This early phase study examined the effects of a series of ten standard-protocol acupuncture treatments over four weeks in 12 healthy, but symptomatic, menopausal women. Two biologic markers, heart rate variability to evaluate effects of acupuncture on the autonomic nervous system as it relates specifically to the heart, and interleukin 6, a proinflammatory cytokine, to capture physiologic impact of acupuncture on the immune-inflammatory response, were collected.Women who exhibited significant menopausal symptoms, as measured by a minimum score of 22 out of a possible 44 points on the Menopause Rating Scale (MRS), underwent 10 sessions of a standard acupuncture point protocol intervention over a four-week period. Symptoms were evaluated for 28 days using the MRS. After the intervention was complete, one final open-ended question was asked of each participant to explore subjective experiences not captured by the validated instrument. Physiologic measurements included a 30-minute continuous measure of electrocardiogram data before and during acupuncture, as well as pre and post acupuncture measures of serum interleukin 6 at the first and final acupuncture treatment. Heart rate variability was assessed using spectral analysis, and interleukin 6 changes were measured using ELISA. Analysis included linear regression, Wilcoxon Signed Ranks test and Spearman correlation coefficients.After the acupuncture intervention, menopausal symptoms improved significantly. Heart rate variability did not show consistent or predictable intra or inter-subject changes, however several components of HRV, interleukin 6 and symptoms were found to have significant correlations.A larger study was deemed feasible. Menopause symptoms improved. Heart rate variability showed no consistent changes or trends. Interleukin 6 decreased in seven subjects, between the first and tenth acupuncture treatment, but did not reach statistical significance.This small project suggests that heart rate variability, when measured at each acupuncture treatment, does not change in a consistent or predictable manner. Rather, acupuncture may provide a modulating influence that depends on the body's functional state at each treatment.

No description available.

Beim aggressiven Non-Hodgkin Lymphom (aNHL) handelt es sich um eine heterogene Gruppe lymphatischer Erkrankungen. Obwohl heutige Behandlungsregime hohe Ansprechraten erzielen können, erreichen viele Patienten keine komplette Remission. Für eine Verbesserung der Behandlungsstrategien sind zuverlässige und klinisch anwendbare prognostische Marker erforderlich. Vorherige Studien weisen darauf hin, dass das Zytokin Interleukin 10 (IL10) eine Rolle sowohl bei der Initiierung als auch für den Verlauf von Lymphomen spielen könnte. Bisherige Daten zu Assoziationen von IL10 Genvariationen und dem IL10 Serumspiegel mit dem klinischen Verlauf von aNHL sind widersprüchlich. Daher ist das Ziel dieser Studie zu klären, ob diese beiden Faktoren prognostische Relevanz für den klinischen Verlauf von aNHL in unabhängigen größeren klinischen Studienkohorten haben sowie die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die hierzu beitragen. Insgesamt wurden 1724 aNHL Patienten von drei verschiedenen klinischen Studien (NHL-B, RICOVER-60 und MInT) in diese Studie eingeschlossen. 604 Patienten kamen aus der RICOVER-60 Studie, wobei von 523 Patienten Serumproben verfügbar waren. Überlebenszeitanalysen zeigten, dass Patienten mit niedrigen IL10 Serumspiegeln im Vergleich zu Patienten mit erhöhten IL10 Serumspiegeln einen besseren klinischen Verlauf aufwiesen. Dies gilt auch für Patienten, die mit Rituximab zusätzlich zu Chemotherapie behandelt worden sind, welches die heutige Standardtherapie ist. Dies weist darauf hin, dass der IL10 Serumspiegel prognostische Relevanz für das klinische Ergebnis von aNHL haben könnte. Die Behandlung von Zielzellen mit IL10 in in vitro Versuchen scheint zu einer Reduktion der Rituximab-vermittelten antikörperabhängigen zellulären Zytotoxizität (antibody dependent cellular cytotoxicity (ADCC)), nicht aber der Komplement-vermittelten Zytotoxizität (complement dependent cytotoxicity (CDC)) zu führen. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass in der RICOVER-60 Kohorte homozygote Träger des IL10-11.668AA ein besseres Behandlungsergebnis zeigen als Träger der anderen zwei Genotypen (OS: HR=0.6; CI= 0.38-0.95; EFS: HR=0.6; CI= 0.41-0.87). Diese Genvariation befindet sich innerhalb einer evolutionär konservierten Sequenz. Mittels Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) modifizierter Histone konnte ermittelt werden, dass die Region um den IL10-11.668G/A sowie andere konservierte Sequenzen in transformierten B-Zellen Enhancer spezifische Histon Modifikationen aufweisen. Sie scheinen also in die Regulation des IL10 Gens involviert zu sein. Zudem wurde eine sehr lange nicht-kodierende RNA identifiziert, die vom IL10 Genlokus transkribiert wird. Die Ergebnisse dieser Studie bestätigen, dass IL10 eine wichtige Rolle für den Klinischen Verlauf von aNHL spielt, und liefern neue Erkenntnisse über Struktur und Regulation des IL10 Gens.

