Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2015. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2015-05-20T15:07:31Z No. of bitstreams: 1 2015_PedroHenriqueMirandaBurgel.pdf: 2254644 bytes, checksum: d9741ccd569672b51edd5debc891636f (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2015-05-21T12:58:45Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_PedroHenriqueMirandaBurgel.pdf: 2254644 bytes, checksum: d9741ccd569672b51edd5debc891636f (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-21T12:58:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_PedroHenriqueMirandaBurgel.pdf: 2254644 bytes, checksum: d9741ccd569672b51edd5debc891636f (MD5) / O Cryptococcus neoformans é um fungo patogênico humano que afeta majoritariamente indivíduos imunossuprimidos. Ele é o agente causador da meningite criptocócica e tem como principal fator de virulência uma cápsula polissacarídica que recobre sua parede celular. Os componentes desta cápsula estão envolvidos em diversos mecanismos de escape e de supressão da resposta imune desenvolvidos pelo fungo, o que leva a uma resposta não adequada da imunidade inata frente à infecção com consequente disseminação do patógeno. Dentre estes componentes, a glucoronoxilomanana (GXM) se destaca devido à grande variedade de modulações que a mesma é capaz de exercer em diversos tipos celulares. Neste trabalho, demonstramos uma nova interação entre estes componentes capsulares secretados e macrófagos: a inibição da secreção de IL-1β e da piroptose em macrófagos previamente ativados. Primeiramente verificamos que estes componentes possuíam a capacidade de inibir a produção de IL-1β, sem interferir na ativação fornecida pelo primeiro sinal – necessária para a produção da dada citocina. Caracterizamos parcialmente a molécula responsável por esta inibição, chegando a uma molécula pequena (menor que 1kDa), resistente ao calor (121 °C) e polar. Também verificamos que a piroptose dos macrófagos estimulados era prevenida por estes componentes capsulares, confirmando a interferência na via do inflamassoma destas células. Posteriormente realizamos ensaios para definir o mecanismo de ação pelo qual esta interferência estava ocorrendo. Verificamos que existiam depósitos da citocina intracelular pró-IL-1β e também que a enzima caspase-1 estava ativada nos macrófagos em contato com os componentes capsulares do C. neoformans. Por último, realizamos ensaios de interação entre os macrófagos e leveduras de C. neoformans, observando uma replicação intracelular exacerbada do fungo nas células tratadas com os componentes capsulares. Estes resultados demonstram a presença de uma molécula com caráter anti-inflamatório, acrescentando mais um mecanismo de modulação ao já extenso arsenal de fatores de virulência expressos pelo C. neoformans. / Cryptococcus neoformans is a human pathogenic fungus that affects mainly immunocompromised individuals. It is the causative agent of the cryptococcal meningitis and it´s major virulence factor is a polysaccharide capsule that covers it´s cell wall. The components of this capsule are involved in various mechanisms of evasion and suppression of the immune response developed by the fungus, which leads to an inadequate answer of the innate immunity to the infection and consequent dissemination of the pathogen. Among these components, the glucuronoxylomannan (GXM) stands out due to the great variety of modulations that it is able to perform in several cell types. In this study, we demonstrated a novel interaction between these capsular components secreted by the fungus and macrophages: the inhibition of IL-1β secretion and pyroptosis in previously stimulated macrophages. First, we verified that these components had the ability to inhibit the production of IL-1β without interfering in the activation led by the first signal – necessary for the production of this given cytokine. Then we partially characterized the molecule responsible for this inhibition, discovering that it was a small molecule (smaller then 1kDa), heat resistant (121 °C) and polar. We also found that the pyroptosis was being prevented in the stimulated macrophages, confirming the interference in the inflammasome pathway of these cells. Later we performed tests to define the mechanism of action by which these interferences were occurring. We found deposits of the intracellular cytokine pro-IL-1β and also activated caspase-1 enzyme in macrophages that were in contact with C. neoformans capsular components. Ultimately, we performed interaction tests between macrophages and yeast cells of C. neoformans, observing an exacerbated intracellular growth of the fungus inside the cells treated with the capsular components. These results demonstrated the presence of a molecule with anti-inflammatory character, adding another modulatory mechanism into the already extensive arsenal of virulence factors expressed by the C. neoformans.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2016. