Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les dommages à l'ADN induits par les rayons ultraviolets B (UV) solaires jouent un rôle important dans les cancers de la peau induits par les rayons solaires. Le travail présenté dans cette thèse examine le rôle de l'enzyme nucléaire poly (ADP-ribose) polymérase-1 (PARP-1) dans les réponses cellulaires suite aux dommages à l'ADN induits par les UV. Premièrement, nous avons examiné le mécanisme précis d'activation de la PARP-1 en réponse aux UV. En utilisant des techniques d'irradiation locale d'UV, d'immunocytochimie et d'immunoprécipitation de la chromatine, nous avons démontré que PARP-1 est activée de deux façons distinctes en réponse à deux types de dommages à l'ADN causés par les UV, i.e., les photo-lésions directes et les dommages oxydatifs. Ces deux types de dommages à l'ADN sont réparés par les voies de réparation par excision de nucléotides (NER) et par excision de bases (BER), respectivement. Depuis que le rôle de PARP-1 est bien connu dans le BER, nous nous sommes concentrés à examiner si la PARP pouvait jouer un rôle dans NER en faisant une déplétion stable de la PARP à l'aide de l'ARN interférence (ARNi) dans des fibroblastes de peau humaine qui étaient compétents dans NER ou déficients dans l'étape de reconnaissance des lésions du NER. En utilisant la technique de «host cell réactivation» (HCR), nous avons observé que les cellules déficientes en PARP-1 étaient inefficaces dans l'étape de la reconnaissance des lésions du NER. Durant l'exploration du rôle de PARP-1 dans l'apoptose induite par les UV, nous avons découvert que l'ARNi arrêtait durant l'apoptose. Nous avons trouvé que Dicer, un endonucléase de la famille RNaselII et un élément critique dans la régulation de l'ARNi, était clivé par la caspase-3 durant l'apoptose, ce qui amenait l'inactivation de ses fonctions catalytiques et l'abrogation de l'ARNi. En résumé, cette thèse élucide un important rôle de PARP-1 dans les réponses cellulaires aux UV. De plus, la découverte imprévue de 1' abrogation de l'ARNi durant l'apoptose présente de nouveaux défis dans les domaines relatifs à l'ARNi. / The DNA damages induced by solar ultraviolet B radiation (UV) play an important role in sunlight-induced skin cancers. The work presented in this thesis examines role of a nuclear enzyme, poly(ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1) in cellular responses to UVinduced DNA damage. PARP-1 is known to be activated in response to different types of DNA damages, and its activation is known to participate in different cellular responses ranging from DNA repair to cell death. To understand the mechanism of activation of PARP-1 in UV-irradiated cells, we used elegant techniques of local UV irradiation, immunocytochemistry and chromatin immunoprecipitation to demonstrate that PARP-1 is activated in two distinct phases in response to two different types of DNA damage caused by UV, i.e., direct photolesions and oxidative DNA damage. These two types of UVinduced DNA lesions are repaired by nucleotide excision repair (NER) and base excision repair (BER) pathways, respectively. Since PARP-1's role in BER is well-known, we focused on examining whether PARP could play a role in NER by stably depleting PARP-1 using DNA vector-based RNAi in human skin fibroblasts which are either proficient in NER or deficient in lesion-recognition steps of NER. Upon analyses of the NER-capacity of these cells by host cell reactivation (HCR) assay using a recombinant adenovirus-based reporter gene, we observed that PARP-1-depleted cells were inefficient in the lesion recognition step of NER. While exploring the role of PARP-1 in UV-induced apoptosis using the above models, we serendipitously discovered that RNAi fails during apoptosis. We find that endonuclease Dicer-1, critical in the regulation of RNAi gets cleaved by caspase-3 during apoptosis, which leads to its catalytic inactivation and failure of RNAi. In summary, this thesis elucidates an important role for PARP-1 in cellular responses to UV. In addition, the RNAi-abrogation during apoptosis is an exciting discovery that presents new challenges in the relatively new field of RNAi.