Intravenous immunoglobulin (IVIg) has been used to treat a variety of autoimmune disorders including multiple sclerosis (MS); however, its mechanism of action remains elusive. Our results demonstrate a novel finding wherein IVIg treatment induces a dramatic surge (>1000-fold increase) in the levels of IL-11 in the circulation and that the liver is the organ of increased IL-11 transcription. Furthermore, we show that IL-11Rα knockout mice, although initially protected, become resistant to protection by IVIg during experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) and develop disease with a similar incidence and severity as control-treated IL-11Rα-/- mice. The inability of IVIg to prevent EAE in IL-11Rα-/- mice correlated with a failure of this agent to decrease IL-17 production by myelin-reactive T-cells in the draining lymph nodes. Finally, we show that IL-11 can directly inhibit IL-17 production by lymph node cells in culture. Together, these results implicate IL-11 as an important immune effector of IVIg in the amelioration of EAE.

Intravenous immunoglobulin (IVIg) has been used to treat a variety of autoimmune disorders including multiple sclerosis (MS); however, its mechanism of action remains elusive. Our results demonstrate a novel finding wherein IVIg treatment induces a dramatic surge (>1000-fold increase) in the levels of IL-11 in the circulation and that the liver is the organ of increased IL-11 transcription. Furthermore, we show that IL-11Rα knockout mice, although initially protected, become resistant to protection by IVIg during experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) and develop disease with a similar incidence and severity as control-treated IL-11Rα-/- mice. The inability of IVIg to prevent EAE in IL-11Rα-/- mice correlated with a failure of this agent to decrease IL-17 production by myelin-reactive T-cells in the draining lymph nodes. Finally, we show that IL-11 can directly inhibit IL-17 production by lymph node cells in culture. Together, these results implicate IL-11 as an important immune effector of IVIg in the amelioration of EAE.

Interleukin-10 (IL-10) is a pleiotropic cytokine which limits inflammatory responses by balancing the hosts immune response against infection. Mammalian Toll-like receptors (TLRs) are pattern recognition receptors that recognize specific molecular pattens on microbial pathogens and activate intracellular signaling via the transcription factors NF-B and IRF-3. In this study we evaluate the contribution of the TLR ligands Poly I:C, Pam3CSK4, LPS and LTA to IL-10 receptor dysfunction in murine peritoneal macrophages (PM). We examine how these ligands are able to alter IL-10 mediated STAT3 phosphorylation and CCR5 gene expression in PM. The ability of Poly I:C and Pam3CSK4 to alter the immunosuppressive activity of IL-10 in C2-ceramide stimulated PM is also examined. The results of our study indicate a delayed inhibition of IL-10 mediated activation of STAT3 by LPS, LTA, Poly I:C and Pam3CSK4. The CCR5 gene expression experiments demonstrate that LPS was able to down-regulate IL-10 induced CCR5 mRNA expression in PM.

HIV Tat protein downregulates surface expression of the interleukin-7 receptor alpha-chain (CD127) on CD8 T cells resulting in impaired T cell proliferation and cytolytic capacity. Once taken up by CD8 T cells, Tat binds directly to the cytoplasmic tail of CD127 inducing receptor internalization and degradation. Given the important roles of CD127 in proper immune function, the Tat/CD127 interactions were characterized and the mechanisms required to induce receptor loss from the surface of CD8 T cells were investigated. Tat deletion mutants were generated each sequentially lacking a region of the protein. CD8 T cells isolated from HIV negative volunteers were exposed to exogenous or intracellular Tat proteins before surface CD127 expression was analyzed by flow cytometry. To characterize Tat/CD127 physical interactions, wild type Tat and Tat mutants were incubated with lysates from a CD127+ Jurkat cell line followed by CD127/Tat co-immunoprecipitation. The effect of Tat on CD127 post-translational modifications was also investigated. Removal of the N-terminus of Tat (aa 1-10 or aa 17-21) prevented Tat from downregulating CD127 and prevented Tat from binding CD127 as assessed by co-immunoprecipitation. Deletion of the basic region (aa 48-59) also prevented Tat from downregulating CD127 but did not prevent Tat from interacting physically as demonstrated by co-immunoprecipitation. Strikingly, endogenously expressed Basic Tat acted as a dominant negative mutant, causing an accumulation of CD127 at the cell surface. These observations suggest that Tat may bind CD127 via its N-terminus to disrupt the normal recycling of the receptor, and then recruit cellular endocytic machinery to the receptor via it’s basic region, to remove the receptor from the cell surface and target it for degradation. Furthermore, Tat encourages the ubiquitination of CD127 by recruiting the cytokine-inducible SH2 containing (CIS) protein to the receptor, possibly leading to accelerated CD127 internalization and proteasomal degradation. I propose a model whereby Tat binds CD127 via its N-terminal region then recruits CIS via its basic region. CIS in turn recruits a cellular E3 ubiquitin ligase to ubiquitin tag the receptor for internalization and proteasome degradation. This research may lead to novel treatments designed to maintain IL-7 signalling and strengthen CD8 T cell function in HIV+ persons.