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2016-06-10T13:02:48Z No. of bitstreams: 1 2016_RaffaelJunioAraujoCastro.pdf: 2480326 bytes, checksum: 03a83d6a12dfb33f04defc765f6b0fe9 (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2016-07-30T11:35:05Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_RaffaelJunioAraujoCastro.pdf: 2480326 bytes, checksum: 03a83d6a12dfb33f04defc765f6b0fe9 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-30T11:35:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_RaffaelJunioAraujoCastro.pdf: 2480326 bytes, checksum: 03a83d6a12dfb33f04defc765f6b0fe9 (MD5) / O Fonsecaea pedrosoi é um fungo dimórfico e o principal agente etiológico da cromoblastomicose, infecção crônica da pele e tecidos subcutâneos iniciada pela inoculação transcutânea das formas saprofíticas do fungo. No hospedeiro, essas células transformam-se em células muriformes, tida como a forma parasítica do fungo e grandes produtoras de melanina, considerada um importante fator de virulência. Estudos recentes têm proposto que a cronicidade da cromoblastomicose decorre de falhas, tanto no reconhecimento inato do fungo, levando à baixa produção de citocinas pró-inflamatórias, quanto na montagem de uma resposta imune adequada para a contenção da infecção. Nesse contexto, considerando o inflamassoma como um importante sistema de reconhecimento inato que compõe respostas imunes antifúngicas, este trabalho foi conduzido visando avaliar a ativação do inflamassoma por F. pedrosoi, bem como o seu papel na infecção induzida pelas formas saprofíticas do fungo. Foi observado, inicialmente, que hifas, ao contrário de conídios, induzem a secreção de IL-1 provendo os 2 sinais necessários à ativação do inflamassoma, tanto em BMDMs, quanto em BMDCs. O fornecimento exógeno do primeiro ou segundo sinal não só incrementou a secreção da citocina durante a infecção com hifas, como possibilitou a secreção de IL-1β por BMDCs infectadas com conídios. Utilizando inibidores ou células nocautes, verificou-se que a secreção de IL-1β é dependente do receptor NLRP3, da caspase-1, e influenciada pela caspase-8. Em adição, observamos que a secreção de IL-1 mediada pelo inflamassoma NLRP3 é dependente: da sinalização via NF-κB independente de MyD88; dos mecanismos de efluxo de K+; da liberação de catepsina B; e, de forma não essencial, da geração de espécies reativas de oxigênio. Ademais, foi mostrado que a melanina presente na parede do fungo, mas não a secretada, contribui para a secreção da IL-1. Foi demonstrado, ainda, que a caspase-1, caspase-11 e o receptor NLRP3, não foram capazes de promover a atividade fungicida de macrófagos em ensaios de co-cultura com o fungo. Entretanto, dados dos ensaios de infecções in vivo sugerem que as caspases-1 e -11, assim como o NLRP3, auxiliam na contenção da infecção por propágulos fúngicos de F. pedrosoi. No entanto, eles são dispensáveis na resposta à infecção com o conídio, confirmando o papel desta forma fúngica na persistência do F. pedrosoi no hospedeiro como resultado da ativação inadequada da resposta imune e seus mecanismos efetores. _________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Fonsecaea pedrosoi is a dimorphic fungus, and the main etiologic agent of chromoblastomycosis, a chronic infection of the skin and subcutaneous tissue initiated after transcutaneous inoculation of saprophytic forms of the fungus. Inside the host, these cells turn into muriformes cells, considered the parasitic form, which produce large amount of melanin, an important virulence factor. Recent studies have suggested that the chronicity observed in chromoblastomycosis is due to both, failure in innate recognition of the fungus, leading to low production of pro-inflammatory cytokines, and development of an inappropriate immune response unable to contain the disease. In this context, and considering the inflammasome as an important innate recognition system that comprises antifungal immune responses, this study was conducted to evaluate inflammasome activation by F. pedrosoi, as well as its role in the infection induced by saprophytic forms of the fungus. First, it was observed that, in contrast to conidia, hyphae induced the secretion of IL-1, and provides both first and second signals for inflammasome activation in BMDMs and BMDCs. Exogenous stimulation of the first or second signal not only increased IL-1 secretion during infection with hyphae, but also enabled the secretion of IL-1 by BMDCs infected with conidia. Using inhibitors or knockout cells, it was found that IL-1β secretion is dependent on NLRP3, caspase-1 and influenced by caspase-8. In addition, we observed that IL-1 secretion mediated by NLRP3 inflammasome is dependent: on a NF-kB signaling pathway independent of MyD88; on efflux of K+; on cathepsin B release; and, in an unessential way, on generation of reactive oxygen species. Furthermore, it was demonstrated that melanin present in fungal cell wall, but not the secreted one, contribute to IL-1β secretion. It was further demonstrated that caspase-1, caspase-11 and NLRP3 receptor did not promote in vitro fungicidal activity of macrophages. However, data from in vivo infection studies suggest that caspase-1 and -11, as well as NLRP3, assist in the disease containment caused by infection with fungal propagules of F. pedrosoi. However, they are dispensable in response to infection with conidia, confirming the role of conidia in F. pedrosoi conidial form persistence in the host through the inappropriate activation of the immune response and its effectors mechanisms.

