Orientador: Julio Lopes Sequeira / Banca: Noeme Sousa Rocha / Banca: Carlos Alberto Hussni / Banca: Osimar de Carvalho Sanches / Banca: Louisiane de Carvalho Nunes / Resumo: A endometrite é a principal causa de redução da fertilidade em éguas. Nas endometroses, glândulas dilatadas e repletas de secreção e restos celulares são observadas com frequência no endométrio eqüino, assim como glândulas não dilatadas que mostram acentuada reação fibrótica. Este estudo teve como objetivo avaliar a fibrose endometrial das éguas considerando as características histomorfológica, histoquímica e imunoistoquímica da endometrose ativa, endometrose inativa, endometrose inativa destrutiva e endometrose ativa destrutiva, procurando esclarecer a participação dos miofibroblastos nestes processos que podem influenciar a progressão da doença. No presente trabalho pode-se constatar que o arranjo das fibras colágenas e suas características, esta relacionado com o tipo de evolução do processo e, eventualmente, com a sua possível origem. O processo de endometrose mostra variações morfológicas que permitem diferenciar subtipos definidos. O picrosirius red demonstrou que nas endometroses ativa e ativa destrutiva o tipo de colágeno predominante é o que possui arranjo reticular, menos denso, enquanto que nas endometroses inativa e inativa destrutiva o predomínio foi de um colágeno mais denso. O colágeno de arranjo reticular predomina nas lesões fibróticas nas endometroses ativa e ativa destrutiva.O colágeno denso predomina nas lesões fibróticas das endometroses inativa e inativa destrutivas. As lesões fibróticas vasculares mais graves acompanham as endometroses inativa e ativa destrutiva sugerindo que estes dois tipos de endometroses tenham origem naquelas lesões. A expressão mais fraca de α-SMA nos ninhos fibróticos das endometroses inativas reflete a predominância de fibrócitos nestas lesões / Abstract: Endometritis is the leading cause of impaired fertility in horses. In endometroses, dilated glands filled with secretion and cell debris are seen frequently in equine endometrium, as well as non-dilated glands showing marked fibrotic reaction. This study aimed to evaluate the endometrial fibrosis considering the characteristics of mares histomorphological, histochemical and immunohistochemical studies of endometriosis active, inactive endometriosis, endometriosis endometriosis active and inactive destructive destructive, seeking to clarify the involvement of myofibroblasts in these processes that may influence disease progression. In the present work can be seen that the arrangement of collagen fibers and their characteristics, is related to the type of process evolution and eventually to their possible origin. The process of endometriosis shows morphological variations defined to differentiate between subtypes. The picrosirius red showed that the active endometroses active and destructive type of collagen is the predominant reticular arrangement that has less dense, whereas in endometroses inactive and inactive destructive was the predominance of a more dense collagen. The lattice arrangement of collagen predominates in the fibrotic lesions in the active and active endometroses destrutiva.O dense collagen predominates in the fibrotic lesions of endometroses inactive and inactive destructive. The most severe vascular fibrotic lesions accompanying endometroses inactive and active destructive suggesting that these two types of endometroses originate in those lesions. The weaker expression of α- SMA in fibrotic nests of endometroses inactive fibrocytes reflects the predominance of these lesions / Doutor

Orientador: Laura Satiko Okada Nakaghi / Coorientador: George Shigueki Yasui / Banca: Diogo Teruo Hashimoto / Banca: José Augusto Senhorini / Resumo: Neste estudo, foram avaliados aspectos relacionados ao desempenho zootécnico e caracterização das células germinativas de machos e fêmeas diploides (2n) e triploides (3n) de Astyanax altiparanae. O principal objetivo foi verificar a performance e a possível esterilidade em peixes 3n. No Capítulo I, o crescimento e as características da carcaça foram examinadas. Fêmeas 3n apresentam maiores valores de ácidos graxos saturados e menores de insaturados e poli-insaturados. Adicionalmente, foi verificada uma diminuição no IGS e maior crescimento. Machos triploides apresentaram IGS e crescimento similares em comparação com os machos diploides normais. No Capítulo II o objetivo foi analisar histologicamente as gônadas dos diploides e