This thesis describes the use of nuclear magnetic resonance techniques to determine the structures of two proteins in solution, hen egg-white lysozyme and human interleukin-4. Using 2D ¹H methods an extensive set of structural data has been collected for hen lysozyme (1158 NOE distance restraints, 68 o and 24 _?1 dihedral angle restraints) and these data have been used in distance geometry-dynamical simulated annealing calculations to determine an ensemble of NMR structures for the protein. The overall Ca RMSD from the average for a set of 16 calculated structures is 1.8 ± 0.2 A but, excluding 14 residues in exposed disordered regions, this value reduces to 1.3 ± 0.2 Å. Regions of secondary structure, and particularly the four a helices, are well defined (Ca RMSD 0.8 ± 0.3 Å for helices). Detailed comparisons of the NMR structures with crystal structures of the protein have shown the close similarity of the main chain fold and the conformation of interior side chains in solution and in crystals. ³J_aß coupling constant measurement have indicated, however, that the conformational mobility of the side chains of many surface residues is significantly more pronounced than an individual crystal structure would suggest. For human interleukin-4, a strategy involving ¹⁵N and ¹³C labelled recombinant protein together with heteronuclear 3D NMR techniques has been employed to determine the structure of the protein. The work has provided the first structure for this protein, a left-handed four helix bundle with an up-up-down-down connectivity. For an ensemble of 10 final calculated NMR structures there is a Ca RMSD from the average of 1.6 ± 0.4 Å, the definition of the helical core of the protein being particularly good (0.8 ± 0.2 Å). There is, however, some disorder in the long overhand loops of the structure; this reflects the unusually high conformational mobility of these regions. Comparison of the interleukin-4 structure with proteins with related folds, particularly members of the haemopoietic cytokine superfamily, suggests that the fold found here for interleukin-4 may be the adopted structure throughout this cytokine superfamily. In a postscript to this thesis the NMR structure of human interleukin-4 is shown to have a very similar conformation to a crystal structure of the protein which has been solved very recently.

Um die Rolle von Interleukin-12p75 (IL-12p75) und Interleukin-12p40 (IL-12p40) in der Abwehr einer Kryptokokken-Infektion im Mausmodell zu untersuchen, wurden Mäuse auf 129Sv/Ev Stammhintergrund intraperitoneal und intranasal mit Cryptococcus neoformans (C. neoformans) infiziert. Dabei wurden die Unterschiede im Infektionsverlauf und in der Immunreaktion von Wildtyp-, IL-12p35-/- und IL-12p35/p40-/--Mäusen analysiert. Unterschiede zwischen den Wildtyp- und den IL-12p35-/--Mäusen lassen auf die Bedeutung von IL-12p75 schließen, wogegen Unterschiede zwischen IL-12p35-/-- und IL-12p35/p40-/--Mäusen auf die Rolle von IL-12p40 schließen lassen. Untersucht wurden sowohl die Erregerkonzentration in den Organen, Antigenspiegel im Blut, histologische Veränderungen und Serumantikörperkonzentrationen. Nach intraperitonealer Infektion war die Keimbelastung der Organe bei den Wildtyp-Mäusen geringer als bei beiden IL-12-/--Mausstämmen. Bei Wildtyp-Mäusen waren nicht nur weniger lebende Kryptokokken in den Organen zu finden, sondern auch weniger Kryptokokken Antigen im Serum als bei beiden IL-12-/--Mäusen nachweisbar. Das zeigt, dass IL-12p75 für die Kontrolle der intraperitonealen Infektion mit C. neoformans notwendig ist. IL-12p40 hatte ähnlich wie IL-12p75, wenn auch in etwas geringerem Masse, eine protektive Rolle bei der Erregerabwehr. Ohne IL-12p40 war eine Kontrolle der Infektion auf einem geringen Niveau der Keimbelastung nicht möglich. Besonders deutlich wurde dieses Phänomen beim Antigentiter bei den IL-12p35/p40-/--Mäusen. Durch das Fehlen von IL 12p40 wurde bei den IL-12p35/p40-/--Mäusen viel mehr Antigen über das Blut im Serum verteilt als bei den IL-12p35-/-- oder den Wildtyp-Mäusen. Die Wirtsreaktion bei einer Infektion mit C. neoformans geht mit der Bildung von Granulomen einher. Ohne IL-12p75 kam es zwar noch zur Bildung von Granulomen, diese zeigten aber eine veränderte zelluläre Zusammensetzung. Die