphocytes (LTCD4). Our objective was to achieve a quantitative assessment of the risk of contamination by Pneumocystis depending on the degree of immunosuppression (ID) of the exposed host. Thus, we developed an animal model of natural transmission of P. carinii where rats undergoing gradual ID (dexamethasone) named receivers, are cohoused with nude rats developing PcP, named donors. Following contact between receiver and donor rats, the level of colonization by Pneumocystis of receiver rats is determined by toluidine blue O staining or by qPCR. This study allowed us to validate our gradual ID rat model, in the sense that we were able to maintain the level of circulating LTCD4 and LTCD8 stable. Finally, and for the first time in an experimental rat model, we observed an inverse relationship between the level of colonization by P. carinii and the level of circulating LTCD4 and LTCD8.Finally, we aimed to acquire the first data concerning the prevalence of P. jirovecii in the Lebanese population. This Franco-Lebanese project was set up because the colonization by Pneumocystis is probably of major importance in the public health, especially in susceptible patients such as patients with chronic obstructive pulmonary diseases (COPD) where Pneumocystis is considered as a worsening prognosis factor. Our results show a low prevalence of P. jirovecii colonization (5.2%) and the predominance of mtLSU genotype 2 in patients with respiratory diseases in Lebanon. Moreover, in our cohort of patients with various respiratory diseases, COPD was the only respiratory disease associated with a significant increased risk of P. jirovecii colonization.

L’empreinte écologique de l’homme sur les milieux naturels forestiers d’Afrique centrale n’a cessé de s’accroître au cours des dernières décennies, et rares sont les écosystèmes qui ne sont pas exploités. Ainsi, même des milieux a priori hostiles comme les grottes constituent des ressources répondant aux besoins primaires des populations environnantes (chasse, pêche, lieu de culte), mais permettant également le développement d’activités économiques (exploitation minière et écotourisme). Cette anthropisation est susceptible d’augmenter l’exposition des populations humaines à une multitude d'agents infectieux circulant au sein de la faune cavernicole. La présence d'animaux sauvages ou domestiques dans l'environnement immédiat des grottes contribue également à augmenter un tel risque. Parmi ces agents infectieux, certains peuvent être transmis par contact direct avec le réservoir animal, d’autres peuvent nécessiter l’intervention d’insectes hématophages. Le rôle de ces insectes dans l'épidémiologie de nombreux pathogènes est bien connu en Afrique en milieux épigés, mais demeure largement sous-investigué dans les environnements cavernicoles. Dans ce travail de thèse, nous nous sommes proposés de réponde à cette problématique. Dans six grottes du Gabon nous avons entrepris une étude de la diversité des diptères hématophages, en réalisant un inventaire taxonomique et l'étude de la dynamique temporelle des assemblages d'espèces. Dans un second temps, nous avons entrepris un criblage moléculaire d'agents infectieux parasitaires, bactériens et viraux en ayant recours à des techniques de détection par PCR nichée et séquençage à haut débit.Les travaux menés nous ont permis de réaliser un inventaire taxonomique de la faune diptérienne hématophage colonisant les grottes explorées. Notre étude a permis de découvrir une part importante de sa diversité de diptères hématophages cavernicoles, représentant plus de 60% des espèces de diptères (tout milieux confondus) actuellement au Gabon. Nos données ont montré que la composition des communautés de diptères était différente d'une grotte à une autre, et que ces dernières présentaient des variations au cours du temps en lien avec les variations microclimatiques des grottes. Le criblage d'agents infectieux chez les diptères collectés a permis 1) d'explorer la diversité parasitaire, virale et bactérienne qu'ils hébergent et 2) d'évaluer leur implication dans la transmission / The man's ecological mark on natural forest environments of central Africa has been increasing in recent decades, and only few natural areas remain non exploited yet. Thus, even supposedly hostile environments such as caves meet the primary needs of surrounding populations (hunting, fishing, shamanic practices), or economical needs (mining and ecotourism). That anthropization is likely to increase the exposure of human populations to multiple infectious agents carried by cave fauna. The presence of wild or domestic animals in the surroundings of caves also increase that risk. Among these infectious agents, some can be transmitted by direct contact with animal reservoirs, whereas others may require the involvement of blood-sucking insects. The role of these insects in the epidemiology of many pathogens is well known in Africa, particularly in epigeic environments, but remains largely investigated in caves. In this thesis work, we proposed to address that issue. In six caves of Gabon we firstly explored the diversity of blood-sucking Diptera, and we studied temporal dynamics of species assemblages. Secondly, we undertook a molecular screening of haemosporidia, bacteria and viruses using nested PCR and high-throughput sequencing.The work carried out has enable to make a taxonomic inventory of the Diptera fauna of the investigated caves. Our study revealed a significant diversity of the blood-sucking Diptera fauna, accounting for more than 60 percent of blood-sucking Diptera species currently known in Gabon, in all types of areas. Our data showed that the composition of Diptera communities was different from one cave to another, and that Diptera assemblages varied over time according to micro-climate fluctuations within caves. The screening of infectious agents in Diptera collected helped 1) to explore the parasitic, viral and bacterial diversity they host, and 2) to assess their involvement in transmission.