L’activation de la poly(ADP-ribose) polymérase-1 (PARP-1) en réponse aux dommages à l’ADN est impliquée dans diverses réponses cellulaires, de la réparation de l’ADN à la mort cellulaire. Dans l'annexe I, nous avons décrit différentes techniques indispensables pour détecter le métabolisme de PARP-1 en réponse aux dommages à l’ADN in vitro et in vivo. Les travaux de cette thèse se concentrent sur le rôle de PARP-1 dans la mort cellulaire. PARP-1 est clivée et inactivée par des caspases pendant l’apoptose ; j’ai donc utilisé une PARP-1 non-clivable pour étudier le rôle de l’activation et de la fragmentation de PARP-1 dans la mort cellulaire induite par les UVB. Nous avons observé que, contrairement aux fibroblastes de peau humaine exprimant la PARP-1, les fibroblastes avec un "knockdown" de PARP-1 sont résistants à l’apoptose induite par les UVB, phénotype pouvant être totalement inversé par ré-expression de PARP-1 sauvage mais pas de PARP-1 non-clivable par les caspases, suggérant un rôle significatif du clivage de PARP-1 en réponse à la mort cellulaire induite par les UVB (chapitre 2). Dans ce contexte, nous avons récemment passé en revue comment les substrats non clivables par des caspases peuvent être utilisés comme outil important pour démystifier le rôle de ce clivage pour la mort comme pour la vie, avec l’exemple spécifique de PARP-1 non-clivable par les caspases (chapitre 3). Curieusement, en utilisant l’ARNi comme outil d’étude du rôle de PARP-1 dans la mort cellulaire, nous avons observé que l’ARNi stable (shRNA) de nombreux gènes, incluant PARP-1, échoue lors de l’apoptose, en raison de l’inactivation catalytique par clivage par une caspase de l’endoribonucléase Dicer-1, indispensable pour la régulation de l’ARNi et des miARN (chapitre 4). Cependant, nous avons découvert que l’ARNi transitoire persiste plusieurs jours même après induction de l’apoptose, soulignant des différences entre les ARNi stable et transitoire dans la dynamique de "knockdown" génétique et dans la dépendance de la fonction de Dicer-1 (chapitre 5). En résumé, mon travail a permis la découverte des avantages et des limites de l’ARNi durant l’apoptose et le rôle de PARP-1 dans la mort cellulaire induite par les UVB.

La poly(ADP-ribosyl)ation est une modification post-traductionnelle effectuée par les poly(ADP-ribose) polymerases (PARP), des enzymes à prédominance nucléaire qui catalysent la formation de polymères d'ADP-ribose sur des protéines acceptrices en utilisant le NAD+ comme substrat. Cette modification est impliquée dans plusieurs processus cellulaires dont la replication, la transcription, la réparation de l'ADN et la mort cellulaire. La poly(ADP-ribose)glycohydrolase (PARG) est l'enzyme qui hydrolyse le polymère d'ADP-ribose, permettant aux protéines modifiées de regagner leurs fonctions. Le projet de recherche ici présent décrit les méthodes et caractéristiques optimales de l'inhibition de l'expression du gène PARG dans le but de moduler la réponse aux dommages à l'ADN des cellules humaines cancéreuses. La première étape a été de développer des anticorps monoclonaux spécifiques envers l'enzyme PARG humaine (B8G4 et D8B10). Ces anticorps, d'un isotype IgGl et IgG2a respectivement, sont capables de détecter spécifiquement trois isoformes de l'enzyme PARG. Les résultats d'immunobuvardages ont montré que B8G4 et D8B10 détectent PARG dans des types cellulaires différents. La deuxième étape consistait au développement de petits ARN en épingle à cheveux (shARN) spécifiques au gène PARG humain et leur insertion dans un système d'expression viral (lentivirus). Les quatre shARN-huPARG produits et caractérisés ont tous démontré une capacité variable de l'inhibition de l'expression du gène PARG chez les cellules humaines. L'inhibition a permis de diminuer significativement la présence cellulaire de la protéine PARG ainsi que son activité enzymatique. Des cellules de gliomes humains SKI-1 dont le contenu en PARG a été constitutivement diminué à l'aide du système de shARN semblent montrer une sensibilité accrue aux rayons ionisants. Les anticorps anti-PARG B8G4 et D8B10 ainsi que les ARN en épingle à cheveux shRNA-PARG sont des outils moléculaires fonctionnels permettant de diminuer significativement l'expression du gène PARG et de déterminer l'ampleur de l'inhibition. Ces outils ont été ainsi utilisés dans une étude fonctionnelle de sensibilisation des cellules cancéreuses envers des rayons ionisants.

