Apesar das evidências apontarem à participação da amilóide sérica A (SAA) em processos que favorecem a carcinogênese e metástase, associado à proposta da SAA como um marcador de progressão tumoral, não há ainda nenhum estudo avaliando a atividade direta da SAA em células tumorais. Este estudo examinou o efeito direto da SAA em duas linhagens de glioma humano. Gliomas são tumores cerebrais primários mais comuns em adultos e as linhagens deste estudo, A172 e T98G, representam carcinomas humanos caracterizados por um comportamento biológico altamente agressivo e quase sempre fatais, sendo classificados como grau IV. As linhagens A172 e T98G possuem algumas diferenças importantes em relação à invasividade; elas são respectivamente menos invasiva e mais invasiva. Para este estudo, avaliamos o efeito de SAA sobre a síntese de compostos representativos de algumas das diferentes classes de substâncias que estão envolvidas na progressão do tumor; entre elas estão a citocina IL-8, IL-6, TNF-α, a molécula mensageira NO, as metaloproteases, MMP2 e MMP9 e o gene RECK. Além disso, nos perguntamos se SAA pode estar envolvida nos processos de proliferação, migração e invasão celular. SAA induziu a produção de NO em ambas as linhagens de glioma. Em relação a IL-8 observamos que sua produção basal é bastante diferente dependendo da linhagem, sendo pouco produzida pela linhagem A172 que foi a única que respondeu à SAA. IL-6 e TNF-α não foram produzidas pelos gliomas quando estimulados com SAA. O tratamento das células com SAA aumentou a expressão das MMP-2 e MMP-9 e diminuiu a de RECK em ambas linhagens. SAA mostrou ser um estímulo mitogênico para os gliomas T98G e A172. SAA aumentou a migração e invasão da linhagem T98G e inibiu estes mesmos parâmetros nas células A172. SAA é constitutivamente expressa e produzida por ambas linhagens, sendo que a isoforma SAA1 é a predominante. A expressão gênica de todas as isoformas, SAA1, SAA2, SAA4, e a síntese protéica das SAA foram aumentadas pela adição de IFN-γ. Nossos resultados com base em ensaios in vitro suportam uma contribuição direta da SAA para a progressão e metástase do tumor, dependendo do tipo de célula e concentração da SAA. O fato de que IFN-γ é um indutor de SAA nos gliomas aponta que SAA pode exercer tanto um efeito intrácrino quanto autócrino ou parácrino nos tumores. / In spite of the evidences sustaining the participation of SAA in processes that favor carcinogenesis and metastasis, and the proposal of SAA as a marker of tumor progression, no studies have yet addressed a potential direct activity of SAA on tumor cells. This study examined the direct effect of SAA on two human glioma lineages. Gliomas are primary brain tumors more common in adults and the lineages of this study, A172 and T98G, represent human carcinomas characterized by a highly aggressive biological behaviour and almost always fatal, classified as grade IV. A172 and T98G have some important differences in the invasiveness, they are less invasive and more invasive, respectively. For this study, we evaluated the effect of SAA on the synthesis of compounds representing different classes of substances that are somehow involved in tumor progression, among them we can cite the cytokine IL-8, the messenger molecule NO, the metalloproteinases MMP2 and MMP9 and RECK gene. Furthermore, we wonder if SAA was involved in the processes of proliferation, migration and cell invasion. SAA stimulated the production of IL-8 in lineage A172, while T98G produced high amounts of IL-8 that were not modified by SAA addition. SAA did not stimulate the production of IL-6 and TNF-α. SAA induced the production of NO, increased the expression of MMP-2 and MPP-9 and decreased the regulator of the expression of the MMPs; gene RECK. Moreover, we observed that SAA was a mitogenic stimulus, but it had a dual effect on migration and invasiveness behavior depending on cell lineage. For T98G SAA increased migration and invasion, and for A172 SAA inhibited migration and invasion. SAA was constitutively expressed and produced by both strains, and the isoform SAA1 predominated. The gene expression of all isoforms, SAA1, SAA2, SAA4, and protein synthesis of SAA were increased by the addition of INF-γ. Our findings based on in vitro assays support a direct contribution of SAA to tumor development, progression and metastasis depending on the cell type and concentration of SAA. Besides the role of SAA on tumor growth during an acute phase, the fact that SAA was expressed in tumor cells suggests an intracrine or an autocrine action of SAA.

