Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-10-07T11:26:10Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1381844 bytes, checksum: f37c2685480834a1dd06580f7461ed33 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-07T11:26:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1381844 bytes, checksum: f37c2685480834a1dd06580f7461ed33 (MD5) Previous issue date: 2010-10-21 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A lagarta da soja, Anticarsia gemmatalis, por ser considerada uma das principais pragas da cultura da soja, tem sido alvo de estudos visando a busca de alternativas para o seu controle. A utilização de inibidores de proteases (IPs) como alternativa para o controle de pragas tem sido amplamente estudada. Sabe-se que uma rota de defesa vegetal, talvez a mais conhecida, é denominada rota octadecanóide (ou via das lipoxigenases), a qual culmina com a produção do ácido jasmônico: um hormônio vegetal que ativa genes que expressam inibidores de proteases, tidos como agentes anti-metabólicos, pois levam os insetos a uma deficiência protéica. Os IPs atuam no intestino médio dos herbívoros, inibindo a ação das proteases sobre as proteínas provindas da alimentação, havendo, portanto, uma redução na disponibilidade de aminoácidos ao inseto, podendo resultar no atraso do crescimento e reprodução desses herbívoros e, consequentemente, na sua morte. Este trabalho teve por objetivos avaliar a capacidade da planta da soja de responder ao ataque de A. gemmatalis através da via das lipoxigenases e as respostas bioquímica, comportamental e fisiológica da lagarta da soja a concentrações crescentes do inibidor sintético de serino-proteases, berenil. Para tal, as lagartas foram alimentadas com plantas de soja da variedade IAC-PL-1, pulverizadas com berenil nas doses 0,0; 0,008; 0,01; 0,20; 0,60; e 1,0% (p/v ) e com plantas de soja das variedades IAC-18, IAC-24 e FOSCARIN-31 contendo 0,0; 0,60; e 1,0% (p/v) de berenil. Nas quatro cultivares testadas, observou-se que após o ataque da lagarta da soja ocorreu um aumento no pool de lipoxigenases nas folhas, o que levou a uma alta produção de inibidores de protease. Nas lagartas que foram alimentadas com plantas da variedade IAC-PL-1, observou-se interferência de berenil na resposta comportamental desses insetos, que tiveram preferência por plantas que não receberam pulverizações com o inibidor, o mesmo não sendo observado para as mariposas com relação à preferência para oviposição. Com relação ao desenvolvimento pós-embrionário, ocorreu uma redução significativa no ganho de peso. Foi observada também uma significativa redução na sobrevivência e no tempo de vida das larvas alimentadas com as maiores doses do inibidor. Além disso, houve inibição das atividades proteolítica e tríptica do intestino das lagartas nas quatro cultivares de soja. Os resultados obtidos indicam que a utilização de berenil é uma estratégia promissora para o controle da lagarta da soja e possivelmente de outros insetos-praga que tenham a tripsina como principal enzima digestiva. / The caterpillar, Anticarsia gemmatalis, for being considered a pest of soybean, has been the target of studies aimed at finding alternatives to its control. The use of protease inhibitors (PIs) as an alternative for pest control has been widely studied. It is known that a plant defense route, perhaps the best known is called octadecanóide route (or lipoxygenase pathway), which culminates with the production of jasmonic acid: a plant hormone that activates genes expressing protease inhibitor, taken as anti-metabolic agents, since they bring the insects to a protein deficiency. IPs work in the midgut of herbivores, inhibiting the action of proteases on proteins originated from food, therefore there is a reduction in the availability of amino acids to the insect, which can result in delayed growth and reproduction of herbivores and hence in its death. This study aimed to evaluate the ability of the soybean plant to respond to the attack of A. gemmatalis through the lipoxygenase pathway and biochemical responses, behavioral and physiological soybean caterpillar to increasing concentrations of synthetic inhibitor of serine proteases, berenil. To this end, the larvae were fed with soybean variety IAC PL-1, treated with berenil doses 0.0, 0.008, 0.01, 0.20, 0.60, and 1.0% (w/v) and the soybean variety IAC-18, IAC-24 and Foscarin-31 containing 0.0, 0.60, and 1.0% (w/v) of berenil. In the four cultivars tested, it was observed that after the attack of soybean caterpillar was an increase in the pool of lipoxygenase in the leaves leading to a high production of protease inhibitors. In the caterpillars that were fed on plants of the variety IAC PAL-1, there was interference from berenil behavioral response of these insects, which had no preference for plants that received the inhibitor sprays, but these were not observed for moths in relation to oviposition preference. Regarding the post-embryonic development, there was a significant reduction in weight gain. There was also a significant reduction in the survival and life span of larvae fed the highest doses of the inhibitor. Furthermore, there was inhibition of the proteolytic and tryptic activities of the gut of caterpillars in the four cultivars. The results indicate that the use of berenil is a promising strategy for control of soybean caterpillar and possibly other insect pests that have the main digestive enzyme trypsin. / Tese importada do Alexandria

