Two isoforms of the tick Ixodes ricinus digestive peptidases cathepsins L1 and L3 are expressed also in salivary glands. In order to assess their role in this tissue, the specific antibodies against these peptidases were prepared by affinity chromatography and used for their detailed immuno-localization using cutting-edge methods of electron microscopy.

The tick Ixodes ricinus is one of the most important vectors of human pathogens like the spirochete Borrelia burgdorferi and TBE virus. The effect of repeated infestations with pathogen-free I. ricinus nymphs and the effect of vaccination with ticks saliva of the tick I. ricinus on the transmision Borrelia burgdorferi and on the production of the cytokines were studied. The draining lymph nodes of C3H/HeN mice were examined for IL-2, IFN-? and IL-10 production by antigen capture enzyme-linked immunosorbent assay. Spirochete load in skin, heart and bladder was examined by real-time polymerase chain reaction.

La maladie de Lyme, ou borréliose de Lyme, est une infection bactérienne causée par le spirochète Borrelia burgdorferi sensu lato et transmise à l’hôte (homme, animal) par piqûre de tique du genre Ixodes. Cette maladie, caractérisée par un polymorphisme clinique important, est la maladie à transmission vectorielle la plus répandue dans l’hémisphère nord. Un traitement par antibiotiques permet une guérison rapide, mais si la maladie est diagnostiquée tardivement, certains symptômes persistent. Actuellement, aucun vaccin n’est commercialisé pour l’homme. Dans ce contexte, nous avons développé des approches protéomiques afin d’apporter de nouveaux éléments de compréhension du mécanisme d’interactions de la triade tique / bactérie / hôte. Ces travaux, visant particulièrement le développement de nouvelles stratégies vaccinales et diagnostiques, sont articulés autour de trois parties : - L’identification, suite à de nombreuses optimisations, d’une méthode d’analyse HPLC-UV et nanoLC-MS/MS, de protéines présentes dans des extraits de glandes salivaires de tiques et possédant une activité sur la réponse immunitaire innée cutanée. Ces développements ont mis en évidence une liste restreinte de protéines potentiellement bioactives. - La mise au point, sur un modèle murin, d’une méthode de détection d’une protéine de Borrelia burgdorferi, OspC, dans des biopsies cutanées par spectrométrie de masse ciblée LC-SRM. Cette étude a ouvert des perspectives quant au développement de nouveaux outils diagnostiques. - L’évaluation de la faisabilité de la détection de Borrelia burgdorferi directement à la surface de la peau par imagerie par spectrométrie de masse MALDI-MSI. / Lyme disease, or Lyme borreliosis, is a bacterial infection caused by Borrelia burgdorferi sensu lato and transmitted to the human or animal host by an Ixodes tick bite. This disease, characterized by a huge clinical polymorphism, is the most common vector-born disease in the Northern Hemisphere. An antibiotic treatment allows a fast recovery, but if it is diagnosed too late, some symptoms persist. Currently, no vaccine is marketed for humans. In this context, we have developed proteomic approaches to bring new understanding to the interaction mechanism of the triad tick / bacteria / host. This work, aimed particularly at the development of new vaccinal and diagnostic strategies, has three parts: - Identification, after numerous optimizations, of the analytical method HPLC-UV and nanoLC-MS/MS, of proteins that are present in tick salivary gland extracts and having activity on cutaneous innate immunity response. This work has highlighted a list of proteins with a potential biological activity. - Development, with a murine model, of a method for detecting Borrelia burgdorferi protein, OspC, in cutaneous biopsies by targeted mass spectrometry LC-SRM. This study has opened up perspectives concerning new diagnostic tools. - Evaluation of the feasibility of the Borrelia burgdorferi detection directly on the skin surface by MALDI imaging mass spectrometry.