Le genre Aeromonas regroupe des bactéries ubiquitaires vivant essentiellement dans les environnements hydriques. Ces pathogènes opportunistes de l’homme et de nombreux animaux possèdent un large répertoire de facteurs associés à la virulence. Bien que des pathotypes aient été proposés et que certaines espèces semblent plus fréquemment isolées en clinique humaine et vétérinaire, leur pouvoir pathogène demeure mal compris, notamment en raison du faible nombre d’études fonctionnelles et du manque d’investigations tenant compte de la diversité génétique et de la complexité des comportements biologiques du genre Aeromonas.Nous avons émis l’hypothèse que chez un pathogène opportuniste d’origine environnementale aussi polyvalent et ubiquitaire qu’Aeromonas, la structuration en complexes d’espèces avec une remarquable diversité génétique/génomique des populations, le polymorphisme des facteurs de virulence et les interactions au sein de communautés « pathogènes » puissent être des facteurs d’adaptation au comportement pathogène. Afin de vérifier cette hypothèse, nous avons étudié i) la diversification au sein d’un complexe d’espèces, « A. media », utilisé comme modèle au moyen d’une étude de population intégrant la génétique et la phylogénie multilocus, les mécanismes d’évolution, la génomique comparative mais également les données phénotypiques, de modes de vie et d’habitats et, ii) la patho-génomique de facteurs de virulence reconnus (aérolysine, entérotoxines thermostable et thermolabile, exotoxine A, protéase à sérine, composants et effecteurs du système de sécrétion de type III, et flagelline latérale) pour une population représentative de la diversité des espèces actuellement connue dans le genre (30 espèces) et iii) le comportement pathogène in vivo (modèle Caenorhabditis elegans) et in vitro (cytotoxicité et cytoadhésion, production de biofilm, motilité) et la signalisation intercellulaire (quorum-sensing de type I) à l’échelle de populations impliquées dans les aéromonoses mixtes (5% des aéromonoses humaines) définies par l’isolement d’au moins 2 clones distincts d’Aeromonas.Le phénomène de spéciation décrit avec l’exemple du complexe A. media, agrégeant 3 espèces génomiques, démontre qu’Aeromonas possède une structure de population en complexes d’espèces dont la diversité génétique et génomique ainsi que les modes d’évolution (mutations et recombinaisons) révèlent divers potentiels adaptatifs et patho-adaptatifs associés à l’émergence de lignées. Au sein du complexe A. media, l’espèce A. rivipollensis semble plus adaptée à un mode de vie associé à des hôtes et possède des gènes spécifiques de résistance à des stress environnementaux. Aeromonas possède de nombreux facteurs de virulence présentant diverses histoires évolutives. Certains montrent une phylogénie dépendante de l’évolution du core-génome, suggérant l’implication de ces gènes dans des processus de spéciation en relation avec l’adaptation à diverses niches. L’étude des performances de PCRs de virulence a révélé des insuffisances majeures dans la sensibilité des méthodes évaluées principalement liées au polymorphisme génétique des facteurs de virulence. Nous avons également montré que des populations mixtes d’Aeromonas isolées d’échantillons cliniques pouvaient modifier le déroulement de l’infection en modèles in vivo et in vitro probablement par mécanisme de coopération ou de compétition avec mise en jeu de signaux de communication cellule-cellule.L’importante complexité d’Aeromonas retrouvée à travers la structure de population, le polymorphisme des facteurs de virulence et les comportements de multicellularité sont autant de facteurs