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:17Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-03-30 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O cancer de prostata e o segundo tipo de cancer mais frequente. Calicreinas teciduais e integrinas estao diretamente relacionadas com essa doenca, interferindo na adesao celular, diferenciacao e proliferacao. Neste trabalho utilizamos as linhagens estabelecidas DU145 e PC3 de cancer de prostata para o estudo do efeito do inibidor de calicreina recombinante, rBbKIm, o qual contem em sua sequencia primaria o motivo RGD, proveniente do inibidor BrTI isolado de Bauhnina rufa. O meio condicionado da cultura de DU145 e PC3 tratadas com rBbKIm por 48 horas inibiu cerca de 95% a atividade hidrolitica de HD-Pro-Phe-Arg- ƒÏNa por serino proteases da familia das calicreinas. rBbKIm inibiu a viabilidade celular da DU145 (56%, 100 ƒÊM, 48 horas) e da PC3 (28%, 100 ƒÊM, 48 horas) e interferiu somente em 5% da viabilidade da linhagem de fibroblastos de liquido amniotico (100 ƒÊM, 48 horas). rBbKIm nao inibiu a adesao das linhagens DU145 e PC3 sobre a fibronectina, laminina, colageno I e IV. Embora rBbKIm nao tenha interferido na migracao de DU145 o inibidor reduziu em 38% o processo migratorio da linhagem PC3 (100 ƒÊM) apos 23 horas de tratamento. Em relacao ao efeito do inibidor sobre a morte celular DU145 e PC3 tratadas com de rBbKIm (50 e 100 ƒÊM, 24 e 48 h) induziu a morte celular por apoptose. Alteracoes no ciclo celular foram observadas na linhagem PC3 com parada do ciclo nas fases G0/G1 e G2/M. Nao houve alteracao no ciclo celular na linhagem DU145. Ambas as celulas externalizaram o citocromo c para o citoplasma quando tratadas com rBbKIm (50 e 100 ƒÊM) por 24 horas. No caso da PC3 observou-se a ativacao de caspase-9 com 50 ƒÊM de rBbKIm apos 48 horas, nao havendo ativacao de caspase-3 enquanto que com a DU145 ocorreu ativacao da caspase-3 e nao houve ativacao da caspase-9. Os peptideos contendo a sequencia RGD e RGE nao inibiram a viabilidade celular de DU145 e PC3. Analises sobre o efeito de rBbKIm na viabilidade e migracao da linhagem endotelial humana (HUVEC), mostrou que rBbKIm (50 ƒÊM) inibiu 28% da viabilidade celular e 30% da motilidade celular da HUVEC. rBbKIm tambem apresentou atividade inibitoria na formacao de estruturas angiogenicas sobre Matrigel in vitro. Em resumo, o presente trabalho demonstrou a ação diferencial do inibidor de protease rBbKIm em linhagens de câncer de próstata independentes de andrógenos, PC3 e DU145, e em células normais de fibroblastos de líquido amniótico e em células endoteliais humanas, HUVEC. / Prostate cancer is the second more frequent type of cancer. In this work, using DU145 and PC3 prostate cancer cellular lines, we studied the effect of recombinant kallikrein inhibitor modified form (rBbKm), in which the sequence containing the signal motif sequence RGD of the inhibitor BrTI from Bauhnina rufa was inserted. When DU145 and PC3 were incubated with rBbKIm for 48h, and the conditioned medium the culture was incubated with the HD-Pro-Phe-Arg-ñNa, an kallikrein substrate, inhibited 95% of the degradation of this in both cells. rBbKIm inhibited cell viabillity of DU145 (56%, 100 ìM, 48 h) and PC3 (28%, 100 ìM, 48 h), but affect only 5% of the viabillity of fibroblast normal cell line (100 ìM, 48h). In cell adhesion, rBbKIm did not inhibit DU145 and PC3 cell line adhesion on fibronectin, laminin, collagen I and IV coat. In cell migration, rBbKIm did not inhibit DU145, but inhibited 38% of the PC3 (100 ìM) after 23 h. To evaluate the cytotoxicity, DU145 and PC3 were incubated with rBbKIm (50 and 100 ìM, 24 and 48h) inducing cell death by apoptosis. The presence of rBbKIm arrest PC3 cell cycle at the G0/G1 and G2/M phase, but did not affect DU145. Both cells released cytocrome c to the cytosol when treated with rBbKIm (50 and 100 ìM) for 24h. Moreover, DU145 when was treated with rBbKIm for 48h activated the caspase-3. However PC3 did not activated caspase-3, but activated caspase-9. The peptides containing the RGD and RGE sequence did not inhbit the cell viabillity of DU145 and PC3. Analyzing the effect of rBbKIm on HUVEC viabillity and migration, rBbKIm (50ìM) inhibited 28% and 30%, respectively. This protein inhibited 49% of the HUVEC angiogenesis in vitro on Matrigel. In summary, we have demonstrated the differential action of the protease inhibitor rBbKIm on androgen-independent prostate cancer PC3 and DU145, normal fibroblast and endothelial HUVEC cells. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2015-05-12T16:27:09Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Dissertacao_Claudio.pdf: 776314 bytes, checksum: 881424867a9fef9cfea247cc4f5b871a (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-12T16:27:09Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Dissertacao_Claudio.pdf: 776314 bytes, checksum: 881424867a9fef9cfea247cc4f5b871a (MD5) Previous issue date: 2015-02-26 / Proteínas antimicrobianas que inibem proteases constituem antibióticos promissores e, adicionalmente, não apresentam como limitação a sensibilidade à proteólise. O xiquexique (Pilosocereus gounellei) é um cacto que cresce nas áreas secas, sendo endêmico da região semi-árida brasileira. A presente dissertação teve como objetivo purificar um inibidor de tripsina (PgTI, do inglês P. gounellei trypsin inhibitor) a partir do caule de P. gounellei e avaliar sua atividade antibacteriana contra espécies patogênicas ao homem. O caule de P. gounellei foi coletado na cidade de Limoeiro (Pernambuco) e, após a remoção dos espinhos, foi cortado em pequenas peças e posto para secar por 3 dias a 28 ºC. Em seguida, o material foi triturado em multiprocessador e a farinha resultante (5 g) foi homogeneizada com NaCl 0,15 M (100 mL) por 16 h a 28 ºC. Após centrifugação (3.000 g, 15 min), o extrato foi coletado e cromatografado em coluna de Sephadex G-100. Fração proteica (P1) obtida nessa etapa foi então avaliada quanto à atividade inibidora de tripsina e concentração de proteínas. Em seguida, P1 foi submetida à cromatografia de troca iônica em coluna DEAE-FF 16/10 acoplada ao sistema ÄKTAprimeTM (GE Healthcare). PgTI foi eluído com NaCl 1,0 M e, após diálise, foi avaliado quanto à atividade inibidora de tripsina, ao perfil em eletroforese bidimensional e à estabilidade de sua atividade inibidora frente ao aquecimento. Os efeitos de PgTI sobre o crescimento e sobrevivência de Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Micrococcus luteus, Pseudomonas aeruginosa, Serratia sp., Staphylococcus aureus e Staphylococcus saprophyticus foram avaliados através da determinação das concentrações mínima inibitória (CMI) e mínima bactericida (CMB). O extrato do caule de xiquexique apresentou alta viscosidade, impossibilitando a avaliação da atividade inibidora de tripsina e a dosagem de proteínas. Cromatografia do extrato em coluna de gel filtração (Sephadex G-100) foi então utilizada para se obter preparação proteica (P1) livre de viscosidade, a qual apresentou atividade inibidora de tripsina de 184 U/mg. PgTI foi obtido por cromatografia de P1 em coluna de troca iônica, tendo apresentado atividade inibidora de tripsina de 373 U/mg (fator de purificação: 2,02). Eletroforese bidimensional revelou PgTI como um único spot, de 37,1 kDa e PI 5,88. PgTI apresentou Ki de 14 nM para tripsina bovina e foi estável ao aquecimento até 50 °C, mas teve sua atividade abolida quando aquecido a 60 °C. PgTI inibiu o crescimento de E. coli, E. faecalis, M. luteus, P. aeruginosa, Serratia sp., S. aureus e S. saprophyticus (CMI: 37,5, 150, 37,5, 18,7, 7,5, 7,5 e 18,7 μg/mL, respectivamente), sendo bactericida somente para E. coli (CMB: 75 μg/ml). Em conclusão, o caule do xiquexique contém um inibidor de tripsina (PgTI) com atividade antibacteriana contra espécies de importância médica.

Com a introdução de uma nova classe de antiretrovirais integrantes da terapia anti-retroviral altamente ativa (HAART) para o tratamento das infecções pelo vírus da imunodeficiência humana, começaram a ser descritos inúmeros efeitos secundários.Na tentativa de se estabelecer um modelo animal para o estudo destes efeitos buscou-se uma espécie com similaridade no perfil e metabolismo lipídico. Iniciou-se estudo em Mesocricetus auratus. Foram avaliados o perfil lipídico e glicêmico,função hepática e renal, níveis de auto-anticorpos anti ox-LDL, perfil eletrocardiográfico, alterações histopatológicas renais e cardíacas nos animais sob dieta hiperlipídica e normal,tratados com Indinavir, inibidor de protease utilizado na HAART. Observou-se uma diminuição da sobrevida nos animais tratados com indinavir, aumento do nível sérico de triglicérides e glicose, redução de auto-anticorpos anti ox-LDL,aumento do segmento QRS no eletrocardiograma, presença de fibrose renal e cardíaca, hipercelularidade glomerular nos animais tratados com a droga com ou sem dieta hiperlipídica quando comparados com os controles. Concluimos que Mesocricetus auratus se apresenta como um bom modelo para o desvendamento dos mecanismos patológicos observados na HAART. / With the introduction of a new antiretroviral class use, integrants of highly active anti-retroviral therapy (HAART) for the treatment of infections by human immunodeficiency virus, several side effects started to be described.To establish an animal model for the study of these side effects, was chosen specie that have similarities in the lipidic profile and metabolism. A study in Mesocricetus auratus was started. It was evaluated the lipidic and glicemic profile ,hepatic and renal function, the levels of auto-antibodies against ox-LDL, electrocardiographic profile and renal and cardiac histopathological alterations in these animals under hyperlipidic and normal diets,treated with Indinavir, a protease inhibitor used in HAART.It was observed a decrease in the survival rate in the animals treated with Indinavir; an increase of the triglycerides and glucose serum level; reduction of anti ox-LDL auto-antibodies; increased QRS segment in the electrocardiogram; presence of renal and cardiac fibrosis; glomerular hypercellularity in the animals treated with the drug, with or without hyperlipidic diet when compared with the controls. We conclude that the Mesocricetus auratus is a good model for disclosure of the pathological mechanisms generated by HAART.