Em diferentes mopdelos, o aumento dos níveis séricos de glicose pode ativar cascatas de sinalização envolvendo receptores semelhantes a Toll, o fator de transcrição NF-kB, moléculas da familia NLRP, ASC e caspase-1, que culminam na produção, ativação e liberação de moléculas inflamatórias. Investigamos o perfil inflamatório sérico e placentário em gestantes com distúrbios glicêmicos e a possível participação da via do inflamassoma NLRP1 e NRLP3 para o estabelecimento desse perfil. Para avaliar o papel da hiperglicemia no estabelecimento desse perfil, a via do inflamassoma foi também estudada em explantes de vilos coriônicos tratados com 100, 200, 300 e 400 mg/dL de glicose. Nossos resultados mostraram aumento na ativação de NF-kB e da expressão de NLRP1, NLRP3, ASC e Caspase-1 nas placentas de gestantes hiperglicemicas e nas culturas tratadas com doses de 300 r 400 mg/dL de glicose. Esses dados sugerem que a ativação da via do inflamassoma na porção fetal da placenta contribui para o processo inflamatório nessas pacientes. / In different models, the increase in serum glucose levels can activate signaling cascades involving Toll-like receptors, the transcription factor NF-kB, NLRP proteins, ASC and caspase-1, which culminate in the production, activation and release of inflammatory molecules . We investigated the serum and placental inflammatory profile in pregnant women with glucose disorders and the possible participation of via the NLRP1 and NRLP3 inflammasome to establish this profile. To evaluate the role of hyperglycemia, molecules of the inflammasome pathway was also studied in explants of chorionic villi treated with 100, 200, 300 and 400 mg / dL glucose. Our results showed an increase in NF-kB activation and expression of NLRP1, NLRP3, ASC and Caspase-1 in placentas of pregnant hyperglycemic women and in cultures treated with 300 and 400 mg / dL glucose. These data suggest that the inflammasome activation of the fetal portion of the placenta contributes to the inflammatory process in these patients.

O reconhecimento eficiente do fungo Paracoccidioides brasiliensis pelos receptores do sistema imune inato do hospedeiro é essencial para a proteção contra a paracoccidioidomicose (PCM), micose sistêmica prevalente na América Latina. Diferente dos receptores do tipo Toll (TLRs),os receptores do tipo Nod-like (NLRs) são proteínas citoplasmáticas com capacidade de formar uma plataforma molecular denominada inflamassoma. Esta plataforma ativa caspase-1 e desencadeia a produção de IL-1? e IL-18. O inflamassoma de NLRC4 regula a resposta imune contra bactérias intracelulares através do reconhecimento de flagelina. No entanto, mesmo na ausência desta molécula, a bactéria Shigella flexneri é capaz de ativar o inflamassoma de NLRC4, o que sugere a existência de outros agonistas. Trabalhos recentes mostraram que o inflamassoma de NLRC4 tem papel importante no controle da infecção por Candida albicans. Contudo, sua participação na infecção por P. brasiliensis é uma incógnita. Portanto, o presente estudo teve como objetivo avaliar a participação do inflamassoma de NLRC4 na paracoccidioidomicose experimental. Os resultados obtidos demonstram que durante a infecção experimental por P. brasiliensis,macrófagos derivados de medula óssea (BMDM) provenientes de animais Nlrc4-/- produzem mais IL-1? do que BMDM de animais controles. Não foram detectadas diferenças significativas quanto aos níveis de TNF- ? em ambos os grupos. Para investigar o mecanismo responsável pelo aumento da produção de IL-1? por BMDM de camundongos Nlrc4-/-, as expressões do gene Nlrp3 e Nlrc4 foram avaliadas por qPCR durante, 0, 2, 6, 12, e 24 horas após a infecção. Comparado aos camundongos WT, BMDM de animais Nlrc4-/- exibiram um aumento na expressão de Nlrp3 durante as primeiras 12 horas de infecção. Surpreendentemente, 24 horas após a infecção, um aumento na expressão do gene de Nlrc4 foi detectado em BMDM de animais Nlrp3-/-, comparado ao controle. Estes resultados sugerem que o inflamassoma de NLRC4 reprime a atividade do inflamassoma de NLRP3, e consequentemente, anula a produção de IL-1? em macrófagos estimulados por P. brasiliensis. Além disso, camundongos Nlrc4-/- exibiram um aumento na produção de IL-1? e redução na produção de IL-18 aos7 dias após a infecção in vivo. Em contraste, a produção de IL-1? foi menor e a produção de IL-18 aumentou aos 30 dias após a infecção.Comparado ao grupo controle observamos menor carga fúngica, formação de granulomas bem definidos e compactos e redução na fibrose em pulmões de camundongos Nlrc4-/- aos 30 dias após infecção. Adicionalmente, observamos aumento na produção de citocinas do perfil Th1 (IFN-?, IL-12p40) e níveis reduzidos de IL-10. Em conclusão, estes dados mostram que o inflamassoma NLRC4 tem papel importante na suscetibilidade do hospedeiro durante a infecção por P. brasiliensis. / The efficient recognition of P. brasiliensis fungal cells by immune system receptors is essential for protection against paracoccidioidomycosis (PCM), a systemic mycosis prevalent in Latin America. Different from the Toll-like receptors (TLRs), NOD-like receptors (NLRs) are cytoplasmic proteins able to form the molecular platform, denominated inflammasome. This platform activates caspase-1 and triggers the production of IL-1? and IL-18. The NLRC4 inflammasome regulates the immune response against intracellular bacteria through recognition of flagellin. However, even in the absence of this structure, the bacteria Shigella flexneri activates the NLRC4 inflammasome, suggesting the existence of other agonists. It is known that NLRC4 control the Candida albicans infection. Therefore, in this study we evaluated the participation of NLRC4 inflammasome in experimental paracoccidioidomycosis. Our data demonstrated that Nlrc4-/- BMDMs produces more IL-1? than WT BMDMs during P. brasiliensis infection. No differences were detected regarding to TNF-? levels in both groups. To investigate the mechanism responsible to improvement of IL-1? production by Nlrc4-/- BMDMs, the nlrp3 and nlrc4 gene expression were evaluated by qPCR during 2, 6, 12 and 24 hours post infection. Compared to WT mice, the expression of nlrp3 was increased in Nlrc4-/- BMDMs during the first 12 hours of infection. Surprisingly, at 24 hour post infection and nlrc4 exhibited increased expression in Nlrp3-/- BMDMs, compared to WT controls. These data suggest that NLRC4 represses NLRP3 inflammasome activity, and consequently, abrogates the IL-1B production by P.brasiliensis estimuled macrophages. Furthermore, Nlrc4-/- mice exhibited an increased production of IL-1? and decreased production IL-18 at 7 days post infection in vivo. In contrast, there was a decrease in the production of IL-1? and increased production of IL-18 at 30 days post infection. Compared to controls, we observed lower fungal load, the formation of well-defined and compact lung granulomas, and decreased fibrosis in the lungs of Nlrc4-/- mice after 30 days post infection. In addition, we observed increased production of Th1 cytokine profile (IFN-?, IL-12p40) and reduced levels of IL-10. In conclusion, these data show that NLRC4 inflammasome play an important role on the host susceptibility during P. brasiliensis infection.

