S'han estudiat els mecanismes d'inhibició antioxidant, temps dependent i temps independent per la inhibició competitiva de l'enzim ciclooxigenasa, així com la capacitat d'inhibició selectiva dels seus isoenzims COX-1/COX-2 per les famílies d'antiinflamatoris AINE arilacètics, indolacètics, N-arilantranílics, N-arilpropiònics i Arilheterocíclics, també s'ha estudiat el mecanisme antioxidant dels inhibidors duals ciclooxigenasa (COX) i 5-lipoxigenasa (5-LOX) derivats dels fenols i di-tert-butilfenols (BHT). L'estudi d'aquests mecanismes d'inhibició s'ha realitzat utilitzant mètodes indirectes de relació quantitativa estructura-activitat (QSAR) i mètodes directes per tècniques de docking (anclatge) i de molecular modeling (modelatge molecular) dels complexos [inhibidor-COX].En els mètodes indirectes, en una primera etapa s'ha optimitzat la estructura molecular dels inhibidors per mètodes semiempírics MNDO, AM1, PM3 i mètodes ab inito (3-21G) i posteriorment a través de l'anàlisis conformacional dels grups químics que permeten la lliure rotació molecular s'han obtingut les conformacions de mínima energia. S'ha seleccionat la conformació possiblement bioactiva per superposició (fitting) amb el substracte àcid araquidònic. Finalment s'han calculat diferents propietats electròniques,de lipofilia i estèriques per les sèries de derivats en la conformació bioactiva. Com paràmetres electrònics s'han calculat les càrregues electròniques i la densitat electrònica en determinats àtoms i fragments moleculars, també s'ha calculat el moment dipolar "mi", les energies en els orbitals frontera HOMO-LUMO. Per avaluar la lipofilia s'ha calculat el ClogP. També s'ha representat el PEM i els mapes d'interacció GRID per diversos grups químics, així com les propietats de solvatació amb el programa AMSOL.Com a resultat les activitats antiinflamatòries in vivo (disminució del volum de l'edema provocat per injecció de carragenina) i in vitro (IC50 ) per la inhibició de la COX correlacionen quantitativament amb la densitat electrònica "pi" dels anells aromàtics, així com amb el moment dipolar, indicant l'existència d'un primer procés de fixació a l'enzim a través del grup carboxílic i una posterior transferència electrònica entre el segon anell aromàtic i el receptor. Aquesta correlació ha estat corroborada amb la representació dels mapes de PEM, que diferencien a més el mecanisme d'inhibició temps dependent dels temps independent. Així els inhibidors temps dependents: àc. meclofenàmic, indometacina, diclofenac i flurbiprofèn entre altres presenten una distribució del PEM amb forma cònica sobre el primer anell aromàtic i amb el vèrtex localitzat en el grup carboxílic, mentre que els inhibidors temps independents: amfenac, fenclofenac, àc. mefenàmic, àc. flufenàmic, ibuprofèn i naxoprèn entre altres localitzen el PEM en el 1r. i 2n anells aromàtics. Els mètodes directes de docking i molecular modelling també corroboren i diferencien aquests dos mecanismes d'inhibició: els inhibidors temps dependents estabilitzen la presència d'una xarxa de molècules d'aigua que possibilita el tancament del locus de la COX entre els residus Arg120 i Tyr355 afavorint la formació de ponts d'hidrogen entre els residus Glu524-Arg513 i Arg120-Tyr355, fet que explicaria que aquests compostos temps dependents romanguessin més temps en el centre actiu de l'enzim podent establir així unions complementàries amb residus específics (Val523, Tyr385).Respecte al mecanisme antioxidant dels fenols i derivats del BHT s'ha verificant que aquests inhibidors actuarien mitjançant un mecanisme de captació de radicals, en aquest procés de neutralització intervindria el radical fenòxid, els derivats més actius tindrien més facilitat per formar aquest radical, el qual seria més estable que en els derivats pocs actius, així l'antiinflamatòria correlaciona amb l'entalpia de reacció delta-Hr per la formació del radical fenòxid a l'igual que la densitat electrònica en el punt crític de l'enllaç O-H. Les propietats de lipofilia també serien un factor determinant per la inhibició dual dels enzims COX i 5-LOX, tenint els compostos més actius un elevat ClogP, la inhibició de la COX2 humana pels fenols ha estat verificada pels mètodes de docking interaccionant el grup fenòlicamb la Ser530 i l'àrea hidrofòbica es localitzaria en un locus específic de l'enzim. En la inhibició de la 5-LOX seria important la interacció dels inhibidors amb l'àtom de ferro de l'enzim que resultaria reduït de d'estat fèrric a ferròs, fet que explicaria la capacitat d'inhibició dual COX i 5-LOX per aquests derivats. Finalment els dos models d'inhibició han estat validats amb sèries de compostos COX selectius i 5-LOX selectius.