Células tumorais têm sua proliferação e mobilidade modificada por diversos fatores de crescimento, citocinas e mediadores inflamatórios, dentre os quais a amilóide sérica A (SAA). Estudos prévios do nosso grupo mostraram o efeito direto da SAA em processos de proliferação, migração e invasão de células de glioblastoma multiforme (GBM), A172 e T98G. Neste estudo nós complementamos resultados prévios de migração e invasão; avaliamos SAA como possível indutora de moléculas importantes para a invasividade do tumor, como as MMP-2 e -9 e ROS; realizamos ensaio clonogênico com a intenção de investigar uma possível contribuição da rSAA no estágio inicial de desenvolvimento do tumor; avaliamos o impacto da hipóxia na expressão dos diferente genes da SAA; estimulamos as células com indutores hepáticos clássicos da SAA e analisamos a possibilidade destes induzirem os diferentes genes da SAA em células tumorais; avaliamos possíveis receptores e vias de sinalizações envolvidas nos processos de proliferação, migração e invasão. Construímos knockdowns (KDs) dos genes da SAA de fase aguda (SAA1 e 2) e constitutiva (SAA4) e avaliamos a função de cada um deles para a morfologia e para os processos de proliferação, migração e invasão de GBM. Por fim investigamos SAA como possível biomarcadora de gliomas em amostras clínicas. Nossos resultados sugerem que rSAA afetou a atividade das MMP-2 e -9 e a produção de ROS em ambos GBM, mas não se mostrou clonogênica. As citocinas IL-6, TNF-α e IL-1β, mas não a hipóxia, foram capazes de induzir os diferentes genes da SAA. A adição de rSAA às culturas celulares estimulou a transrição dos diferentes genes da SAA, sugerindo a ativação de mecanismos intracelulares retroalimentados. Efeitos pró-tumorais da rSAA parecem ser viabilizados via RAGE, enquanto efeitos anti-tumorais parecem ser induzidos via TLR-4. Pela primeira vez mostramos que SAA induz aumento de RAGE. KDs da SAA inibiram proliferação, migração e invasão, sugerindo que SAA seja um produto tumoral importante para a manutenção do fenótipo invasivo de GBM. A adição de SAA exógena reverteu grande parte dos efeitos nas células T98G KD, enquanto células A172 KD responderam parcialmente à rSAA. KDs da SAA sugerem a mesma como mantenedora da morfologia das células de GBM. De maneira inédita mostramos que o gene SAA4 até então descrito como um gene constitutivo de função desconhecida é importante para a proliferação, migração e invasão de GBM. Nós especulamos que os efeitos diferenciados induzidos por rSAA nos GBM estejam associados à natureza multiligante da SAA e às diferenças genéticas dos GBM. Pacientes com GBM apresentaram aumento significativo na transcrição e expressão de SAA1 no tecido tumoral, bem como aumento sérico de SAA. A correlação na expressão de SAA1 com moléculas importantes para progressão tumoral, como CXCR4, CXCR7, CD163 e HIF-1α também a identificam como uma proteína associada à malignidade. / Tumor cells have their proliferation and migration modified by several growth factors, cytokines and inflammatory mediators, such as serum amyloid A (SAA). Previous studies from our group showed the direct effect of SAA on proliferation, migration and invasion of glioblastoma multiforme (GBM) cells, A172 and T98G. In this study we complemented previous migration and invasion data; evaluated SAA as possible inducer of MMP-2, -9 and ROS; performed clonogenic assay to investigate a possible contribution of rSAA in the early stage of tumor development; evaluated the impact of hypoxia on the expression of different genes of SAA; stimulated the cells with classics inducers of hepatic SAA and analyzed the possibility of these different genes to induce SAA in tumor cells; evaluated possible receptors and signaling pathways involved in proliferation, migration and invasion processes. SAA knockdowns (KDs) were made for acute phase (SAA1 and 2) and constitutive protein (SAA4) and evaluated their role in cell proliferation, migration, morfology and invasion. Finally it was investigated SAA as a possible biomarker of glioma grade in clinical samples. Our results suggest that rSAA affects MMP-2 and -9 activity and ROS production in both GBM, but did not affect clonogenicity. IL-6, TNF-α and IL-1β, but not hypoxia, were able to induce SAA expression. rSAA addition to cell cultures stimulated transcription of the three different SAA genes, suggesting the activation of intracellular feedback mechanisms. Pro-tumor effects of rSAA seem to occur via RAGE and anti-tumor effects appear to be induced via TLR-4. This was de first time that induction of RAGE triggered by rSAA was shown. Proliferation, migration and invasion were inhibited in SAA KDs, suggesting that SAA is an important tumoral product for the maintenance of the invasive phenotype of GBM. The addition of exogenous SAA largely reversed the effects on SAA KDs T98G cells, whereas SAA KDs A172 cells partially responded to the rSAA. The findings with SAA KDs suggest that SAA affect cell morphology. Another new contribution from our study was that SAA4, a constitutive gene with unknown function, was important for the proliferation, migration and invasion of GBM and it can be induced by rSAA, IL-6, TNF-α and IL-1β. We speculate that the different effects induced by rSAA in GBM are associated with the affinity of SAA to different receptors and the different genetic backgrounds of GBM. Patients with GBM showed a significant increase in the transcription and expression of SAA1 in tumor tissue as well as increased serum SAA. The correlation between the expression of SAA1 with important molecules for tumor progression, such as CXCR4, CXCR7, CD163 and HIF-1α also identified SAA as a protein associated with malignancy.

