Neisseria gonowhoeae has evolved a repertoire of high-affinity iron acquisition systems to facilitate essential iron uptake in the human host. Acquisition of iron requires both the energy-harnessing cytoplasmic membrane protein, TonB, as well as specific outer membrane TonB-dependent transporters (TdTs). The overall goal of this study was to investigate the extra- and intracellular iron acquisition mechanisms of N. gonorrhoeae and determine the role of the TonB and TdTs in this process.The ability of gonococci to acquire potential exogenous iron sources was determined by plate bioassay. Gonococcal growth was promoted by various catecholate and hydromate siderophores; however, growth was not dependent upon TonB expression.As all previously characterized siderophore-iron uptake is dependent upon this protein, apotential TonB-bypass mechanism is suggested.The role of the Ton system and TdTs in gonococcal survival within human cervicalepithelial cells was also determined for two gonococcal strains, FA1090 and MS 1 1. Wedemonstrate that intracellular survival of both strains was dependent upon host cell ironacquisition, yet the expression of the Ton system was only critical to the survival ofFA1090. One characterized difference between these two strains is possession of thegonococcal genetic island (GGI) which is present in approximately 80% of gonococcalstrains. This study demonstrates that the GGI provides a mechanism to bypassintracellular TonB-dependent iron acquisition.In the strain lacking the genetic island, none of the characterized TdTs provided abenefit to the gonococcus when grown intracellularly. However, expression of oneuncharacterized TdT, TdfF, was necessary for successful intracellular survival. To ourknowledge, this is the first demonstration of a specific requirement for a single irontransporter in the survival of a bacterial pathogen within host epithelial cells.In the GGI-containing strain, TonB function was not critical to survival withincervical epithelial calls. The presence of the GGI was associated with the ability to bypass TonB-dependant uptake. Specifically, this bypass mechanism was mediated bycomponents of the T4S machinery encoded by the GGI, and replication was directlyrelated to iron acquisition. To our knowledge, this study provides the first direct linkbetween bacterial iron acquisition and a type IV secretion system.

Anaplasma phagocytophilum is an obligate intracellular bacterium that infects neutrophils to cause the emerging tick-transmitted disease, human granulocytic anaplasmosis (HGA). Following entry, the pathogen replicates within a host cell-derived vacuole that fails to mature along the endocytic pathway, does not acidify, and does not fuse with lysosomes. Selective fusogenicity is prototypical of many vacuole-adapted pathogens and has been attributed, at least in part, to pathogen modification of the vacuolar inclusion membrane and/or to selective recruitment or exclusion of host trafficking regulators. As a result, the A. phagocytophilum-occupied vacuolar membrane (AVM) provides a unique interface to study the host-pathogen interactions critical to A. phagocytophilum intracellular survival. Diverse vacuole-adapted pathogens; including Chlamydia, Legionella, and Salmonella; selectively recruit host Rab GTPases to their vacuolar membranes to establish replicative permissive niches within their host cells. Rab GTPases coordinate many aspects of endocytic and exocytic cargo delivery. We determined that the A. phagocytophilum-occupied vacuole (ApV) selectively recruits a subset of fluorescently-tagged Rabs that are predominantly associated with recycling endosomes. Another emerging theme among vacuole-adapted pathogens is the ability to hijack ubiquitin machinery to modulate host cellular processes. Mono- and polyubiquitination differentially dictate the subcellular localization, activity, and fate of protein substrates. Monoubiquitination directs membrane traffic from the plasma membrane to the endosome and has been shown to promote autophagy. We show that monoubiquitinated proteins decorate the AVM during infection of promyelocytic HL-60 cells, endothelial RF/6A cells, and to a lesser extent, embryonic tick ISE6 cells. Importantly, tetracycline treatment concomitantly promotes loss of the recycling endosome-associated GFP-Rabs and ubiquitinated proteins and acquisition of the late endosomal marker, Rab7, and lysosomal marker, LAMP-1, implicating bacterial-derived proteins in the ApV's altered fusogenicity. Therefore, we rationalized that A. phagocytophilum-encoded proteins that associate with the AVM may establish interactions with the host cell that are important for intracellular survival. By focusing on A. phagocytophilum proteins that are induced during host infection, we identified the first two bacterial-encoded proteins -- APH_1387 and APH_0032 -- that modify the AVM. Although functional studies are hindered by the lack of a system to genetically manipulate Anaplasma, the pathobiological roles of APH_1387 and APH_0032 are likely unique, as both proteins exhibit very little or no homology with any previously described protein. APH_1387 and APH_0032 are present at the cytoplasmic face of the AVM, therefore they likely interact with host proteins. We demonstrate that ectopic expression of APH_1387 and APH_0032 inhibits the ApV development in A. phagocytophilum infected cells. The results presented in this dissertation contribute to our understanding of how A. phagocytophilum modifies the vacuolar membrane in which it resides to establish a safe haven and evade lysosomal degradation.