El principal factor desencadenant del procés de neurodegeneració que caracteritza la Malaltia d’Alzheimer (MA) és el pèptid beta-amiloide (BA). La formació incrementada d’aquest pèptid i la seva agregació en forma d’oligòmers i fibrilles estan a l’origen d’una cascada de processos neurotòxics que culminen amb una disfunció neuronal generalitzada i mort neuronal. Recentment s’ha descrit una funció no colinèrgica de l‘enzim acetilcolinesterasa (AChE) d’importància fonamental en el context de la MA, ja que col•loca l’enzim a l’inici de la cascada de neurodegeneració de la malaltia. El Prof. Inestrosa va demostrar que l’enzim AChE, que coexisteix amb el BA en les plaques senils, es pot unir al pèptid accelerant in vitro la seva agregació. L’AChE no només promou l’agregació del BA sinó que a més promou l’agregació d’altres pèptids amiloidogènics, com pot ser el pèptid priònic. El lloc d’unió de l’AChE d’aquests pèptids és l’anomenat lloc perifèric de l’enzim, una zona d’unió que es troba a l’entrada de una cavitat o gorja d’uns 20 Å de longitud, al fons de la qual es troba el centre catalític de l’enzim. Així, en aquesta Tesi Doctoral quatre noves famílies d’híbrids que interaccionen simultàniament amb el centre catalític i el lloc perifèric de l’enzim han estat dissenyades, sintetizades i avaluades per la seva habilitat d’inhibir l’AChE, la butirilcolinesterasa, l’agregació del pèptid BA i l’agregació d’aquests pèptids amiloidogènics induïda per AChE. A més, els estudis de modelatge molecular realitzats han demostrat el caràcter d’inhibidors d’unió dual d’aquests nous híbrids. / The design of novel classes of inhibitors of acetylcholinesterase (AChE) have been mostly driven during the last years by the pivotal finding that AChE can promote aggregation of the β-amyloid peptide. Blockade of the peripheral site of AChE, the Aβ recognition zone within the enzyme, is therefore expected to affect the AChE-induced Aβ aggregation and could be a potential strategy to modulate the progression of Alzheimer’s Disease. On the basis of this premises novel classes of AChE inhibitors able to simultaneously bind to both peripheral and catalytic sites of AChE have emerged as promising anti-Alzheimer drug candidates. In this Thesis, new families of dual binding site inhibitors have been designed, synthesized and tested. To gain insight into the molecular determinants that modulate the AChE inhibitory activity of these novel inhibitors, the binding mode of the most active compounds was investigated by means of molecular modelling studies.

En els darrers anys s´ha consolidat l´enfoc translacional en l´abordatge del càncer. Aquest es basa en la voluntat de comprendre la biologia tumoral i implementar clínicament aquest coneixement dissenyant nous fàrmacs capaços d´inhibir específicament molècules oncogèniques.En aquest context, s´han descobert els receptors tirosina-quinasa (RTK) com a proto-oncogens crucials en la diferenciació i proliferació cel·lular i com a molècules amb un gran paper en carcinogènesi. KIT i PDGFR són dos exemples paradigmàtics de RTK pels que s´han desenvolupat fàrmacs inhibidors, amb gran èxit terapèutic en aquells tumors, com el GIST, on aquestes proteïnes tenen un paper patogenètic crucial.L´enfoc translacional ha tingut un gran impacte en el camp dels tumors renals que representen un 3% dels tumors de l´economia i dels quals s´en reconeixen diferents subtipus. Els avenços en biologia molecular han permès definir la patogènia d´algunes entitats, sobretot del Carcinoma renal de cèl·lula clara (CRCC), un dels subtipus tumorals freqüents i més agressiu per l´alt nombre de pacients que desenvolupen malaltia metastàtica (30-50%) i pels quals s´estan buscant noves eines terapèutiques.Pel valor oncogènic i com a dianes terapèutiques del KIT i PGFR, aquest treball té com a objectiu estudiar l´expressió d´aquestes proteïnes per immunohistoquímica sobre teixit de tumors de cèl·lules renals. A més a més, en base a aquests resultats i la literatura es pretén discutir el seu valor com a dianes terapèutiques.En el nostre estudi es va demostrar expressió de KIT de forma específica en Carcinoma renal Cromòfob (ChRCC) i Oncocitoma (OR). També es va trobar sobreexpressió de KIT i PDGFRα en la diferenciació sarcomatoide de carcinomes renals (SRCC) sense que aquesta s´associès amb mutacions en els exons 9, 11, 13, 17 del KIT ni en els exons 11, 12, 17, 18 de PDGFRα; que són els més freqüent mutats en el GIST .Alhora vam observar expressió inespecífica en cèl·lules tumorals de PDGFRα i PDGFRβ en un baix nombre de casos i de forma dèbil en diferents subtipus de tumors renals. Per contra, vam evidenciar sobreexpressió de PDGFRβ vascular de forma característica en un alt percentatge de CRCC. En base als nostres resultats, proposem la utilitat de KIT com a marcador en el diagnòstic diferencial de diferents subtipus tumorals. Alhora, hem demostrat que l´expressió de KIT i PDGFRα en els SRCC no segueix el mateix model patogenètic que el GIST. La literatura sosté la necessitat de demostrar la implicació patogènica d´una proteïna en un tumor per plantejar l´efectivitat de la seva inhibició selectiva, essent l´expressió immunohistoquímica per si mateixa insuficient per sostindre aquest principi.Fins al moment, no es coneix si KIT i PDGFR tenen un paper oncogènic en el ChRCC, OR i en SRCC.Per tant, no hi ha suficients dades per proposar l´us d´inhibidors proteics contra aquestes proteïnes en ChRCC i SRCC disseminats.Per altra banda l´expressió vascular de PDGFRβ en CRCC si que té una base patogenètica ja que el seu lligand (PDGF) s´ha implicat directament en la seva biologia. Alhora aquesta expressió vascular és coherent amb els estudis que relacionen la isoforma beta del PDGFR amb la maduració dels pericits i en la promoció de l´angiogènesi.Per tant, els nostres resultats sostenen la relació del PDGFRβ en la patogènia del Carcinoma renal de cèl·lula clara i el valor terapèutic dels fàrmacs contra aquest receptor amb finalitat antiangiogènica.En conclusió, en el context de l´enfoc translacional del càncer i la necessitat d´implementació de nous fàrmacs inhibidors proteics pel tractament del carcinoma renal metastàtic, l´anàlisi d´expressió de RTK en tumors renals permet juntament amb la integració d´altres estudis, la discussió del valor diagnòstic i sobretot terapèutic d´aquestes dianes moleculars. / Renal Cell Neoplasms (RCN) represent 3% of cancer incidence and comprise different clinicopathologic entities. Malignant subtypes, specially the most frequent one Clear Cell Renal Cell Carcinoma (CRCC), remain the most lethal of urologic cancers due to the high rate of patients (30-50%) developing metastatic disease for whom new therapies are needed.Great advances in molecular biology have led