Doctor of Philosophy / Department of Diagnostic Medicine/Pathobiology / Manuel Borca / Stephen Higgs / African swine fever (ASF) is a lethal hemorrhagic disease of swine caused by a double-stranded DNA virus. ASFV is endemic in Sardinia and Saharan Africa and has been recently expanded from the Caucasus to Eastern Europe. There is no vaccine to prevent the disease and current control measures are limited to culling and restricted animal movement. Swine infected with attenuated strains are protected against challenge with a homologous virulent virus, but there is limited knowledge of the host immune mechanisms generating that protection. Swine infected with Pret4 virus develop a fatal severe disease, while a derivative strain lacking virulence-associated gene 9GL (Pret4Δ9GL virus) is completely attenuated. Swine infected with Pret4 Δ9GL virus and challenged with the virulent parental virus at 7, 10, 14, 21, and 28 dpi showed a progressive acquisition of protection (from 40% at 7 dpi to 80% at 21 and 28 dpi). This animal model was used to associate the presence of host immune response and protection against the challenge. Anti-ASFV antibodies and cytokines in serum, as well as ASFV-specific IFN-γ production in PBMCs, were assessed in each group. Interestingly, with the exception of ASFV-specific antibodies in the surviving swine challenged at 21 and 28 dpi, no solid association between any of the parameters assessed and the extent of protection could be established. These results were corroborated using a similar model based on the use of a rationally attenuated derivative of the highly virulent strain Georgia 2007. These results, encompassing data from 114 immunized swine, underscore the complexity of the system under study where it is very plausible that protection against disease or infection relies heavily on the concurrence and or interaction of different host immune mechanisms.

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TRAIL (TNF Related Apoptosis Inducing Ligand), ein Mitglied der TNF-Ligandenfamilie, wurde bislang hauptsächlich hinsichtlich seiner dominanten Funktion als Auslöser des apoptotischen Programms untersucht. In neueren Untersuchungen konnte allerdings gezeigt werden, dass TRAIL unter bestimmten Bedingungen auch eine starke Aktivierung nicht-apoptotischer Signalwege induzieren kann. Um die Mechanismen der TRAIL-induzierten nicht-apoptotischen Signaltransduktion genauer zu untersuchen, wurde in der hier vorliegenden Arbeit besonderes Augenmerk auf die TRAIL-vermittelte Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFkB und deren Modulation durch Interferon gamma und FLIP gelegt. Hierbei konnte gezeigt werden, dass Interferon gamma, neben einer synergistischen Wirkung hinsichtlich der TRAIL-induzierten Apoptose, unter nicht-apoptotischen Bedingungen, die durch Caspase-Inhibition oder Bcl2-Überexpression geschaffen wurden, auch eine verstärkende Wirkung auf die TRAIL-induzierten NFkB-Aktivierung in KB-Zellen entfaltet. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass FLIP, ein Inhibitor der Caspase-8-Aktivierung, dessen Expression unter anderem durch Interferon gamma reguliert wird, neben einer Apoptose-inhibierenden Wirkung auch die TRAIL-induzierte NFkB-Aktivierung in KB-Zellen inhibiert, was auf eine gemeinsame Regulation beider Mechanismen auf der Ebene des DISC (Death Inducin Signaling Complex) hindeutet. / TRAIL (TNF Related Apoptosis Inducing Ligand) is a member of the TNF superfamily and is primarily known for its strong apoptosis inducing capability. However, it could be shown that besides its strong apoptotic potential, TRAIL can also induce non-apoptotic signaling pathways under certain conditions. In this dissertation it is shown that interferon gamma synergistically enhances the TRAIL induced activation of NFkB under non-apoptotic conditions, which were achieved by inhibition of caspases or stable expression of Bcl2 in KB-cells. Furthermore, FLIP, an inhibitor of caspase-8-activation, which is amongst others regulated by interferon gamma, is shown not only to block TRAIL-induced apoptosis but also to inhibit TRAIL-induced NFkB-activation in KB-cells, indicating that both mechanisms are coregulated at the level of the DISC (Death Inducing Signaling Complex).