O gene ADAM23 está epigeneticamente silenciado em tumores de mama de estágios mais avançados e o seu silenciamento nesses tumores confere ao paciente um maior risco de desenvolvimento de metástases e um pior prognóstico. O silenciamento do gene ADAM23 na linhagem tumoral de mama MDA-MB-435 reduz a capacidade proliferativa e aumenta a capacidade migratória e invasiva das células em modelo tridimensional de cultura. No entanto, paradoxalmente, o silenciamento do gene ADAM23 nessa linhagem reduz a capacidade tumorigênica e metastática das células em ensaios in vivo utilizando animais imunodeficientes. Ensaios subsequentes utilizando misturas de células positivas e negativas para a expressão de ADAM23 revelaram que as células negativas estimulam a proliferação, migração e invasão das células positivas e que a heterogeneidade tumoral em relação à expressão de ADAM23 é importante para a disseminação e colonização metastática. Este trabalho teve como objetivo validar a associação entre o silenciamento do gene ADAM23 em tumores primários e a progressão tumoral, e também encontrar um modelo celular alternativo para a realização de ensaios funcionais que comprovassem o papel do gene ADAM23 na proliferação, migração, e invasão celular, bem como a existência de interação celular entre células ADAM23 positivas e negativas. A análise da expressão do gene ADAM23 em amostras de gliomas de diferentes estágios através de PCR em Tempo Real revelou que a expressão desse gene diminui ao longo da progressão tumoral e está bastante reduzida em tumores de grau avançado. Porém, ao contrário do observado em tumores de mama, o silenciamento do gene ADAM23 em gliomas não é causado por hipermetilação de sua região promotora nem por mutações em sua região codificante, ou perda de heterozigose. Infelizmente, não foi possível selecionar clones derivados da linhagem celular de glioblastoma U87MG com silenciamento estável do gene ADAM23 para a realização de ensaios funcionais. Aparentemente, o silenciamento de ADAM23 nessa linhagem resulta na parada do ciclo celular na fase G0/G1, impedindo a seleção de clones com silenciamento estável do gene. O mesmo fenômeno não foi observado na linhagem de melanoma SKmel-37, permitindo a seleção de clones com silenciamento estável de ADAM23 e a realização de ensaios funcionais. Curvas de proliferação em monocamada e ensaios de incorporação de MTT em modelo tridimensional in vitro demonstraram que o silencimento de ADAM23 na linhagem SKmel-37 diminui sua taxa de proliferação em 20-50%. Ensaios de citometria de fluxo demonstraram que o silenciamento de ADAM23 interfere na expressão das integrinas αvβ3 e αvβ5 na membrana celular, resultando em diminuição de 50% na afinidade aos ligantes de matriz e aumento significativo na capacidade de migração e invasão no colágeno. Ensaios in vitro e in vivo utilizando misturas de células SKmel-37 ADAM23 positivas e negativas também confirmaram a existência de interação entre os dois subtipos celulares. Ensaios in vitro de migração e invasão no colágeno revelaram que células ADAM23 negativas induzem a migração e a invasão de células positivas e, em ensaios de tumorigienese in vivo, observamos que os tumores formados a partir da injeção de uma mistura de células positivas e negativas apresentam crescimento semelhante ao dos tumores formados a partir da injeção de células ADAM23 positivas. / The ADAM23 gene is epigenetically silenced in breast tumors of more advanced stages and its silencing in these tumors gives the patient a greater risk of developing metastasis and a worse prognosis. The ADAM23 gene silencing in the MDA-MB-435 breast tumor cell line reduces the proliferative capacity and increases migratory and invasive abilities of cells in three-dimensional culture models. Yet, paradoxically, the ADAM23 gene silencing in this line reduces tumorigenic and metastatic abilities of cells in in vivo assays using immunodeficient animals. Subsequent tests using ADAM23 positive and negative cells mixtures revealed that negative cells stimulate proliferation, migration and invasion of positive cells and the heterogeneity of ADAM23 expression in tumors is important for the spreading and metastatic colonization. This study aimed to validate the association between ADAM23 gene silencing in primary tumors and tumor progression as well as find an alternative cellular model for performing functional tests to prove the role of the ADAM23 gene in proliferation, migration and cell invasion, and to prove the existence of cell interaction between ADAM23 positive and negative cells. The analysis of ADAM23 gene expression in samples from different stages of gliomas by RT-PCR revealed that the expression of this gene decreases over tumor progression and is greatly reduced in tumors of advanced degree. However, unlike that observed in breast tumors, the ADAM23 gene silencing in gliomas is not caused by hypermethylation of its promoter region or by mutations in its coding region, or by loss of heterozygosity. Unfortunately, it was not possible to select clones derived from the U87MG glioblastoma cell line with stable silencing of the gene ADAM23 for the functional testing. Apparently, the silencing of ADAM23 in this cell line results in cell cycle arrest in G0/G1 phase, preventing the selection of clones with stable gene silencing. The same phenomenon was not observed in SKmel-37 melanoma cell line, allowing selection of clones with stable silencing of ADAM23 and functional testing. Monolayer proliferation curves and in vitro MTT incorporation assays in three-dimensional models showed that ADAM23 silencing in the SKmel-37 cell line reduces their rate of proliferation by 20-50%. Flow cytometry assays demonstrated that ADAM23 silencing interferes with the expression of αvβ3 and αvβ5 integrins in the cell membrane, resulting in a 50% decrease in binding afinity to the matrix and a significant increase in migratory and invasive abilities on collagen. In vitro and in vivo assays using ADAM23 positive and negative SKmel-37 cell mixtures also confirmed the existence of interaction between the two cell subsets. In vitro invasion and migration on collagen assays revealed that ADAM23 negative cells induce migration and invasion of positive cells. Furthermore, in in vivo tumorigenic tests we found that tumors formed from injection of a mixture of positive and negative cells exhibit growth similar to the tumors formed after injection of ADAM23 positive cells.

Made available in DSpace on 2014-07-29T16:21:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rodrigo Carvalho.pdf: 354139 bytes, checksum: 4f557de5909b41993211b240c60d40cd (MD5) Previous issue date: 2009-06-05 / Biological invasions has been a major threat to whole biomes around the world, affecting communities and ecossistems with consequences to the trophic web. At the same time it is a huge biogeographical experiment that allows the formulation of hypotheses about the rules for communitie assembly. This study tested the hypothesis that the level of phylogenetic relationship is positively correlated with the magnitude of competitive interactions, being stronger for closer species. We used two exotic African species (Panicum maximum and Andropogon gayanus) and a native of South America (Paspalum atratum-focal species) in a partial additive design for the mix of native-exotic, with an increase in density of the exotic. The results showed greater competitive effect on the focal species when in the presence of P. maximum (closer to the focal), suggesting that predictions can be made on potential invasive species based on the Darwin s Naturalization Hypothesys. / Invasões biológicas são atualmente umas das mais graves ameaças aos ecossistemas. Suas consequências estendem-se por toda a cadeia trófica, atingindo também comunidades e ecossistemas, com altos custos estimados para ações mitigadoras. Ao mesmo tempo revela-se um imenso experimento biogeográfico que possibilita a formulação de hipóteses sobre regras de assembléia de comunidades. Este trabalho testou a hipótese de que o nível de relação filogenética esta positivamente associado com a magnitude da interação competitiva, sendo maior para espécies mais aparentadas. Foram utilizadas duas espécies exóticas africanas (Panicum maximum e Andropogon gayanus) e uma nativa da América do Sul (Paspalum atratum-espécie focal) em um delineamento aditivo parcial para a combinação exótica-nativa, com aumento na densidade da espécie exótica. Os resultados mostraram maior efeito competitivo sobre a espécie focal quando na presença de P. maximum (mais próxima à focal), o que sugere que podem ser feitas predições sobre potenciais espécies invasoras com base na Hipótese de Naturalização de Darwin.