potentiels d’adaptation au comportement infectieux qui permettent d’expliquer au moins en partie les difficultés rencontrées dans l’élucidation de pouvoir pathogène de ces bactéries. / Aeromonas groups ubiquitous bacteria mainly living in aquatic environments. These opportunistic pathogens for human and numerous animals have a large repertoire of virulence-associated factors. Although pathotypes were proposed and despite some species are more frequently isolated in human and animal infections, their pathogenicity is still poorly understood, mostly because very few comprehensive functional studies are available and because investigations taking into account the genetic diversity and the biological complexity within the genus are lacking.We assumed that for an opportunistic bacterial pathogen of environmental origin as versatile and ubiquitous as Aeromonas, the population structure in complex of species, the outstanding genetic/genomic diversity, the polymorphism of virulence factors and the interactions within pathogenic populations can act as factors driving the adaptation to a pathogenic behaviour. To test this hypothesis, we studied i) the diversification within “A. media”, a complex of species used as a model by a population study that included multilocus genetics, phylogenetics, evolutionary features, comparative genomics, as well as phenotypics, lifestyle and habitat ii) the patho-genomics of well-known virulence factors in aeromonads (aerolysin, thermolabile and thermostable enterotoxins, exotoxin A, serine protease, components and effectors of type III secretion system, and lateral flagellin) in a population that is representative of the known taxonomic diversity in the genus (30 species) and iii) the pathogenic behaviour using an in vivo model (Caenorhabditis elegans), an in vitro model (cytotoxicity, cytoadhesion, biofilm production, motility), and intercellular signals production (type I quorum-sensing) for populations involved in mixed aeromonosis, i.e. 5% of human aeromonosis defined by the isolation of at least 2 distinct clones.The phenomenon of speciation described in the complex “A. media” that aggregates 3 genomic species demonstrates that Aeromonas harbours a population structured in complexes of closely related species whose genetic and genomic diversity, as well as evolution mode (mutations and recombinations) reveal a wide adaptative and patho-adaptative potential linked to lineage emergence. Among the complex “A. media”, the species A. rivipollensis seems to be more adapted to a host-associated lifestyle and harbours specific genes for the resistance to environmental stress. Aeromonas has a wide range of virulence-associated genes, which presented diverse evolutive history. Some of them display a phylogeny linked to the core-genome evolution. These results suggest that these genes are involved in speciation processes probably related to niches adaptation. The evaluation of performances of virulence PCRs revealed major lacks of sensitivity of tested methods mainly due to the genetic polymorphism of the virulence factors. By using in vivo models and in vitro models, we also showed that Aeromonas mixed populations recovered from clinical samples could change the course of infection, likely through a cooperative or competitive mechanism that involves cell-to-cell signalling.The high complexity of Aeromonas results from its population structure, virulence factors polymorphism and multicellular behaviours. They are all putative adaptation factors to a pathogenic behaviour that may explain at least partially the difficulties encountered to elucidate pathogenicity of these bacteria.