triploides, e adicionalmente, caracterizar a estrutura das espículas presentes nas nadadeiras pélvicas e anal (característica sexual secundária em machos) e alguns parâmetros seminais (motilidade, concentração e viabilidade, ultraestrutura e ploidia). Machos 3n apresentam espículas nas nadadeiras pélvicas e anal, assim como observado nos diploides. Análise histológica mostrou que fêmeas 2n apresentaram gônadas desenvolvidas com ovócitos vitelogênicos. Por outro lado, fêmeas 3n exibiram gônadas imaturas. As gônadas dos machos 2n e 3n apresentaram morfologia similar, no entanto, machos 2n exibiram maior quantidade espermatozoides. Machos 3n apresentaram menor concentração espermática, motilidade e duração da motilidade. No que se refere à viabilidade espermática, não foi observada diferença significativa (P > 0,05). Em ambas ploidias, os espermatozoides apresentaram ultraestrutura similar e mesmo número de mitocôndrias, com estruturas morfológicas características: cabeça (redonda), peça e flagelo, este com formação tubular típica (9+2). Adicionalmente, a análise de citometria de fluxo mostrou que machos triploides produzem espermatozoides aneuploides (n=1,71). Em conclusão... / Abstract: In this study, aspects related with growth performance and characterization of the germ cells from diploids (2n) and triploids (3n) males and females of yellow tail tetra Astyanax altiparanae were analyzed. The principal aim was to verify the performance and sterility of 3n fish. In the Chapter I, growth and carcass traits were examined. Female 3n presented high values of saturated fatty acids in comparison with unsaturated and polyunsaturated. Additionally, decreased GSI and better growth performance was verified within triploids. Triploid males presented similar GSI and similar performance parameters in comparison with normal diploid males. In the Chapter II, the aim was to study histologically the gonads of diploids and triploids, and additionally to characterize the spines in the pelvic and anal fins (sexual secondary trait in male), and some sperm parameters (motility, concentration and viability, ultrastructure and ploidy) of 2n and 3n fishes. Triploid males presented spines in the anal fin, similarly as observed in diploids. Histological analysis showed that 2n female present developed gonads with vitelogenic oocytes. On the other hand, 3n female exhibit immature gonads. The gonads of 2n and 3n males presented similar morphology, however, 2n male presented increased amount of spermatozoa. Triploid males also presented decreased sperm concentration, motility and duration of motility. Regarding the sperm viability, no significant differences were observed (P > 0.05). In both statuses, the spermatozoa presented similar ultrastructures and same number of mitochondria, with characteristic morphological structures: head (round), midpiece and flagela, which have a typical tubular formation (9+2). Additionally, the flow cytometrycal analysis showed that 3n male produce aneuploid spermatozoa (n=1.71). In conclusion, the triploidization does not ensure sterility in males, however, 3n female (sterile) may be used for aquaculture ... / Mestre

Made available in DSpace on 2016-02-05T18:29:24Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-02-24. Added 1 bitstream(s) on 2016-02-05T18:33:27Z : No. of bitstreams: 1 000854848_20170224.pdf: 559642 bytes, checksum: 8d2a6d63ed75d0d56155b3983f8b13ab (MD5) Bitstreams deleted on 2017-02-24T13:00:33Z: 000854848_20170224.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2017-02-24T13:01:23Z : No. of bitstreams: 1 000854848.pdf: 2525049 bytes, checksum: d1a81014a30b837374c5f94d1d24ce5a (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Neste estudo, foram avaliados aspectos relacionados ao desempenho zootécnico e caracterização das células germinativas de machos e fêmeas diploides (2n) e triploides (3n) de Astyanax altiparanae. O principal objetivo foi verificar a performance e a possível esterilidade em peixes 3n. No Capítulo I, o crescimento e as características da carcaça foram examinadas. Fêmeas 3n apresentam maiores valores de ácidos graxos saturados e menores de insaturados e poli-insaturados. Adicionalmente, foi verificada uma diminuição no IGS e maior crescimento. Machos triploides apresentaram IGS e crescimento similares em comparação com os machos diploides normais. No Capítulo II o objetivo foi analisar histologicamente as gônadas dos diploides e triploides, e adicionalmente, caracterizar a estrutura das