Neospora caninum (Apicomplexa) é o agente causador da neosporose, descrita como a principal causa de aborto parasitário em gado bovino .Parasitos desse filo interagem e invadem as células hospedeiras através da secreção coordenada de proteínas do complexo apical, formado por diversas organelas, dentre elas as roptrias (ROPs), que desempenham papel fundamental no processo de infecção, associado à formação do vacúolo parasitóforo (PV), sobrevivência no ambiente intracelular e virulência do parasito. Essas proteínas podem ser caracterizadas em: proteínas de roptrias de pescoço (RONs), e proteínas de roptrias (ROPs). Além disso, algumas ROPs podem se diferenciar e, dessa maneira, constituem uma grande família de quinases e pseudo-quinases, denominada família de roptrias quinase (ROPKs). O objetivo deste estudo foi caracterizar as proteínas de roptrias NcROP15B (NcLIV_011700) e NcROP55 (NcLIV_031550) de N. caninum. As sequências de NcROP15B e NcROP55 foram alinhadas com homólogos de alguns microrganismos, incluindo apicomplexas, ao BLAST. NcROP15B apresentou identidade de 19% com as sequencias de ROP15 de T. gondii e Hammondia hammondi. NcROP55 mostrou identidade de 14% com a ROP37 de T. gondii e com ROP28 de Hammondia hammondi, e 15% com a ROP28 de Neospora caninum. Foram detectados domínios pertencentes à família de proteínas quinase para NcROP15B e NcROP55, e peptídeo sinal apenas para NcROP15B. Os primers foram delineados para amplificar regiões de cDNA de ambos os genes com diferentes tamanhos, denominados NcROP15B maior, NcROP15B menor, NcROP55 maior e NcROP55 menor. Os insertos foram subclonados (pGEM) e posteriormente ligados em plasmídeo de expressão pET28 em E. coli BL21(DE3) e a expressão recombinante induzida por IPTG. As formas recombinantes foram expressas com 30 kDa e 16 kDa (NcROP15B fragmento Maior e Menor, respectivamente) e NcROP55 Maior e Menor gerou um peso molecular de 19.9 kDa e 15 kDa, respectivamente. Após purificação, NcROP15B e NcROP55 foram utilizadas para obtenção de soros policlonais. Anti-ROP15B e anti-ROP55 reagiram com extrato de N. caninum em Western Blot 1D, tendo NcROP15B sido detectada com 35 kDa, próximo ao predito (32 kDa) e NcROP55 com aproximadamente 35 KDa, porém abaixo do predito (47.9 kDa). Na imunofluorescência confocal, NcROP-15B e NcROP55 exibiram padrão de localização na região perinuclear de taquizoítos de N. caninum. Os anticorpos anti-NcROP15B e anti-NcROP55 apresentaram, individualmente, capacidade limitada para inibir o processo de adesão/invasão de N. caninum, sendo 16% e 6,43% respectivamente. Quando os soros anti-NcROP15B e anti-NcROP55 foram associados, a a inibição da invasão aumentou para 62%. As proteínas NcROP-15B e NcROP55 podem representar quinases importantes no metabolismo de N. caninum, e podem estar relacionadas ao processo de invasão e proliferação do parasito. Dessa maneira, são possíveis alvos para se considerar no estudo de medidas preventivas, sendo necessários mais estudos para avaliar suas funções na sobrevivência intracelular e virulência de N. caninum. / Neospora caninum (Apicomplexa) is the causative agent of neosporosis, described as the main responsible of parasitic abortion in cattle. Parasites of this phylum interact and invade the host cells through a coordinated secretion of proteins of the apical complex, formed by organelles like rhoptries, which play a key role in the infection process, associated to the formation of the parasitophorous vacuole (PV), intracellular survival and parasite virulence. These proteins can be characterized in: neck rhoptry proteins (RONs), and rhoptry proteins (ROPs). Some ROPs can differentiate and thus constitute a large family of kinases and pseudo-kinases, called the kinase rhoptry family (ROPKs). The aim of this study was to characterize N. caninum NcROP15B (NcLIV_011700) and NcROP55 (NcLIV_031550) rhoptry proteins. The amino acid sequences of NcROP15B and NcROP55 were aligned with homologous proteins from some microorganisms, including apicomplexan on BLAST. NcROP15B showed a 19% identity with the ROP15 of T. gondii and Hammondia hammondi. NcROP55 had 14% of identity with ROP37 of T. gondii and with ROP28 of Hammondia hammondi, and 15% with ROP28 of Neospora caninum. Domains were detected belonging to the protein kinase family for NcROP15B and NcROP55, and signal peptide only for NcROP15B. Primers were designed to amplify cDNA regions of both genes, opting for fragments of different sizes, names as NcROP15B major, NcROP15B minor, NcROP55 major and NcROP55 minor. The inserts were subcloned (pGEM) and then ligated into pET28 expression plasmid in E. coli BL21 (DE3) and IPTG-induced recombinant expression. The recombinant forms were expressed with 30 kDa and 16 kDa (NcROP15B Major and Minor, respectively) and Major and Minor NcROP55 had molecular weights of 19.9 kDa and 15 kDa, respectively. After purification, NcROP15B and NcROP55 were used to obtain polyclonal serum. Anti-ROP15B and anti-ROP55 reacted with N. caninum extract in Western Blot 1D, with NcROP15B being detected at 35 kDa, near predicted (32 kDa) and NcROP55 at approximately 35 KDa, but below the predicted (47.9 kDa). At confocal immunofluorescence, NcROP-15B and NcROP55 exhibited a localization pattern at the perinuclear region of N. caninum tachyzoites. Anti-NcROP15B and anti-NcROP55 antibodies had, individually, limited ability to inhibit the N. caninum adhesion/invasion process (16 and 6,43%, respectively). When associated, anti-NcROP15B and anti-NcROP55 sera inhibition of invasion increased to 62%. NcROP-15B and NcROP55 proteins might represent important kinases in the metabolism of N. caninum with a possible role in the parasite invasion and proliferation process. Thus, they represent possible targets for preventive measures, but further studies are necessary to evaluate their functions in intracellular survival and virulence of N. caninum.