BEZERRA, Lady Clarissa Brito da Rocha. Purificação, caracterização bioquímica e potencial quimiopreventivo de um novo inibidor de quimotripsina de sementes de Enterolobium contortisiliquum (Vell.) Morong. 2014. 110 f. Tese (Doutorado em bioquímica)- Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2014. / Submitted by Elineudson Ribeiro (elineudsonr@gmail.com) on 2016-09-02T12:04:52Z No. of bitstreams: 1 2014_tese_lcbrbezerra.pdf: 2595573 bytes, checksum: 6f4356b55ad7ccae8f05a1adf548f991 (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2016-09-05T20:31:04Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_tese_lcbrbezerra.pdf: 2595573 bytes, checksum: 6f4356b55ad7ccae8f05a1adf548f991 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-05T20:31:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_tese_lcbrbezerra.pdf: 2595573 bytes, checksum: 6f4356b55ad7ccae8f05a1adf548f991 (MD5) Previous issue date: 2014 / Protease inhibitors are proteins with the intrinsic ability to inhibit catalytic activity of enzymes and are very common in plant seeds. Proteases play a major role in development of several diseases. The control of their activity by protease inhibitors have increased interest on these molecules as chemopreventive agents, specially for cancer. The anticarcinogenic effects of legume seeds present in human diet as well as those of underexploited plant species have been extensively investigated. This study aimed to purify, perform biochemical characterization and evaluate the in vitro chemopreventive potential of protease inhibitors from Enterolobium contortisiliquum seeds upon human colorectal adenocarcinoma cells. Two protease inhibitors were purified and named EcCI and EcTI. By means of N-terminal sequence analysis, EcCI was identified as a Kunitz type inhibitor. EcTI was identified, by means of peptide mass fingerprinting and N-terminal sequence analyses, as the same EcTI purified previously (NCBI Protein BLAST; access number: sp|P86451.1|ITRY_ENTCO). The molecular masses of the two inhibitors determined by means of SDS-PAGE and mass spectrometry are, respectively, 18.5 kDa and 19,710.4 Da (EcCI); 20.2 kDa and 19,813.22 Da (EcTI). Both inhibitors consist of two polypeptide chains and have several isoforms with acidic pIs, ranging from 5 to 6. Towards chymotrypsin, EcCI is a non competitive inhibitor and shows ki of 8 x 10-8 M, while EcTI is a competitive inhibitor with ki of 48 x 10-8 M. Towards trypsin, EcTI shows non competitive inhibition and ki of 2.8 x 10-8 M. EcCI and EcTI show high (93%) and moderate (38%) chymotrypsin inhibition and EcTI was also able to strongly inhibit trypsin (100%). EcCI and EcTI showed high leukocyte elastase inhibition (85 and 75%), respectively, and inhibited pancreatic elastase weakly (about 10%). Neither of them was able to inhibit papain nor bromelain. Both inhibitors are functionally stable under wide temperature range (from 37 to 70 °C – EcCI; from 37 to 60 °C – EcTI), pH (from 2 to 12) and DTT concentration (from 1 to 10 mM – EcCI; from 1 to 100 mM – EcTI). Both EcCI and EcTI were able to inhibit HT29 colorectal adenocarcinoma cells with IC50 of 35.5 and 20.4 x 10-6 M, respectively. These results clearly indicate that these are molecules with interesting biotechnological features and very promising tools as chemopreventive agents. / Inibidores de proteases são proteínas que inibem a atividade catalítica de enzimas, sendo bastante comuns em sementes de plantas. As proteases desempenham papéis centrais no desenvolvimento de muitas doenças. O controle de sua atividade realizado por inibidores de proteases despertou o interesse sobre estas moléculas como agentes quimiopreventivos, especialmente sobre o câncer. Os efeitos anticarcinogênicos das sementes de leguminosas presentes comumente na dieta, bem como de espécies vegetais subexploradas, têm sido extensivamente investigados. O objetivo deste trabalho foi purificar, caracterizar bioquimicamente e avaliar o potencial quimiopreventivo in vitro de inibidores de proteases de sementes de Enterolobium contortisiliquum, utilizando como modelo células de adenocarcinoma colorretal humano. Foram purificados dois inibidores de proteases denominados EcCI e EcTI. Através da sequência N-terminal, EcCI foi identificado como um inibidor da família Kunitz. EcTI foi identificado, por meio de peptide mass fingerprinting e por análise da sequência N-terminal, como aquele descrito previamente na literatura (NCBI Protein BLAST; número de acesso: sp|P86451.1|ITRY_ENTCO). Suas massas moleculares determinadas por SDS-PAGE e espectrometria de massas são, respectivamente, 18,5 kDa e 19.710,4 Da (EcCI); 20,2 kDa e 19.813,22 Da (EcTI). Ambos os inibidores são formados de duas subunidades proteicas e apresentam isoformas cujos pI’s são ácidos, entre 5 e 6. Frente a quimotripsina, EcCI é um inibidor não competitivo e apresenta ki de 8 x 10-8 M, enquanto EcTI é inibidor competitivo com ki de 48 x 10-8 M. Frente à tripsina, EcTI apresenta inibição não competitiva e ki de 2,8 x 10-8 M. EcCI e EcTI apresentam atividade inibitória de quimotripsina alta (93%) e moderada (38%), respectivamente. Apenas EcTI foi capaz de inibir a tripsina (100%). EcCI e EcTI apresentam alta atividade inibitória de elastase neutrofílica (85 e 75%, respectivamente). Os dois inibidores inibiram sutilmente a elastase pancreática (ca. de 10%) e nenhum foi capaz de inibir papaína e bromelaína. Os dois inibidores apresentam alta estabilidade à variação de temperatura (de 37 a 70 °C para EcCI e de 37 a 60 °C para EcTI), pH (2 a 12) e concentração de DTT (de 1 a 10 mM para EcCI e de 1 a 100 mM para EcTI). EcCI e EcTI inibiram a proliferação de células de adenocarcinoma colorretal humano da linhagem HT29 com CI50 de 35,5 e 20,4 x 10-6 M, respectivamente, indicando que esses inibidores apresentam bom potencial quimiopreventivo e, portanto, são moléculas bastante interessantes do ponto de vista biotecnológico.