to the identification of tyrosine-kinase receptors (TKR) as relevant proteins in tumorigenesis. Moreover the advent of selective inhibitors against them has raised interest on its expression in different tumors.PDGFR and KIT are two examples of TKR that have an oncogenic role in numerous neoplasms and can be inhibited pharmacologically. Because of its potential role as proto-oncogens and therapeutic targets; We aimed to study its immunohistochemical expression in RCN and to discuss its possible role as molecular targets.Our results highlight specific expression of KIT in Chromophobe renal cell carcinoma (ChRCC) and Renal Oncocytoma (RO). Overexpression of KIT and PDGFRα was found in sarcomatoid differentiation of renal tumours (SRCC) without mutations in KIT exons 9,11,13,17 nor PDGFR exons 11,12,17,18 which are the most commonly mutated in GIST.Moreover inespecific and low expression of PDGFRα and PDGFRβ was evidenced in tumoral cells in different RCN. In contrast, vascular expression of PDGFRβ was seen caracteristically in half of CRCC cases.According to our results, we propose KIT as a useful marker for differential diagnosis among RCN.Moreover we demonstrate that expression of KIT and PDGFR in SRCC doesn´t follow the same pathogenetic mecanism as GIST.Scientific community claims that immunohistochemical expression of a protein in a tumor is not enough to propose it as a therapeutic target and that demonstation of its pathogenetic role is needed. So as, there is still no evidence of participation of KIT-PDGFR in ChRCC, OR nor SRCC oncogenesis, there is not enough data to propose them as therapeutic targets.Conversely, in different studies PDGFRβ has been involved in CRCC pathogenesis and has been related to tumor angiogenesis by perycite recruitment. So that, vascular expression of PDGFRβ in CRCC favours its consideration as a therapeutic target in this tumor subtype.

Malignant melanoma is the most lethal skin cancer with no effective therapeutic treatment in its metastatic stages. RAS and PI3K pathways have been shown to play a critical role in melanoma development and progression. In this study, we assessed the in vitro and in vivo inhibition potential of a BRAF inhibitor (Sorafenib, Bayer) and a PI3K/mTOR inhibitor (PI-103, PIramed-Genentech) in primary melanoma cell lines. We used primary cell lines isolated from spontaneous melanomas obtained in the UV induced HGF transgenic melanoma mouse model.Although PI-103 and sorafenib inhibited melanoma in vitro cell proliferation and viability, the inhibition of RAS pathway was more effective. The combination of the two drugs showed a synergistic effect inhibiting RAS and PI3K pathways and in vitro melanoma cell proliferation in a cell line dependent manner. However, the combined treatment of orthotopic xenographs in immunocompetent FVB mice did not cooperate blocking tumor growth. Surprisingly, the in vivo treatment with PI-103 enhanced tumor growth. Our results also revealed that PI-103 caused immunosuppression inducing thymus atrophy and upregulating the intratumoral transcriptional levels of inmunosuppressors. In addition, PI-103 induced the antiapoptotic BH3 family proteins Mcl-1, Bcl-2 and BclXL, which correlated with the lower apoptotic rate observed within the PI-103 treated tumors. These data indicates that due to melanoma heterogeneity, some precautions should be taken when using these inhibitors for treatment. Moreover, these results certainly make an argument for investigating unexpected effects of rational drug combinations on immunocompetent animal models before conducting clinical studies.

No description available.

Entre les estratègies ambientals i productives en l'ús dels nutrients s'inclou l'ús dels purins i l'ús dels inhibidors de la nitrificació (IN). En el cas del purins cal conèixer el seu impacte en el medi i valorar la seva capacitat d'aportar nutrients. L'aparició del nou IN, 3,4-dimetilpirazol fosfat (DMPP), patentat per l'empresa BASF l'any 1997, obria la possibilitat d'aplicar un producte que fins ara estava limitat als cultius d'alt valor econòmic, a la jardineria i als camps de golf.La Tesi doctoral avalua, en diferents escenaris, l'ús del DMPP i l'ús de purins. Per aquest motiu, es van dur a terme dos experiments en testos amb el cultiu de raigràs anglès (Lolium perenne L.). També es van realitzar tres experiments de camp, un amb blat d'hivern (Triticum aestivum L.) durant quatre campanyes (1999-2003) en un sòl franc, un amb el mateix cultiu durant dues campanyes (2001-2003) en un sòl franc argil.lo-llimós, i un amb panís (Zea mays L.) durant dues campanyes (2002 i 2003) en un sòl franc. Utilitzant les dades del primer experiment de blat es va portar a terme una calibració i validació del model de simulació CropSyst.El DMPP es va avaluar en diferents dosis de purí i en fertilitzants minerals, mitjançant el control del rendiment del cultiu, de l'absorció de nitrogen i en alguns experiments, de la resta de macro i micronutrients, i dels nivells de nitrats i amoni en el perfil del sòl.També es van calcular índexs d'eficiència en l'ús del nitrogen i es va fer un balanç aproximat de nitrogen. En el cas dels testos, es van mesurar les pèrdues de nitrogen per lixiviació.En general els rendiments van respondre directament a les aportacions de nitrogen, peròno es van trobar diferències clarament significatives per la utilització del DMPP.Igualment va passar amb l'absorció de nitrogen i altres macro i micronutrients. Es van veure alguns resultats interessants a nivell mediambiental pel que fa a la pèrdua de nitrats per lixiviació, ja que hi va haver una reducció considerable d'aquestes pèrdues pel fet d'utilitzar el DMPP.El que és evident és que en experiments de camp hi ha un error experimental molt elevat que emmascara l'efecte que es vol analitzar. Com s'ha demostrat, no hi ha una clara consistència dels resultats. És a dir, en el cas de l'IN, l'efecte analitzat no sempre ha estat el de la hipòtesi plantejada. Tot i així, en la situació actual amb uns preus similars entre els fertilitzants amb i sense inhibidor de la nitrificació, els avantatges en l'ús de l'IN cal que es considerin (menys pèrdues per rentat, major disponibilitat de N per a laplanta i millors índexs d'eficiència) com una clara millora en la gestió de la fertilitzaciónitrogenada i una opció que s'ha tenir en compte com a bona pràctica agrària.D'altra banda, en l'experimentació amb purins en quantitats que no superin els 30 m3 ha-1, el sistema tendeix a estar equilibrat respecte al balanç de fòsfor en el cas del blat de regadiu. El valor fertilitzant dels purins va quedar clarament demostrat i les seves limitacions ambientals poden controlar-se amb l'ús d'anàlisis tant dels purins com dels sòls on s'apliquen.Pel que fa