IL-12p35/p40-/--Mäuse waren nicht zur Ausbildung von typischen Granulomen fähig. Bei ihnen kam es zu einer vermehrten Ansammlung von Kryptokokken fast ohne Entzündungszellen. IL-12p40 ist also für die Ausbildung einer zellulären Entzündungsreaktion notwendig. IL-12p40 ist auch für die Antikörperbildung gegen C. neoformans erforderlich. Die IL 12p35/p40-/--Mäuse waren kaum in der Lage, spezifische Antikörper gegen C. neoformans zu bilden. IL-12p75 ist für die Ausbildung einer Th1-Antwort notwendig. Infizierte Wildtyp-Mäuse produzierten doppelt soviel IgG2a, welches für ein Th1-Antwort typisch ist, wie die IL 12p35-/--Mäuse. Der intranasale Infektionsweg kommt der natürlichen aerogenen Infektion recht nahe. Deshalb wurde – zusätzlich zur intraperitonealen Infektion - dieser Infektionsweg zur Untersuchung der Immunantwort gegen C. neoformans berücksichtigt. Auch bei intranasaler Infektion ist IL-12p75 für die Kontrolle der Keimbelastung der Organe notwendig. Interessanterweise war die Keimbelastung der Lunge bei den IL-12p35-/--Mäusen etwas höher als bei den IL-12p35/p40-/--Mäusen. Bei den Wildtypmäusen war die Dissemination der Kryptokokken aus der Lunge in die Milz und ins Gehirn gering. Ein Fehlen von IL-12p75 bewirkte allerdings eine Besiedlung besonders des Gehirns. Nach intranasaler Infektion kam es in der Lunge von Wildtyp-Mäusen zu atypischen Granulomen mit zentraler Einschmelzung von Gewebe und Kryptokokken. Diese Reaktion war bei den IL-12p35-/--Mäusen noch stärker ausgeprägt als bei den Wildtyp-Mäusen. Bei den IL-12p35/p40-/--Mäusen blieb eine Gewebsreaktion größerer Areale aus. Es waren nur eine Aktivierung des BALT zu sehen. IL-12p40 ist demnach auch nach intranasaler Infektion für eine zelluläre Entzündungsreaktion notwendig. Möglicherweise kann sich diese Eigenschaft von IL-12p40 bei intranasaler Infektion in einer immunpathologischen Reaktion äußern, die bei IL-12p35-/--Mäusen für eine massive Infiltration der Lunge mit Entzündungszellen verantwortlich ist. Der Gehalt an Kryptokokken-spezifischen Antikörpern war nach intranasaler Infektion fünf- bis zehnmal höher als nach intraperitonealer Infektion. Der intranasale Infektionsweg zeigte also eine wesentlich ausgeprägtere humorale Antwort. Der Typ der Immunantwort schien sich im Gegensatz zur intraperitonealen Infektion in Richtung Th2 (d. h. verstärkte Antikörperbildung) verschoben zu haben. Sowohl nach intraperitonealer wie auch nach intranasaler Infektion mit C. neoformans lassen sich die immunstimulatorischen Aktivitäten von IL-12p75 und von IL-12p40 nachweisen, auch wenn diese sich in Abhängigkeit vom Infektionsweg etwas unterschiedlich manifestieren. / To analyse the role of interleukin-12p75 (IL-12p75) and interleukin-12p40 (IL-12p40) in the defence against Cryptococcus neoformans (C. neoformans) a murine infection model was established and studied. Mice of wild-tpye 129Sv/Ev background as well as IL-12p35-/- and IL-12p35/p40-/- 129Sv/Ev mice were infected intraperitoneally or intranasally with C. neoformans. The differences between the immune response of these genotypes were analysed. Comparing wild-type and IL-12p35-/--mice allows for conclusions related to the importance of IL-12p75, comparing IL-12p40-producing IL-12p35-/- mice with IL-12p35/p40-/- mice shows the importance of IL-12p40. Fungal organ burden, serum antigen levels, inflammatory cell responses, and antibody production were examined. The fungal organ load in wild-type mice was smaller than in both mutant IL-12-/--mice. In wild-type mice fewer cryptococci were found in organs and less cryptococcal antigen in serum than in IL-12p35-/- and IL-12p35/p40-/- mice. This underlines the importance of IL 12p75 for the control of the infection with C. neoformans. In addition, IL-12p40 was found to have a similar but weaker role as IL-12p75 in protection against C. neoformans. In the absence of IL-12p40 IL-12p35/p40-/- mice developed higher antigen titers than IL-12p35-/- and wild-type mice. The host response against infection with C. neoformans is associated with granuloma formation. Recruitment of inflammatory cells to granulomas was altered in the absence of IL 12p75. In addition, IL-12p40 contributed significantly to granuloma formation since IL 12p35/p40-/- mice developed no or only