Orientador: James Venturini / Resumo: A paracoccidioidomicose (PCM) é micose sistêmica causada por fungos do gênero Paracoccidioides. As principais formas clínicas da doença são aguda/subaguda e crônica (FC), sendo que nessa última, a maioria dos pacientes desenvolvem fibrose pulmonar e enfisema. Estudos prévios demonstraram que pacientes FC, na forma ativa da doença, apresentam elevada produção de mediadores inflamatórios, incluindo a IL-1β. Essa citocina, diferente das demais, é produzidas por uma plataforma protéica intracelular denominada inflamassoma que pode ser ativadas por patógenos e sinais de dano do hospedeiro. Considerando-se que os mecanismos de ativação do inflamassoma em pacientes com PCM não são conhecidos, o presente estudo teve por objetivo determinar a expressão de genes envolvidos na ativação do inflamassoma e a produção de citocinas por monócitos e macrófagos alveolares de pacientes com PCM em diferentes momentos do tratamento antifúngico.Nossos resultados demonstram a ativação do NLRP3-inflamassoma, caracterizada pela elevada expressão de NLRP3, CASP1 e IL1B por monócitos. Esses achados corroboram a contribuição do NLRP3-inflamassoma na patogênese da PCM também em pacientes. / Abstract: Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic mycosis caused by species of the genus Paracoccidioides . The main clinical forms of the disease are acute/subacute (AF) and chronic (CF), and in the latter, most patients develop pulmonary fibrosis and emphysema. Previous studies showed that CF patients in active disease, exhibit elevated production of inflammatory mediators, including IL-1β. This cytokine, different from the others, are produced by an intracellular multiprotein platform called inflammasome that can be activated by pathogens and host signs of damage. Considering that the activation mechanisms of the inflammasome in patients with PCM are not know, this study aimed to determine the expression of genes involved in inflammasome activation and cytokine production by monocytes and alveolar macrophages from PCM patients at different times of antifungal treatment. Our results demonstrate the activation of the NLRP3 inflammasome-characterized by high expression of NLRP3, CASP1 and IL1B by monocytes. These findings corroborate the contribution of NRLP3-inflamassome in pathogenesis of PCM also in patients. / Mestre

Leishmania amazonensis é um parasito endêmico no Brasil, que ao infectar humanos, pode causar a leishmaniose cutânea. Cerca de 12 milhões de pessoas estão infectadas com parasitos do gênero Leishmania em 98 países, e anualmente, 350 milhões de indivíduos estão em risco de contrair esta doença. Enquanto o papel da imunidade adaptativa já foi extensivamente investigado, em modelos de infecção com Leishmania spp., os mecanismos de alguns receptores da imunidade inata, e principalmente dos citosólicos, como é o caso do AIM2, permanecem obscuros. Recentemente, o nosso grupo descreveu a importância do inflamassoma de NLRP3 no controle da infecção por L. amazonensis, o qual é mediado pela produção de óxido nítrico dependente da sinalização de IL-1R. Neste trabalho, foi demonstrado que a deficiência para IL-1R confere uma maior susceptibilidade a este parasito do que a deficiência para NLRP3. Sugerindo que outros inflamassomas, que operam via IL- 1R, possam estar envolvidos na resposta contra este patógeno. Dentre estes, o AIM2 destacase como sendo um receptor de DNA citosólico que mediante a sua ativação promove a secreção de citocinas pro-inflamatórias e piroptose. Neste contexto, nós demonstramos que o AIM2 promove o controle da infecção in vitro por L. amazonensis em macrófagos, e que estas células requerem este sensor de DNA para a secreção de IL-1?, expressão da enzima NOS2 e produção de óxido nítrico. Adicionalmente, também observamos que AIM2 promove resistência à infecção por L. amazonensis in vivo, contribuindo para o desenvolvimento de uma resposta Th1. Por fim, também demonstramos que o inflamassoma de AIM2 atua na produção de IL-1? e IL-1?, por células dendríticas, assim como na expressão de CD86 e CD40 e na secreção de IL-12 por estas células. Desta forma, foi demonstrado neste trabalho que o AIM2, ao ativar células da imunidade inata e adaptativa, promove o controle direto ou indireto da infecção por L. amazonensis. / Leishmania amazonensis is an endemic parasite in Brazil that can cause the cutaneous leishmaniasis in humans. Annually, around 12 million people are infected with Leishmania spp. parasites, in 98 countries. In addition, 350 million of individuals are on risk to develop this disease. While the role of the adaptive immune response was already extensively evaluated, on models of infection with Leishmania spp., the mechanisms of some innate immune receptors, and mainly the cytosolic ones, such as AIM2, remain unclear. Recently, our group described the importance of the NLRP3 inflammasome to the control of L. amazonensis mediated by NO, which is dependent of