a l'ús del DMPP en els purins, els clars efectes de l'assaig amb testos no es van mostrar de manera tan evident en els experiments de camp. Fa falta un major control de les variables mesurades al camp per obtenir una clara resposta de l'efecte de l'IN aplicat amb el purí. / Entre las estrategias ambientales y productivas en el uso de los nutrientes, se incluye el uso de los purines y el uso de los inhibidores de la nitrificación (IN). En el caso de lospurines, hace falta conocer su impacto en el medio y valorar su capacidad para aportar nutrientes. La aparición del nuevo IN, 3,4-dimetilpirazol fosfato (DMPP), patentado por la empresa BASF en el año 1997, abría la posibilidad de aplicar un producto, que hasta el momento, estaba limitado a cultivos de alto valor económico, a la jardinería y acampos de golf.La tesis doctoral evalúa, en distintos escenarios, el uso del DMPP y el uso de los purines. Por este motivo, se llevaron a cabo dos experimentos en macetas con el cultivo de raigrás inglés (Lolium perenne L.). También se realizaron tres experimentos de campo, uno con trigo de invierno (Triticum aestivum L.) durante cuatro campañas(1999-2003) en un suelo franco, uno con el mismo cultivo durante dos campañas (2001- 2003) en un suelo franco arcillo-limoso, y uno con maíz (Zea mays L.) durante dos campañas (2002 y 2003) en un suelo franco. Utilizando los datos del primerexperimento de trigo se llevó a cabo una calibración y validación del modelo de simulación CropSyst.El DMPP fue evaluado en diferentes dosis de purín y en fertilizantes minerales, mediante el control del rendimiento del cultivo, de la absorción de nitrógeno y en algunos experimentos, de los otros macro y micronutrientes, y de los niveles de nitratos y amonio en el perfil del suelo. También se calcularon índices de eficiencia en el uso delnitrógeno y se hizo un balance aproximado de nitrógeno. En el caso de las macetas, se midieron las pérdidas de nitrógeno por lixiviación.En general los rendimientos respondieron directamente a las aportaciones de nitrógeno,pero no se encontraron diferencias claramente significativas por la utilización del DMPP. Igualmente pasó con la absorción de nitrógeno y otros macro y micronutrientes. Se vieron algunos resultados interesantes a nivel medioambiental con respecto a lapérdida de nitratos por lixiviación, ya que ha habido una reducción considerable de estas pérdidas por el hecho de utilizar el DMPP.Lo que es evidente es que en experimentos de campo hay un error experimental muy elevado que enmascara el efecto que se quiere analizar. Como se ha demostrado, no hay una clara consistencia de los resultados. Es decir, en el caso del IN, el efecto analizado no siempre ha sido el de la hipótesis planteada. Sin embargo, en la situación actual con unos precios similares entre los fertilizantes con y sin inhibidor de la nitrificación, las ventajas en el uso del IN deben considerarse (menos pérdidas por lavado, mayordisponibilidad de N para la planta y mejores índices de eficiencia) como una claramejora en la gestión de la fertilización nitrogenada y una opción a tener en cuenta comobuena práctica agraria.Por otro lado, en la experimentación con purines en cantidades que no superen los 30 m3 ha-1, el sistema tiene tendencia a estar equilibrado respeto al balance de fósforo en el caso del trigo de regadío. El valor fertilizante de los purines quedó claramente demostrado y sus limitaciones ambientales pueden controlarse con el uso de análisis tanto de los purines como de los suelos dónde se aplican.En referencia al uso del DMPP en los purines, los claros efectos en el ensayo con macetas no se vieron de manera tan evidente en los experimentos de campo. Hace falta un mayor control de las variables medidas en campo para obtener una clara respuesta del efecto del IN aplicado con el purín. / Pig slurry (PS) fertilization and nitrification inhibitors (NI) use are included in environmental and productive strategies. In the case of PS, it is important to know its impact to environment and to value its capacity of nutrient contribution. The appearance of a new NI, 3,4-dimethylpirazol phosphate (DMPP), patented by BASF in 1997,offered the possibility to apply this kind of products to agriculture and not only to valuecrops, gardening and golf courses, as it was the case before.This PhD thesis evaluates the use of DMPP and pig slurries in different scenarios. It is carried out in two pot experiments with ryegrass (Lolium perenne L.). Also, three field experiments were conducted, one with wheat (Triticum aestivum L.), during four seasons (1999-2003) in a loam soil, one with the same crop during two seasons (2001-2003) in a silty clay loam soil, and one with maize (Zea mays L.) during two seasons (2002 and 2003) in a loam soil. Using data for the first experiment with wheat, a calibration and validation of the simulation model CropSyst was carried out.DMPP was appraised in different doses of PS and in mineral fertilizers, by evaluating crop yield, nitrogen absorption, as well as macro and micronutrients absorption in some of the experiments, and nitrates and ammonium levels in soil profile. Nitrogen use efficiency indices and approximated nitrogen balance were also calculated. In pot experiments, lixiviation nitrogen losses we re measured. In general, crop yields had a direct response to nitrogen contribution, but there was no significant difference due to DMPP utilization. The same effect was found with nitrogen and macro and micronutrients absorption. Some interesting results were found because of the reduction of nitrate lixiviation due to DMPP utilitzation.It is evident that in field experiments there is a high experimental error, which could mask the effect of what we want analyze. As it is demonstrated, results are not consistent. Namely, in the case of NI, the observed effect does not always agree with the initial hypothesis. However, in the present situation with similar prices between fertilizers with and without NI, we have to consider the advantages of using NI (lesslixiviation losses, higher nitrogen availability for plants and better efficieny indeces) asa better management of nitrogen fertilization and an option for better agriculture practices.Nevertheless, in experiments with pig slurries in quantities below 30 m3 ha-1 the systemtended to be balanced with phosphorus balance in the case of irrigated wheat. Pig slurry fertilizing value was proved and its environmental limitations can be controlled with pigslurry and soil analyses.The clear results found in pot experiments using DMPP with pig slurries, were not so evident in field experiments. A higher control in field measured variables is necessary in order to obtain a clear response to the effect of NI applied with pig slurry.