espículas presentes nas nadadeiras pélvicas e anal (característica sexual secundária em machos) e alguns parâmetros seminais (motilidade, concentração e viabilidade, ultraestrutura e ploidia). Machos 3n apresentam espículas nas nadadeiras pélvicas e anal, assim como observado nos diploides. Análise histológica mostrou que fêmeas 2n apresentaram gônadas desenvolvidas com ovócitos vitelogênicos. Por outro lado, fêmeas 3n exibiram gônadas imaturas. As gônadas dos machos 2n e 3n apresentaram morfologia similar, no entanto, machos 2n exibiram maior quantidade espermatozoides. Machos 3n apresentaram menor concentração espermática, motilidade e duração da motilidade. No que se refere à viabilidade espermática, não foi observada diferença significativa (P > 0,05). Em ambas ploidias, os espermatozoides apresentaram ultraestrutura similar e mesmo número de mitocôndrias, com estruturas morfológicas características: cabeça (redonda), peça e flagelo, este com formação tubular típica (9+2). Adicionalmente, a análise de citometria de fluxo mostrou que machos triploides produzem espermatozoides aneuploides (n=1,71). Em conclusão... / In this study, aspects related with growth performance and characterization of the germ cells from diploids (2n) and triploids (3n) males and females of yellow tail tetra Astyanax altiparanae were analyzed. The principal aim was to verify the performance and sterility of 3n fish. In the Chapter I, growth and carcass traits were examined. Female 3n presented high values of saturated fatty acids in comparison with unsaturated and polyunsaturated. Additionally, decreased GSI and better growth performance was verified within triploids. Triploid males presented similar GSI and similar performance parameters in comparison with normal diploid males. In the Chapter II, the aim was to study histologically the gonads of diploids and triploids, and additionally to characterize the spines in the pelvic and anal fins (sexual secondary trait in male), and some sperm parameters (motility, concentration and viability, ultrastructure and ploidy) of 2n and 3n fishes. Triploid males presented spines in the anal fin, similarly as observed in diploids. Histological analysis showed that 2n female present developed gonads with vitelogenic oocytes. On the other hand, 3n female exhibit immature gonads. The gonads of 2n and 3n males presented similar morphology, however, 2n male presented increased amount of spermatozoa. Triploid males also presented decreased sperm concentration, motility and duration of motility. Regarding the sperm viability, no significant differences were observed (P > 0.05). In both statuses, the spermatozoa presented similar ultrastructures and same number of mitochondria, with characteristic morphological structures: head (round), midpiece and flagela, which have a typical tubular formation (9+2). Additionally, the flow cytometrycal analysis showed that 3n male produce aneuploid spermatozoa (n=1.71). In conclusion, the triploidization does not ensure sterility in males, however, 3n female (sterile) may be used for aquaculture ... / CNPq: 30417/2013-0

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:11Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-05-28Bitstream added on 2014-06-13T18:41:58Z : No. of bitstreams: 1 masseno_apb_dr_botfmvz.pdf: 1005397 bytes, checksum: af3e9ebab8f013213218462766cb7b8e (MD5) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / A endometrite é a principal causa de redução da fertilidade em éguas. Nas endometroses, glândulas dilatadas e repletas de secreção e restos celulares são observadas com frequência no endométrio eqüino, assim como glândulas não dilatadas que mostram acentuada reação fibrótica. Este estudo teve como objetivo avaliar a fibrose endometrial das éguas considerando as características histomorfológica, histoquímica e imunoistoquímica da endometrose ativa, endometrose inativa, endometrose inativa destrutiva e endometrose ativa destrutiva, procurando esclarecer a participação dos miofibroblastos nestes processos que podem influenciar a progressão da doença. No presente trabalho pode-se constatar que o arranjo das fibras colágenas e suas características, esta relacionado com o tipo de evolução do processo e, eventualmente, com a sua possível origem. O processo de endometrose mostra variações morfológicas que permitem diferenciar subtipos definidos. O picrosirius red demonstrou que nas endometroses ativa e ativa destrutiva o tipo de colágeno predominante é o que possui arranjo