Cardiac tissue slices, a rarely used pseudo two-dimensional preparation, have gained increasing popularity for applications such as drug testing over the last ten years as they combine ease of handling with patho-physiologically relevant cell-type representation, distribution and inter-connection. The most well-established methods to measure electrophysiology in cardiac tissue are sharp electrodes and multi-electrode-arrays, techniques which are limited in spatial resolution or signal content. In this work, we have applied dual voltage Ca²⁺ optical mapping on cardiac slices, allowing us to record these two key parameters simultaneously at high spatio-temporal resolution, yielding better visualisation of conduction waves, spatial dispersion in action potential (AP) characteristics, and intracellular Ca²⁺ transient (CaT). The slice preparation method and the measurement protocols were refined to yield good reproducibility. Data analysis routines were developed to extract relevant parameters reliably. Despite being a promising candidate for drug testing, little is known about how slice and intact whole-heart AP properties are interrelated, and how to scale-up from observations in two dimensions (2D) to the three dimensional (3D) heart. In this thesis, we present a method to compare directly AP properties of intact whole-heart and tissue slices, and show the extent to which slices preserve AP characteristics. We have explored the suitability of tissue slices as an experimental model to study stretch induced changes in AP and CaT. During axial stretch, a dynamic profile of both AP and CaT was observed with an initial shortening of both AP and CaT duration, followed by a gradual recovery/prolongation. We have also used tissue slices to study spatial heterogeneity of AP and CaT properties in the rabbit left ventricular free wall. A transmural gradient can be captured in CaT and AP (with the longest APD and CaT durations being captured in the subendocardium). No large AP prolongation was found in the mid-myocardium. We conclude that the cardiac tissue slice preparation preserves some key functional parameters of the whole heart and is a promising model to study cardiac electrophysiology.

A travers l'évolution, les agents pathogènes ont développé des stratégies leur permettant de survivre au sein de leur hôte en interférant avec la biogénèse des phagolysosomes. Comme C. burnetii vit dans un phagosome acide incapable de fusionner avec les lysosomes et que sa virulence est associée à l'expression de son LPS, nous avons étudié le rôle du LPS de C. burnetii dans le détournement de la conversion phagosomale. En effet, nous avons montré que C. burnetii virulent ainsi que son LPS se localisent dans des compartiments Lamp-1+ qui n'acquièrent pas la CathepsineD et Rab7 n'est pas recruté à leur surface. Contrairement au LPS du variant avirulent de C. burnetii, qui est localisé dans les lysosomes, le LPS de C. burnetii virulent (vLPS) n'induit pas l'activation de la MAPKinase p38, empêche le recrutement de Rab7 à la surface des compartiments en déstabilisant le complexe HOPS. Finalement, nous avons démontré que la bactérie virulente exprimant le vLPS détourne la conversion phagosomale pour survivre et pour se multiplier dans les macrophages en évitant l'activation de l'axe MAPK-p38/Vps41-HOPS. Nous avons également étudié les mécanismes permettant à Tropheryma whipplei, l'agent de la maladie de Whipple, de se répliquer dans les macrophages puisque les macrophages sont la cible in vivo de cette bactérie. Nous avons montré que T. whipplei bloque la conversion de son phagosome. / Through evolution, pathogens have developed strategies to survive within their host by interfering with the