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Protease inhibitors are proteins with the intrinsic ability to inhibit catalytic activity of enzymes and are very common in plant seeds. Proteases play a major role in development of several diseases. The control of their activity by protease inhibitors have increased interest on these molecules as chemopreventive agents, specially for cancer. The anticarcinogenic effects of legume seeds present in human diet as well as those of underexploited plant species have been extensively investigated. This study aimed to purify, perform biochemical characterization and evaluate the in vitro chemopreventive potential of protease inhibitors from Enterolobium contortisiliquum seeds upon human colorectal adenocarcinoma cells. Two protease inhibitors were purified and named EcCI and EcTI. By means of N-terminal sequence analysis, EcCI was identified as a Kunitz type inhibitor. EcTI was identified, by means of peptide mass fingerprinting and N-terminal sequence analyses, as the same EcTI purified previously (NCBI Protein BLAST; access number: sp|P86451.1|ITRY_ENTCO). The molecular masses of the two inhibitors determined by means of SDS-PAGE and mass spectrometry are, respectively, 18.5 kDa and 19,710.4 Da (EcCI); 20.2 kDa and 19,813.22 Da (EcTI). Both inhibitors consist of two polypeptide chains and have several isoforms with acidic pIs, ranging from 5 to 6. Towards chymotrypsin, EcCI is a non competitive inhibitor and shows ki of 8 x 10-8 M, while EcTI is a competitive inhibitor with ki of 48 x 10-8 M. Towards trypsin, EcTI shows non competitive inhibition and ki of 2.8 x 10-8 M. EcCI and EcTI show high (93%) and moderate (38%) chymotrypsin inhibition and EcTI was also able to strongly inhibit trypsin (100%). EcCI and EcTI showed high leukocyte elastase inhibition (85 and 75%), respectively, and inhibited pancreatic elastase weakly (about 10%). Neither of them was able to inhibit papain nor bromelain. Both inhibitors are functionally stable under wide temperature range (from 37 to 70 ÂC â EcCI; from 37 to 60 ÂC â EcTI), pH (from 2 to 12) and DTT concentration (from 1 to 10 mM â EcCI; from 1 to 100 mM â EcTI). Both EcCI and EcTI were able to inhibit HT29 colorectal adenocarcinoma cells with IC50 of 35.5 and 20.4 x 10-6 M, respectively. These results clearly indicate that these are molecules with interesting biotechnological features and very promising tools as chemopreventive agents. / Inibidores de proteases sÃo proteÃnas que inibem a atividade catalÃtica de enzimas, sendo bastante comuns em sementes de plantas. As proteases desempenham papÃis centrais no desenvolvimento de muitas doenÃas. O controle de sua atividade realizado por inibidores de proteases despertou o interesse sobre estas molÃculas como agentes quimiopreventivos, especialmente sobre o cÃncer. Os efeitos anticarcinogÃnicos das sementes de leguminosas presentes comumente na dieta, bem como de espÃcies vegetais subexploradas, tÃm sido extensivamente investigados. O objetivo deste trabalho foi purificar, caracterizar bioquimicamente e avaliar o potencial quimiopreventivo in vitro de inibidores de proteases de sementes de Enterolobium contortisiliquum, utilizando como modelo cÃlulas de adenocarcinoma colorretal humano. Foram purificados dois inibidores de proteases denominados EcCI e EcTI. AtravÃs da sequÃncia N-terminal, EcCI foi identificado como um inibidor da famÃlia Kunitz. EcTI foi identificado, por meio de peptide mass fingerprinting e por anÃlise da sequÃncia N-terminal, como aquele descrito previamente na literatura (NCBI Protein BLAST; nÃmero de acesso: sp|P86451.1|ITRY_ENTCO). Suas massas moleculares determinadas por SDS-PAGE e espectrometria de massas sÃo, respectivamente, 18,5 kDa e 19.710,4 Da (EcCI); 20,2 kDa e 19.813,22 Da (EcTI). Ambos os inibidores sÃo formados de duas subunidades proteicas e apresentam isoformas cujos pIâs sÃo Ãcidos, entre 5 e 6. Frente a quimotripsina, EcCI à um inibidor nÃo competitivo e apresenta ki de 8 x 10-8 M, enquanto EcTI à inibidor competitivo com ki de 48 x 10-8 M. Frente à tripsina, EcTI apresenta inibiÃÃo nÃo competitiva e ki de 2,8 x 10-8 M. EcCI e EcTI apresentam atividade inibitÃria de quimotripsina alta (93%) e moderada (38%), respectivamente. Apenas EcTI foi capaz de inibir a tripsina (100%). EcCI e EcTI apresentam alta atividade inibitÃria de elastase neutrofÃlica (85 e 75%, respectivamente). Os dois inibidores inibiram sutilmente a elastase pancreÃtica (ca. de 10%) e nenhum foi capaz de inibir papaÃna e bromelaÃna. Os dois inibidores apresentam alta estabilidade à variaÃÃo de temperatura (de 37 a 70 ÂC para EcCI e de 37 a 60 ÂC para EcTI), pH (2 a 12) e concentraÃÃo de DTT (de 1 a 10 mM para EcCI e de 1 a 100 mM para EcTI). EcCI e EcTI inibiram a proliferaÃÃo de cÃlulas de adenocarcinoma colorretal humano da linhagem HT29 com CI50 de 35,5 e 20,4 x 10-6 M, respectivamente, indicando que esses inibidores apresentam bom potencial quimiopreventivo e, portanto, sÃo molÃculas bastante interessantes do ponto de vista biotecnolÃgico.