Von den acht bekannten HBV-Genotypen sind die Genotypen A und D in Europa vorherrschend, Genotyp A in Nordwesteuropa, Genotyp D im Mittelmeerraum und in Südosteuropa. Dies bestätigte sich auch in der vorliegenden Studie, bei der von 62 genotypisierten Proben 91,9 % diesen beiden Genotypen zugeordnet werden konnten. Genotyp D war mit 64,5 % (40 Patienten) vorherrschend. Es folgten der Genotyp A (17 Patienten) und der Genotyp C (4 Patienten). In einem Fall wurde Genotyp B nachgewiesen. Deutschland als Herkunftsland war bei Patienten mit Genotyp A signifikant häufiger vertreten als bei Patienten mit Genotyp D. Der relativ hohe Genotyp D-Anteil ist möglicherweise darauf zurückzuführen, dass durch zunehmende Immigration das Auftreten verschiedener Genotypen beispielsweise aus dem südosteuropäischen Raum begünstigt wird. Patienten mit Genotyp A sprechen häufig besser auf IFN-alpha an, so dass eine Therapie mit Nukleosid- bzw. Nukleotidanaloga nicht erforderlich ist. Diese Patienten wurden somit à priori nicht in dieser Studie erfasst, was eine mögliche Erklärung dafür ist, dass der Genotyp A-Anteil mit 27,4 % relativ gering ausfiel. Bei der Untersuchung von statistischen Zusammenhängen zwischen HBV-Genotyp und Patientenalter, Geschlecht, Viruslast und Therapiedauer ergaben sich keine signifikanten Ergebnisse. Diese Studie bietet Basisinformationen zur Genotypverteilung in Deutschland. Bezüglich einer Korrelation zwischen den verschiedenen HBV-Genotypen und demographischen, virologischen sowie klinischen Charakteristika wird es künftig weiterer Studien bedürfen. / Among the eight known HBV-genotypes, genotype A and D dominate in Europe. This study established the prevalence of different HBV genotypes in 62 patients from universityhospital Wuerzburg, Germany. The prevalences of genotypes A and D were 27,4% and 64,5%, for genotypes B and C 1,6% and 6,5%. The results indicated that genotypes A and D are the predominat genotypes in German patients with chronic HBV infection.

In dieser Arbeit wurde das PVM-Mausmodell verwendet, um die Bedeutung der Typ I und Typ III Interferonantwort für die Pathogenese einer pneumoviralen Infektion zu analysieren. Hierzu wurden zunächst mit Hilfe der reversen Genetik rekombinante PVM-Mutanten hergestellt, bei denen die Gene für die NS-Proteine, welche vermutlich als Interferonantagonisten fungieren, deletiert sind. Die Charakterisierung der Replikationsfähigkeit der rPVM dNS-Mutanten erfolgte in vitro in Interferon-kompetenten und Interferon-inkompetenten Zelllinien. Ein zentraler Schritt innerhalb dieser Charakterisierung war die Untersuchung der Induktion von Interferonen in vivo und in vitro nach Infektion mit den rPVM dNSMutanten, wobei nachgewiesen wurde, dass die NS-Proteine von PVM als Interferonantagonisten fungieren. In allen Interferon-kompetenten Zellkulturen wurde eine Attenuierung von rPVM dNS1, rPVM dNS2 und rPVM dNS1dNS2 bezogen auf rPVM beobachtet. In allen Interferon-inkompetenten Zellkulturen konnte die Attenuierung der rPVM dNS-Mutanten nahezu vollständig revertiert werden. Nach Infektion mit den rPVM dNS-Mutanten wurde in verschiedenen Zelllinien eine Induktion von Typ I und Typ III Interferonen betrachtet, wobei Unterschiede in der Stärke der Interferon-Induktion nach Infektion mit den rPVM dNS-Mutanten vorhanden waren. Zusammenfassend war es möglich, die NS1- und NS2-Proteine von PVM in Analogie zu RSV eindeutig als Antagonisten der Interferonantwort zu identifizieren. Die Untersuchung der protektiven Rolle von Typ I und Typ III Interferonen für die Replikation und Pathogenität von PVM bildete den zweiten Teil dieser Arbeit. Hierzu wurde die Replikationsfähigkeit und Pathogenität der rPVM dNS-Mutanten in verschiedenen Interferon-defizienten Mausstämmen getestet. Die Untersuchungen ergaben eine protektive Rolle von Typ I und Typ III Interferonen bei einer Infektion mit PVM, wobei den Typ I Interferonen ein effektiverer Einfluss zugeordnet werden konnte. Ein Vergleich von Replikation und Virulenz zwischen den verschiedenen Typ I oder Typ III oder Typ I/Typ III Interferonrezeptor-defizienten