biogenesis of phagolysosomes. As it is known that C. burnetii lives in acidic phagosome which is unable to fuse with the lysosomes and that its virulence is associated with the expression of LPS, we studied the role of C. burnetii LPS in hijacking of phagosomal conversion. Indeed, we showed that the virulent C. burnetii and its LPS are located in Lamp-1+ compartments which do not acquire CathepsineD and Rab7 is not recruited to their surface. Contrary to LPS of avirulent C. burnetii, which is located in the lysosomes, the LPS of virulent C. burnetii (vLPS) does not induce activation of the p38 MAPKinase and it prevents the recruitment of Rab7 to the surface of compartments by destabilizing the HOPS complex. Finally, we demonstrated that virulent bacteria expressing virulent LPS hijack phagosomal conversion to survive and multiply in macrophages by preventing activation of p38-MAPK/Vps41HOPS axis. We also studied the mechanisms by which Tropheryma whipplei, the agent of Whipple's disease, replicates in macrophages, which are its target in vivo. We have shown that T. whipplei blocks the conversion of its phagosome. Indeed, after purification of phagosomes containing-T. whipplei, we observed by Western blot and confocal microscopy that T. whipplei survives in an immature phagosome with characteristics of both early and late phagosomes (presence of Rab5 and Rab7) making it unable to fuse with lysosomes. As the IL-16 is known to induce replication of T. whipplei, we studied the effect of this cytokine on the phagosome biogenesis of T. whipplei.

Les étapes précoces du cycle réplicatif du VIH-1 sont assistées par des cofacteurs cellulaires dont la nature et la fonction restent mal connues. Nos travaux ont caractérisé la contribution de la protéine kinase dépendante de l'AMP cyclique (PKA), dans la cellule cible ou incorporée dans la particule virale VIH-1, dans les étapes post-entrée du cycle réplicatif. Les virus dépourvus d'activité PKA se caractérisent par un défaut de la synthèse de l'ADN proviral. En absence de Nef, la perte d'activité PKA associée aux particules VIH-1 induit une baisse plus modérée du pouvoir infectieux. En outre, le contournement des voies d'entrée classiques, par l'utilisation de particules pseudotypées, rend l'infectiosité indépendante de l'activité PKA. L'action de PKA s'exercerait donc au sein de la particule VIH-1 assemblée et impliquerait à la fois la protéine Nef et les voies de transport des complexes de transcription inverse au cours des étapes post-entrée. De plus, l'inhibition de l'activité PKA dans les cellules cibles entraîne également un défaut de synthèse de l'ADN proviral. Nos résultats indiquent que PKA agit comme un cofacteur de la transcription inverse. / The nature and function of cellular factors involved in post-entry steps of the HIV-1 life cycle are still poorly understood. We highlighted the role of cAMP-dependent protein kinase (PKA) in the early step of viral cycle, either as a host cellular protein in infected cells or as an incorporated protein into HIV-1 particles. PKA-deficient viruses failed to synthesize proviral DNA. In the absence of Nef, the loss of PKA activity associated to HIV-1 particles induces a minor diminution of infectiousness. Accordingly, VSV-G pseudotyped viruses, that use alternate entry pathway, exhibit full infectivity regardless of PKA deficiency. PKA action could therefore take place in the assembled HIV-1 particles, implying Nef protein and intracellular pathways of reverse transcription complexes. Moreover, the inhibition of PKA activity in target cells engenders a defective proviral DNA synthesis. Taken together, our data suggest that PKA may act as a cofactor required for HIV-1 reverse transcription.