Les structures périodiques induites par laser sont étudiées depuis plusieurs années et sont présentes sur des matériaux très variés : métaux, verres, céramiques, matériaux cristallins, semi-conducteurs. Elles sont un phénomène générique mais elles ont leurs particularités pour chaque type de matériau. La plupart des modèles développés n’expliquent qu’une partie des résultats et ne s’étendent pas à tous les types de matériaux. Les modèles se basent généralement sur l’hypothèse d’une interférence du laser avec une onde créée subséquemment; elle peut être d’origine plasmonique si le matériau le permet. Ce mémoire a pour but de présenter les résultats de l’interaction d’un laser femtoseconde avec des verres de chalcogénure, en fonction des différents paramètres du laser. / Laser induced periodic surfaces structures have been the subject of studies for many years and are present on very different materials: metals, glasses, ceramics, crystalline materials, semiconductors. They are a generic phenomenon but each material has its distinctive features. The majority of the models developed only explain part of the results and do not extend over to all types of materials. They are generally based on the hypothesis of interference from the laser with a wave created subsequently; they can be of plasmonic nature if the material allows it. The purpose of this report is to present the results of femtosecond laser interaction with chalcogenide glasses, as a function of the various laser parameters.


Chez les mammifères, l'environnement est un puissant régulateur de l'expression des gènes. Par exemple, en fonction de l'alimentation, la disponibilité en nutriments, en particulier en acides aminés, est responsable de l'induction de l'expression d'un certain nombre de gènes. Ainsi, des mécanismes moléculaires sont mis en jeu de façon à permettre la détection de ces variations et d'y répondre de façon appropriée. Lorsque l'un des neuf acides aminés essentiels vient à manquer, on observe une augmentation de la transcription de certains gènes. Cette activation de la transcription requière d'une part l'accumulation du facteur de transcription ATF4 et d'autre part la phosphorylation du facteur de transcription ATF2. La voie ATF4 a été identifiée et relativement bien décrite. En revanche les éléments régulateurs de la voie de signalisation en amonts du facteur ATF2 restent inconnus. Le but de ma thèse était donc de déterminer les différents intermédiaires responsables de la phosphorylation d'ATF2 en réponse à une carence en acides aminés. J'ai ainsi montré qu'une carence en acides aminés provoque la mise en jeu d'un module MAPK composé de MEKK1>MKK7>JNK2 contrôlant la phosphorylation d'ATF2 sur les résidus thréonine 69 et 71. J'ai montré que ce module est régulé en amont par deux GTPases Cdc42+Rac1 et par la protéine Gα12. Enfin, j'ai démontré l'impact de cette nouvelle voie de signalisation sur la transcription AARE-dépendante du gène ATF3 en réponse à une carence en acides aminés.