Mausstämmen belegte eine erhöhte Suszeptibilität der Typ I/Typ III Interferonrezeptor-defizienten Mäuse gegenüber einer Infektion mit den rPVM dNS-Mutanten. Eine vollständige Aufhebung der Attenuierung wurde auch in den Typ I/Typ III Interferonrezeptor-defizienten Mäusen nicht erlangt. Eine anti-apoptotische Funktion der NS-Proteine zusätzlich zu ihrer Wirkungsweise als Interferonantagonisten wurde aufgrund der unvollständigen Revertierung der Pathogenität der rPVM dNS-Mutanten in Typ I/Typ III Interferonrezeptor-defizienten Mäusen vermutet. Der abschließende Teil dieser Dissertation befasste sich mit der Frage, welche Zellen bei einer natürlichen pulmonalen Infektion Interferone in vivo produzieren. In vitro wurde beobachtet, dass überraschenderweise nur sehr wenige virusinfizierte oder uninfizierte Zellen Typ I Interferone bilden. Der Nachweis darüber, welche Zellen während einer pulmonalen Infektion hauptsächlich Interferone in vivo produzieren, war aufgrund der fehlenden Eignung der kommerziell erhältlichen Interferon-Antikörper für intrazelluläre Gewebefärbungen nicht möglich. Dennoch gelang es abschließend durch eine neue Nachweismethode erstmals Zellen mit rezeptorgebundenen Interferon zu identifizieren, wobei es sich um ziliierte Epithelzellen, Alveolarmakrophagen und vermutlich Clarazellen sowie Typ I und Typ II Pneumozyten handelte. / In this thesis the PVM mouse model was used to unveil the role of type I and type III interferone response for the pathogenesis of pneumoviral infection. First, recombinant PVM dNS-mutants with single or combined deletions of the NS-genes were generated and replication efficiency characterization was analyzed in interferon-competent cells as well as in interferon-incompetent cells. A major point was to elucidate the NS-proteins of PVM as interferon antagonists. In interferon-competent cells the replication of rPVM dNS-mutants were significantly attenuated. These attenuation of all three rPVM dNS-mutants was almost completely reversed when interferon-incompetent cells were infected. Induction of type I and type III interferons was determined in different cell types after infection with rPVM dNS-mutants with differences in intensity of interferon induction. Thus, NS1- and NS2-proteins were clearly identified as interferon antagonists. To analyze the protective capacity of type I and type III interferons with respect to replication and pathology of PVM, mice lacking functional receptors for either or both interferons were infected with rPVM or the respective dNS-mutants. The results indicated that both type I and type III interferons which one restricted replication and pathology of PVM, with the former playing the greater role. Interestingly, the replication and virulence of wild-type PVM were completely unaffected by the presence or absence of functional receptors to type I and type III interferon, indicating that both systems are strongly suppressed during infection. However, pretreatment of mice with type I interferon were protective against lethal rPVM challenge, whereas pretreatment with type III interferon delayed but did not prevent death. Finally, the PVM-NS-proteins appeared to delay apoptosis independently of its IFN-antagonistic activity that may contribute to the limited pathogenicity of the viruses in type I/type III receptor deficient mice. In the last part type I interferon producing cells in a pneumoviral infection in vivo should be identified. It was documented that type I interferon producing cells are virusinfected cells as well as uninfected cells. Surprisingly, in vitro only few cells produced type I interferon during rPVM-GFP7 dNS1dNS2 infection. Because the commercially available interferon antibodies are not qualified for intracellular tissue staining it was not possible to identify in vivo the interferon producing cells, but by inventing a new method it was possible to verify the binding of type I interferon to the cell surface receptor of ciliated epithelial cells, alveolar macrophages and presumably Clara cells and type I and type II pneumocytes.