Les tiques sont des arthropodes ectoparasites obligatoires qui se nourrissent sur une grande variété de vertébrés sur une large partie du globe. Au cours de leur repas, les tiques sécrètent dans leur salive de nombreux facteurs leur permettant de contourner bon nombre des défenses de l’hôte. Bien que la littérature rapporte beaucoup d’informations au sujet des effets du repas de la tique sur l’hôte, la nature des facteurs actifs exprimés par les glandes salivaires de la tique est peu connue. Au cours d’anciens travaux au sein du laboratoire, le crible de deux banques d’ADN complémentaires - issues de la rétro-transcription des ARN messagers synthétisés par les glandes salivaires de la tique Ixodes ricinus – a permis l’identification de 27 protéines dont l'expression est spécifiquement induite ou régulée positivement pendant le repas sanguin de la tique I. ricinus. Parmi ces protéines, la protéine Seq24, induite au cours du repas sanguin, présente la capacité de moduler les immunités innée et acquise de l’hôte. En conséquence, la protéine Seq24 a été nommée Iris pour « Ixodes ricinus Immunosuppressor ». Au cours de la présente étude, notre but fût de caractériser le rôle d’Iris et de déterminer son importance dans le repas sanguin de la tique I. ricinus.<p>La protéine Iris appartient à la famille des inhibiteurs de sérine protéases et présente une homologie significative avec l’inhibiteur d’élastase de leucocytes. Une analyse in silico a confirmé qu’Iris présentait la structure des serpines, et notamment le RCL (Reactive Center Loop), boucle responsable de l’activité anti-protéasique. Comme attendu (sur base de l’analyse in silico), Iris inhibe de manière spécifique l’activité de plusieurs sérine protéases, et en particulier l’élastase de leucocyte. Ces tests effectués, nous avons essayé de comprendre quel(s) pouvai(en)t être le(s) rôle(s) d’Iris dans l’accomplissement du repas sanguin de la tique, c’est à dire dans la lutte contre les différents systèmes de défenses de l’hôte.<p>Tout d’abord, des tests ont démontré la capacité d’Iris à inhiber les mécanismes de l’hémostase. Des tests sur du plasma et du sang complet ont montré qu’Iris allonge le temps de fibrinolyse, la voie intrinsèque de la coagulation et l’adhésion plaquettaire. L’utilisation de mutants a également démontré que si les deux premières activités sont dépendantes du RCL, et donc d’un mode de fonctionnement anti-protéolytique, l’adhésion plaquettaire est indépendante de ce système. Ce résultat met en évidence l’existence d’autres sites actifs, isolés par analyse in silico, nommés Receptor Binding Domain (RBD).<p>Un travail antérieur du laboratoire avait permis d’indiquer la capacité de la protéine recombinante Iris semi-purifiée à inhiber la production de TNF-a, d’IL-6, et d’IL-8 (cytokines pro-inflammatoires) ainsi que l’IFN-g par des PBMCs (Peripherical Blood Mononuclear Cells) humaines. Ces résultats ont été confirmés avec de la protéine purifiée. Des analyses complémentaires ont démontré qu’un mutant d’Iris - dépourvu d’activité anti-protéasique - conserve l’activité pro-inflammatoire. Là encore, ce mécanisme semble impliquer un ou plusieurs RBD. L’utilisation d’anticorps dirigés contre ces zones a permis de déterminer le domaine d’interaction (aa :105-120) impliqué dans cette fonction. D’autre part, une analyse par FACS a permis de démontrer qu’Iris interagit uniquement avec les cellules d’origine monocytaire.