the IL-1R signaling. In this work, it was also reported that the Il-1r deficiency displayed a higher susceptibility to L. amazonensis infection in comparison to Nlrp3-deficient mice. Suggesting that other inflammasomes, which may operate through IL-1R, might be involved in the response to this pathogen. Among these, the AIM2 highlights as a cytosolic DNA sensor, which, after its activation, promotes the secretion of proinflammatory cytokines and pyroptosis. On this context, we demonstrated that AIM2 promotes the in vitro control of L. amazonensis in macrophages, and that these cells require this DNA sensor for the IL-1? secretion, NOS2 expression and NO production. In addition, we also observed that AIM2 promotes the in vivo resistance to L. amazonensis infection, contributing for the development of a Th1 response. Finally, we also demonstrated that AIM2 acts on the production of IL-1? and IL-1?, by dendritic cells, as well as on the CD86 and CD40 expression and IL-12 secretion by these cells. Therefore, in this work, we showed that the AIM2, leading to the activation of innate and adaptive immune cells, promotes the direct or indirect control of L. amazonensis infection.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2017. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2017-12-13T15:36:52Z No. of bitstreams: 1 2017_LíviaPimenteldeSant’AnaDourado.pdf: 15871216 bytes, checksum: 0273482c49bc7a39fe247577a7fa6a8a (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-02-15T18:16:11Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_LíviaPimenteldeSant’AnaDourado.pdf: 15871216 bytes, checksum: 0273482c49bc7a39fe247577a7fa6a8a (MD5) / Made available in DSpace on 2018-02-15T18:16:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_LíviaPimenteldeSant’AnaDourado.pdf: 15871216 bytes, checksum: 0273482c49bc7a39fe247577a7fa6a8a (MD5) Previous issue date: 2018-02-15 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). / A obesidade é uma doença reconhecida pela Organização Mundial da Saúde (OMS) desde 1997. Devido a vários fatores (genéticos, ambientais, dietéticos), esta doença atualmente é uma grande parte da população mundial e está associada a várias outras patogenicidades. Vários estudos mostraram que quantidades maiores de gordura corporal estão associadas a riscos aumentados de vários tipos de câncer. A inflamação está relacionada à obesidade e ao câncer. Os mediadores pró-inflamatórios causam efeitos locais e sistêmicos. O inflamassoma NLRP3, um importante complexo proteico para o processo inflamatório, é responsável pela maturação das citocinas pró-inflamatórias IL-1β e IL-18. A ausência de componentes da inflamação já foi relacionada a um aumento de peso aumentado. Outro fator intimamente relacionado com obesidade, inflamação e, consequentemente, câncer é a microbiota. A filogenia e os metabólitos da microbiota intestinal podem desempenhar um papel benéfico e protetor ou nocivo, sendo relacionados ao desenvolvimento de doenças no hospedeiro. Ainda, existem dois tipos de adipócitos presentes no corpo – branco (WAT), amplamente distribuído e mais conhecido por seu papel no armazenamento de gordura, e marrom (BAT), localizados em depósitos específicos e com papel termogênico – têm papéis distintos na modulação do metabolismo e da resposta imune. O presente estudo avaliou o papel do inflamassoma NLRP3 no perfil inflamatório, metabolismo lipídico e na modulação da microbiota intestinal de animais obesos. Também foi avaliado se a abundância de WAT e BAT é modificada com a depleção dos componentes do inflamassoma e a ativação de macrófagos induzida por esses tecidos e o papel do inflamassoma nessa ativação. Para a primeira parte, camundongos selvagens e deficientes para caspase 1/11 e NLRP3 do inflamassoma foram alimentados com dieta convencional e rica em lipídeos (45% de calorias advindas de lipídeos) por 90 dias, a resposta inflamatória, o metabolismo de lipídeos e a filogenia da microbiota intestinal foram analisados. Nossos dados sugerem que animais nocautes para caspase1/11 apresentaram maior suscetibilidade à obesidade, com consequentes alterações dos marcadores de metabolismo lipídico e inflamatórios (esteatose hepática, biogênese de corpúsculos lipídicos, secreção de IL-12 e CD1d em células do lavado peritoneal), mudanças metabolômicas no perfil lipídico global do fígado e alteração na abundância filogenética da microbiota intestinal, apresentando filos envolvidos com ganho de peso e esteatose hepática; indicando uma modulação imunológica e no metabolismo lipídico. Na segunda parte, WAT e BAT foram retirados de animais selvagens e depletados para componentes de inflamassoma, mantidos em meio de cultura e o sobrenadante foi usado para estimular macrófagos de medula óssea (BMDM). Os animais nocautes apresentaram uma distribuição distinta desses tecidos e o uso do sobrenadante WAT e BAT depletados para proteínas do inflamassoma NLRP3 sugere que este complexo desempenha um papel importante