The objective of this Ph.D. study was to develop new and improved miniaturized particle-based optochemical sensors for the analysis of biological fluid and cellular components. This is highly important because current sensing systems can be biologically toxic and incompatible, invasive, and have limited responsiveness. To accomplish this goal we defined three tasks. The first was to develop lipobead-based sensors for chloride. The halide-specific fluorescence dye, lucigenin, was immobilized into the phospholipid membrane of the lipobeads to enable chloride ion detection. The fluorescence intensity of lucigenin decreases with increasing chloride ion concentration due to dynamic quenching. To stabilize the lipobeads we co-immobilized hexadecanesulfonate molecules into the phospholipid membrane. We also immobilized the chloride ionophore [9] mercuracarborand-3 (MC-3) into the lipobeads membrane. The study resulted in a unique submicrometric chloride ion sensor, which is suitable for chloride ion measurements in biological fluids. The second task was to develop for the first time lipobeadbased biosensors. Urea was chosen as a model substance since the urea/urease biosensing system is well known. Fluorescence sensing lipobeads were characterized by coating carboxylfunctionalized silica microspheres with phospholipids for the measurement of urea in aqueous samples. The enzyme urease and the pH indicator Fluorescein-5-thiosemicarbazide were attached covalently to the phospholipid membrane of the lipobeads. We prepared improved fluorescence sensing lipobeads by utilizing covalent chemistry to bind the phospholipid membrane to the silica particles and the fluorophores to the membrane. It led to improvement in the stability of the newly developed urea sensing lipobeads compared to previously developed micrometric fluorescence sensors. The final task of this study was to coat particle-based sensors with cell penetrating peptides to enable their permeation into cells. This step is essential for the use of particles as intracellular sensors. Streptavidin coated microspheres were modified by the strongest noncovalent interaction between avidin and biotin. Tat peptide and nonfluorescence indicator flubida were attached to the surface of the microspheres. These nanoparticles were delivered into MCF7 and Hela cancer cells for pH measurement. Before penetrating into the cells, flubida did fluoresce in cell medium; however it did not convert to fluorecein in Phosphate Buffered Saline (PBS) buffer.

Nanoobjekte werden als eines der meist untersuchten Forschungsgebiete unserer Zeit immer beliebter in der Industrie, da durch Variation ihrer Strukturen besondere Eigenschaften entlockt werden können, die bei makrokristallinen Kompositionen nicht auftreten. Doch mit Zunahme der Anwendungsbereiche steigt wiederum die Wahrscheinlichkeit einer hohen Exposition, was die toxikologischen Untersuchungen der letzten Jahre bedingte. Allerdings wurden dabei weniger die kausalen Zusammenhänge eruiert. In dieser Arbeit zeigt der Autor die Beziehungen zwischen ZnO-Toxizität und intrazellulärer Zn2+-Konzentrationen auf. Zu diesem Zweck erfolgten Zytotoxizitätsuntersuchungen mittels MTT-Test von ZnO-Nanopartikeln und ZnCl2. Dadurch konnten die toxischen Eigenschaften dieser Agenzien belegt werden. Sowohl Nanopartikel als auch Zn2+ weißen in äquivalenter Gesamtmasse dieselben Toxizitätswerte auf. Nachfolgend wurde die Toxizität I) der Partikel durch Chelatierung der Ionen und II) der freigesetzten Zn2+ durch Abzentrifugieren der Partikel untersucht. Hierbei zeigte sich eine deutlich niedrigere Toxizität der Partikel in Abwesenheit von Zn2+. Hingegen verursachten die partikelfreien Proben allein durch die freigesetzten Zn2+ durchaus vergleichbare Effekte wie die ZnO-Dispersion. Erwähnenswert ist, dass generell eine geringere Toxizität durch FKS-Zugabe vorhanden war. Im Weiteren wurde die intrazelluläre Zn2+-Konzentration in Abhängigkeit der Zinkexposition untersucht. Anhand der Markierung mit dem zinkspezifischen Fluorophor FluoZin-3 erfolgte die quantitative Zn2+-Bestimmung mittels Durchflusszytometrie. Dabei ergab sich ein signifikanter Anstieg der intrazellulären Zn2+-Konzentration, der eine einschneidende Störung der Zinkhomöostase darstellt. Bemerkenswert ist der Anstieg in vitalen Zellen auf ein Vielfaches der Ausgangkonzentration, wobei das Überschreiten von etwa 10 nM zum Übergang in die Nekrose führte. Unabhängig von äußeren Faktoren lagen bei gleichen Toxizitätswerten vergleichbare intrazelluläre Zn2+-Konzentrationen vor. Offenbar gibt es einen direkten Zusammenhang zwischen intrazellulären Zn2+ und der Toxizität. Dieser Sachverhalt kann zur Risikobewertung der Nanopartikel herangezogen werden.