O câncer colorretal (CCR) é o terceiro tipo de câncer mais comum no mundo. Apesar dos avanços nos tratamentos convencionais, aproximadamente dois terços dos pacientes com CCR são submetidos à cirurgia potencialmente curativa. Entretanto, grande parte desses pacientes evolui mal, apresentando recidivas e/ou metástases. A busca de novos alvos moleculares para a terapia do CCR revelou a proteína celular Prion (PrPC) como um possível candidato. Trabalhos recentes sugerem participação direta ou indireta de PrPC no crescimento de tumores, na formação de metástases, na composição de complexos multiproteicos e na indução de vias de sinalização envolvidas em diversos processos biológicos, como proliferação. Além disso, PrPC foi descrito como um importante modulador do crescimento de tumor colorretal. Resultados prévios mostraram que a interação da proteína PrPC com a proteína HSP70/HSP90 Organizing Protein (HOP) induz proliferação em glioblastomas. HOP é uma proteína predominantemente citoplasmática, podendo também ser secretada associada às vesículas extracelulares. Assim, o presente estudo objetivou avaliar o papel do complexo PrPC-HOP e das vesículas extracelulares no desenvolvimento e progressão dos tumores colorretais. Os nossos resultados mostram que HOP induziu migração e invasão em linhagens de CCR de maneira dependente de PrPC, uma vez que o uso do peptídeo sem atividade que compete pelo sítio ligação de HOP a PrPC inibiu estes processos. Além disso, nossos dados apontaram que o aumento de migração e invasão das células de CCR induzida pela interação PrPC-HOP é mediada pela ativação da via ERK1/2. Os achados in vitro estimularam a avaliação do perfil de expressão de PrPC e HOP por imuno-histoquímica em tecidos de pacientes com diferentes tipos de tumores colorretais. Nossos resultados sugeriram que essas proteínas são importantes no início do desenvolvimento tumoral e na transição de adenomas para adenocarcinomas, não havendo correlação entre a presença de HOP e/ou PrPC com metástase, linfonodos acometidos, estadiamento, sobrevida ou região tumoral versus tecido normal. Em relação ao papel das vesículas extracelulares na progressão dos tumores colorretais, nossos resultados mostraram que linhagens celulares que apresentam padrões parecidos de agressividade tumoral podem ter perfis de secreção de proteínas e vesículas extracelulares bastante diferentes, induzindo, portanto, processos biológicos com intensidades distintas. O meio condicionado e as vesículas extracelulares da linhagem WiDr apresentaram maior potencial de indução de migração quando comparado com a linhagem HCT8. Além disso, a modulação negativa da proteína VPS4, uma das responsáveis pela formação dos corpos multivesiculares, mostrou-se uma abordagem interessante no estudo da secreção de vesículas por células de CCR, uma vez que o dominante negativo de VPS4 promoveu diminuição do cargo proteico e da secreção de vesículas extracelulares, redução da proliferação celular e do efeito indutor do processo de migração na linhagem WiDr. Assim, em conjunto, o presente trabalho indicou que o complexo PrPC-HOP pode ser um bom alvo terapêutico nos processos de migração e invasão em CCR. Ainda, essas proteínas se mostraram importantes nos estágios iniciais da formação dos tumores. A modulação da secreção de vesículas extracelulares pode contribuir para retardar a progressão dos tumores colorretais. / Colorectal cancer (CRC) is the third most common type of cancer in the world. Despite improvements in conventional treatments, approximately two-thirds of CRC patients undergo potentially curative surgery. However, most of these patients evolve poorly, showing recurrence and/or metastasis. Search of new molecular targets for CRC therapy revealed the cellular protein Prion (PrPC) as a putative candidate. Recent studies have shown that PrPC exhibit direct or indirect participation in tumor growth, formation of metastasis, composition of multiprotein complexes and induction of signaling pathways involved in many biological processes such as proliferation. Moreover, PrPC has been described as an important modulator of colorectal tumor growth. Previous findings showed that the interaction between PrPC and its ligand HSP70/90 heat shock organizing protein (HOP) induces gliobastoma proliferation. It is well known that HOP localizes mainly in the cytoplasm but HOP is also secreted associated with extracellular vesicles. In this way, the present study sought to evaluate the role of PrPC-HOP complex and extracellular vesicles in the development and progression of CRC. We demonstrate that HOP induces the migration and invasion of CRC cell lines in a PrPC-dependent manner because the use of HOP peptide, which is able to bind to PrPC, blocking PrPC-HOP complex formation, inhibited the migration and invasion processes. In addition, our data showed that the enhancement of migration and invasion induced by PrPC-HOP interaction is mediated by ERK1/2 pathway activation. These in vitro results lead us to evaluate the PrPC and HOP expression by immunohistochemistry in tissues from patients with different tumor types. Our data showed that these proteins could be important for the initial steps of tumor development, represented