<p>Enfin, nous avons également analysé l’importance d’Iris au cours du repas sanguin de la tique par une approche vaccinale. Les résultats observés indiquent que 30 % des tiques nourries sur des lapins immunisés par la protéine rIris ne survivent pas au repas. / Doctorat en sciences, Spécialisation biologie moléculaire / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Einleitung: Coxiella burnetii ist ein gramnegatives und obligat intrazelluläres Bakterium und Erreger der meldepflichtigen Zoonose Q-Fieber. Den Hauptübertragungsweg stellt die Inhalation infizierter Stäube dar, aber auch Zecken werden seit der Isolation des Pathogens aus der Spezies Dermacentor andersonii als Vektoren diskutiert. Es liegen jedoch keine gesicherten Berichte über Infektionen des Menschen durch Zecken oder eine Beteiligung von Vektoren bei Q-Fieber-Ausbrüchen vor. Zudem steht durch die genetische Nähe zu überwiegend apathogenen Endosymbionten die Spezifität molekularer Untersuchungsmethoden in Frage, wodurch die Relevanz von Zecken in der Übertragung von Q-Fieber in der Literatur kontrovers diskutiert wird. Ziele der Untersuchung: Es sollten mithilfe einer systematischen Literaturanalyse die Daten zur Prävalenz von C. burnetii in Zecken in Europa dargelegt werden. Zudem sollte mittels eines in-vitro-Fütterungssystems untersucht werden, inwieweit die heimischen Spezies Ixodes ricinus und Dermacentor marginatus den Erreger aus dem Blut aufnehmen und ausscheiden, sowie ob das Bakterium transstadial in I. ricinus übertragen wird, wodurch Aussagen über die Vektorkompetenz dieser Arten möglich sind. Tiere, Material und Methoden: Im experimentellen Ansatz wurde die Infektion der Zecken in einem Silikonmembran-basierten Fütterungssystem mit heparinisiertem Rinderblut vorgenommen. Die Gruppengrößen betrugen 7-9 Weibchen mit fünf Männchen oder 50-60 Nymphen. Es wurden verschiedene Konzentrationen C. burnetii Nine Mile RSA439 Phase II eingesetzt: 10^4 (zwei Gruppen adulte I. ricinus), 10^5 (zwei Gruppen adulte I. ricinus) und 10^6 (fünf Gruppen adulte I. ricinus, vier Gruppen adulte D. marginatus, drei Gruppen I. ricinus Nymphen) Genomäquivalente (GE)/ml Blut sowie insgesamt sieben Negativkontrollgruppen. Zudem wurden vier Gruppen adulte I. ricinus für 36 Stunden zu Beginn der Fütterung mit 10^6 GE C. burnetii/ml infiziert und anschließend mit sterilem Blut gefüttert. Täglich wurde Zeckenkot entfernt, zudem wurden adulte I. ricinus zu unterschiedlichen Zeitpunkten während oder nach der Fütterung entnommen. Die Proben wurden nach DNA-Extraktion mittels quantitativer Echtzeit-PCR (qPCR) auf das C. burnetii-Gen icd untersucht. Ein Teil (n = 46) der infizierten Nymphen wurde vor bzw. nach der Häutung mittels qPCR untersucht. Ein anderer Teil (acht Weibchen in zwei Gruppen) wurde nach der Häutung erneut auf sterilem Blut gefüttert. Dabei wurden Kot sowie Blut getestet. Weiterhin fand in L929-Zellen und axenischem Medium eine Anzucht von C. burnetii aus einem Filtrat des Zeckenkots sowie aus dem Filtrat eines qPCR-positiven Weibchens statt, welches sich von einer zuvor infizierten Nymphe gehäutet hatte. Die statistische Auswertung erfolgte mittels SPSS V 22.0, wobei je nach Voraussetzung der t-Test, der Mann-Whitney-U-Test sowie der Chi²-Test nach Pearson verwendet wurden. Das Signifikanzniveau wurde jeweils auf p < 0,05 festgelegt. Ergebnisse: Im Fütterungssystem haben 49 % der adulten I. ricinus und 29 % der D. marginatus vollständig gesaugt. Die Häutungsrate der I. ricinus Nymphen betrug 92 %. I. ricinus-Weibchen nahmen den Erreger auf, welcher innerhalb von sieben Wochen in einer Konzentration von ca. 10^3 GE/mg in den Zecken nachweisbar war. Eine Ausscheidung von infektiösen C. burnetii mit dem Kot wurde bei adulten Zecken ab