L'expression intracellulaire des anticorps (intracorps) est une approche qui permet l'étude et le ciblage des antigènes dans les compartiments intracellulaires. Néanmoins, l'expression d'anticorps entiers fonctionnels dans les cellules reste une tâche difficile en raison de leur grande taille et de leur structure, l'environnement réducteur du milieu intracellulaire étant défavorable à la formation des ponts disulfure. Notre groupe a une forte expertise dans le domaine de l'immunisation intracellulaire et son application pour l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques. Pour cela, notre équipe a élaboré des banques de fragments d'anticorps scFv optimisés pour une meilleure expression intracellulaire. Nos travaux antérieurs ont démontré que ces intracorps peuvent cibler spécifiquement des domaines ou des modifications post-traductionnelles de protéines dans des cellules vivantes. Ceci est particulièrement important car il démontre l'un des avantages principaux des intracorps par rapport à l'approche basée sur l'ARNi. Cet avantage a été démontré par un criblage phénotypique dans un modèle d'allergie. En appliquant cette approche à l'étude de l'activation des mastocytes, nous avons pu identifier un nouvel acteur moléculaire impliqué dans la voie de signalisation mise en jeu. Ce travail a été protégé par un brevet européen en 2013 et est publié récemment. Dans le cadre de mon projet de thèse, j'ai construit une nouvelle banque synthétique (HUSCIv) optimisée pour la stabilité, la diversité et l'affinité des scFvs. Pour cela, le scFv 13R4 isolé dans notre équipe a servi de charpente pour le greffage des différentes boucles hypervariables, tout en respectant la diversité des régions CDR observée dans les anticorps naturels humains. Nous avons utilisé la protéine GFP en tant que rapporteur pour étudier le repliement et la solubilité des intracorps. Nos résultats ont clairement démontré que la plupart des intracorps issus de la banque HUSCIv sont soluble dans le cytoplasme des cellules mammifères. Mon projet de thèse décrit ici rapporte l'utilisation de la banque HUSCIv pour un criblage phénotypique dans des cellules de cancer colorectal portant une mutation du gène K-RAS et résistantes au traitement par l'anticorps chimérique Cetuximab. Le projet cherche à sélectionner des scFv capables de restaurer la sensibilité au Cetuximab, avec comme objectif l'identification des cibles intracellulaires impliquées.Pour ce criblage fonctionnel, la banque HUSCIv a été exprimée dans les cellules HCT116 par l'intermédiaire d'un système d'expression rétroviral. Le processus de sélection est basé sur la sélection directe de la prolifération des cellules en utilisant un colorant fluorescent (CMRA). Les cellules dont la prolifération est bloquée sont isolées et un séquençage à haut débit permet de suivre l'évolution des populations de scFv tout au long de l'expérience. Ainsi, ce projet a nécessité un séquençage profond d'un grand nombre de scFv afin de réaliser une analyse statistique. Nous avons réalisé à ce jour deux tours de sélection. Les tests de cytotoxicité réalisés sur les populations sélectionnées ont montré une inhibition significative de la prolifération en présence du Cetuximab d'environ 10%. Ces résultats indiquent l'évolution du phénotype qui tend vers une sélection de scFv inhibiteurs et suggèrent que nous devons réaliser au moins un ou plusieurs tours plus sélectifs avant de formuler des conclusions.L'approche introduite ici est différente de toutes les études existantes en ce qu'elle utilise des banques « naïves », et permet non seulement de répondre à la diversité du protéome, mais aussi d'étudier les messagers secondaires et le métabolisme des cellules. En tant que tel, et par rapport à d'autres approches à grande échelle, celle-ci représente une voie simple pour la découverte de molécules thérapeutiques potentielles. / Intracellular expression of antibodies (intrabodies) permitted the study and targeting of antigens in cellular compartments. However, the expression of functional intrabodies remains a difficult task due to their large size, structure, and the reducing intracellular environment. Our group has a strong expertise in the field of intracellular immunization and the identification of new therapeutic targets. For this purpose, we have developed an scFv library optimized for intracellular expression of scFv antibody fragments. Our previous works have shown the successful use of intrabodies for targeting specific domains or post-translational modifications in living cells. This is particularly important because it demonstrates one of the main advantages of intrabodies compared to the approaches using RNAi. This benefit was demonstrated by a phenotypic screen in a model of allergy. Applying this approach to the study of mast cell activation, we identified a new molecular player involved in the signaling pathway implemented. This work was protected by a European patent in 2013 and was recently published. As part of my thesis project, I designed a new synthetic library (HUSCIv) optimized for scFv stability, diversity and affinity. For this, a highly soluble and hyper-stable framework, scFv13R4 isolated in our group, was used as a scaffold for grafting different hypervariable