A produção noturna de melatonina pela glândula pineal é fundamental no controle do sistema oscilatório endógeno de mamíferos. Sua síntese é iniciada pela ativação de receptores adrenérgicos em resposta à liberação noturna de noradrenalina (NA) por terminais simpáticos. A ativação adrenérgica induz, em roedores, a transcrição do gene e a ativação da enzima arilalquil-N-acetiltransferase (AA-NAT) que converte a serotonina em N-acetilserotonina (NAS). A NAS é então convertida em melatonina pela ação da enzima hidroxiindol-O-metiltransferase (HIOMT). Além das funções cronobiológicas, a pineal apresenta comunicação bidirecional com o sistema imunológico, descrita pelo conceito do eixo imune-pineal. Nosso grupo de pesquisa tem demonstrado que mediadores imunológicos, como o lipopolissacarídeo (LPS) de bactérias gram-negativas e o fator de necrose tumoral (TNF), inibem a síntese de melatonina pela pineal por um mecanismo dependente da ativação do fator nuclear de transcrição kappa B (NF-κB). Por outro lado, fatores que inibem esta via (glicocorticoides) aumentam a produção de melatonina pela glândula pineal. Outros mediadores imunológicos que sinalizam por vias distintas à do NF-κB também são capazes de atingir e modular a produção de melatonina. A citocina inteferon-gama (IFN-γ) classicamente sinaliza pela via do STAT1 (do inglês Signal Transducer and Activator of Transcription) e é capaz de aumentar a produção de melatonina em pineais. Contudo, não existem relatos do papel desta via de sinalização sobre a síntese hormonal da glândula pineal. Sabendo-se que o IFN-γ também é capaz de sinalizar pela ativação do NF-κB, o objetivo do presente trabalho foi caracterizar e avaliar o papel destas duas vias de sinalização ativadas pelo IFN-γ sobre as produções de NAS e melatonina, induzidas por NA, em pineais em cultura. Nossos dados mostram que o aumento da síntese de NAS e melatonina induzida pelo IFN-γ está associado ao aumento da expressão dos genes Aanat e Hiomt. A incubação das glândulas com IFN-γ aumenta a translocação nuclear de STAT1 e de dímeros de NF-κB ativadores da transcrição gênica. Além disso, a incubação de pineais com IFN-γ aumenta a transcrição de 27 genes relacionados com a via das STATs. IFN-γ tende a aumentar a ligação da STAT1 com uma região do promotor do gene Aanat e a utilização de uma droga que potencia a ativação da STAT1 também aumenta a produção de NAS e melatonina. Por fim, o bloqueio da via do NF-κB inibe o aumento na produção de NAS e melatonina e da expressão de Aanat e Hiomt induzido pelo IFN-γ. Nossos dados demonstram, pela primeira vez, a importância da via da STAT1 em associação com a via NF-κB sobre a produção hormonal da glândula pineal / The nocturnal production of melatonin by the pineal gland is crucial in the control of the mammalian endogenous oscillatory system. Melatonin synthesis is initiated by the activation of adrenergic receptors in response to nocturnal release of noradrenaline (NA) by sympathetic terminals. The adrenergic activation induces, in rodents, gene transcription and activation of the arylalkyl-N-acetyltransferase enzyme (AA-NAT) that converts serotonin into N-acetilserotonin (NAS). NAS is then converted to melatonin by the action of the enzyme hydroxyindole-O-methyltransferase (HIOMT). In addition to the chronobiological functions, the pineal has a bidirectional communication with the immune system as described by the concept of the immune-pineal axis. Our research group has demonstrated that immunological mediators as the lipopolysaccharide (LPS) of gram-negative bacteria and the tumor necrosis factor (TNF) inhibit the synthesis of melatonin by the pineal in a mechanism dependent on the activation of the nuclear transcription factor kappa B (NF-κB). Moreover, factors that inhibit NF-κB pathway (glucocorticoids) increase the production of melatonin by the pineal gland. Other immunological mediators that signalize by distinct signaling pathways are also able to target and modulate the melatonin production. The cytokine interferon-gamma (IFN-γ) classically signals trough STAT1 (Signal transducer and Activator of Transcription) and is able to increase the production of melatonin by the pineal. However, there are no reports of the role of STAT1 pathway on the hormonal synthesis of the pineal gland. Considering that IFN-γ is also able to signalize through NF-κB, the aim of this study was to characterize and evaluate the