Sepsis remains a severe issue in critically ill patients. Adjunctive therapies might play important role to decrease morbidity and mortality. The aim of this thesis is to investigate new adjunctive therapies role in the treatment of sepsis and septic shock. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La protéine Nef des virus de l’immunodéficience humaine (VIH-1 et VIH-2) joue un rôle essentiel dans la physiopathologie de l’infection et induction du SIDA. La capacité de Nef à perturber le trafic intracellulaire de protéines membranaires, et notamment du récepteur CD4, circulant entre les compartiments de la voie d’endocytose pourrait rendre compte de son importance comme facteur de virulence au cours de l’infection naturelle. Les mécanismes responsables des perturbations de la voie d’endocytose induites par Nef au cours de l’infection ne sont pas totalement élucidés, mais il est admis qu’elles résultent d’interactions avec les complexes adaptateurs (AP) associés à la clathrine et participant au transport vésiculaire entre les différents compartiments de la voie d’endocytose. Notre objectif était de déterminer les mécanismes par lesquels Nef influe positivement sur le pouvoir infectieux du VIH-1 en interagissant avec la machinerie cellulaire de la voie d’endocytose. Notre programme s’est organisé autour de deux axes principaux: le premier a consisté à étudier l’implication respective des différents types de complexes AP (AP-1, -2 et -3) sur les perturbations du fonctionnement de la voie d’endocytose induites par Nef en analysant son impact sur le niveau d’expression de surface de CD4; le deuxième axe a consisté à évaluer l’impact de l’interaction de Nef avec les complexes AP sur les capacités infectieuses des particules virales. Le rôle respectif des différents complexes AP dans ces fonctions de Nef a donc été étudié après déplétion de l’expression des complexes AP-1, AP-2 et AP-3 par une approche d’ARN interférence. Les résultats obtenus montrent que contrairement à certaines données de la littérature, la déplétion des complexes AP de la voie d’endocytose ne semble pas avoir un impact majeur sur la capacité de Nef à moduler l’expression de surface de CD4, même si une légère diminution de l’activité de Nef a pu être révélée dans notre étude réalisée sur des cellules HeLa-CD4 transduites par les shRNA ciblant les complexes AP-2. Inversement, nos résultats confirment que la déplétion des complexes AP-1, AP-2 et AP-3 dans les cellules productrices des particules virales se traduit par une diminution importante des propriétés infectieuses de ces particules sur lesquelles l’impact positif de Nef n’est plus alors capable de se manifester. En conclusion, ce travail a donc permis de montrer que les complexes AP de la voie d’endocytose sont indispensables pour que Nef puisse exercer son rôle positif sur le pouvoir infectieux du VIH-1. Il est maintenant important de confirmer ces résultats en analysant le rôle fonctionnel des complexes AP sur les activités de Nef dans les cibles cellulaires naturelles du VIH-1, lymphocytes et macrophages. / Nef protein of human immunodeficiency virus (HIV-1 and HIV-2) plays an essential role in the pathophysiology of infection and induction of AIDS. The ability of Nef to disrupt intracellular trafficking of membrane proteins, including the CD4 receptor, moving between the compartments of the endocytic pathway could account for its importance as a virulence factor during natural infection. The mechanisms responsible for disruption of the endocytic pathway induced by Nef during infection are not fully understood, but it is accepted that they arise from interactions with adaptor complexes (AP) associated with clathrin and participant in vesicular transport between the different compartments of the endocytic pathway. Our objective was to determine the mechanisms by which Nef positively affects the infectivity of HIV-1 by interacting with the cellular machinery of the endocytic pathway. Our program has been organized around two main axes: the first was to investigate the respective involvement of different types of complexes (AP-1, -2 and -3) on the Nef induced disruption of the endocytic pathway by analyzing its impact on the level of surface expression of CD4; the second axis was to evaluate the impact of the interaction of Nef with AP complexes on the infectious capacity of the viral particles. The respective roles of the different AP complexes in these functions of Nef has been studied after depletion of the expression of complex AP-1, AP-2 and AP-3 by RNA interference approach. The results show that, contrary to some literature data, depletion of AP complex endocytic pathway does not appear to have a major impact on the ability of Nef to modulate the surface expression of CD4, although a slight decreased activity of Nef could be revealed in our study on HeLa-CD4 cells transduced with the shRNA targeting complex AP-2. Conversely, our results confirm that the depletion of complex AP-1, AP-2 and AP-3 in the cells producing viral particles resulted in a significant decrease in infectious properties of these particles on which the positive impact of Nef is no longer able to manifest. In conclusion, this work has shown that complex AP of endocytic pathway are essential for Nef to exercise its positive role in the infectivity of HIV-1. It is now important to confirm these findings by analyzing the functional role of AP complexes on the activities of Nef in the natural cellular targets of HIV-1, lymphocytes and macrophages.