very poor granulomatous responses. Therefore, IL 12p40 is required for inflammatory cell responses. IL-12p40 was also found to be required for antibody production against C. neoformans. Infected IL-12p35/p40-/--mice had only very low levels of specific antibodies against C. neoformans. IL-12p75 is known to be essential for protective Th1 response against intracellular microorganisms. Th1 responses are commonly associated with the production of IgG2a. Infected wild-type mice produced 2-fold higher IgG2a levels than IL-12p35-/--mice. To adapt the infection model more to the natural infection mode the intraperitoneal infection route was changed to an intranasal route. Following intranasal infection IL-12p75 also proved to be necessary for control of the fungal organ load. Interestingly the organ load was higher in IL-12p35-/--mice than in IL-12p35/p40-/-mice which suggest a role of IL-12p40 in cell recruitment. Following intranasal application of cryptococci fungal dissemination to spleen and brain was reduced as compared to the intraperitoneal infection route. Without IL-12p75 dissemination of C. neoformans to the brain occured. This shows that IL-12p75 is involved in control of dissemination from lung to brain. The inflammatory response of IL-12p35-/--mice was stronger than the tissue response of wild-type mice. The massive tissue reactions of IL-12p35-/--mice caused big areas of diffuse cellular infiltration in their lungs. In IL-12p35/p40-/--mice inflammatory responses could be observed only in the peribronchial tissue. This shows that IL-12p40 is not only needed for a cellular inflammatory response following intraperitoneal but also following intranasal infection. Following intranasal infection IL-12p40 can induce immunopathological effects. Intranasal infection of mice with C. neoformans resulted in five to ten times higher antibody responses than intraperitoneal infection. This suggests that intranasal infection of mice results in a more Th2-biased humoral response. In summary, these experiments show that besides IL-12p75 also IL-12p40 contributes to cellular immunity against C. neoformans. The immunostimulatory properties of both, IL 12p75 and IL-12p40, can be observed after intraperitoneal and intranasal infection routes with similar but also distinct manifestations.

Chronic inflammatory diseases such as rheumatoid arthritis, type 2 diabetes and cardiovascular diseases, are associated with the homeostatic imbalance of one of several physiological systems combined with the lack of spontaneous remission, which causes the disease to persevere throughout patients’ lives. The inflammatory response relies mainly on tissue-resident, pro-inflammatory M1 type macrophages and, consequently, a chance for therapeutic intervention lies in driving macrophage polarization towards the anti-inflammatory M2 phenotype. Therefore, anti-inflammatory cytokines that promote M2 polarization, including interleukin-4 (IL4), have promising therapeutic potential. Unfortunately, their systemic use is hampered by a short serum half-life and dose-limiting toxicity. On the way towards cytokine therapies with superior safety and efficacy, this thesis is focused on designing bioresponsive delivery systems for the anti-inflammatory cytokine IL4. Chapter 1 describes how anti-inflammatory cytokines are tightly regulated in chronic, systemic inflammation as in rheumatoid arthritis but also in acute, local inflammation as in myocardial infarction. Both diseases show a characteristic progression during which anti-inflammatory cytokine delivery is of variable benefit. A conventional, passive drug delivery system is unlikely to release the cytokines such that the delivery matches the dynamic course of the (patho-)physiological progress. This chapter presents a blueprint for active drug delivery systems equipped with a 24/7 inflammation detector that continuously senses for matrix metalloproteinases (MMP) as surrogate markers of the disease progress and responds by releasing cytokines into the affected tissues at the right time and place. Because they are silent during phases of low disease activity, bioresponsive depots could be used to treat patients in asymptomatic states, as a preventive measure. The drug delivery system only gets activated