Com a introdução de uma nova classe de antiretrovirais integrantes da terapia anti-retroviral altamente ativa (HAART) para o tratamento das infecções pelo vírus da imunodeficiência humana, começaram a ser descritos inúmeros efeitos secundários.Na tentativa de se estabelecer um modelo animal para o estudo destes efeitos buscou-se uma espécie com similaridade no perfil e metabolismo lipídico. Iniciou-se estudo em Mesocricetus auratus. Foram avaliados o perfil lipídico e glicêmico,função hepática e renal, níveis de auto-anticorpos anti ox-LDL, perfil eletrocardiográfico, alterações histopatológicas renais e cardíacas nos animais sob dieta hiperlipídica e normal,tratados com Indinavir, inibidor de protease utilizado na HAART. Observou-se uma diminuição da sobrevida nos animais tratados com indinavir, aumento do nível sérico de triglicérides e glicose, redução de auto-anticorpos anti ox-LDL,aumento do segmento QRS no eletrocardiograma, presença de fibrose renal e cardíaca, hipercelularidade glomerular nos animais tratados com a droga com ou sem dieta hiperlipídica quando comparados com os controles. Concluimos que Mesocricetus auratus se apresenta como um bom modelo para o desvendamento dos mecanismos patológicos observados na HAART. / With the introduction of a new antiretroviral class use, integrants of highly active anti-retroviral therapy (HAART) for the treatment of infections by human immunodeficiency virus, several side effects started to be described.To establish an animal model for the study of these side effects, was chosen specie that have similarities in the lipidic profile and metabolism. A study in Mesocricetus auratus was started. It was evaluated the lipidic and glicemic profile ,hepatic and renal function, the levels of auto-antibodies against ox-LDL, electrocardiographic profile and renal and cardiac histopathological alterations in these animals under hyperlipidic and normal diets,treated with Indinavir, a protease inhibitor used in HAART.It was observed a decrease in the survival rate in the animals treated with Indinavir; an increase of the triglycerides and glucose serum level; reduction of anti ox-LDL auto-antibodies; increased QRS segment in the electrocardiogram; presence of renal and cardiac fibrosis; glomerular hypercellularity in the animals treated with the drug, with or without hyperlipidic diet when compared with the controls. We conclude that the Mesocricetus auratus is a good model for disclosure of the pathological mechanisms generated by HAART.