Les microorganismes du domaine du vivant Archaea sont très divers sur le plan biologique et sont présents dans de nombreux types d'écosystèmes. Ils sont majoritaires dans les environnements dits extrêmes. Parmi les virus d'archées, ceux infectant les espèces d'un phylum majeur des archées, Crenarchaeota, constitué d'hyperthermophiles, forment un groupe exceptionnel. En effet, leurs morphotypes sont uniques, variés, et complexes. Le contenu de leur génome est également unique. Enfin, la plupart de ces virus se maintiennent dans la cellule hôte en état porteur, une relation chronique qui permet un équilibre entre production de virions et division cellulaire. J'ai d'abord démontré que le virus de crenarchée Sulfolobus islandicus rod-shaped virus 2 est un virus virulent, et non chronique comme il avait été suggéré. Un mécanisme de lyse unique a été découvert. La paroi cellulaire est modifiée en plusieurs points, avec l'apparition de structures pyramidales saillantes. Celles-ci s'ouvrent en fin de cycle infectieux, permettant aux virions, assemblés auparavant dans le cytoplasme, de quitter la cellule. Puis j'ai travaillé sur des échantillons de sources géothermiques de la péninsule de Kamchatka (Russie) et contribué à l'isolement et la caractérisation d'un virus de morphotype filamenteux. Des protéines structurales supplémentaires ont ainsi été identifiées. Enfin, des mots courts exceptionnels ont été identifiés dans un grand nombre de génomes d'archées et de leurs éléments extra-chromosomiques. Ce sont potentiellement des motifs fonctionnels non-codants, impliqués dans des mécanismes biologiques importants. Typiquement, les motifs palindromiques sont évités dans les génomes / The microorganisms from the Archaea domain are very diverse at the biological level and they are present in many types of ecosystems. They are dominant in the so-called extreme environments. Among their viruses, those infecting species of the Crenarchaeota phylum, a major archaeal phylum comprising hyperthermophiles, form an exceptional group. Indeed, their morphotypes are unique, diverse, and complex. Their genome content is also unique. Finally, most of these viruses persist in the host cell in a carrier state, a chronic relationship allowing an equilibrium between virion production and cell division. I first proved that Sulfolobus islandicus rod-shaped virus 2 is a virulent virus, and not chronic, as had previously been suggested. A unique lysis mechanism was discovered. The cell wall is modified in several locations, with the appearance of pyramidal prominent structures. Those burst open at the end of the infection cycle, allowing the virions, previously assembled in the cytoplasm, to leave the cell. Then, I worked on environmental samples from geothermal springs of the Kamchatka peninsula (Russia) and contributed to the isolation and characterization of a virus of filamentous morphotype. Additional structural proteins were in particular identified. Finally, short exceptional words were identified in a great number of genomes from archaea and their extra-chromosomal elements. These are potentially functional non-coding motifs involved in important biological mechanisms. Typically, palindromic motifs are avoided in the genomes

Des souches de Vibrio appartenant au clade Splendidus sont retrouvées de manière récurrente lors des mortalités estivales d'huîtres juvéniles. La souche V. tasmaniensis LGP32 est un pathogène intracellulaire facultatif des hémocytes d'huître, dont elle altère les fonctions de défense. Nous montrons ici que LGP32 se comporte comme un pathogène intravacuolaire qui survit au sein de larges vacuoles intrahémocytaires. Il induit des effets cytopathiques tels qu'une perméabilisation membranaire et un lessivage du contenu cytosolique des hémocytes. Cette cytotoxicité est dépendante de l'invasion hémocytaire. Par ailleurs, à l'intérieur du phagosome, LGP32 sécrète des vésicules de membrane externe (OMVs). Chez LGP32, ces OMVs jouent un rôle protecteur contre les défenses de l'hôte et servent de véhicules pour la délivrance de facteurs de virulence aux cellules de l'hôte. En effet, elles sont capables de titrer les peptides antimicrobiens et présentent un fort contenu en hydrolases (25% du protéome des OMVs). Une sérine protéase, nommée Vsp car elle est uniquement sécrétée par voie vésiculaire participe à la virulence de LGP32 en infections expérimentales mais ne dégraderait pas les peptides antimicrobiens. Par une approche transcriptomique, nous avons identifié une série de gènes impliqués dans la réponse anti-oxydante et l'efflux de cuivre, qui sont surexprimés dans les stades intracellulaires précoces de LGP32. La génomique fonctionnelle a montré que ces deux fonctions importantes sont requises pour la survie intracellulaire, la cytotoxicité et la virulence de LGP32. Leur grande conservation parmi les vibrios laisse supposer