role of these two signaling pathways activated by IFN-γ on the production of NAS and melatonin induced by NA in cultured pineals. Our data show that the increase in NAS and melatonin synthesis induced by IFN-γ is associated with increased expression of the genes Aanat and Hiomt. Incubation of the glands with IFN-γ increases the nuclear translocation of STAT1 and of p50:RelA NF-κB dimers. In addition, pineal incubation with IFN-γ increases the transcription of 27 related to STAT pathway. IFN-γ tends to increase the binding of STAT1 to a promoter region and the Aanat gene and the use of a STAT1-enhancer also increased the production of NAS and melatonin. Finally, the blockade of NF-κB pathway inhibits the increase in melatonin and NAS productions and also of Aanat and Hiomt genes expression induced by IFN-γ. Our data demonstrate, for the first time, the importance of the STAT1 pathway in association with NF-κB pathway on the hormonal production of the pineal gland

Le polyomavirus humain BK (virus BK) établit une infection persistante asymptomatique dans les voies rénales de 80% de la population humaine. Chez les patients transplantés, la réactivation du virus BK est à l'origine de néphropathies et de cystites hémorragiques. L'augmentation des pathologies associées au virus BK en même temps que l'utilisation de traitements immunosuppresseurs de plus en plus puissants souligne un lien étroit entre la réponse immunitaire de l'hôte et la réactivation virale. Cependant la réponse immune à l'infection par le virus BK, en particulier le rôle des cytokines antivirales dans le contrôle de l'infection est peu documentée. Ici, nous avons étudié l'efficacité antivirale des interférons (IFN) sur la multiplication du virus BK. Nous avons testé les IFN-alpha, lambda et gamma sur la souche Dunlop du virus BK dans les cellules Véro et MRC 5. L'IFN-gamma inhibe de façon dose-dépendante la transcription virale de la région précoce et de la région tardive ainsi que l'expression de la protéine virale VP1. Un moindre effet antiviral a été observé avec l'IFN-alpha et l'IFN lambda. Ces résultats sont associés à une phosphorylation prolongée de STAT 1 avec l'IFN-gamma, non retrouvée avec l'IFN-alpha et lambda. La différence d'efficacité entre ces trois types d'IFN suggère que certaines protéines induites seulement par l'IFN-gamma ont un effet antiviral dans l'infection par le virus BK. L'analyse transcriptionnelle révèle neuf protéines qui pourraient être impliquées dans cet effet antiviral spécifique. Parmi elles, nous avons étudié l'effet antiviral de l'indoleamine 2,3-dioxygénase (IDO) et les protéines de liaison au guanylate (GBP ou guanylate binding protéines), GBP1 et GBP2, sur le virus BK. Nos résultats montrent que GBP1 et GBP2 mais pas IDO contribuent à l'activité antivirale de l'IFN-gamma sur le virus BK. Trouver le mécanisme d'action de ces protéines antivirales induites par l'IFN pourrait nous aider à développer une stratégie thérapeutique / The human polyomavirus BK (BK virus) establishes an asymptomatic persistent infection in the urinary tract of 80% of the human population. In transplant recipients, reactivation of the BK virus infection is the cause of nephropathy and hemorrhagic cystitis. Diseases associated with BK virus infections are increasing at the same time as potent immunosuppressive therapies are developing. This highlights the importance of components of the immune system in controlling viral reactivation. However, the immune response to the BK virus, particularly the role of antiviral cytokines in infection control, is poorly documented. Here, we investigated the antiviral efficacy of interferons (IFN) on the BK virus multiplication. We tested IFN-alpha, lambda and gamma on the Dunlop strain of BK virus in Vero cells and MRC 5 cells. Treatment with IFN-gamma inhibited the expression of the viral protein VP1 in a dose dependent manner and decreased the expression of the early and late viral transcripts. A weaker antiviral effect was observed with IFN-alpha and IFN-lambda. These results are associated with a prolonged STAT1 phosphorylation with IFN-gamma but not with IFN-alpha and lambda. The difference of efficacy between these three types of interferon suggests that some interferon induced proteins only produced by IFN-gamma had an antiviral effect on BK virus infection. Transcriptomic analysis reveals that nine proteins could be involved in this specific antiviral effect. Among them, we selected and investigated the antiviral effect of indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) and guanylate binding protein 1 and 2 (GBP1 and GBP2) on the BK virus. Our results suggest that GBP1 and GBP2 but not IDO contribute to the antiviral activity of IFN-gamma on the BK virus. Finding the action mechanism of these IFN gamma induced antiviral proteins could help to develop a therapeutic strategy