Cancer is the second disease leading cause of death in industrialized countries. Although early detection and more efficient drugs are responsible of the reduction of mortality, several cancers still present difficult treatments and low survival rates. Conventional drugs only exhibit moderate therapeutic index between cancer and normal tissues but recent advances are focused to improve lesstoxic treatments. Hence, new drugs must target specific signaling pathways involved in cell growth and proliferation. Concerning this aim, two mechanism involved in cancer disease, named apoptosis (or programmed cell death) and pentose phosphate pathway, have been selected in this work to search new inhibitors to target crucial proteins of both cell routes.Overexpression of antiapoptotic genes has been correlated with tumor growth and resistance tochemotherapy, thus many efforts have been done to block the activity of XIAP and Survivin, central proteins acting in apoptosis and studied in the present work. Moreover, the two most active proteins detected in both the oxidative and nonoxidative branches of the pentose phosphate pathway, Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase (G6PDH) and Transketolase (TKT), have been also selected in this thesis.Molecular Modeling methods, covering topics in protein and peptide recognition, molecular dynamics, pharmacophore generation, database searching, docking and scoring in virtual screening and binding free energy prediction, have been applied with success to discover new active molecules inhibitors of XIAP, Survivin, G6PDH and TKT proteins. / TÍTULO: "Ruptura del reconocimiento proteína-proteína en rutas tumorales mediante modelizaciónmolecular".TEXTO:El cáncer es el segunda causa de muerte por enfermedad en los paises industrializados. A pesar de la existencia de métodos eficaces de detección precoz y tratamientos cada vez más efectivos responsables de la reducción de mortalidad, algunos tipos de tumores presentan todavía tratamientos difíciles y bajos índices de supervivencia. Los fármacos convencionales sólo exhiben un índice terapéutico moderado, entre células sanas y tumorales, por ello los avances recientes se centran en encontrar tratamientos menos tóxicos para esta enfermedad. Así pues, los fármacos del futuro deberán incidir en rutas biológicas específicas, involucrando el crecimiento celular y laproliferación descontrolada. Siguiendo este planteamiento, en este trabajo se han seleccionado dos mecanismos biológicos involucrados en el cáncer, llamados apoptosis (o muerte celular programada) y ruta de las pentosas fosfato, con el objetivo de encontrar nuevos inhibidores de las proteínas más sensibles de ambas rutas.La sobreexpresión de genes antiapoptóticos se ha correlacionado con el crecimiento tumoral y laresistencia a los tratamientos habituales. Así, se está trabajando en entender el funcionamiento de dos proteínas importantes de esta ruta, el XIAP y el Survivin, las cuales se han seleccionado en este trabajo, debido a que todavía no existen fármacos en el mercado que actúen sobre estas dos proteínas y debido a que su interés terapéutico se ha demostrado claramente.Por otro lado, en este trabajo también se han estudiado las dos proteínas más activas detectadas en la rama oxidativa y no oxidativa de la ruta de las pentosas fosfato, la Glucosa-6-Fosfato Deshidrogenasa y la Transketolasa.El objetivo principal ha consistido en aplicar métodos de la Modelización Molecular, que cubrentópicos recientes, como el reconocimiento de péptidos y proteínas, la búsqueda en bases de datos, el anclaje y evaluación del cribado virtual de compuestos y la predicción de energías libres de unión, para encontrar nuevos inhibidores de las proteínas XIAP, Survivin, Glucosa-6-Fosfato Deshidrogenasa y Transketolasa.