La polyarthrite rhumatoïde (PR) est le plus fréquent des rhumatismes inflammatoires et représente un problème de santé publique majeur. A l'heure actuelle, les biothérapies anti-TNF sous forme de protéines recombinantes constituent une avancée considérable dans le traitement de la polyarthrite rhumatoïde (PR). Néanmoins, il convient de développer des approches thérapeutiques alternatives pour traiter les 40% de patients non-répondeurs ainsi queceux qui échappent à plusieurs années de traitement. La recherche de nouvelles cibles thérapeutiques est indispensable pour proposer des approches alternatives à ces biothérapies. Par ailleurs, les techniques de transfert de gène offrent une alternative thérapeutique possible pour pallier aux limitations des biothérapies actuelles, à condition de les adapter aux contraintes du tissu cible de la PR, les articulations. Les projets ont consisté à développer et valider dans des modèles expérimentaux d'arthrite de nouvelles stratégies anti-inflammatoires basées sur l'utilisation de l'ARN interférence comme outil thérapeutique. En effet, la possibilité d'interférer au niveau des mécanismes responsables de l'expression des protéines,la régulation de la stabilité des ARNm et de l'efficacité de la machinerie traductionnelle, présente un intérêt thérapeutique supérieur aux biothérapies actuelles basées sur l'inhibition des protéines sécrétées (anticorps ou récepteurs solubles) mais nécessite cependant de posséder un vecteur qui transduit efficacement les cellules productrices de la molécule ciblée. / Rheumatoid arthritis (RA) is the most frequent chronic inflammatory systemicautoimmune disease that remains a major medical challenge as the exact causes of the disease are not completely elucidated. The principal treatment strategies arebased on the inhibition of TNF-α, one of the major inflammatory cytokine in RA.Although risk and benefit analyses are in favour of the use of monoclonal antibodiesagainst TNF-α, the most currently used biotherapy, they are not devoid from multipleside effects. The search for new therapeutic targets is essential to proposealternative approaches to non responders to such biotherapies. The possibility to interfere in the mechanisms responsible for regulating mRNA stability andeffectiveness of the translational machinery also present a therapeutic benefitsuperior to current biologic therapies based on inhibition secreted proteins(antibodies or soluble receptors). Such approach however requires developingvectors that efficiently transduced the specific cell type producing the targeted gene.Projects of my PhD fellowship have included both the development of gene therapyvehicles for RNAi-based intervention in experimental mouse models of arthritis andevaluation of novel candidate genes for alternative anti-inflammatory therapy in RA.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Leishmania et Trypanosoma brucei sont des protozoaires parasites responsables de graves parasitoses de distribution mondiale. Aucun vaccin n'est disponible contre ces maladies dont le traitement reste basé sur un nombre limité de médicaments coûteux, souvent toxiques et peu efficaces, problème auquel s'ajoute celui des chimiorésistances. D'où l'urgente nécessité de trouver de nouvelles cibles pour le développement de nouveaux traitements qui soient à la fois efficaces, non ou moins toxiques et à un coût plus accessible. Les Trypanosomatidés, dont les génomes ont été entièrement séquencés, présentent de nombreuses originalités dans leur biologie cellulaire et moléculaire, par exemple un ADN mitochondrial unique et extrêmement complexe appelé kinétoplaste. Leur développement suit également un "double" cycle cellulaire répliquant, d'une part, classiquement le noyau et, d'autre part, l'ensemble "corps basal-ADN mitochondrial" dont la ségrégation correcte conditionne la cytodiérèse. Ils possèdent par ailleurs deux types de protéasomes, un classique (26S) et un de type procaryote, plus spécifique et absent chez l'homme, le complexe HslVU. Nous avons montré que HslVU est localisé exclusivement dans l'unique mitochondrie des parasites, et qu'il est, chez T. brucei, essentiel pour la survie de ces organismes. En effet, son inhibition par ARN interférence entraine un blocage de la cytodiérèse suivi par une mort cellulaire. Le premier objectif de cette thèse a été de tenter de mieux comprendre le rôle de HslVU dans le cycle cellulaire associé au kinétoplaste chez ces parasites possédant déjà un protéasome classique. Mettant un terme à plusieurs publications contradictoires, nous avons confirmé la localisation