Os inibidores de proteases desempenham nas plantas funções como: defesa contra ataque de predadores de sementes, regulação de enzimas endógenas e fontes de proteínas e aminoácidos. Muitos destes inibidores são utilizados em estudos bioquímicos, bem como no tratamento de patologias humanas como inflamação e câncer. Neste trabalho, um inibidor de serinoprotease, presente na semente de Stryphnodendron barbatinan (barbatimão), foi purificado, caracterizado e denominado SbKI. Sementes de barbatimão maduras foram trituradas, até a obtenção de uma farinha, e esta foi suspensa em PBS, pH 7,4 (1 :5 m/v), sob agitação por 14 horas a 4°C. O extrato foi centrifugado, filtrado e tratado com PVPP, sendo denominado EB, o qual apresentou inibição da coagulação sanguínea e da atividade de algumas serinoproteases. O inibidor SbKI foi purificado utilizando-se três procedimentos cromatográficos: cromatografia de exclusão molecular (Superdex-75, 10/30), troca iônica (Mono-S HR, 5/5), ambas acopladas em um sistema &TA Purifier e fase reversa (C-18, Waters 250 x 4,6mm) acoplada a um sistema HPLC. Em cada etapa de purificação a presença do inibidor foi monitorada pelos testes de atividade inibitória da tripsina e da coagulação, ambos in vitro. SDS-PAGE, sob condições redutoras, mostrou que o inibidor é formado por duas cadeias polipeptídicas (cadeia pesada e leve) unida por ligação dissulfeto. As cadeias foram separadas pela cromatografia de &se reversa após serem reduzidas e alquiladas. Suas seqüências N-terminais foram determinadas pela degradação de Edman, em seqüenciador automatizado, apresentando alta identidade seqüencial com inibidores do tipo Kunitz de outras leguminosas. A determinação da massa/molecular do inibidor e de suas cadeias isoladas, foram determinadas por espectroscopia de massa (LCtESI-MS system) mostrando massas moleculares de 19.570Da7 15530Da e 4040Da, respectivamente. A espectroscopia de dicroísmo circular (CD) revelou que o inibidor é formado predominantemente por elementos beta e estruturas desordenadas. SbKI foi estável a variações de pHs (2-12) e temperaturas extremas e a temperatura de transição foi calculada em 73,3\" C. A determinação das constantes de inibição (KI) foi realizada para as serinoproteases tripsina (KI = 5,5 nM) e calicreína plasmática (KI = 1,l nM). / Proteinase inhibitors perform many beneficia1 roles in plants such as defense against the attack of seed predators, regulation of endogenous enzymes and sources of proteins and amino acids. Many inhibitors are used in biochemistry research, as well as human pathology treatment such as inflammation and cancer. In this work, a serino proteinase inhibitor found in Stryphnodendron barbatiman seeds (barbatimão) was purified, characterized and denoted SbKI. Mature barbatimão seeds were ground and suspended in PBS pH 7.4 (15 wlv) and stirred for 14 hours at 4OC. The suspension was centrifuged, filtered and treated with PVPP and denoted EB. This EB inhibited blood coagulation and some serine proteinases activities. The inhibitor SbKI was purified by three chromatography step: molecular exclusion (on Supredex-75, 10/30), ion exchange (on Mono-S, 5/5), both connected to AKTA Purifíer System and reversed phase (on C-18, Waters 250 x 4.6 mm) connected to HPLC System. In each purification step the presence of inhibitor was monitored, in vitro, by trypsin and coagulation inhibitory activity. SDS-PAGE, reduced conditions, showed two polypeptide chains (heavy and light chains) linked by one disulphide bridge. The chains were separated by reversed phase chromatography aíter reduced and alquilated. The N-terminal sequence were performed on automated protein sequencer by Edman degradation and showed homology with Kunitz type inhibitors from Leguminosae. Molecular weight of inhibitor and its chains were determined by mass spectrometry (LC/ESI-MS System) and showed molecular weight of 19.570Da, 15.530Da and 4040Da, respectively. Circular dichroism spectroscopy showed SbKI is constituted predominantly by P elements and unordered structures. SbKI was stable over extreme ranges of pH (2-12) and temperature and the transition temperature 73.3\"C investigated by CD and fluorescence emission spectroscopies. Inhibition constants (Ki) were determined by typsin (Ki = 5.5 nM) and human plasmatic kallikrein (Ki = 1.1 mM)

MARTINS, Thiago Fernandes. Purificação e caracterização bioquímica de um inibidor tipo Bowman-Birk de sementes Luetzelburgia auriculata (Allemão) Ducke. 2015. 102 f. Dissertação (mestrado em bioquímica)- Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2015. / Submitted by Elineudson Ribeiro (elineudsonr@gmail.com) on 2016-03-18T20:49:01Z No. of bitstreams: 1 2016_dis_tfmartins.pdf: 2013799 bytes, checksum: b9c6f661705801d01e9be5b261d014c0 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-04-28T20:46:41Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_dis_tfmartins.pdf: 2013799 bytes, checksum: b9c6f661705801d01e9be5b261d014c0 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-28T20:46:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_dis_tfmartins.pdf: 2013799 bytes, checksum: b9c6f661705801d01e9be5b261d014c0 (MD5) Previous issue date: 2015 / Plant protease inhibitors are proteins of low molecular weight, usually present in high concentrations in storage tissues, particularly in seeds of species belong to the Fabaceae family. In this study, a Bowman-Birk protease inhibitor (LzaBBI) was purified from the saline extract of the Luetzelburgia auriculata seeds After boiling of this saline extract, the inhibitor was purified by affinity chromatography on Sepharose® 4B-anhydrotrypsin, followed by ion exchange chromatography on DEAE Sepharose and reverse phase chromatography. Under reducing conditions or not, LzaBBI showed an apparent molecular mass of 17.3 kDa and a single polypeptide chain. The NH2-terminal sequencing of the LzaBBI showed high similarity with other Bowman-Birk inhibitors of legumes. LzaBBI remained stable after boiling at 98 °C for 120 min and also remained stable with trypsin inhibitory activity after incubation in pH buffers with pHs varying from 2 to 11. In addition to its relevant structural stability, of importance in future biotechnological applications, LzaBBI showed negative impact on the Staphylococcus aureus development when at low doses. / Inibidores de proteases vegetais são proteínas de baixa massa molecular, geralmente presentes em altas concentrações nos tecidos de armazenamento, particularmente em sementes de plantas pertencentes à família Fabaceae. Neste estudo, um inibidor de proteases pertencente à família Bowman-Birk (LzaBBI) foi purificado a partir do extrato salino de sementes de Luetzelburgia auriculata. Após fervura desse extrato salino, o inibidor foi purificado por cromatografia de afinidade em matriz de anidrotripsina-Sepharose® 4B, seguido de cromatografia em matriz de troca iônica (DEAE Sepharose) e cromatografia em fase reversa. Em condições redutoras, ou não, o LzaBBI apresentou massa molecular aparente de 17,3 kDa, e uma única cadeia polipeptídica. Sua sequência NH2-terminal possui alta similaridade com inibidores do tipo Bowman-Birk de leguminosas. O LzaBBI permaneceu estável após fervura a 98 °C por 120 min, bem como após incubado na faixa de pHs entre 2 a 11. Além de possuir relevante estabilidade estrutural, de importância para futuras aplicações biotecnológicas, apresentou efeito negativo no crescimento da bactéria Staphylococcus aureus, quando em baixas concentrações.