La present Tesi tracta sobre el desenvolupament d’inhibidors d’integrasa (INIs) del VIH alternatius. Es va partir de la base existent a la literatura química sobre diverses substàncies quelatants d’ions divalents com a potencials inhibidors del procés de strand transfer catalitzat per la integrasa. Amb aquest concepte en mà, varem pensar que la unió de grups quelatants semblants, però no idèntics, als àcids 2,4-dioxocarbonílics a nucleobases o nucleòsids purínics i pirimidínics podrien millorar les propietats farmacocinètiques dels substrats, tot reduint-ne la toxicitat intrínseca d’alguns dicetoàcids. Al Capítol 1 de la Tesi es duen a terme rutes accessibles i segures cap a la síntesis de tetrazols substituïts mitjançant una reacció de cicloaddició-[3+2] entre azides orgàniques i cianurs d’acil en presència de Cu2(OTf)2. Al Capítol 2 es concentren els nostres esforços cap a la preparació de “dicetotetrazols” juntament amb la síntesi de derivats de timidines i AZT amb subestructures de “dicetotetrazols”. Al Capítol 3 es preparen estructures que contenen nucleòsids o nucleobases units a hidroxiquinolines (com a farmacòfors del tipus “dicetoàcids” o “dicetotetrazols”). Finalment, al Capítol 4, es descriuen les diferents rutes que s’han assajat per arribar a la obtenció de N-hidroxiderivats d’hipoxantina i inosines, així com N-hidroxiderivats de benzopirimidines. En aquest cas, el farmacòfor està relacionat amb el Raltegravir, que és l’únic INI aprovat fins la data per la FDA. / As the initial diketo acids, uncovered by Shionogi and Merck pharmaceutical companies around 2000 as integrase inhibitors, turned out to be toxic, other small molecules were early designed. An obvious replacement of the carboxyl group by its bioisoster tetrazole ring was envisaged by many groups. This posed the question of how to prepare these substrates safely and efficiently. A new method to synthesize 5-acetyl or 5-methoxycarbonyl derivatives of tetrazoles was envisaged in our lab taking advantage of the [3+2]-cycloaddition reaction of organic azides with acyl cyanides and alcoxycarbonyl cyanides (ROCO-CO-CN) in the presence of Cu2(OTf)2 as the catalyst of choice. We achieved to carry out these processes under very mild conditions as described in chapter 1. The most outstanding facts of the second topic may be summarized as follows: 5-acetyl-tetrazole (prepared as reported in topic 1) was linked to N3 of thymidine and of 3’-azido-3’-deoxythymidine (AZT), as model compounds of natural nucleosides and of nucleoside RT inhibitors (NRTIs), respectively, by condensation of the lithium salt of 5-acetyl-1-(4-methoxybenzyl)tetrazole, with nucleoside-derived oxo nitriles. Most of the original activity of AZT was retained. A route for the conjugation of potential NRTIs with pharmacophores of integrase inhibitors (INIs) was disclosed. In the third topic, which we examined in parallel with the preceding one, 8-hydroxy-quinolinecarboxylic acids were linked to position 5 of 5-iodo-2’-deoxy- uridines or 5-iodouracils through spacers that were generated by [3+2]-cycloaddition of TMS–C=C–Ura (where Ura means any uracil derivative), with azides, catalysed by Cu2(OTf)2. This is an example of a click reaction with a non-terminal triple bond, but it was shown that the cleavage of C–Si bond preceded the CuAAC reaction. In topic 4, N-hydroxybenzopyrimidine-2-carboxamides and N-hydroxyhypoxanthine-2-carboxamide with the amide nitrogen substituted by a 4-fluorobenzyl group, containing the essential pharmacophoric elements of HIV-1 integrase inhibitor Raltegravir, were synthesized by means of a sequence that involved a cyclization of amino-hydroxamates with methyl trimetoxiacetate. Other approaches were unsuccessful. Unfortunately, prototypes prepared to date are devoid of integrase inhibition and antiviral activity (IC50 and EC50 > 10 μM).

El virus de la immunodeficiència humana de tipus 1 (VIH-1) és l'agent que provoca la síndrome de la immunodeficiència adquirida (SIDA). Una malaltia, que va ser descoberta al principi del 80, que pateixen avui en dia entre 31.1 i 35.8 milions d'individus arreu del món i que causa 2.7 milions de nous infectats cada any. Per tot això, i pels gairebé tres milions de morts que provoca cada any de mitjana aquesta malaltia, es considera important intentar bloquejar el virus (VIH-1), un paràsit que utilitza la maquinària metabòlica de la cèl·lula per replicar-se. Actualment, el tractament més comú és el TARGA (tractament antiretroviral de gran activitat), que consisteix en la combinació d'inhibidors de la transcriptasa inversa i de la proteasa, dos enzims vírics necessaris perquè es produeixi la replicació del virus. La principal problemàtica que presenta un virus d'aquestes característiques és la gran quantitat de mutacions que pot patir i, en conseqüència, la resistència que adquireix front als fàrmacs administrats. Per això és de vital importància trobar noves molècules que puguin no només suplir-ne d'altres front a aquest problema sinó que puguin interaccionar sobre noves dianes terapèutiques. No va ser fins al segle XXI que van ser aprovats fàrmacs per altres dianes terapèutiques que no fossin la transcriptasa inversa o la proteasa. Destacant-ne Fuzeon® com a inhibidor de fusió entre les membranes del VIH i la cèl·lula hoste i Selzentry® com a inhibidor de CCR5, un dels dos coreceptors d'entrada que pot emprar el virus per infectar la cèl·lula. En canvi, encara a dia d'avui no hi ha cap estructura aprovada per inhibir CXCR4, un altre coreceptor d'entrada. D'entre els compostos estudiats contra aquesta diana terapèutica en destaca l'AMD3100, un compost format per dos macrocicles (ciclam) units per un espaiador p-fenilenbismetilènic. Durant les estudis en fases clíniques, es va observar un efecte cardiotòxic i falta de biodisponibilitat oral relacionats amb l'elevada càrrega positiva a pH fisiològic. En el Laboratori de Síntesi de l'IQS, s'ha desenvolupat una família de tetraamines anàlogues del AMD3100 amb les quals, conservant l'espaiador i substituint les unitats de ciclam per diamines, s'han aconseguit bones activitats inhibidores de CXCR4. En el present treball es desenvolupen variants d'aquestes tetraamines per modificació de l'espaiador i per substitució dels ciclams per altres sistemes heterocíclics, respectivament. D'altra banda, un dels primers ITINANs (Inhibidor de la Transcriptasa Inversa No Anàleg