by the transition from adenoma to adenocarcinoma. No correlation was found among HOP and/or PrPC expression and metastasis, lymph node involvement, staging, survival or tumor area versus normal tissue. Regarding the role of extracellular vesicles in the progression of colorectal tumors, our results showed that cell lines exhibiting similar aggressive tumor behavior can have a different protein secretion pattern and a distinct profile of extracellular vesicles release, which could induce biological process with different intensities. The conditioned medium and the extracellular vesicles derived from WiDr cell line showed a higher potential to induce migration than HCT8 cell line. Moreover, the negative modulation of VPS4, one of the proteins responsible for multivesicular body formation, showed to be an interesting approach in the study of extracellular vesicles secretion secreted by CRC cells; the negative dominant of VPS4 promoted in the WiDr cell line a reduction in the protein cargo and secretion of the extracellular vesicles, a decrease of cell proliferation and induction of migration process. Therefore, taken together, our data highlights that PrPC-HOP complex can be considered a new therapeutic target in migration and invasion processes of CRC. Moreover, these proteins appeared to be important at onset of tumor formation. The modulation of extracellular vesicles secretion may contribute for delaying the progression of colorectal tumors.

Os pacientes com melanomas, em geral, apresentam extrema quimiorresistência e prognóstico ruim, com taxa de sobrevida de aproximadamente seis meses; portanto, novas estratégias terapêuticas são necessárias. As células deste tipo de tumor acumulam alterações na expressão gênica que contribuem para a proliferação descontrolada, evasão de senescência e inibição de morte celular em múltiplas rotas intracelulares. No Capítulo 1, foi explorado o controle epigenético do supressor tumoral RECK. Esse gene é largamente expresso em tecidos normais, com correlação de sua expressão com melhor prognóstico. Em tumores, RECK é inibido, incluindo em melanoma. Neste estudo, sua inibição por hipermetilação do promotor e remodelamento da cromatina por HDACs não foi o único fator inibitório nas linhagens de melanoma analisadas. Mesmo após a utilização a remoção de marcas epigenéticas associadas ao silenciamento gênico, a expressão proteica não pôde ser recuperada nas linhagens utilizadas neste trabalho. No Capítulo 2, isolou-se subpopulações clonais ao acaso a fim de modelar a heterogeneidade tumoral intrínseca. Neste modelo experimental, caracterizamos a presença de dois perfis tumorais subclonais: uma mais proliferativa, invasiva e sensível a vemurafenibe; e outra menos proliferativa, mais resistente e com maior expressão de RECK e fatores ligados a EMT. Nossos resultados, em conjunto, mostraram que as linhagens celulares parentais utilizadas apresentam diferenças entre si quanto à viabilidade celular, indução de apoptose e fosforilação de ERK após o tratamento com vemurafenibe. Segundo o nosso modelo, a resistência intrínseca ao vemurafenibe está presente e reflete a heterogeneidade do tumor inicial. Com estes resultados, pretendemos contribuir para o conhecimento sobre a composição clonal presente na heterogeneidade tumoral, além de contribuir para a função de RECK na biologia do melanoma. / Patients with melanoma often present extreme chemoresistance and poor prognosis, with survival rates of approximately six months; therefore, new therapeutic strategies are necessary. Melanoma cells accumulate genotypic changes that contribute to uncontrolled proliferation, evasion of senescence and cell death inhibition in multiple cellular pathways. In Chapter 1, we have explored the epigenetic control of the tumor suppressor RECK. This gene is widely expressed in normal tissues, with correlation of its expression with better prognosis. In tumors, RECK is inhibited, including melanoma. Here, RECK inhibition by promoter hypermethylation and chromatin remodeling by HDACs was not the only inhibiting factor in the melanoma cell lines analyzed. Even after removing the epigenetic marks associated to gene expression silencing, the protein expression could not be recovered in the cell lines used in this study. In Chapter 2, it has been isolated several tumor clonal subpopulations in order to modulate the intrinsic tumor heterogeneity. In this experimental model, we have characterized the presence of two tumor subclonal profiles: a more proliferative, invasive and sensitive to Vemurafenib; and other less proliferative, less sensitive to Vemurafenib and presenting more expression of RECK and factors associated to EMT. Our results together have showed the parental cell lines used here differed from each other in terms of cell viability, induction of apoptosis, and ERK phosphorylation after treatment with Vemurafenib. According to our model, the intrinsic resistance to Vemurafenib is present and reflects the heterogeneity of the initial tumor. With these results, we intend to contribute to the knowledge of the tumor clonal subpopulations composition in tumor heterogeneity, and contributes to the RECK function in melanoma biology.