einer Konzentration von 10^5 GE/ml im verfütterten Blut festgestellt. Dabei erfolgte in allen Versuchen mit beiden Zeckenspezies eine signifikant höhere Ausscheidung von C. burnetii an den Tagen 10-13, welche bis zu 10^5 GE/mg erreichte. Es wurde eine transstadiale Übertragung bei I. ricinus mit einer Rate von 25 % nach-gewiesen. Infizierte Nymphen, die nach der Häutung steriles Blut bekamen, schieden ebenfalls C. burnetii im Kot aus; im Blut wurde hingegen keine DNA von C. burnetii nachgewiesen. Schlussfolgerungen: Das genutzte Fütterungssystem eignet sich für die Untersuchung der Vektorkompetenz von Zecken. Beide Zeckenspezies sind in der Lage, infektiösen Zeckenkot auszuscheiden, wodurch eine Gefahr einer möglichen aerogenen Übertragung entsteht. Dabei muss jedoch eine hohe Erregerkonzentration im Blut des Wirts erreicht werden. Es wurde eine transstadiale Übertragung von C. burnetii in I. ricinus von Nymphen zu Adulten und damit die Möglichkeit der Bildung eines Reservoirs nachgewiesen. Die Ergebnisse legen eine Vermehrung von C. burnetii im Mitteldarm der Zecken nahe. Dadurch konnten historische Aussagen aus der Literatur über andere Zeckenspezies zur Ausscheidung von C. burnetii mittels Zeckenkot bestätigt werden. In der Studie konnte weiterhin gezeigt werden, dass heimische Zecken unter Laborbedingungen zur Verbreitung von Q-Fieber beitragen können. Weitere Untersuchungen sind jedoch notwendig, um die tatsächliche Bedeutung der Vektorkompetenz von Zecken unter natürlichen Bedingungen abschätzen zu können.:1 Einleitung 2 Literaturübersicht 2.1 Coxiella burnetii 2.1.1 Historischer Ursprung und taxonomische Einordnung 2.1.2 Morphologie und Replikation 2.1.3 Coxiella burnetii als Krankheitserreger 2.1.3.1 Epidemiologie 2.1.3.2 Coxiellosen der Tiere 2.1.3.3 Q-Fieber des Menschen 2.1.3.4 Nachweis und Therapie 2.2 Zecken 2.2.1 Taxonomie 2.2.2 Verbreitung und Habitat 2.2.3 Morphologie 2.2.4 Lebenszyklus 2.2.5 Wirtssuche und sensorische Fähigkeiten 2.2.6 Blutmahlzeit und Verdauung 2.2.7 Zeckenmikrobiom und Coxiella-like Endosymbionten 2.2.8 Zecken als Vektoren 2.2.8.1 Infektionserreger 2.2.8.2 Coxiella burnetii in Zecken 2.3 Fütterung von Zecken 2.3.1 Fütterungssysteme 2.3.1.1 Membranbasierte Fütterungssysteme 2.3.1.2 Fixierungsstimuli im Zeckenfütterungssystem 2.3.1.3 Experimentelle Infektionen im membranbasierten in-vitro-System 3 Veröffentlichungen 3.1 Stellungnahme zum Eigenanteil an den Arbeiten zur Publikation 3.1.1 Publikation 1 3.2 Stellungnahme zum Eigenanteil an den Arbeiten zur Publikation 3.2.2 Publikation 2 4 Diskussion 5 Zusammenfassung 6 Summary 7 Literaturverzeichnis 8 Anhang 8.1 Bilder der Zeckenfütterung 9 Danksagung

Over the last 20 years, Lyme disease has grown to become the most common vector-borne disease affecting Americans. Spread in the eastern U.S. primarily by the bite of Ixodes scapularis, the black-legged tick, the disease affects an estimated 329,000 Americans per year. Originally confined to New England, it has since spread across much of the east coast and has become endemic in Virginia. Since 2010 the state has averaged 1200 cases per year, with 200 annually in the New River Health District (NRHD), the location of our study. Efforts to geographically model Lyme disease primarily focus on landscape and climatic variables. The disease depends highly on the survival of the tick vector, and white-footed mouse, the primary reservoir. Both depend on the existence of forest-herbaceous edge-habitats, as well as warm summer temperatures, mild winter lows, and summer wetness. While many studies have investigated the