de Nucleòsid) descoberts va ser l'1-[(2-hidroxietoxi)metil]-6-(feniltio)timina (HEPT). En el Laboratori de Disseny Molecular de l'IQS es va seleccionar una quimioteca d'anàlegs d'aquesta estructura i es va proposar una ruta sintètica. Un dels objectius d'aquest treball és doncs, a més d'obtenir anàlegs d'HEPT, confirmar sintèticament la viabilitat de l'itinerari proposat, comprovant que sigui robust, de rendiments elevats i de condicions de reacció prou suaus per poder automatitzar-lo. / El virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1 (VIH-1) es el agente que provoca el síndrome de la inmunodeficiencia adquirida (SIDA). Una enfermedad, que fue descubierta a principios de los 80, que sufren hoy en día entre 31.1 y 35.8 millones de individuos por todo el mundo y que causa 2.7 millones de nuevos infectados cada año. Por todo esto, y por los casi tres millones de muertos que provoca cada año de media esta enfermedad, se considera importante intentar bloquear el virus (VIH-1), un parásito que utiliza la maquinaria metabólica de la célula para replicarse. Actualmente, el tratamiento más común es el TARGA (tratamiento antirretroviral de gran actividad), que consiste en la combinación de inhibidores de la transcriptasa inversa y de la proteasa, dos enzimas víricas necesarias para que se produzca la replicación del virus. La principal problemática que presenta un virus de estas características es la gran cantidad de mutaciones que puede sufrir y, en consecuencia, la resistencia que adquiere frente a los fármacos administrados. Por eso es de vital importancia encontrar nuevas moléculas que puedan no sólo suplir a otras frente a este problema sino que puedan interaccionar sobre nuevas dianas terapéuticas. No fue hasta al siglo XXI que fueron aprobados fármacos para otras dianas terapéuticas que no fuesen la transcriptasa inversa o la proteasa. Destacan Fuzeon® como inhibidor de fusión entre membranas del VIH y la célula huésped y Selzentry® como inhibidor de CCR5, uno de los dos correceptores de entrada que puede usar el virus para infectar la célula. En cambio, aún a día de hoy no hay ninguna estructura aprobada para inhibir CXCR4, otro correceptor de entrada. De entre los compuestos estudiados contra esta diana terapéutica destaca el AMD3100, un compuesto formado por dos macrociclos (ciclam) unidos por un espaciador p-fenilenbismetilénico. Durante los estudios en fases clínicas, se observó un efecto cardiotóxico y falta de biodisponibilidad oral relacionados con la elevada carga positiva a pH fisiológico. En el Laboratorio de Síntesis del IQS, se ha desarrollado una familia de tetraaminas análogas al AMD3100 con las cuales, conservando el espaciador y sustituyendo las unidades de ciclamo por diaminas, se han conseguido buenas actividades inhibidoras de CXCR4. En el presente trabajo se desarrollan variantes de estas tetraaminas por modificación del espaciador y por sustitución de los ciclamos por otros sistemas heterocíclicos, respectivamente. Por otro lado, uno de los primeros ITINANs (Inhibidor de la Transcriptasa Inversa No Análogo de Nucleósido) descubiertos fue el 1-[(2-hidroxietoxi)metil]-6-(feniltio)timina (HEPT). En el Laboratorio de Diseño Molecular del IQS se seleccionó una quimioteca de análogos de esta estructura y se propuso una ruta sintética. Uno de los objetivos de este trabajo es pues, además de obtener análogos de HEPT, confirmar sintéticamente la viabilidad del itinerario propuesto, comprobando que sea robusto, de rendimientos elevados y de condiciones de reacción lo suficientemente suaves para poder automatizarlo. / The human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) is the agent which causes acquired immunodeficiency syndrome (AIDS). A disease that was discovered in the early 80s, that nowadays affects between 31.1 and 35.8 million individuals around the world and causes 2.7 million new infections each year. For all this, and for the nearly three million deaths caused each year on average by this disease, it is considered important to try to block the virus (HIV-1), a parasite which uses the cell's metabolic machinery to replicate. Currently, the most common treatment is HAART (highly active antiretroviral therapy), which is a combination of reverse transcriptase and protease inhibitors, two viral enzymes necessary for virus replication. The main issues presented by this type of virus are the large number of mutations that can occur and, therefore, the resistance it acquires to administered drugs. It is therefore of vital importance to find new molecules which can not only replace others dealing with this problem, but can interact on new therapeutic targets. It was not until the 21st century that drugs interacting with other therapeutic targets, neither reverse transcriptase nor protease, were approved. Emphasizing Fuzeon® as an inhibitor of membrane fusion between HIV and the host cell and Selzentry® as an inhibitor of CCR5, one of the two coreceptor that the virus can use to infect the cell. However, even today there is not an approved structure to inhibit CXCR4, another entry coreceptor. Among the studied compounds against this therapeutic target highlights the AMD3100, a compound formed by two macrocycles (cyclam) linked by a p-phenylenbismethylenic spacer. During clinical trials, there was a cardiotoxic effect and a lack of oral bioavailability associated with its high positive charge at physiological pH. In the Synthesis Laboratory at IQS, a family of tetraamines analogs of AMD3100 which retain the spacer and replace the cyclam units by diamines, have been developed. These compounds showed good CXCR4 inhibitory activity. In this thesis we develop variants of these tetraamines by modification of the spacer and replacement of the cyclams by other heterocyclic systems, respectively. On the other hand, one of the first NNRTIs (Non-Nucleoside Reverse Transcriptase Inhibitors) that was discovered was 1-[(2-hydroxyethoxy)methyl]-6-(phenylthio)thymine (HEPT). In the Laboratory of Molecular Design at IQS a chemical library of analogs of this structure was selected and a synthetic route was proposed. Therefore, one objective of this work is to obtain HEPT analogs, confirm the feasibility of the proposed synthetically pathway, checking the robustness of the reactions, that the yields are high and that the reaction conditions are mild enough to automate the process.