reticular, menos denso, enquanto que nas endometroses inativa e inativa destrutiva o predomínio foi de um colágeno mais denso. O colágeno de arranjo reticular predomina nas lesões fibróticas nas endometroses ativa e ativa destrutiva.O colágeno denso predomina nas lesões fibróticas das endometroses inativa e inativa destrutivas. As lesões fibróticas vasculares mais graves acompanham as endometroses inativa e ativa destrutiva sugerindo que estes dois tipos de endometroses tenham origem naquelas lesões. A expressão mais fraca de α-SMA nos ninhos fibróticos das endometroses inativas reflete a predominância de fibrócitos nestas lesões / Endometritis is the leading cause of impaired fertility in horses. In endometroses, dilated glands filled with secretion and cell debris are seen frequently in equine endometrium, as well as non-dilated glands showing marked fibrotic reaction. This study aimed to evaluate the endometrial fibrosis considering the characteristics of mares histomorphological, histochemical and immunohistochemical studies of endometriosis active, inactive endometriosis, endometriosis endometriosis active and inactive destructive destructive, seeking to clarify the involvement of myofibroblasts in these processes that may influence disease progression. In the present work can be seen that the arrangement of collagen fibers and their characteristics, is related to the type of process evolution and eventually to their possible origin. The process of endometriosis shows morphological variations defined to differentiate between subtypes. The picrosirius red showed that the active endometroses active and destructive type of collagen is the predominant reticular arrangement that has less dense, whereas in endometroses inactive and inactive destructive was the predominance of a more dense collagen. The lattice arrangement of collagen predominates in the fibrotic lesions in the active and active endometroses destrutiva.O dense collagen predominates in the fibrotic lesions of endometroses inactive and inactive destructive. The most severe vascular fibrotic lesions accompanying endometroses inactive and active destructive suggesting that these two types of endometroses originate in those lesions. The weaker expression of α- SMA in fibrotic nests of endometroses inactive fibrocytes reflects the predominance of these lesions

Orientador: Julio Lopes Sequeira / Banca: Alessandre Hataka / Banca: Louisiane de Carvalho Nunes / Resumo: A endometrose é uma alteração degenerativa das glândulas uterinas e do estroma circundante, caracterizada pelo arranjo periglandular de miofibroblastos e a deposição de matriz extracelular (ECM). O presente trabalho objetivou avaliar a expressão de colágeno tipo I, III e IV e α-actina de músculo liso (α-SMA) nas endometroses equinas, procurando esclarecer a participação dos miofibroblastos na progressão destes processos. Foram utilizadas 24 biópsias uterinas com diagnóstico de endometrose, recebidas pelo Serviço de Patologia Veterinária e de Reprodução Animal da FMVZ, UNESP, Botucatu, SP. Cortes histológicos foram submetidos às técnicas histoquímicas de Tricrômico de Masson, Picrosirius Red sob luz polarizada e Ácido Periódico de Schiff (PAS) e imuno-histoquímicas para os três tipos de colágeno citados e α-SMA. Ainda, traçou-se um paralelo entre a técnica de Picrosirius Red e a imunomarcação dos colágenos tipos I e III. A análise histológica revelou que as fibras de colágeno denso correspondem ao colágeno tipo I, predominantes nas endometroses inativa e inativa destrutiva. As fibras de colágeno frouxo correspondem ao colágeno tipo III, predominantes nas endometroses ativas e ativas destrutivas. Nestes mesmos processos, a membrana basal revelou espessamento, aparentemente não relacionado ao colágeno tipo IV, e uma maior imunomarcação de miofibroblastos periglandulares em relação às endometroses inativa e inativa destrutiva. Desta forma, nota-se que os miofibroblastos estão relacionados ao aumento na deposição de colágeno tipo III nos ninhos fibróticos ativos / Abstract: Endometrosis is a degenerative change of the uterine glands and surrounding stroma, characterized by periglandular arrangement of myofibroblasts and deposition of extracellular matrix (ECM). The aim of this study was evaluate the expression of collagen type I, III and IV and α-smooth muscle actin (α-SMA) in equine endometroses, and investigate the role of myofibroblasts in the progression of these processes. A parallel was made with histochemical