Les patients HIV controllers (HICs) sont des patients infectés par le VIH contrôlant spontanément la réplication virale sans traitement anti-rétroviral (TARV). Certains de ces patients présentent, au cours de leur suivi, une baisse de leurs lymphocytes T CD4 (LT CD4) et parfois, perdent le contrôle antiviral. Nous avons ainsi voulu étudier les paramètres d’activation immunitaire et d’inflammation systémique chez ces patients.Dans le travail n°1, nous avons quantifié plusieurs biomarqueurs de l’inflammation, et nous avons mis en évidence qu’en dépit d’une charge virale ARN VIH très faible, les HICs présentaient des taux de TNFα, IP10 et CD14 soluble anormalement élevés. La chimiokine IP10, produite sous l’effet des IFN de type I et II, était celle qui permettait le mieux de distinguer le profil inflammatoire des HICs par rapport aux témoins non infectés ou aux patients progresseurs. Notamment, les taux d’IP10 étaient inversement corrélés aux LT CD4 circulants. Nous avons poursuivi cette analyse dans le Travail n°2 par l’analyse en qPCR de gènes induits par l’Interféron (ISGs), au sein des LT CD4, LT CD8 et monocytes triés ex vivo. Le niveau d’expression des ISGs et leur régulation étaient différents selon le type cellulaire. En outre, le gène ifitm1 était surexprimé au sein des LT CD4 des HICs. Son rôle exact mérite d’être caractérisé précisément. Enfin, nous avons analysé les causes d’échappement immunologique et virologique des HICs de la cohorte ANRS CO21 CODEX, montrant queles taux de LT CD4, de charge virale ultra-sensible et d’IP10 à l’inclusion étaient anormaux chez les patients à risque d’échappement.Ces résultats soulignent donc que chez certains HICs, une inflammation anormale persiste. La place de ces biomarqueurs pour identifier les HICs à risque de progresser, chez lesquels un TARV devrait être instauré, doit être précisée. De même, le ciblage de ces voies d’activation immunitaire doit être étudié afin d’en réduire les conséquences. / HIV controllers patients (HICs) are HIV-infected patients who spontaneously control the viral replication without anti-retroviral treatment (ART). Some of these patients experience a decline of their CD4 T cell count (CD4 Tc) and/or lose their ability to control the virus during follow-up. Our aim was to study the parameters of immune activation and systemic inflammation in such settings.In the first article, we quantified several biomarkers of inflammation in HICs, and we highlighted that despite very low circulating HIV RNA viral load, HICs had higher levels of TNF, soluble CD14 and IP10 than healthy volunteers. IP10, depending on the production of type I and II IFN, was the one that allowed the better distinction in the inflammatory profile of HICs compared with uninfected controls or viremic patients. In particular, IP10 levels were negatively correlated to circulating CD4 T cell counts. We continued this analysis by performing qPCR analyses of the expression of 4 Interferon stimulated genes (ISGs) in sorted circulating CD4 T lymphocytes, CD8 T lymphocytes and monocytes ex vivo. The level of ISGs and their regulation differed depending on the cell type. In addition, Ifitm1 was overexpressed in HICs’ CD4 T cells. His precise role in antiviral control and/or regulation of inflammation should be further characterized. Lastly, we analyzed the immunological and virological progression causes in the HICs ANRS CO21 CODEX cohort, showing that CD4 T cell counts (nadir and at inclusion), as well as ultra-sensitive HIV viral load and IP10 levels at inclusion were abnormal in patients at risk of progression. These results point out that in some HICs, abnormal inflammation persists. The role of these biomarkers in the biological follow up of HICs must be specified to better identify patients at risk of progression, in which ART should be earlier initiated. Similarly, immunomodulatory drugs should be further studied in order to reduce the long term consequences of persistent inflammation in HICs.