Os inibidores de proteases desempenham nas plantas funções como: defesa contra ataque de predadores de sementes, regulação de enzimas endógenas e fontes de proteínas e aminoácidos. Muitos destes inibidores são utilizados em estudos bioquímicos, bem como no tratamento de patologias humanas como inflamação e câncer. Neste trabalho, um inibidor de serinoprotease, presente na semente de Stryphnodendron barbatinan (barbatimão), foi purificado, caracterizado e denominado SbKI. Sementes de barbatimão maduras foram trituradas, até a obtenção de uma farinha, e esta foi suspensa em PBS, pH 7,4 (1 :5 m/v), sob agitação por 14 horas a 4°C. O extrato foi centrifugado, filtrado e tratado com PVPP, sendo denominado EB, o qual apresentou inibição da coagulação sanguínea e da atividade de algumas serinoproteases. O inibidor SbKI foi purificado utilizando-se três procedimentos cromatográficos: cromatografia de exclusão molecular (Superdex-75, 10/30), troca iônica (Mono-S HR, 5/5), ambas acopladas em um sistema &TA Purifier e fase reversa (C-18, Waters 250 x 4,6mm) acoplada a um sistema HPLC. Em cada etapa de purificação a presença do inibidor foi monitorada pelos testes de atividade inibitória da tripsina e da coagulação, ambos in vitro. SDS-PAGE, sob condições redutoras, mostrou que o inibidor é formado por duas cadeias polipeptídicas (cadeia pesada e leve) unida por ligação dissulfeto. As cadeias foram separadas pela cromatografia de &se reversa após serem reduzidas e alquiladas. Suas seqüências N-terminais foram determinadas pela degradação de Edman, em seqüenciador automatizado, apresentando alta identidade seqüencial com inibidores do tipo Kunitz de outras leguminosas. A determinação da massa/molecular do inibidor e de suas cadeias isoladas, foram determinadas por espectroscopia de massa (LCtESI-MS system) mostrando massas moleculares de 19.570Da7 15530Da e 4040Da, respectivamente. A espectroscopia de dicroísmo circular (CD) revelou que o inibidor é formado predominantemente por elementos beta e estruturas desordenadas. SbKI foi estável a variações de pHs (2-12) e temperaturas extremas e a temperatura de transição foi calculada em 73,3\" C. A determinação das constantes de inibição (KI) foi realizada para as serinoproteases tripsina (KI = 5,5 nM) e calicreína plasmática (KI = 1,l nM). / Proteinase inhibitors perform many beneficia1 roles in plants such as defense against the attack of seed predators, regulation of endogenous enzymes and sources of proteins and amino acids. Many inhibitors are used in biochemistry research, as well as human pathology treatment such as inflammation and cancer. In this work, a serino proteinase inhibitor found in Stryphnodendron barbatiman seeds (barbatimão) was purified, characterized and denoted SbKI. Mature barbatimão seeds were ground and suspended in PBS pH 7.4 (15 wlv) and stirred for 14 hours at 4OC. The suspension was centrifuged, filtered and treated with PVPP and denoted EB. This EB inhibited blood coagulation and some serine proteinases activities. The inhibitor SbKI was purified by three chromatography step: molecular exclusion (on Supredex-75, 10/30), ion exchange (on Mono-S, 5/5), both connected to AKTA Purifíer System and reversed phase (on C-18, Waters 250 x 4.6 mm) connected to HPLC System. In each purification step the presence of inhibitor was monitored, in vitro, by trypsin and coagulation inhibitory activity. SDS-PAGE, reduced conditions, showed two polypeptide chains (heavy and light chains) linked by one disulphide bridge. The chains were separated by reversed phase chromatography aíter reduced and alquilated. The N-terminal sequence were performed on automated protein sequencer by Edman degradation and showed homology with Kunitz type inhibitors from Leguminosae. Molecular weight of inhibitor and its chains were determined by mass spectrometry (LC/ESI-MS System) and showed molecular weight of 19.570Da, 15.530Da and 4040Da, respectively. Circular dichroism spectroscopy showed SbKI is constituted predominantly by P elements and unordered structures. SbKI was stable over extreme ranges of pH (2-12) and temperature and the transition temperature 73.3\"C investigated by CD and fluorescence emission spectroscopies. Inhibition constants (Ki) were determined by typsin (Ki = 5.5 nM) and human plasmatic kallikrein (Ki = 1.1 mM)