O sucesso da gestação depende da adequada comunicação materno-fetal, que em algumas espécies têm um contato mais íntimo devido à capacidade migratória de populações de células trofoblásticas. Nos bovinos esse mecanismo é realizado pelas células trofoblásticas gigantes (CTGs), com invasão limitada até a lâmina basal do epitélio materno. Apesar dessa leve invasão das CTGs, é possível encontrar células fetais circulantes no sangue periférico da vaca gestante, levando ao microquimerismo fetal. Além de toda uma sinalização local e sistêmica e mudanças conformacionais, a migração das CTGs também é dependente da tolerância imunológica do epitélio materno que possui uma baixa expressão de MHC de classe I. Em contrapartida, o trofoblasto expressa MHC de classe Ib para impedir a ativação das células natural killers uterinas (uNK) contra ele mesmo. Neste contexto, o objetivo desse trabalho foi estudar a ocorrência e contribuir para o entendimento dos mecanismos da migração celular na placenta bovina, com marcadores exclusivos do cromossomo Y e de um modelo de clone transgênico expressando a proteína GFP. A hipótese testada foi que o microquimerismo fetal observado mediante a detecção do gene TSPY no sangue periférico da vaca gestante de embrião macho, e de GFP nos tecidos placentários maternos, associado à expressão de MHC classe 1b (Qa2) na interface materno-fetal. Para tanto, 153 embriões produzidos por fertilização in vitro (FIV) foram transferidos, resultando em 34 embriões machos e 31 fêmeas no dia 62 de gestação, quando foi realizada a coleta de sangue periférico da receptora. Dentre estas gestações, foram selecionadas de 25 machos, 4 fêmeas e 5 perdas gestacionais (confirmadas no D39 por ultrassonografia) para detecção de TSPY. Também foram produzidas gestações de clones transgênicos, expressando GFP com 30, 60 e 90 dias que foram utilizadas para a detecção de mRNA e a proteína GFP. Nas gestações de FIV 60% dos embriões machos, 50% das fêmeas e 40% das perdas gestacionais foram positivos para TSPY. A detecção de TSPY nas gestações de fêmeas possivelmente é resultante da persistência do microquimerismo de gestações anteriores. Nas gestações de clones transgênicos, observou-se a presença de mRNA e proteína GFP no endométrio, também indicando migração nesta região ou o transporte da GFP, e outros conteúdos do trofoblasto, para o epitélio materno. Nos placentônios, usando anticorpo anti-GFP pode-se ver a marcação positiva tanto no trofoblasto como no epitélio materno, possivelmente decorrente de liberação das CTGs no estroma endometrial após a fusão. As CTGs, quando em formação sincicial, têm a sua expressão de GFP diminuída, o que também foi observado, utilizando-se anticorpo anti-Qa2 (antígeno murino para MHC classe Ib). O epitélio materno e o trofoblástico também foram marcados para Qa2. Mediante as técnicas utilizadas, observamos que o microquimerismo pôde ser identificado nas gestações analisadas com o uso dos marcadores TSPY no sangue e o GFP nos tecidos placentários maternos. Este estudo mostra que na placenta bovina ocorre uma migração de células fetais além do epitélio materno e abre novas perspectivas para estudos das características da interação materno-fetal ainda pouco explorada nos bovinos. / The pregnancy success depends of adequate materno-fetal communication, that in some species are have a more intimate contact due migratory capacity of trophoblastic cells populations. In bovines, this mechanism is realized by trophoblast giant cells (TGC) with limited invasion until basal lamina of maternal epithelium. Besides this light invasion of TGCs, is possible to encounter circulate fetal cells in peripheral blood of pregnant cow, leading to fetal microchimerism. Beyond local and systemic sinalization and conformational changes, TGC migration is also dependent of immunologic tolerance of maternal epithelium that possess a downregulation of classe I MHC. In complement, the trophoblast express classe Ib MHC to inhibit natural killers cells activation. In this context, the objective of this work was to study the occurrence and contribute for knowledge cellular migration mechanisms in bovine palcenta, with Y-specific markers and a model of transgenic clone expressing GFP. The tested hypothesis was that fetal microchimerism observed by detection od TSPY gene in peripheral blood of cow pregnant of male embryo, and of GFP in maternal placental tissues associated by expression of class Ib MHC (Qa2) in materno-fetal interface. For this, 153 embryos produced by in vitro fertilization (IVF) were trasnfered, resulting in 34 male embryos and 31 female in day 62 of pregnancy, when recipient peripheral blood was collected. Among these pregnancies, 25 males, 4 females and 5 pregnancy losses (confirmed at 39 days of pregnancy by ultrassonography) was selected for TSPY detection. Also were produced pregnancies of transgenic cloned, embryos expressing GFP, with 30, 60 and 90 days of pregnancy that utilized for GFP mRNA and protein detection. In IVF pregnancies, 60% of male embryos, 50% of females and 40% of pregnancy losses were positive for TSPY. The detection of TSPY in female pregnancies possible is resultant of persistence of microchimerism of anterior pregnancies. In transgenic cloned pregnancies, was observed presence of GFP mRNA and protein in endometrium, also indicating migration in this region or GFP transport, and another trophoblast content, to maternal epithelium. In placentomes, using anti-GFP antibody, could be observed positive immunolabeling in trophoblast and maternal epithelium, possible due CTGs liberation in endometrial stroma after fusion. The CTGs, in syncytium formation, have a downregulation of GFP, that also be observed, utilizing anti-Qa2 antibody (murine antigen of classe Ib MHC). The maternal and trophoblastic epithelium also was Qa2 immunolabed. By utilized techniques, microchimerism could be indentified in analyzed pregnancies with use of markers for TSPY in maternal blood and GFP in maternal placental tissues. This study show that in bovine placenta occurs fetal cell migration further maternal epithelium and show new perspectives for studies of materno-fetal interaction characteristics until under explored in bovines.