Hypothèse : Notre équipe étudie le rôle, mal connu, du trafic membranaire dans le contrôle de l’activation de la voie de signalisation JAK/STAT par les interférons (IFN), une voie clé du contrôle des processus cancéreux. La liaison de l’IFN-a à son récepteur IFNAR active les kinases JAK1 et TYK2 puis des transducteurs de signal comme STAT1, antiprolifératif, ou STAT3, qui a un pouvoir oncogénique. Le laboratoire a démontré récemment que le trafic membranaire d’IFNAR détermine la spécificité du signal des différents IFNs.L’objet de cette thèse est l’étude du rôle des cavéoles dans ce contrôle. Les cavéoles sont des invaginations membranaires enrichies en cholestérol et glycosphingolipides, formées par l’oligomérisation de la cavéoline1 (Cav1). Les cavéoles ou le gène CAV1 ont souvent été associés à la progression tumorale, notamment des cellules mammaires, mais ce rôle reste énigmatique et controversé. Le fait que IFNAR ait été détecté par biochimie dans des fractions de membrane enrichies en cholestérol et positives pour la cavéoline-1 chez la souris et le fait que l’expression du gène CAV1 ait été corrélée à l’action antitumorale de l’IFNa nous ont conduit à étudier le rôle des cavéoles dans l’action antitumorale des IFNs.Résultats: Le rôle putatif des cavéoles sur le contrôle de la voie JAK/STAT a été étudié dans des cellules murines MLEC n’exprimant pas Cav1 et dans des lignées humaines par interférence ARN contre Cav1. Nous avons pu démontrer que la présence de Cav1 régule de manière opposée deux étapes de la voie de signalisation de STAT3 activée par l’IFN-a. Par contre, ni l’activation de STAT1 par l’IFN-a ni celle de STAT3 par les autres IFNs ne nécessitent Cav1. Parallèlement, le laboratoire a montré que les cavéoles jouent un rôle capital dans la réponse cellulaire aux stress mécaniques en se dépliant lors d’un étirement membranaire, ce qui amortit la tension membranaire. Nous montrons qu’un tel stress mécanique par étirement module spécifiquement la signalisation de STAT3 par l’IFN-a d’une manière dépendante de Cav1 dans les cellules MLEC, suggérant pour la première fois un rôle de STAT3 et de l’IFN-a dans la mécanotransduction dépendante des cavéoles. Ce résultat permet aussi de relier les contraintes mécaniques présentes dans la masse tumorale et leur effet sur la progression tumorale. Perspectives : Les IFNs et la voie JAK/STAT sont bien caractérisés pour leur action antiproliférative, mais si l’IFN-a est utilisé en thérapeutique oncologique, les mécanismes de l’effet antitumoral sont mal connus. Nos résultats impliquent pour la première fois les cavéoles dans l’activation sélective du proto-oncogène STAT3 par l’IFN-a et proposent STAT3 comme un des nouveaux acteurs de la mécanotransduction par les cavéoles. Elucider les mécanismes moléculaires mis en jeu dans ces deux fonctions inédites des cavéoles devrait permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques dans la progression tumorale. / Hypothesis: Our team studies the poorly investigated role of membrane trafficking in the control of the activation of the JAK / STAT signaling pathway by interferons (IFN), a key mechanism in the control of tumorigenesis. The binding of the IFN-a to its receptor IFNAR activates the kinases JAK1 and TYK2 and then, signal transducers and activators of transcription including the antiproliferative STAT1 or the oncogenic STAT3. The laboratory demonstrated recently that the trafficking of IFNAR at the plasma membrane determines the signal specificity of the various IFNs.The goal of this thesis was to study the role of caveolae in this control. Caveolae are specialized membrane invaginations enriched in cholesterol and glycosphingolipids, formed by the oligomerization of their main structural protein, caveolin-1 (Cav1). Caveolae or the CAV1 gene have often been associated with tumorigenesis, in particular in mammary cancer cells, but this role remains enigmatic and controversial. The fact that IFNAR was previously found in Cav1-positive lipid microdomains and the fact that the expression of the CAV1 gene had been functionally linked to the antitumoral function of IFN-a led us to investigate the role of caveolae in the antitumoral function of the IFNs.Results: The putative role of caveolae in the control of the JAK / STAT signaling pathway have been studied in murine lung endothelial MLEC cells that do not express Cav1 and in a human lineage by RNA interference against Cav1. We were able to demonstrate that the presence of Cav1 regulates in an opposite manner two stages of the signaling pathway of STAT3 activated by the IFN-a whereas the activation of STAT1 by IFN-a, or STAT3 by the other type I and II IFNs do not require Cav1.At the same time, the laboratory showed that caveolae play a major role in the cellular answer to mechanical stress by flattening during a membrane stretching, thus buffering the membrane tension. We show that mechanical stress by uniaxial cell stretching modulates specifically the signaling pathway of STAT3 activated by the IFN-a in a Cav1-dependant manner in MLEC cells. This result suggests for the first time a role of STAT3 and of IFN-a in caveolae-driven mechanotransduction. This result also allows us to link the mechanical constraints found in the tumoral mass to their effect on tumorigenesis.Prospects:The IFNs and the JAK / STAT signaling pathway protect the cells from tumorigenesis, but although IFN-a is used in oncology, the mechanisms of its antitumoral effect are poorly known. Our results involve for the first time caveolae in the selective activation of the proto-oncogenic STAT3 by the IFN-a and allow us to propose STAT3 and the IFN-a as new actors of the mechanotransduction by caveolae. Clarifying the molecular mechanisms involved in these two new functions of caveolae should allow us to identify new therapeutic targets in tumorigenesis.