effect of forest fragmentation on Lyme, none have made use of high-resolution land cover data to do so at the peridomestic level. To fill this knowledge gap, we made use of the Virginia Geographic Information Network’s 1-meter land cover dataset and identified forest-herbaceous edge-habitats for the NRHD. We then calculated the density of these edge-habitats at 100, 200 and 300-meter radii, representing the peridomestic environment. We also calculated the density of <2-hectare forest patches at the same distance thresholds. To avoid confounding from climatic variation, we also calculated mean summer temperatures, total summer rainfall, and number of consecutive days below freezing of the prior winters. Adding to these data, elevation, terrain shape index, slope, and aspect, and including lags on each of our climatic variables, we created environmental niche models of Lyme in the NRHD. We did so using both Boosted Regression Trees (BRT) and Maximum Entropy (MaxEnt) modeling, the two most common niche modeling algorithms in the field today. We found that Lyme is strongly associated with higher density of developed-herbaceous edges within 100-meters from the home. Forest patch density was also significant at both 100-meter and 300-meter levels. This supports the notion that the fine scale peridomestic environment is significant to Lyme outcomes, and must be considered even if one were to account for fragmentation at a wider scale, as well as variations in climate and terrain. / M.S. / Lyme disease is the most common vector-borne disease in the United States today. Infecting about 330,000 Americans per year, the disease continues to spread geographically. Originally found only in New England, the disease is now common in Virginia. The New River Health District, where we did our study, sees over 200 cases per year. Lyme disease is mostly spread by the bite of the black-legged tick. As such we can predict where Lyme cases might be found if we understand the environmental needs of these ticks. The ticks themselves depend on warm summer temperatures, mild winter lows, and summer wetness. But they are also affected by forest fragmentation which drives up the population of white-footed mice, the tick’s primary host. The mice are particularly fond of the interface between forests and open fields. These edge habitats provide food and cover for the mice, and in turn support a large population of ticks. Many existing studies have demonstrated this link, but all have done so across broad scales such as counties or census tracts. To our knowledge, no such studies have investigated forest fragmentation near the home of known Lyme cases. To fill this gap in our knowledge, we made use of high-resolution forest cover data to identify forest-field edge habitats and small isolated forest patches. We then calculated the total density of both within 100, 200 and 300 meters of the homes of known Lyme cases, and compared these to values from non-cases using statistical modeling. We also included winter and summer temperatures, rainfall, elevation, slope, aspect, and terrain shape. We found that a large amount of forest-field edges within 100 meters of a home increases the risk of Lyme disease to residents of that home. The same can be said for isolated forest patches. Even after accounting for all other variables, this effect was still significant. This information can be used by health departments to predict which neighborhoods may be most at risk for Lyme. They can then increase surveillance in those areas, warn local doctors, or send out educational materials.