Tot i que s'han assolit molts reptes en la lluita contra el SIDA, actualment encara se'n desconeix la cura definitiva. Tots els fàrmacs assequibles comercialment i llur combinació en l'anomenada teràpia antiretroviral altament activa (HAART) milloren la qualitat de vida de les persones infectades però l'actual teràpia té uns costos molt elevats, sobretot si tenim en compte que els 95% de la gent infectada viu en països en vies de desenvolupament, i pateix altres limitacions com ara la necessitat de dosis elevades, els efectes secundaris i sobretot, el problema de la resistència als fàrmacs. A més a més aquests inhibidors, tot i tenir una forta activitat, no són ideals, ja que en general tenen una baixa solubilitat aquosa, s'eliminen fàcilment, no són assequibles per via oral i tenen una durada d'acció breu.La present Tesi doctoral té per objectiu el disseny, síntesi i avaluació de nous inhibidors de la proteasa del VIH-1 que actuïn per un mecanisme d'inhibició diferent als comercialitzats fins al moment i que ajudi a combatre els inconvenients associats als inhibidors comercials.En aquest treball es descriu en primer lloc la síntesi de diferents estructures pseudodipeptídiques: l'oxazolopiperidona 80, el lactam de Freidinger 82 i les pirrolizidinones (6R)- i (6S)-79.A continuació es descriu la incorporació de l'oxazolopiperidona 80 i el lactam de Freidinger 82 en nous inhibidors de dimerització de la HIV-1 PR, mitjançant síntesi peptídica en fase sòlida.Els inhibidors sintetitzats es poden subdividir en 3 categories: a) inhibidors patró formats per aminoàcids naturalsb) inhibidors de tipus I, formats per una sola cadena peptídica i que incorporen una de les estructures pseudodipeptíquesc) inhibidors de tipus II, formats per dues cadenes peptídiques i que incorporen una de les estructures pseudodipeptídiques d) inhibidors de tipus II, formats pels subproductes de reacció simètrics fruit de l'entrecreuament entre cadenes peptídiques.Aquests nous compostos han estat avaluats in vitro mitjançant un assaig de fluorescència sobre la HIV-1 PR expressada en E.coli. Aquest estudi ha mostrat 8 dels inhibidors presenten baixa activitat i 7 activitat moderada. D'aquests compostos amb activitat moderada, els compostos CH-50, 176 i 181 han mostrat ser inhibidors dissociatius.Addicionalment, s'ha assajat l'activitat in vivo dels inhibidors sintetitzats. Els assaigs in vivo han mostrat que 3 dels compostos tenen activitat baixa anti-VIH sobre el virus wild type, mentre que 4 presenten activitat moderada (176, 186, 187cc i 189). Els assaigs in vivo també han evidenciat la baixa toxicitat dels inhibidors sintetitzats.Entre els compostos sintetitzats destaca l'inhibidor 176, que ha resultat tenir activitat anti-VIH sobre un virus resistent als inhibidors de proteasa comercials. Es tracta, doncs, d'un bon cap de sèrie per a la investigació de nous inhibidors de la proteasa del VIH-1 actius en línies cel·lulars resistents als inhibidors comercials.Finalment, s'han dut a terme experiments de microcalorimetria per tal d'estudiar la interacció del compost 176 amb la HIV-1 PR, on s'ha observat que aquest compost presenta un perfil d'interacció amb la proteasa similar a l'inhibidor comercial ritonavir, tot i presentar menor afinitat (Ka). Aquests experiments també han posat de manifest que l'inhibidor 176 actua sobre la forma dimèrica de la proteasa, sense arribar a desplaçar un dels monòmers. / Dimerization of HIV-1 protease is essential to attainment of the mature structure, an enzymatically active C2-symmetric homodimer. The dimerization interface is largely composed of interdigitated N- and C-terminal portions of the protease, which thus form a four-stranded antiparallel ß-sheet. By targeting this ß-sheet portion of the protease, a region which is highly conserved among HIV-1 isolates, agents may be generated which block the assembly of the homodimer or disrupt the dimeric interface, and so should lead to a loss of biological activity.Dimerization inhibitors have been developed in the context of this research based on a structure composed by the native sequences of HIV-1 protease N- and C-termini and by substitution of some of the dipeptides in these structures for pseudopeptides with restricted conformation (3-aminolactams derivatives), to increase the conformational constraint and convert them, this way, in more active agents and less prone to degradation.First of all, the synthesis of oxazolopiperidone 80, Freidinger lactam 82 and pyrrolizidinones (6R)- i (6S)-79 has been achieved and these structures have been incorporated by SPPS into the N- and C-terminal peptide chains of HIV-1 PR.The resulting compounds have been tested in vitro by means of a fluorescence assay, using HIV-1 PR expressed in E. Coli. As a result, 7 compounds with moderate activity have been identified.An in vivo test has been also carried out, showing that 4 of the synthesized compounds (176, 186, 187cc i 189) present moderate activity against the HIV wild type and that none of the compounds show significant toxicity at the assayed concentrations. The compound 176 has additionally shown to present activity against a mutated strain of HIV-1, proving its potential as a lead compound for future research of resitant HIV-1 PR inhibitors.