qu'elles puissent contribuer à la survie intracellulaire d'autres espèces de Vibrio. / Vibrio strains belonging to the Splendidus Clade have been repeatedly found in juvenile diseased oysters affected by summer mortalities. V. tasmaniensis LGP32 is an intracellular pathogen of oyster hemocytes which has been reported to alter the oxidative burst and inhibit phagosome maturation. We show here that LGP32 behaves as an intravacuolar pathogen that survives within large cytoplasmic vacuoles. LGP32 induces cytotoxic effects such as membrane disruptions and cytoplasmic disorders. Cytotoxicity was shown to be entirely dependent on LGP32 entry into hemocytes. Moreover, LGP32 releases outer membrane vesicles (OMVs) inside the phagosome. LGP32 OMVs were found to be protective against host defenses and to serve as vehicles for the delivery of LGP32 virulence factors to oyster immune cells. Indeed, OMVs conferred a high resistance to antimicrobial peptides. They also displayed a high content in hydrolases (25 % of total proteome) among which a serine protease, named Vsp for vesicular serine protease, was found to be specifically secreted through OMVs. Vsp was shown to participate in the virulence phenotype of LGP32 in oyster experimental infections but did not degrade AMPs entrapped in OMVs. By developing a transcriptomic approach, we identified a series of Vibrio antioxidant and copper efflux genes whose expression is strongly induced within oyster hemocytes. Construction of isogenic deletion mutants showed that resistance to reactive oxygen species and copper efflux are two important functions required for LGP32 intracellular survival, cytotoxic effects and virulence. Their high conservation among vibrios suggests they could contribute to intracellular survival of other Vibrio species.

La famille des Flexiviridae a été créée en 2004 et regroupe plusieurs genres viraux affectant particulièrement des espèces ligneuses dont des arbres fruitiers. Grâce à diverses approches plusieurs nouveaux Flexiviridae ont été partiellement caractérisés au cours de ces dernières années. En revanche la position taxonomique précise de certains d’entre eux et leur contribution à des pathologies particulières restent encore incertaines du fait de difficultés inhérentes à l’étude de ces agents. Dans le présent travail, nous avons obtenu les séquences génomiques complètes pour quatre agents proches de l’Apricot latent virus. Ceci a permis de préciser l’organisation génomique de ces virus et d’en déterminer la position taxonomique. Cette étude a également permis de montrer que la partie C-terminale de la capside et la protéine TGBp1 sont soumises à une pression sélective particulièrement forte. Dans un second volet de ce travail, plusieurs approches permettant l’obtention simple et rapide d’ADNc infectieux, sous forme clonée ou non ont été développées. Travaillant sur plusieurs Flexiviridae, dont le virus des taches foliaires chlorotiques du pommier (Apple chlorotic leaf spot virus, ACLSV), nous avons mis au point l’amplification d’ADNc génomiques complets en une seule étape à partir d’extraits d’acides nucléiques totaux obtenus à partir de plantes infectées. Des amplifiats comportant l’ADNc viral sous le contrôle du promoteur 35S du CaMV ou du promoteur de la RNA polymérase du phage T7 ont été obtenus et utilisés pour infecter des plantes directement par biolistique (promoteur 35S) ou pour obtenir des ARN infectieux par transcription in vitro (promoteur T7). Ces données ont mis en évidence des différences importantes dans le comportement de deux hôtes de l’ACLSV, Chenopodium quinoa et Nicotiana occidentalis 37B. Nous avons également utilisé le système de recombinaison homologue de la levure Saccharomyces cerevisiae simplifier le clonage d’ADNc complets amplifiés par PCR ou pour réaliser en une seule étape la construction d’un vecteur navette ternaire levure-E. coli-A. tumefaciens et l’obtention d’un clone ADNc de l’ACLSV inoculable par agroinfiltration. Ces différentes stratégies devraient trouver une large application, en particulier pour tester plus rapidement des hypothèses d’étiologie pour les virus de plantes réputés "difficiles", tels que ceux infectant des hôtes ligneux. / The Flexiviridae family was created in 2004 and contains several viral genera affecting in particular woody hosts, including fruit trees. Using various strategies several new Flexiviridae have been partially characterized in the past few years. However, due to difficulties inherent in studying these agents, the precise taxonomic position of some of them and their contribution to particular diseases are still uncertain. In the present work, the complete genomic sequences of four Prunus-infecting Apricot latent virus (ApLV) like isolates have been determined. This has allowed to determine the genomic organization and the taxonomic position of these viruses. The results