Les réservoirs de Borrelia burgdorferi jouent un rôle clé pour assurer sa transmission dans l’environnement. Récemment, de nouveaux acaricides, comme le fluralaner, présentant une efficacité élevée contre les tiques et une longue durée d’action, ont été commercialisés sur le marché des médicaments vétérinaires. Cibler les réservoirs de B. burgdorferi, comme les souris du genre Peromyscus, avec le fluralaner permettrait : d’abord, d’en altérer le cycle endémique; ensuite, de réduire la densité de tiques infectées dans l’environnement ; et, ultimement, de réduire le risque de transmission de la maladie de Lyme (ML). En premier lieu, l’efficacité du fluralaner à tuer des larves de l’espèce Ixodes scapularis infestant des souris du genre Peromyscus a été démontrée en laboratoire. Lors d’infestations expérimentales, des doses de 12,5 et 50 mg/kg ont tué > 90 % des larves d’I. scapularis dans les 4 jours suivant l’administration du traitement. Cependant, cette efficacité a été réduite à moins de 5 % dans les 30 premiers jours. En second lieu, dans le cadre d’une étude controllée non randomisée, des appâts de fluralaner ont été administrés répétitivement à une population de micromammifères sauvages à des densités de 2,1 ou 4,4 appâts/1000 m2 pendant 3 à 4 ans. L’efficacité du traitement à réduire l’infestation des micromammifères a, au préalable, été évaluée. Les densités de 2,1 et 4,4 ont respectivement réduit de 68 % et 86 % le nombre de larves infestant les souris du genre Peromyscus. Seule la densité de 4,4 a réduit significativement le nombre de nymphes de 72 %. Après quoi, l’effet des deux densités d’appâts sur le cycle endémique de B. burgdorferi a été évalué par le biais de 3 paramètres : 1- la prévalence de Peromyscus spp. infectées (PIM), 2- la densité de nymphes en quête (DON), 3- la prévalence de nymphes infectées par B. burgdorferi (NIP). La prévalence d’infection des souris par B. burgdorferi a chuté de 60 à 37 % après deux années de déploiements du traitement. Le traitement a provoqué une réduction de la DON de 45 à 63 % dans les zones traitées. Aucun effet n’a été observé sur le dernier paramètre. En troisième lieu, la pharmacologie du fluralaner a été caractérisée chez des souris du genre Peromycus dans une étude réalisée en laboratoire. Les données recueillies ont été utilisées pour simuler et interpréter différents scénarios de traitement de souris Peromyscus spp. pour une durée équivalente aux pics d’activités des larves et des nymphes d’I. scapularis. Les simulations ont permis d’identifier un jeu de scénarios qui conféreraient une protection contre les tiques pendant toute la saison d’activité des stades immatures d’I. scapularis. L’étude de la pharmacologie des acaricides chez les espèces ciblées et la modélisation de la pharmacocinétique représentent des étapes cruciales pour développer ce type d’intervention. Cette thèse a permis d’entreprendre le développement d’une approche ciblant les réservoirs de B. burgdorferi en utilisant une molécule de la famille des isoxazolines. L’approche décrite a montré le potentiel d’altérer le cycle endémique de B. burgdorferi et de réduire la densité de nymphes infectées dans l’environnement. Plus généralement, en intégrant des études sur la pharmacologie du fluralaner en laboratoire et des études terrains, elle permet d’initier la réflexion quant à l’importance d’avoir un cadre de développement commun pour structurer la recherche autour de ce type d’approches. / Reservoirs of Borrelia burgdorferi play a key role in ensuring its transmission in the environment. Recently, new acaricides, such as fluralaner, with high efficacy against ticks and a long duration of action have been commercialized in the veterinary drug market. Targeting B. burgdorferi reservoirs, such as Peromyscus spp. mice, with fluralaner would yield the following benefits: first, alter its transmission in the environment; second, reduce the density of B. burgdorferi-infected ticks in the environment; and, ultimately, reduce the risk of Lyme disease (LD). Firstly, the efficacy of fluralaner for killing Ixodes scapularis larvae infesting Peromyscus mice was demonstrated in a laboratory setting. Doses of 12.5 and 50 mg/kg showed > 90% efficacy at killing I. scapularis larvae infesting Peromyscus spp. mice within 4 days of treatment during experimental infestations. However, efficacy was reduced to less than 5% beyond 30 days. Secondly, in a non-randomized controlled study, fluralaner baits were repeatedly administered to a wild population of small mammals at densities of 2.1 or 4.4 baits/1000m2 over a period of 3 to 4 years. First, the treatment's efficacy at reducing small mammal infestation was evaluated. Densities