na ativação de macrófagos regulada pelo tecido adiposo. Tomados em conjunto, nossos resultados sugerem que a ausência de caspase 1/11 modulam a abundância de WAT e BAT, que possuem papéis diferenciados na ativação de células imunes e, ainda, que a obesidade induzida pela dieta rica em gordura e a ausência de caspase 1/11 podem regular o metabolismo lipídico, a resposta inflamatória e a composição da microbiota intestinal. / Obesity is a disease recognized by the World Health Organization (WHO) since 1997. Due to several factors (genetic, environmental, dietary), this disease is currently a large part of the world population and is associated with several other pathogenicities. Several studies have shown that higher amounts of body fat are associated with increased risks of various types of cancer. Inflammation is related to obesity and cancer. Pro-inflammatory mediators cause local and systemic effects. The inflammasome NLRP3, an important protein complex for the inflammatory process, is responsible for the maturation of the proinflammatory cytokines IL- 1βand IL-18. The absence of components of the inflammasome has already been related to an increased weight gain. Another factor closely related to obesity, inflammation and, consequently, cancer is the microbiota. The phylogeny and metabolites of the gut microbiota may play a beneficial and protective or deleterious role, being related to the development of diseases in the host. Furthermore, there are two types of adipocytes present in the body - white (WAT), widely distributed and better known for their role in fat storage, and brown (BAT), located in specific deposits and with thermogenic paper - have distinct roles in modulating metabolism and immune response. The present study evaluated the role of NLRP3 inflammation in the inflammatory profile, lipid metabolism and modulation of the intestinal microbiota of obese animals. It was also evaluated whether the abundance of WAT and BAT is modified by the depletion of the components of the inflammasome and the activation of macrophages induced by these tissues and the role of the inflammasome in this activation. For the first part, wild-type and caspase-deficient mice 1/11 and NLRP3 of the inflammasome were fed with a conventional diet and rich in lipids (45% of calories from lipids) for 90 days, the inflammatory response, lipid metabolism and phylogeny of the intestinal microbiota were analyzed. Our data suggest that animal knockouts for caspase 1/11 were more susceptible to obesity, with consequent changes in the markers of lipid and inflammatory metabolism (hepatic steatosis, biogenesis of lipid bodies, IL-12 and CD1d secretion in peritoneal lavage cells), changes metabolomics in the global lipid profile of the liver and alteration in the phylogenetic abundance of the intestinal microbiota, presenting phyla involved with weight gain and hepatic steatosis; indicating immunological modulation and lipid metabolism. In the second part, WAT and BAT were taken from wild animals and depleted for inflammasome components, kept in culture medium and the supernatant was used to stimulate bone marrow derived macrophages (BMDM). The knockout animals showed a distinct distribution of these tissues and the use of the supernatant WAT and BAT depleted for proteins of the NLRP3 inflammasome suggests that this complex plays an important role in the activation of macrophages regulated by adipose tissue. Taken together, our results suggest that the absence of caspase 1/11 modulate the abundance of WAT and BAT, which have differentiated roles in the activation of immune cells and also that obesity induced by the high fat diet and the absence of caspase 1/11 can regulate lipid metabolism, inflammatory response and intestinal microbiota composition.

Submitted by Automa??o e Estat?stica (sst@bczm.ufrn.br) on 2017-05-31T20:46:06Z No. of bitstreams: 1 PauloRicardoPorfirioDoNascimento_TESE.pdf: 3589123 bytes, checksum: d44189d5ff788541433dfaed7669cd11 (MD5) / Approved for entry into archive by Arlan Eloi Leite Silva (eloihistoriador@yahoo.com.br) on 2017-06-01T20:53:14Z (GMT) No. of bitstreams: 1 PauloRicardoPorfirioDoNascimento_TESE.pdf: 3589123 bytes, checksum: d44189d5ff788541433dfaed7669cd11 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-01T20:53:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PauloRicardoPorfirioDoNascimento_TESE.pdf: 3589123 bytes, checksum: d44189d5ff788541433dfaed7669cd11 (MD5) Previous issue date: 2016-12-13 / Introdu??o: Os c?es s?o considerados os principais reservat?rios dom?sticos de Leishmania infantum no Brasil e apresentam um amplo espectro de manifesta??es cl?nicas, variando de perda de peso, anemia grave, hepatoesplenomegalia e les?es d?rmicas disseminadas. O objetivo deste estudo foi avaliar o perfil de express?o g?nica em c?lulas do ba?o e do sangue perif?rico de c?es naturalmente infectados por L. infantum e investigar as altera??es histopatol?gicas no ba?o, f?gado, intestino