during flares of inflammation, which are then immediately suppressed by the released cytokine drug and could prevent the steady damage of subclinical chronic inflammation, and therefore reduce hospitalization rates. In a first proof of concept study on controlled cytokine delivery (chapter 2), we developed IL4-decorated particles aiming at sustained and localized cytokine activity. Genetic code expansion was deployed to generate muteins with the IL4’s lysine 42 replaced by two different unnatural amino acids bearing a side chain suitable for click chemistry modification. The new IL4 muteins were thoroughly characterized to ensure proper folding and full bioactivity. Both muteins showed cell-stimulating ability and binding affinity to IL4 receptor alpha similar to those of wild type IL4. Copper-catalyzed (CuAAC) and strain-promoted (SPAAC) azide–alkyne cycloadditions were used to site-selectively anchor IL4 to agarose particles. These particles had sustained IL4 activity, as demonstrated by the induction of TF-1 cell proliferation and anti-inflammatory M2 polarization of M-CSF-generated human macrophages. This approach of site-directed IL4 anchoring on particles demonstrates that cytokine-functionalized particles can provide sustained and spatially controlled immune-modulating stimuli. The idea of a 24/7 sensing, MMP driven cytokine delivery system, as described in the introductory chapter, was applied in chapter 3. There, we simulated the natural process of cytokine storage in the extracellular matrix (ECM) by using an injectable solution of IL4 for depot formation by enzyme-catalyzed covalent attachment to ECM components such as fibronectin. The immobilized construct is meant to be cleaved from the ECM by matrix-metalloproteinases (MMPs) which are upregulated during flares of inflammation. These two functionalities are facilitated by a peptide containing two sequences: a protease-sensitive peptide linker (PSL) for MMP cleavage and a sequence for covalent attachment by activated human transglutaminase FXIIIa (TGase) included in the injection mix for co-administration. This peptide was site-selectively conjugated to the unnatural amino acid at IL4 position 42 allowing to preserve wild type bioactivity of IL4. In vitro experiments confirmed the anticipated MMP response towards the PSL and TGase-mediated construct attachment to fibronectin of the ECM. Furthermore, the IL4-peptide conjugates were able to reduce inflammation and protect non-load bearing cartilage along with the anterior cruciate ligament from degradation in an osteoarthritis model in rabbits. This represents the first step towards a minimally invasive treatment option using bioresponsive cytokine depots with potential clinical value for inflammatory conditions. One of the challenges with this approach was the production of the cytokine conjugate, with incorporation of the unnatural amino acid into IL4 being the main bottleneck. Therefore, in chapter 4, we designed a simplified version of this depot system by genetically fusing the bifunctional peptide via a flexible peptide spacer to murine IL4. While human IL4 loses its activity upon C-terminal elongation, murine IL4 is not affected by this modification. The produced murine IL4 fusion protein could be effectively bound to in vitro grown extracellular matrix in presence of TGase. Moreover, the protease-sensitive linker was selectively recognized and cleaved by MMPs, liberating intact and active IL4, although at a slower rate than expected. Murine IL4 offers the advantage to evaluate the bioresponsive cytokine depot in many available mouse models, which was so far not possible with human IL4 due to species selectivity. For murine IL4, the approach was further extended to systemic delivery in chapter 5. To increase the half-life and specifically target disease sites, we engineered a murine IL4 variant conjugated with a folate-bearing PEG chain for targeting of activated macrophages. The bioactive IL4 conjugate had a high serum stability and the PEGylation increased the half-life to 4 h in vivo. Surprisingly, the folate moiety did not improve targeting in an antigen-induced arthritis (AIA) mouse model. IL4-PEG performed better in targeting the inflamed joint, while IL4-PEG-folate showed stronger accumulation