techniques of Masson's trichrome, Picrosirius Red under polarized light and Periodic Acid-Schiff (PAS). Twenty four uterine biopsies received by the Veterinary Pathology Service and Animal Reproduction of FMVZ, UNESP, Botucatu, SP, were diagnosed with endometrosis. Histological analysis revealed that the orange dense collagen fibers correspond to type I collagen, being prevalent in inactive and inactive destructive endometrosis. And the green loose collagen fibers correspond to type III collagen, and are predominant in active and active destructive endometrosis. In the same processes, a greater amount of periglandular myofibroblasts were observed in comparison to inactive and inactive destructive endometrosis. The presence of these cells in active processes are strongly related to an increased deposition of collagen type III in fibrotic nests. Regarding the basement membrane, the active destructive and active endometrosis shows thickening, apparently not related to an increase in expression of type IV collagen. The active destructive and inactive destructive endometrosis exhibited disruption areas in type IV collagen fibers. Thus, it is noted that the myofibroblasts are related to increased deposition of type III collagen in active fibrotic nests / Mestre

Made available in DSpace on 2015-12-10T14:22:37Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-05-27. Added 1 bitstream(s) on 2015-12-10T14:28:45Z : No. of bitstreams: 1 000851207.pdf: 1059422 bytes, checksum: 3ef98dc609c2e964bafefa24cd2efdc7 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A endometrose é uma alteração degenerativa das glândulas uterinas e do estroma circundante, caracterizada pelo arranjo periglandular de miofibroblastos e a deposição de matriz extracelular (ECM). O presente trabalho objetivou avaliar a expressão de colágeno tipo I, III e IV e α-actina de músculo liso (α-SMA) nas endometroses equinas, procurando esclarecer a participação dos miofibroblastos na progressão destes processos. Foram utilizadas 24 biópsias uterinas com diagnóstico de endometrose, recebidas pelo Serviço de Patologia Veterinária e de Reprodução Animal da FMVZ, UNESP, Botucatu, SP. Cortes histológicos foram submetidos às técnicas histoquímicas de Tricrômico de Masson, Picrosirius Red sob luz polarizada e Ácido Periódico de Schiff (PAS) e imuno-histoquímicas para os três tipos de colágeno citados e α-SMA. Ainda, traçou-se um paralelo entre a técnica de Picrosirius Red e a imunomarcação dos colágenos tipos I e III. A análise histológica revelou que as fibras de colágeno denso correspondem ao colágeno tipo I, predominantes nas endometroses inativa e inativa destrutiva. As fibras de colágeno frouxo correspondem ao colágeno tipo III, predominantes nas endometroses ativas e ativas destrutivas. Nestes mesmos processos, a membrana basal revelou espessamento, aparentemente não relacionado ao colágeno tipo IV, e uma maior imunomarcação de miofibroblastos periglandulares em relação às endometroses inativa e inativa destrutiva. Desta forma, nota-se que os miofibroblastos estão relacionados ao aumento na deposição de colágeno tipo III nos ninhos fibróticos ativos / Endometrosis is a degenerative change of the uterine glands and surrounding stroma, characterized by periglandular arrangement of myofibroblasts and deposition of extracellular matrix (ECM). The aim of this study was evaluate the expression of collagen type I, III and IV and α-smooth muscle actin (α-SMA) in equine endometroses, and investigate the role of myofibroblasts in the progression of these processes. A parallel was made with histochemical techniques of Masson's trichrome, Picrosirius Red under polarized light and Periodic Acid-Schiff (PAS). Twenty four uterine biopsies received by the Veterinary Pathology Service and Animal Reproduction of FMVZ, UNESP, Botucatu, SP, were diagnosed with endometrosis. Histological analysis revealed that the orange dense collagen fibers correspond to type I collagen, being prevalent in inactive and inactive destructive endometrosis. And the green loose collagen fibers correspond to type III collagen, and are predominant in active and active destructive endometrosis. In the same processes, a greater amount of periglandular myofibroblasts were observed in comparison to inactive and inactive destructive endometrosis. The presence of these cells in active processes are strongly related to an increased deposition of collagen type III in fibrotic nests. Regarding the basement membrane, the active destructive and active endometrosis shows thickening, apparently not related to an increase in expression of type IV collagen. The active destructive and inactive destructive endometrosis exhibited disruption areas in type IV collagen fibers. Thus, it is noted that the myofibroblasts are related to increased deposition of type III collagen in active fibrotic nests