loops, while respecting the diversity of CDRs observed in human natural antibodies. We used protein GFP as a reporter to study the folding and solubility of intrabodies. Our findings clearly demonstrated that most of the intrabodies from HUSCIv library are soluble in the cytoplasm of mammalian cells. My thesis project described here reports the use of HUSCIv in a phenotypic screen of colorectal cancer cells carrying a mutation in the K-RAS gene and resistant to the treatment with the chimeric antibody Cetuximab. The project seeks to select scFv fragments able to restore the sensitivity to Cetuximab, with the objective to identify the intracellular targets involved. For this functional screen, the HUSCIv library was expressed in HCT116 cells via a retroviral expression system. The selection process is based on the direct selection of cell proliferation using a fluorescent dye (CMRA). The cells whose proliferation is blocked are isolated and the evolution of scFv populations throughout the experiment are tracked via high-throughput sequencing. This sequencing requires a large number of scFvs to perform a statistical analysis. So far, we have achieved two rounds of selection. The cytotoxicity tests carried out on the selected populations showed a significant inhibition of proliferation (10%) in the presence of Cetuximab. These results indicate that the evolving phenotypes are tending towards a selection of scFv inhibitors and suggest that we need to perform at least one or more selective rounds before making conclusions. The approach introduced here is different from all existing studies in that it uses "naive" libraries not only to respond to the diversity of the proteome, but also to study secondary messengers and metabolism in cells. As such, and in comparison to other large-scale approaches, it is a simple way for the discovery of potential therapeutic molecules.

Une partie de ce travail de thèse a consisté à appliquer les méthodes de FISH pour l’étude de trois bactéries pathogènes intracellulaires. La viabilité de Bartonella henselae a été évaluée à partir de ganglions de patients atteints de la maladie des griffes du chat (CSD). Le faible taux d’ARN détecté par biologie moléculaire, la stérilité des cultures, l'absence de détection par analyses histologiques et FISH confirment que B. henselae n'est pas ou rarement viable dans les ganglions de patients atteints de CSD. Tropheryma whipplei, l’agent de la maladie de Whipple, a été identifié et localisé par FISH, dans les macrophages d’un ganglion et d’une biopsie pulmonaire, confirmant le diagnostic infectieux. Deux méthodes de FISH ont été testées pour détecter Coxiella burnetii dans des cas d’endocardites et d’infections vasculaires en utilisant des sondes oligonucléotidiques et des sondes PNA. Les résultats ont confirmé une meilleure efficacité des sondes PNA et démontré que les techniques de FISH sont plus sensibles que l’immunohistochimie pour le diagnostic des endocardites et des infections vasculaires à C. burnetii. Nous avons également évalué les stratégies moléculaires mises en place pour le diagnostic syndromique. Bien que la PCR conventionnelle à large spectre permette l'identification de micro-organismes fastidieux et anaérobies, la PCR spécifique en temps réel révèle une supériorité significative dans le diagnostic syndromique. En conclusion, ce travail a permis de démontrer l’efficacité et l’applicabilité de la FISH pour la détection bactérienne. Cette méthode peut être utilisée comme un outil complémentaire afin d'améliorer le diagnostic de microbiologie clinique. / We applied FISH methods to the study of three intracellular pathogenic bacteria. The viability of Bartonella henselae was evaluated in a large series of lymph nodes from patients with cat scratch disease (CSD). The results obtained, associated with sterile cultures and negative histological analyzes and FISH, as well as the low level of RNA detected by molecular biology, provide evidence that B. henselae are not or are rarely viable in the lymph nodes of patients with CSD. Tropheryma whipplei has been identified by FISH in macrophages from one lymph node and for the first time in a pulmonary biopsy, confirming the diagnosis of infection. Two methods of FISH have been tested to detect Coxiella burnetii in cases of endocarditis and vascular infections using oligonucleotide and PNA probes. The results attested to the greater efficiency of PNA probes, and demonstrated that FISH were applicable for the diagnosis of C. burnetii endocarditis. We also evaluated the molecular strategies used for syndrome-driven diagnosis of infectious diseases. Although conventional broad-spectrum PCR allows for the identification of fastidious and anaerobic microorganisms, real-time specific PCR reveals a significant superiority in syndrome-driven diagnosis. The addition of specific PCRs in real time PCR would improve our molecular strategies, for example, in the case of the detection of Staphylococcus aureus for the diagnosis of lymphadenopathy. In conclusion, this work demonstrates the effectiveness and applicability of FISH for the identification of intracellular bacteria. This method can be used as an important complementary tool to the improvement of clinical microbiological diagnosis.