in the liver. Fortunately, the modular nature of the IL4 conjugate facilitates convenient adaption of PEG chain length and the targeting moiety to further improve the half-life and localization of the cytokine. In summary, this thesis describes a platform technology for the controlled release of cytokines in response to inflammation. By restricting the release of the therapeutic to the site of inflammation, the benefit-risk ratio of this potent class of biologics can be positively influenced. Future research will help to deepen our understanding of how to perfectly combine cytokine, protease-sensitive linker and immobilization tag or targeting moiety to tackle different diseases. / Chronische Entzündungskrankheiten wie rheumatoide Arthritis, Typ-2-Diabetes oder Herz-Kreislauf-Erkrankungen werden durch das Ungleichgewicht eines von mehreren physiologischen Systemen in Verbindung mit fehlender spontaner Remission verursacht, wodurch die Krankheiten lebenslang bestehen bleiben. Die zugrunde liegenden Entzündungsreaktionen beruhen hauptsächlich auf im Gewebe vorhandenen Makrophagen und deren Polarisation in Richtung des entzündlichen M1-Phänotyps, was gleichzeitig die Möglichkeit einer therapeutischen Intervention bietet. Entzündungshemmende Zytokine, einschließlich Interleukin-4 (IL4), haben ein großes therapeutisches Potenzial, da sie Makrophagen in Richtung des entzündungshemmenden M2-Phänotyps zu polarisieren vermögen. Leider ist ihre systemische Anwendung durch eine kurze Serumhalbwertszeit und dosislimitierende Toxizität eingeschränkt. Auf dem Weg zu Zytokintherapeutika mit verbesserter Sicherheit und Wirksamkeit konzentriert sich diese Arbeit auf die Entwicklung von bioresponsiven Freisetzungssystemen für das entzündungshemmende Zytokin IL4. Kapitel 1 beschreibt, wie entzündungshemmende Zytokine bei chronischen systemischen Entzündungen wie rheumatoider Arthritis im Vergleich zu akuten lokalen Entzündungen wie dem Myokardinfarkt reguliert werden. Beide Erkrankungen zeigen einen charakteristischen Verlauf, währenddessen die Freisetzung von entzündungshemmenden Zytokinen von unterschiedlich großem Nutzen ist. Gewöhnliche, passive Arzneimittelfreisetzungssysteme sind nicht in der Lage, Zytokine in idealer Menge zur optimalen Unterdrückung des dynamischen, (patho-)physiologischen Verlaufs der Krankheit freizusetzen. In diesem Kapitel werden deshalb aktive Arzneimittelfreisetzungssysteme vorgestellt, die mit einer Sensorik für die Entzündung ausgestattet sind, mit der sie kontinuierlich die Konzentration von Matrix-Metalloproteinasen (MMP) als Indikatoren für den Krankheitsverlauf erfassen können. Somit kann das aktive Arzneimittelfreisetzungssystem krankes Gewebe zum richtigen Zeitpunkt und am richtigen Ort mit Zytokinen behandeln. Solche bioresponsiven Depots können zur vorbeugenden Behandlung von asymptomatischen Patienten eingesetzt werden, da sie während Phasen geringer Krankheitsaktivität inaktiv sind. Das Freisetzungssystem wird erst durch Entzündungsschübe aktiviert, die dann sofort durch die freigesetzten Zytokine unterdrückt werden. Dadurch könnte die dauerhafte Schädigung durch subklinische, chronische Entzündung verhindert und als Konsequenz die Hospitalisierungsrate gesenkt werden. In einer ersten Machbarkeitsstudie wurden in Kapitel 2 IL4-dekorierte Partikel mit dem Ziel entwickelt, eine langanhaltende und lokalisierte Zytokinaktivität zu gewährleisten. Dazu wurden IL4-Muteine erzeugt, bei denen das Lysin 42 mittels Erweiterung des genetischen Codes durch zwei verschiedene unnatürliche Aminosäuren ersetzt wurde, die jeweils eine für Klick-Chemie geeignete Seitenkette tragen. Die IL4-Muteine wurden ausführlich charakterisiert, um eine korrekte Faltung und volle Bioaktivität sicherzustellen. Beide Muteine zeigten zellstimulierende Fähigkeit und Bindungsaffinität an IL4-Rezeptor-alpha, die mit der von Wildtyp-IL4 vergleichbar ist. Anschließend wurde kupferkatalysierte (CuAAC) und kupferfreie (SPAAC) Azid-Alkin-Cycloaddition verwendet, um IL4 ortsspezifisch auf Agarosepartikeln zu verankern. Die Partikel waren in der Lage, die IL4-Aktivität über längere Zeit aufrecht zu erhalten, was durch TF-1-Zellproliferation und M2-Polarisation von M-CSF-generierten, humanen Makrophagen gezeigt werden konnte. Dieser