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2018-06-28T16:55:35Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1148332 bytes, checksum: 74696fa31ad64b873b9c041356bb1c2a (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-28T16:55:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1148332 bytes, checksum: 74696fa31ad64b873b9c041356bb1c2a (MD5) Previous issue date: 2018-02-23 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / O reprodutor tem grande importância na cadeia produtiva por possuir maior potencial de difusão do seu material genético dentro do rebanho que as fêmeas que produzem apenas uma cria por ano, em manejo de monta natural. Entretanto, este potencial somente se torna real quando os machos apresentam boa qualidade seminal, resultando em menores taxas de não retorno ao estro. Não há duvidas da importância da morfologia espermática na fertilidade de touros. Entre as anomalias espermáticas identificadas nos ejaculados de bovinos, a aplasia segmentar da bainha mitocondrial (ASBM) é classificada como defeito espermático maior, comprometendo a fertilidade dos reprodutores, pelo fato dos ejaculados apresentarem baixa motilidade e vigor espermático. Este estudo teve como objetivo estudar a fisiopatologia de ejaculados com altos porcentuais da patologia espermática ASBM, utilizando como base o exame andrológico e análise espermática por citometria de fluxo. Portanto, os touros foram divididos em dois grupos: o primeiro foi o grupo controle com morfologia espermática normal (n = 3) e o segundo foi o grupo com morfologia anormal (n = 3) com alta porcentagem de SAMS. Cinco ejaculados foram coletados de cada animal. Ejaculados de touros com ASBM apresentaram baixa motilidade (P<0,05), baixo potencial mitocondrial (P<0,05), maior porcentagem de espermatozoides com fragmentação do DNA (P<0,05), baixa integridade da membrana plasmática e acrossomal (P<0,05) e alta porcentagem de espermatozoides com desorganização da bicamada lipídica ou fluidez da membrana (P<0,05) em comparação aos touros com morfologia espermática normal. Além de possuir baixa porcentagem de viabilidade espermática, sêmen com alta porcentagem de ASBM pode estar sofrendo apoptose, possivelmente devido ao estresse oxidativo. Esses resultados indicam que touros com alta porcentagem desta patologia espermática são inférteis e sugere também que esta anomalia espermática seja de origem genética na raça estudada. / Bulls are of great importance in the productive chain because they have a higher potential for diffusion of genetic material within the herd than females that produce only one calf per year in natural mating management. However, this potential is only possible when males present good seminal quality, resulting in lower rates of non- return to estrus. There is no doubt about the importance of sperm morphology in bull fertility, among the sperm anomalies identified in bovine ejaculates, the segmental aplasia of the mitochondrial sheath (SAMS) is classified as a major sperm defect, compromising the reproductive fertility; ejaculates with presence of this anomaly show low sperm motility and sperm vigor. This study aimed to understand the pathophysiology of ejaculates with high percentage of spermatozoa with SAMS, using Breeding Soundness Evaluation and sperm analysis by flow cytometry. Therefore, the bulls were divided in two groups: The first one was the control group with normal sperm morphology (n=3) and the second was the abnormal one (n=3) with high percentage of SAMS. Five ejaculates were collected from each animal. Bulls with SAMS exhibited poor motility (P<0.05), low mitochondrial membrane potential (P<0.05), a high percentage of sperm with DNA fragmentation (P<0.05), low acrosome and plasma membrane integrity (P<0.05), and high membrane fluidity (P<0.05) in comparison with bulls that have a normal morphology; in addition to have a low percentage of viability, sperm with a high percentage of SAMS may be undergoing apoptosis. These findings indicate that bulls with this sperm pathology are infertile; furthermore, it suggests there is a putative genetic basis for this sperm defect in this breed.