obtained also indicate that the C-terminal half of the coat protein and the TGBp1 are the genomic regions under the strongest purifying selection pressure. In the second part of this work, a set of approaches to simplify and streamline the construction of cloned or uncloned infectious full-length viral cDNAs were developed. working with several Flexiviridae and, in particular, with the Apple chlorotic leaf spot virus (ACLSV), we have developed protocols allowing the one-step amplification from total nucleic acids extracts of full-length cDNAs. under the control of the CaMV 35S or phage T7 RNA polymerase promoters. Successful inoculation of plants with these uncloned amplification products was obtained by biolistic bombardment (35S promoter) or using in vitro synthesized RNA transcripts (T7 promoter). Results obtained showed significant differences in the behavior of the two ACLSV hosts, Chenopodium quinoa and Nicotiana occidentalis 37B. We also used the yeast homologous recombination system for the efficient cloning of full-length cDNAs and for the simultaneous one-step construction of a ternary yeast-E. coli-Agrobacterium tumefaciens shuttle vector and generation of an agroinfiltrable infectious ACLSV construct. These various strategies should find broad applications, in particular for the validation of etiological hypotheses in the case of “difficult” plant viruses, such as those infecting woody hosts.

L'émergence des zoonoses est à relier directement avec les perturbations générées par l'Homme sur son environnement naturel à plus ou moins grande échelle. Sur l'ensemble des zoonoses émergentes chez l'Homme, la majorité provient d'animaux sauvages. L'étude du rôle de la faune sauvage dans la circulation des agents pathogènes est donc cruciale en particulier quand les interfaces faune sauvage/Homme sont fortes. L'objectif de cette thèse a été de comprendre par des approches éco-épidémiologiques à large échelle, la circulation d'agents pathogènes dans les populations d'un oiseau sauvage en contact étroit avec l'Homme, le goéland leucophée (Larus michahellis). Le premier chapitre présente les différentes méthodes utilisées dans la surveillance d'agents pathogènes ainsi que leurs limites lorsqu'elles sont menées en populations naturelles. Ce chapitre met en évidence au travers d'une étude portant sur les virus influenza aviaires, que la quantification des anticorps maternels dans les œufs est un outil efficace. Le second chapitre consiste à élargir l'échelle spatiale de l'étude afin de mettre en évidence plus finement les facteurs éco-épidémiologiques influençant la transmission des virus influenza aviaires dans et entre les populations de goéland leucophée de l'ouest méditerranéen. Enfin, le dernier chapitre repose sur la comparaison des patrons d'expositions obtenus pour des agents pathogènes au mode de transmission vectoriel : les flavivirus. Cette thèse permet de mettre en évidence les patrons d'exposition de certains agents pathogènes (virus influenza aviaire et flavivirus) et d'appréhender les facteurs éco-épidémiologiques potentiellement impliqués dans leurs circulations. Les résultats permettent d'envisager de futurs axes de recherches, nécessaires pour évaluer plus précisément la dispersion de ces virus en Méditerranée. / The emergence of zoonotic diseases is directly linked to the noise generated by humans on the natural environment to a greater or lesser extent. Of all the emerging zoonoses in humans, the majority comes from wild animals. The study of the role of wildlife in the circulation of pathogens is crucial, especially when wildlife/human interfaces are prominent. The aim of this thesis is to understand, using large scale eco-epidemiological approaches, the circulation of pathogens in a close to human population of wild bird, the yellow-legged gull (Larus michahellis). The first chapter presents the different methods used in the monitoring of pathogens and their limitations when they are conducted in natural populations. This chapter further highlights, through a study of avian influenza viruses, that the quantification of maternal antibodies in eggs is an effective tool. The second chapter expands the spatial scale of the study to highlight the finer eco-epidemiological factors influencing the transmission of avian influenza viruses within and between populations of Western Mediterranean yellow-legged gull. Finally, the last chapter is based on the comparison of exposition patterns obtained for vectorial transmission mode pathogens: flaviviruses. This thesis highlights patterns of exposure for certain pathogens (avian influenza virus and flaviviruses) and enables the understanding of the eco-epidemiological factors potentially involved in their circulations. The results allow to consider future areas of research needed to more accurately assess the dispersion of these viruses over the Mediterranean.