Le développement d’une réponse innée est essentiel pour lutter contre les infections virales. Elle se traduit par la production de cytokines antivirales, parmi lesquelles les interférons-alpha (IFN-). Les cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC) sont les principales cellules productrices d’IFN-Nous avons démontré que les virus libres d’HTLV-1 induisaient une réponse innée se traduisant par une forte production d’IFN-. Les pDC non stimulées sont dans un état de quiescence avec des taux du ligand pro-apoptotique TRAIL (TNF-Related Apoptosis Inducing Ligand) intracellulaire très élevés, rapidement mobilisés à la surface des pDC sous activation de la voie du Toll-like receptor 7. Les pDC acquièrent alors un phénotype de cellules tueuses, les IKpDC (Interferon producing killer pDC). C’est la première fois qu’une réponse innée induite par les particules libres d’HTLV-1 a été mise en évidence.Il a été montré que des taux sériques d’IFN- apparaissaient dans les phases tardives du SIDA, suggérant un rôle de l’IFN- dans la pathologie du VIH. La voie d’apoptose régulée par TRAIL/DR5 est impliquée dans la déplétion massive des LTCD4+ des patients infectés par le VIH. Les patients « HIV Controllers » (HIC) sont des patients infectés par le VIH mais qui contrôlent la charge virale et la mort de leurs LTCD4+. Nous avons alors étudié la voie IFN/TRAIL/DR5 chez ces patients. Notre analyse protéique et génomique de DR5 a révélé un défaut d’expression de DR5 à la surface des LTCD4+ des patients HIC par rapport aux patients virémiques. Le séquençage du gène DR5 a révélé l’existence d’une substitution homozygote dans l’exon 1 du gène des HIC. Cette substitution génomique a pour conséquence le changement d’un acide aminé dans la région leader de la protéine DR5 entrainant la séquestration intracellulaire de DR5. Cette mutation associée au profil des patients HIC pourrait expliquer le maintien du nombre de leurs LTCD4+, ainsi que la non-progression vers la phase SIDA. / Innate immune response which is characterized by antiviral cytokines such as interferon-alpha (IFN-, is essential during viral infections. Plasmacytoid dendritic cells (pDC) are the main IFN- producer cells. We demonstrated that HTLV-1 free viruses induced a strong IFN- production by pDC. Unstimulated pDC were in fact dormant cells stocking intracellular proapoptotic ligand TRAIL (TNF-Related Apoptosis Inducing Ligand), which was quickly mobilized at the cell surface of pDC after Toll-like receptor 7 activation. Then, pDC acquire a new killer phenotype, the IKpDC (Interferon producing killer pDC). This is the first demonstration that HTLV-1 free viruses can induce an innate immune response by pDC.Plasma levels of IFN- have been found in HIV-1-infected patients, suggesting a role of IFN- in HIV-associated disease. We hypothesized in our HIV in vitro model the implication of TRAIL/DR5 pathway in CD4 T cells massive depletion observed in HIV-1-infected patients.A population of HIV-infected patients, called « HIV Controllers » (HIC), do not progress to AIDS despite HIV infection, control their viral load and their CD4 T cells depletion. We have then study IFN/TRAIL/DR5 pathway of these patients. Our proteomic and genomic analysis revealed a default of DR5 expression at the cell surface of CD4 T cells from HIV controllers in contrast to progressor patients. DNA sequencing revealed a homozygous substitution in the exon 1 of DR5 gene from HIC. The consequence of this substitution is the change of one amino-acid in the leader region of DR5 protein. Thus, DR5 is uncleaved and is sequestrated in the intracellular copartements in CD4 T cells. The lack of DR5 cell surface expression in HIV Controllers may explain the maintain of CD4+ T cells count and thus the non progression to AIDS.