Ansatz der ortsspezifischen Verankerung von IL4 auf Agarosepartikeln zeigt, dass zytokinfunktionalisierte Partikel anhaltende und räumlich kontrollierte, immunmodulierende Stimuli liefern können. Die Idee eines MMP-gesteuerten Zytokinfreisetzungssystems mit 24/7-Sensorik, das im Einleitungskapitel vorgestellt wurde, wurde in Kapitel 3 umgesetzt. Der natürliche Prozess der Zytokinspeicherung in der extrazellulären Matrix (EZM) wurde mithilfe einer injizierbaren IL4-Lösung zur enzymatischen Depotbildung durch kovalente Bindung an EZM-Komponenten, z. B. Fibronektin, simuliert. Nach der Bindung soll das Konstrukt durch Matrix-Metalloproteinasen (MMPs), die während Entzündungsschüben hochreguliert werden, aus der EZM freigesetzt werden können. Eine Peptidsequenz, die ein Protease-sensitives Verbindungsstück und eine Sequenz, mit der das Zytokin bei gleichzeitiger Injektion von aktivierter menschlicher Transglutaminase FXIIIa (TGase) kovalent auf der EZM immobilisiert wird enthält, wurde ortsspezifisch über eine unnatürliche Aminosäure an Position 42 von IL4 gekoppelt. Dadurch wurde die Bioaktivität von IL4 vollständig erhalten, während das Protease-sensitive Verbindungsstück auf MMPs reagierte und das Konstrukt durch TGase an das Fibronektin der EZM gebunden werden konnte. Die IL4-Peptid-Konjugate waren in einem Osteoarthritis-Modell bei Kaninchen in der Lage, die Entzündung des Kniegelenks zu verringern und den nicht-tragenden Knorpel sowie das vordere Kreuzband vor Degradation zu schützen. Dies ist der erste Schritt in Richtung einer minimalinvasiven Behandlung durch Verwendung von bioresponsiven Zytokindepots mit potenziellem klinischem Nutzen bei Entzündungserkrankungen. Eine der Herausforderungen bei diesem Vorgehen war die Herstellung der Zytokinkonjugate, wobei der Einbau der unnatürlichen Aminosäure in IL4 den größten Engpass darstellte. Deshalb wurde in Kapitel 4 eine vereinfachte Version dieses Depotsystems entworfen, indem das bifunktionelle Peptid über eine flexible Verbindungssequenz mit murinem IL4 genetisch fusioniert wurde. Während humanes IL4 bei C-terminaler Verlängerung an Aktivität verliert, ist murines IL4 durch die Modifikation nicht beeinflusst. Die murinen IL4-Fusionsproteine konnten in Gegenwart von TGase wirksam an in vitro generierte extrazelluläre Matrix gebunden werden. Darüber hinaus wurde das Protease-sensitive Verbindungsstück selektiv von MMPs erkannt und gespalten, wobei intaktes und aktives IL4 freigesetzt wurde, wenn auch mit einer langsameren Rate als erwartet. Murines IL4 bietet die Möglichkeit das bioresponsive Zytokindepot in den vielen verfügbaren Mausmodellen zu testen, was mit humanem IL4 aufgrund der Speziesselektivität nicht möglich ist. Für murines IL4 wurde die Entwicklung in Kapitel 5 auf die systemische Applikation ausgeweitet. Um die Serumhalbwertszeit zu erhöhen und eine Wirkstofflokalisation im entzündeten Gewebe zu erreichen, wurde eine murine IL4-Variante entwickelt, die mit einer Folat-tragenden PEG-Kette konjugiert wurde, um aktivierte M1 Makrophagen zu adressieren. Das bioaktive IL4-Konjugat wies eine hohe Serumstabilität auf und die PEGylierung erhöhte die Halbwertszeit in vivo auf 4 h. Allerdings konnte durch die Konjugation der Folatgruppe an IL4 die Wirkstofflokalisation in einem Mausmodell mit Antigen-induzierter Arthritis (AIA) nicht verbessert werden. IL4-PEG akkumulierte sich stärker im entzündeten Gelenk, während IL4-PEG-Folat eine stärkere Anreicherung in der Leber zeigte. Erfreulicherweise erleichtert der modulare Aufbau des IL4-Konjugats die bequeme Anpassung der PEG-Kettenlänge und der zielorientierten Einheit, um die Halbwertszeit und Lokalisierung des Zytokins weiter zu verbessern. Zusammenfassend beschreibt diese Arbeit eine Plattformtechnologie zur kontrollierten Freisetzung von Zytokinen als Reaktion auf Entzündungen. Durch die Beschränkung der Freisetzung des Therapeutikums auf den Ort der Entzündung kann das Nutzen-Risiko-Verhältnis dieser potenten Klasse von Biologika positiv beeinflusst werden. Zukünftige Forschungen werden dazu beitragen zu verstehen, wie Zytokin, Protease-sensitives Verbindungsstück und Immobilisierungsanhängsel oder etwaige zielorientierte Einheiten zur Bekämpfung verschiedener Krankheiten perfekt kombiniert werden können.