O movimento dos animais desempenha papel importante na aptidão dos indivíduos, no fluxo gênico, na dinâmica de metapopulações e na persistência, a longo prazo, de espécies em um ambiente. Dessa forma, o objetivo deste estudo foi compreender aspectos relacionados à ecologia do movimento da rã-manteiga (Leptodactylus latrans) e da rã-touro (Lithobates catesbeianus). Para isso, indivíduos de ambas as espécies foram marcados com radiotransmissores e rastreados com o objetivo de coletar informações sobre seus movimentos. Ressaltamos os seguintes resultados deste trabalho: (1) a área de vida média de L. latrans é de 2034,2 m2; (2) com o aumento do tamanho corpóreo de anuros há o aumento do tamanho da área de vida; (3) indivíduos de L. latrans se locomovem mais em noites escuras, chuvosas e quentes; e (4) o aumento da pressão de propágulos não reflete uma maior probabilidade no aumento da distribuição geográfica de uma dada população de L. catesbeianus. Entender os padrões de locomoção dos anfíbios e como utilizam o espaço na natureza é fundamental para o entendimento de processos ecológicos e evolutivos relacionados às histórias de vida das espécies desse grupo. Além disso, esse conhecimento serve como uma ferramenta importante no estabelecimento de limites de áreas de conservação com significado biológico para espécies ameaçadas. Ainda, saber como espécies invasoras se locomovem é um dos primeiros passos para que se tomem medidas de controle populacional e para o bloqueio do avanço da distribuição de espécies exóticas / The ability of animals to move plays an important role in individual fitness, gene flow, population regulation, metapopulation dynamics and long-term persistence of species. The aim of this study was to understand aspects related to the movement ecology of the Butter Frog (Leptadactylus latrans) and the Bullfrog (Lithobates catesbeianus). We collected movement data by radio tracking individuals of both species. Some of the most important results obtained were: (1) the mean home range of L. latrans is 2034.2 m2; (2) increasing body size increases home range size in anurans; (3) individuals of L. latrans are more likely to move larger distances in dark, rainy and warm nights; (4) the increase in propagule pressure does not reflect an increase in the probability of geographical spread of a given population of L. catesbeianus. Understanding how amphibians move and use the space in nature is fundamental for the understanding of basic ecological and evolutionary processes related to life history of the species. Moreover, this knowledge is a useful tool to establish biologically meaningful conservation boundary areas to threatened species. Yet, understanding how invasive species move in nature is one of the first steps to population control and to block the spread of geographical distribution of exotic species

A endometriose é uma doença de origem multifatorial, caracterizada por presença de tecido endometrial fora da cavidade uterina, responsável por sintomas álgicos com grande impacto na qualidade de vida da paciente, além de ser um dos principais fatores de infertilidade. Muitos estudos já foram realizados no intuito de explicar a etiopatogenia da endometriose, assim como muito tem sido estudado para encontrar novas estratégias de tratamento. Várias linhas de medicamentos têm sido estudadas com este intuito, agindo em diferentes pontos da etiopatogênese da doença, uma delas na inibição de metaloproteinases da matriz extracelular, que tem papel no remodelamento do mesotélio do peritônio e angiogênese. O objetivo deste estudo foi avaliar a influência de uma droga (doxiciclina) de baixo custo, com ação conhecida na inibição das metaloproteinases, em endometriose peritoneal induzida em ratas. Para isso, foram usadas 30 ratas adultas Wistar com lesão induzida de endometriose, divididas em três grupos, um grupo controle (C, n=10) sem tratamento, um grupo onde foi administrado doxiciclina em baixa dose (BD, n=10) e um grupo onde foi realizado doxiciclina em alta dose (AD, n=10). Foi realizada avaliação da área das lesões de cada rata e estudo imunohistoquímico para positividade de anticorpo primário de metaloproteinase de matriz 9 (MMP9) e de inibidor de metaloproteinase de matriz 2 (TIMP2). A doxiciclina atuou reduzindo a área das lesões nos grupos BD e AD (p=0,0052) em relação ao grupo C e reduzindo a expressão do TIMP2 no grupo AD (p=0,0009) em relação aos grupos BD e C. Não houve resultado significativo na expressão da MMP9. / Endometriosis is a multifactorial origin disease, characterized by the presence of endometrial tissue outside the uterine cavity, responsible for painful symptoms with important impact on the life quality of the patient, besides being one of the main factors of infertility. Many studies have already been carried out to explain the etiopathogenesis of endometriosis, and much has been studied to find new treatment strategies. Several lines of drugs have been studied for this purpose, acting at different points in the etiopathogenesis of the disease, one of them in the inhibition of extracellular matrix metalloproteinases, which plays a role in the remodeling of the peritoneum mesothelium and angiogenesis. The purpose of this study was to evaluate the influence of a low-cost drug (doxycycline), with known action on the inhibition of metalloproteinases, in induced peritoneal endometriosis in rats. Thirty adult Wistar rats with endometriosis-induced lesions were divided into three groups: one untreated control group (C, n = 10), one group receiving low dose doxycycline (BD, n = 10) and a group where high dose doxycycline (AD, n = 10) was performed. An evaluation of the lesion area of each rat and immunohistochemical study for primary antibody to matrix metalloproteinase 9 (MMP9) and matrix metalloproteinase inhibitor 2 (TIMP2) was performed. Doxycycline worked by reducing the area of lesions in the BD and AD groups (p = 0.0052) in relation to the C group and reducing the expression of TIMP2 in the AD group (p = 0.0009) in relation to the BD and C groups. There was no significant effect on MMP9 expression in the present study.