e pele, visando identificar poss?veis vias imunorreguladoras envolvidas na patog?nese da LVC. Metodologia: Vinte e um c?es oriundos do Centro de Controle de Zoonoses de Natal-RN foram estudados e um subgrupo destes animais (n=8) foi utilizado para estudos de express?o g?nica global. A carga de Leishmania nos diversos tecidos, foi estimada por qPCR e cultura para Leishmania foi realizada. O RNA total do ba?o e do sangue perif?rico foi extra?do e as bibliotecas de cDNA foram obtidas e sequenciadas em plataforma Illumina. As sequ?ncias obtidas foram filtradas e alinhadas contra o genoma de Canis familiaris pelo software Bowtie. A express?o g?nica diferencial foi analisada usando o protocolo do Cufflinks, a anota??o funcional e as caracter?sticas moleculares dos genes foram obtidas no banco de dados Gene Ontology e KEGG atrav?s do pacote STRINGdb. Fragmentos de f?gado, duodeno, pele e ba?o foram coletados, processados e corados com hematoxilina/eosina e imunofluoresc?ncia para an?lises histopatol?gicas. Resultados: As cargas parasit?rias estimadas para ba?o e f?gado apresentam correla??o, por?m n?o h? correla??o entre a carga parasit?ria destes tecidos com aquela presente no sangue. Aproximadamente 756 genes se mostraram super expressos no ba?o de animais sintom?ticos, como CTLA4, CCL2 e IL27; al?m destes, cerca de 1.190 genes apresentaram express?o reprimida neste mesmo grupo, como BMP6, C1QB e C1QC. As vias de ativa??o de c?lulas NK, receptores dos tipos Toll-like e NOD-like expressas no ba?o de animais sintom?ticos estavam com express?o elevada, enquanto as vias de s?ntese de ?ncoras de GPI e ativa??o do imunoproteossoma estavam reprimidas. A progress?o da LVC resulta em desorganiza??o da citoarquitetura do ba?o, com perda parcial da delimita??o entre polpa branca e vermelha. ? observado infiltrado inflamat?rio no f?gado, duodeno e pele. Validando o achado do transcriptoma, foi observada por imunofluoresc?ncia a presen?a de CTLA4, CCR7 e NLRP3 no ba?o de animais sintom?ticos. Conclus?es: A desregula??o de mecanismos tipicamente associados ? imunidade inata pode estar diretamente envolvida na patogenia da LVC. Al?m disso, uma alta efici?ncia no processamento e apresenta??o de ant?genos parecem ser respons?veis, pela resist?ncia ao desenvolvimento dos sinais cl?nicos e integridade tissular durante a infec??o por L. infantum em c?es. / Background: Dog is the main domestic reservoir of Leishmania infantum in Brazil. Those animals present a wide spectrum of clinical manifestations, varying from weight loss, anemia to hepatosplenomegaly and skin lesions. The goal of this study was to evaluate the gene expression profile in the spleen and peripheral blood cells from naturally Leishmania-infected dogs and to study the histology of the spleen, liver, gut and skin, in order to determine possible molecular pathways and histopathological process underlying the mechanisms related to disease progression and resistance. Methodology: 21 dogs was studied and a sub group (n=8) was selected for transcriptomic studies. In addition, spleen, liver, gut and blood parasitism were estimated by qPCR and parasite was isolated from the spleen by culture. Total RNA was extracted and cDNA libraries were constructed and sequenced in an Illumina platform. The reads obtained were filtered and aligned against Canis familiaris genome using Bowtie. Differential gene expression was analyzed using the Cufflinks workflow, functional annotation and molecular features for each gene was obtained from Gene Ontology and KEGG database using STRINGdb. A fragment of liver, gut, skin and another spleen fragment were collected, processed and stained by HE and immunofluorescence for histopathological analysis. Results: Parasite load estimated in the spleen and liver were strongly associated, however no correlation was observed between them and circulating parasite estimation. Approximately, 756 genes were upregulated in the spleens of symptomatic dogs, as CTLA4, CCL2 and IL27, furthermore, about 1,190 genes were downregulated in the same group of animals, as BMP6, C1QB and C1QC. We found that NK cells activation, toll-like and NOD-like receptors pathways are highly expressed in the spleen of symptomatic dogs, while GPI-anchors synthesis and immunoproteasome activation related genes are downregulated in these animals. Additionally, we observed that in symptomatic animals, the cytoarchitecture of spleen is altered, with partial loss of the delimitation between white and red pulp. Furthermore, an intense inflammatory infiltrate in the liver, gut and skin of these animals. Confirming the RNA-Seq findings, we observed by immunofluorescence CTLA4, CCR7 and NLRP3 are overexpressed the spleen of symptomatic dogs. Conclusions: These findings suggest that misregulation of innate immunity is involved in CVL and an efficient antigen presentation maybe decisive for resistance to clinical signs development and tissue integrity during L. infantum infection in dogs.