La mycobactérie à croissance rapide Mycobacterium abscessus est un pathogène opportuniste de l’homme, particulièrement des poumons, capable de se multiplier au sein de macrophages (MФ) mais aussi d’amibes environnementales. Nous avons pu montrer que l’environnement amibien est propice à l’adaptation de M. abscessus à cette survie intramacrophagique. Par des analyses transcriptomiques comparant les adaptations de M. abscessus au sein d’amibes ou de MФ, nous observons des enrichissements de voies biologiques démontrant des adaptations au stress oxydatif et des adaptations métaboliques telle que la béta-oxydation des lipides et l’assimilation des sulfates. Ces adaptations ont également été observées chez Mycobacterium tuberculosis, mycobactérie pathogène pulmonaire stricte de l’homme responsable de la tuberculose. Parmi les gènes induits par M. abscessus au sein des amibes figurent des gènes impliqués dans le transport de polyamines, la biosynthèse du MoCo (molybdopterin cofactor) ainsi que l’assemblage des centres fer-soufre (Fe-S). L’induction de tels gènes, décrits comme des facteurs de virulence chez certaines bactéries intracellulaires, contribuerait à la virulence de M. abscessus en permettant sa survie intramacrophagique. Quarante-cinq gènes ont été identifiés comme fortement induits en amibes chez M. abscessus. Mycobacterium chelonae, appartenant au même complexe génomique que M. abscessus et responsable exclusivement d’infections cutanées, ne présente pas de telles inductions après analyse de son transcriptome intracellulaire, ce qui pourrait expliquer son absence de survie en MФ. Cinq opérons recouvrant 10 gènes ont été délétés au sein du génome de M. abscessus par recombinaison homologue. Ces gènes sont requis pour la survie de M. abscessus en amibes et en MФ. La surexpression chez M. chelonae de deux de ces gènes, MAB_1517c et MAB_2649, codant respectivement une protéine TcmP (tetracenomycin polyketide synthesis O-methyltransferase) et une MmpS (mycobacterial membrane protein small), a conféré une survie intra-macrophagique à M. chelonae, suggérant que l’induction de ces gènes en amibes favorise la survie intracellulaire de M. abscessus en MФ. Enfin, l’analyse du transcriptome de M. abscessus en MФ révèle des adaptations propres à la vie intramacrophagique. Différents gènes particulièrement induits sont impliqués dans le métabolisme de la proline, la sécrétion de protéine par le système de sécrétion de type II ou appartiennent la voie MEP (méthylérythritol phosphate), des voies biologiques contribuant à la virulence de pathogènes. De plus, parmi les gènes induits, certains correspondent à des activités de N-acétylation, d’oxydoréduction, de liaison à l’oxygène ou de détoxification de l’oxyde nitrique par des dioxygénases qui sont enrichies. Comparé à 5 autres opérons délétés, sélectionnés selon leur niveau d’induction et leur activité biologique, le gène eis2 (MAB_4532c), codant une N-acétyltransférase, est essentiel à la survie de M. abscessus en MФ.L’utilisation d’une approche complémentaire, le criblage d’une banque de mutants par transposition chez M. abscessus en amibes, a révélé le rôle essentiel du gène mmpl8 (mycobacterial membrane protein large 8) parmi la famille de protéines MmpL, impliquées dans le transport et/ou la synthèse de lipides mycobactériens. Chez M. abscessus, l’absence de production de cette protéine est corrélée à un défaut d’export d’un nouveau glycolipide (GDND, glycosyl diacetylated nonadecyl diol) et à un phénotype délétère pour la bactérie en MФ.En conclusion, notre travail a montré le rôle fondamental de l’amibe dans l’apprêtement de M. abscessus à la survie intramacrophagique. Trois gènes ayant fait l’objet d’études approfondies, mmpL8, eis2 ainsi que le gène eccB4 (MAB_3759c) mis en évidence par le crible amibien de la banque de mutants de