Les études des interactions entre cellules hôtes et rétrovirus ont conduit à définir le concept de restriction virale dont les facteurs constituent une part de l'immunité innée des cellules hôtes. Ces facteurs contribuent au contrôle des rétrovirus endogènes (ERV) dont l'émergence peut être associée à certaines pathologies telles que des leucémies ou des immunodéficiences. Chez le porc, certains ERV (PERV) sont réplicatifs, pourtant aucune pathologie ne leur a, à ce jour, été associée. Les mécanismes de restriction virale impliqués dans ce phénomène ont fait l'objet de nombreuses études. Elles n'ont cependant concerné que certains facteurs. Les protéines porcines à motif tripartite (poTRIM) n'ont ainsi fait l'objet que de peu d'études. Pourtant, de nombreux membres de cette famille participent à la restriction virale chez d'autres organismes que le porc. La présente étude s'intéresse par conséquent aux orthologues porcins de ces protéines et à leur relation avec les PERV. L'élaboration d'une stratégie d'expression de ces protéines dans un modèle humain, sensible à l'infection par le PERV nous a permis d'évaluer et de caractériser les effets des TRIM sur le cycle infectieux du PERV. Cette stratégie a mis en évidence une activité de restriction par TRIM8 tandis que TRIM44 semble au contraire agir en faveur de la réplication virale. En ce qui concerne poTRIM11, elle favorise l'entrée du PERV tout en inhibant son expression. L'étude a également confirmé l'insensibilité du PERV vis-à-vis de poTRIM5α. L'ensemble de ces résultats contribuent à la compréhension de la relation entre la réplication des PERV et le contrôle mené par son hôte. / From studies of pathogens and their host interaction has emerged the concept of viral restriction considered to be part of an innate immune system. These factors contribute to the control of endogenous retroviruses (ERV) whose emergence may be associated with several diseases such as leukemia or immunodeficiency. Three subgroups of the porcine ERV-γ-1 group (PERV) are replicative. Nevertheless, these PERVs are not associated with any pathology in the pig. Several studies have been performed on viral restriction mechanism capabilities of the pig but these covered a very limited number of restriction factors. Regarding the porcine tripartite motif-containing (poTRIM) proteins, knowledge is weak although several members of this family have proved to be implicated in the viral restriction of other species. The purpose of this study is to investigate the relationship between these orthologous poTRIMs proteins and replicating PERVs. In order to explore this potential interaction, a TRIM protein expressing model in human cells, known to be sensitive to the PERV infection, has been developed. It has enabled us to assess and characterize potential TRIMs effects on the PERV infection cycle. We equally identified poTRIM8 as a restriction factor. Conversely, poTRIM44 seems to act as an enhancer of the PERV infection, while, TRIM11 displayed ambiguous effects including an enhancer effect of the early infectious stages and an inhibitor activity of the late infectious stages. In this study, we also confirmed the PERV insensitivity to the porcine TRIM5α protein. Finally, this work aims at contributing to the understanding of the relationship between PERV replication and their control leading by the host cells.