Leishmania amazonensis é um parasito endêmico no Brasil, que ao infectar humanos, pode causar a leishmaniose cutânea. Cerca de 12 milhões de pessoas estão infectadas com parasitos do gênero Leishmania em 98 países, e anualmente, 350 milhões de indivíduos estão em risco de contrair esta doença. Enquanto o papel da imunidade adaptativa já foi extensivamente investigado, em modelos de infecção com Leishmania spp., os mecanismos de alguns receptores da imunidade inata, e principalmente dos citosólicos, como é o caso do AIM2, permanecem obscuros. Recentemente, o nosso grupo descreveu a importância do inflamassoma de NLRP3 no controle da infecção por L. amazonensis, o qual é mediado pela produção de óxido nítrico dependente da sinalização de IL-1R. Neste trabalho, foi demonstrado que a deficiência para IL-1R confere uma maior susceptibilidade a este parasito do que a deficiência para NLRP3. Sugerindo que outros inflamassomas, que operam via IL- 1R, possam estar envolvidos na resposta contra este patógeno. Dentre estes, o AIM2 destacase como sendo um receptor de DNA citosólico que mediante a sua ativação promove a secreção de citocinas pro-inflamatórias e piroptose. Neste contexto, nós demonstramos que o AIM2 promove o controle da infecção in vitro por L. amazonensis em macrófagos, e que estas células requerem este sensor de DNA para a secreção de IL-1?, expressão da enzima NOS2 e produção de óxido nítrico. Adicionalmente, também observamos que AIM2 promove resistência à infecção por L. amazonensis in vivo, contribuindo para o desenvolvimento de uma resposta Th1. Por fim, também demonstramos que o inflamassoma de AIM2 atua na produção de IL-1? e IL-1?, por células dendríticas, assim como na expressão de CD86 e CD40 e na secreção de IL-12 por estas células. Desta forma, foi demonstrado neste trabalho que o AIM2, ao ativar células da imunidade inata e adaptativa, promove o controle direto ou indireto da infecção por L. amazonensis. / Leishmania amazonensis is an endemic parasite in Brazil that can cause the cutaneous leishmaniasis in humans. Annually, around 12 million people are infected with Leishmania spp. parasites, in 98 countries. In addition, 350 million of individuals are on risk to develop this disease. While the role of the adaptive immune response was already extensively evaluated, on models of infection with Leishmania spp., the mechanisms of some innate immune receptors, and mainly the cytosolic ones, such as AIM2, remain unclear. Recently, our group described the importance of the NLRP3 inflammasome to the control of L. amazonensis mediated by NO, which is dependent of the IL-1R signaling. In this work, it was also reported that the Il-1r deficiency displayed a higher susceptibility to L. amazonensis infection in comparison to Nlrp3-deficient mice. Suggesting that other inflammasomes, which may operate through IL-1R, might be involved in the response to this pathogen. Among these, the AIM2 highlights as a cytosolic DNA sensor, which, after its activation, promotes the secretion of proinflammatory cytokines and pyroptosis. On this context, we demonstrated that AIM2 promotes the in vitro control of L. amazonensis in macrophages, and that these cells require this DNA sensor for the IL-1? secretion, NOS2 expression and NO production. In addition, we also observed that AIM2 promotes the in vivo resistance to L. amazonensis infection, contributing for the development of a Th1 response. Finally, we also demonstrated that AIM2 acts on the production of IL-1? and IL-1?, by dendritic cells, as well as on the CD86 and CD40 expression and IL-12 secretion by these cells. Therefore, in this work, we showed that the AIM2, leading to the activation of innate and adaptive immune cells, promotes the direct or indirect control of L. amazonensis infection.

Submitted by Andre Moraes Queiroz (andre.moraesqueiroz@ufpe.br) on 2015-04-14T13:54:51Z No. of bitstreams: 2 Dissertação Anselmo Jiro Kamada.pdf: 3782162 bytes, checksum: 9e3edbe815739e95716e1427a8368966 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-14T13:54:51Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação Anselmo Jiro Kamada.pdf: 3782162 bytes, checksum: 9e3edbe815739e95716e1427a8368966 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2013 / FACEPE / Recentemente foi demonstrado o envolvimento do complexo protéico conhecido como inflamassoma na resposta inata à infecção pelo HIV-1. O inflamassoma é um complexo citoplasmático constituído principalmente por um receptor de padrões moleculares (NLRP-1, NLRP-3, NLRC-4, IFI16 ou AIM-2) e uma cisteína protease (caspase-1) responsável pela digestão de precursores e citocinas pró-inflamatórias da família IL-1 (IL-1ß, IL-18 e IL-33). A ampla atividade das citocinas IL-1ß e IL-18 na inflamação e ativação de células dendríticas e linfócitos demonstra um papel central do inflamassoma na regulação da resposta imune. A atuação deste complexo pode ter relevância particularmente na infecção pelo HIV-1 no qual o comprometimento do sistema imune é determinante na progressão da doença. Objetivo do trabalho foi avaliar o papel do inflamassoma na infecção pelo HIV-1 através de um modelo celular baseado em células dendríticas derivadas de monócitos (MDDCs). O cultivo alogênico do HIV-1 a partir do sangue periférico de portadores crônicos do HIV-1 e a padronização do protocolo de diferenciação in vitro em MDDCs foram estabelecidos inicialmente. Em seguida, a indução da resposta mediada pelo inflamassoma foi avaliada por expressão gênica dos componentes do inflamassoma e de produção de IL-1ß em MDDCs. Contemporaneamente, polimorfismos de base única (SNPs) nos principais genes do inflamassoma foram analisados em coortes de Recife e São Paulo de portadores do HIV-1 para verificar o papel das variações genéticas na susceptibilidade à infecção pelo HIV-1.