transposition, participent à ce phénotype, confirmant le caractère pathogène de M. abscessus. / Mycobacterium abscessus is a rapidly growing mycobacterium, causing opportunistic infections in humans, and notably pulmonary infections. M. abscessus is able to multiply inside macrophages (MФ) and environmental amoebae. Here we demonstrate that M. abscessus undergoes adaptations in amoebae allowing its survival in MФ. Intracellular adaptations of M. abscessus to amoebae and MФ were assessed by RNAseq. We observed a significant enrichment of biological pathways reflecting adaptations to oxidative stress and metabolic adaptations illustrated by the consumption of fatty acids and activation of the sulfate assimilation pathway. These adaptations have been described in intramacrophagic Mycobacterium tuberculosis, a strictly pathogenic mycobacteria infecting the lung of humans and causing tuberculosis. Among the set of genes induced by M. abscessus during the amoebal co-culture are genes implicated in polyamine transport, MoCo (molybdopterin cofactor) biosynthesis and iron-sulfur (Fe-S) cluster assembly. The induction of such genes, described as virulence factors from intracellular bacteria, might enhance M. abscessus virulence and thus allow its survival in MФ. Forty-five genes are highly induced along the amoebal co-culture. In comparison, the amoebal co-culture with Mycobacterium chelonae, a mycobacterium that belongs to the same genomic complex as M. abscessus and causing solely extrapulmonary infections, does not elicit the same adaptations; potentially explaining M. chelonae inability to persist in macrophages. Five operons, representing a total of 10 genes, were deleted from M. abscessus genome by homologous recombineering. These genes are required for both M. abscessus survival in amoebae and MФ. Overexpression of two of these genes in M. chelonae, MAB_1517c and MAB_2649, encoding a TcmP (tetracenomycin polyketide synthesis O-methyltransferase) protein and an MmpS (mycobacterial membrane protein small) protein respectively, enhances M. chelonae survival in MФ, suggesting that the induction of these genes favors M. abscessus survival in MФ. Analyses of M. abscessus transcriptome in MФ also shed light on adaptations specific to the bacterium intramacrophagic life. Several genes highly induced in macrophages are implicated in biological pathways known to contribute to bacteria virulence, including proline metabolism, protein secretion by the type II secretion system and the MEP (methylerythritol phosphate) pathway. Among the set of induced genes selected according to their level of induction and their biological activity, N-acetylation and redox activities, bounding to oxygen and detoxification from nitric oxide by dioxygenases are significantly enriched. Among operons from this set of genes, it appears that M. abscessus eis2 gene (MAB_4542c), encoding a N-acetyltransferase, is essential for M. abscessus survival in MФ.In addition, a complementary approach to RNAseq, the screening of a transposon (Tn) mutant library of M. abscessus inside amoebae, revealed important roles of the mmpL8 gene encoding a mycobacterial membrane protein large belonging to a family of proteins implicated in lipid biosynthesis and export to the cell surface. When this protein was no longer produced by M. abscessus, a lower amount of a new glycolipd family (GDND, glycosyl diacetylated nonadecyl diol) was observed as well as a deleterious phenotype in MФ.To conclude, our work has shown a fundamental role of amoebae in triggering the virulence of M. abscessus, further allowing its survival in macrophages. Besides, three genes that have been studied more extensively – mmpL8, eis2 and eccB4 (revealed by the Tn library screening) – are required for M. abscessus survival in macrophages and confirmed its pathogenic behavior.