mitochondriale de ce complexe chez Leishmania et chez T. brucei. Nous montrons pour la première fois qu'il est tout aussi essentiel dans les formes sanguines, celles présentes chez l'hôte mammifère, que dans les formes procycliques. Nous montrons aussi un rôle différencié des différentes sous-unités du complexe dans le déroulement du cycle cellulaire associé au kinétoplaste. Le deuxième objectif de cette thèse a été d'identifier de nouvelles protéines mitochondriales régulatrices du cycle cellulaire associé au kinétoplaste. Pour ce faire, nous avons développé une approche de criblage par ARN interférence "semi-systématique" sur 104 protéines mitochondriales, principalement de fonction inconnue. Si l'inhibition de l'expression de la majorité de ces protéines (62) n'a aucun effet sur la croissance cellulaire, celle des 42 restantes induit une baisse moyenne ou sévère de cette croissance. De façon surprenante, cette inhibition modifie significativement et avec plus ou moins d'ampleur le déroulement du cycle cellulaire, suggérant qu'il est dépendant de multiples fonctions cellulaires. Finalement, ce travail valide le protéasome HslVU comme une cible thérapeutique pertinente tout particulièrement à l'adresse des formes sanguines de T. brucei. La différenciation fonctionnelle de HslU1 et HslU2 et l'activité indépendante de HslV donnent une image plus complexe sur le fonctionnement de ce protéasome. Les données d'ARN interférence pour leur part nous orientent vers une régulation du cycle cellulaire très intégrée à l'ensemble des activités cellulaires. / Leishmania and Trypanosoma brucei are protozoan parasites responsible for worldwide distributed severe diseases. No vaccine is available and the treatment relies upon a limited number of drugs, which are costly, often toxic and not highly efficient, and for which resistances are increasing. Hence the necessity to urgently discover novel drug targets with the aim of developing new drug treatments which would be more efficient, less toxic and if possible cheaper.Trypanosomatids, of which the genome has been entirely sequenced, exhibit numerous peculiarities in their cell and molecular biology, for example a single and complex mitochondrial DNA network termed kinetoplast. Also, their development follows a ‘double' cell cycle ensuring the replication of, on the one hand, the nucleus (classical mitosis) and on the other hand, the “basal body-kinetoplast” whole, of which the correct segregation conditions cytokinesis. They also possess tow types of proteasomes, one classical one (26S) and one of the prokaryotic type, more specific and absent in human, the HslVU complex. We have shown that HslVU is located exclusively in the single mitochondrion of these parasites and, in T. brucei, that it is essential to parasite's survival. Indeed, its RNAinterference-based knockdown leads to a cytokinesis block followed par cell death. The first aim of this work was to try to better understand the role of HslVU in the ‘kinetoplast-associated' cell cycle in these parasites that already possess a classical proteasome. Putting an end to several contradictory publications, we confirmed the mitochondrial location of this complex in Leishmania and T. brucei. For the first time, we also demonstrate that it is just as essential in bloodstream forms (those present in the mammalian host) than in procyclic forms. We finally show a differentiated role for the different subunits of the complex in the progress of the kinetoplast-associated cell cycle.The second aim of this work was to identify novel mitochondrial proteins which would participate in the regulation of the kinetoplast-associated cell cycle. To do this, we developed a ‘semi-systematic' screening approach using RNA interference for 104 mitochondrial proteins, most of them being of unknown function. If the inhibition of most of these proteins (64) had no effect on cell growth, that of the 42 remaining ones induced a moderate or severe growth defect. Surprisingly, this inhibition yielded significant and more or less visible modifications of the cell cycle progress, suggesting that the latter is dependent upon multiple cell functions.Finally, this study validates the HslVU proteasome as a pertinent drug target, particularly for the bloodstream forms of T. brucei. The functional differentiation of HslU1 and HslU2 and the independent activity of HslV are intriguing and give a complex picture of the functioning of this proteasome. On the other hand, the RNA interference data suggest a cell cycle regulation which would be highly integrated to the whole of the cell activities.