of 2.1 and 4.4 baits/1000m2 reduced the number of larvae infesting Peromyscus mice by 68% and 86% respectively. Only the density of 4.4 baits/1000m2 significantly reduced the number of nymphs by 72%. Next, the effect of the both bait densities on the B. burgdorferi endemic cycle was evaluated through 3 parameters: i- the prevalence of B. burgdorferi-infected Peromyscus spp. mice (PIM), ii- the density of questing nymphs (DON), and iii- the prevalence of B. burgdorferi in questing nymphs (NIP). Mouse infection by B. burgdorferi decreased from 60 to 37% following two years of treatment deployment. The treatment reduced the DON by 45-63% in the treated areas but no effect was observed on B. burgdorferi prevalence in the NIP. Thirdly, fluralaner pharmacology was characterized in Peromycus mice in a laboratory setting. The data collected were used to simulate and interpret different treatment scenarios for Peromyscus mice over a period corresponding to the peak activities of I. scapularis larvae and nymphs. The simulations identified a set of treatment scenarios that confer protection against ticks for an entire season of I. scapularis activity. The results indicate that investigation of acaricide pharmacology in target species and pharmacokinetic modeling are critical steps in the development of this type of intervention. This thesis initiated the development of an approach targeting B. burgdorferi reservoirs using a molecule of the isoxazoline family. This approach showed potential for disrupting the endemic cycle of B. burgdorferi and reducing the density of B. burgdorferi-infected nymphs in the environment. More broadly, by integrating studies on fluralaner pharmacology in laboratory and field settings, this work has initiated a reflection on the importance of establishing a general development framework to structure research around this type of approach.

The spotted fever rickettsia, Rickettsia helvetica, is an endemic tick-borne bacteria in Sweden. It causes infections in humans, manifested as aneruptive fever, headache, arthralgia and myalgia, and sometimes an inoculation eschar or a rash. There have also been two known cases of human infections with R. felis in Sweden. The present thesis starts by investigating dispersal of ticks and Rickettsia spp. by migrating birds flying from Africa to Europe. Almost 15,000 birds were searched and 734 ticks collected, mainly of the species Hyalomma marginatum complex. Almost half (48%) of the ticks were infected with Rickettsia spp., 96% of which was R. aeschlimannii, the remaining R. africae and undefined species. The next study focused on questing ticks over a large area in Sweden and determining the prevalence of Rickettsia spp., Anaplasma spp. and Coxiella burnetii. Rickettsia spp. was found in 9.5-9.6% of the ticks and A. phagocytophilum in 0.7%; no C. burnetii was found. The last three papers in the thesis focused on the clinical presentation of rickettsiosis, the symptoms associated with the infection in general and particularly in patients with neurological complications. A tick-exposed population in Sweden was investigated to gain a better understanding of symptoms due to rickettsioses, also in relation to co-infections with other tick-borne bacteria. Based on symptoms, it was not possible to distinguish what pathogen caused the infections. Most patients had erythema migrans, some had serological reactions to Rickettsia spp., Borrelia spp. or co-infections by Rickettsia spp., Borrelia spp. and/or Anaplasma spp. In the fourth and fifth papers, we found associations between antibodies against Rickettsia spp. and sudden deafness (in 10-24% of patients) and facial nerve paralysis (in 8.3-25% of patients). In three patients R. felis was detected in the cerebrospinal fluids.    Briefly, the thesis helps to clarify our knowledge about tick dispersal, shows a narrower prevalence estimate of Rickettsia spp. in Swedish ticks, and illuminates symptoms of rickettsioses and co-infections with other tick-borne infections. It also shows that presence of erythema migrans may be explained by more than Lyme disease and indicates a possible association between rickettsiosis and sudden deafness and facial nerve paralysis.

This thesis examines the parasite dynamics and the mechanisms affecting parasite load and transmission focalising on the role played by host and habitat heterogeneities. This study is based on the gastrointestinal nematode Heligmosomoides polygyrus and the small mammal yellow necked mouse and uses data gathered from experimental field manipulations of parasites intensities and data gathered from trapping monitoring. Initially the parasite community of yellow-necked mouse (Apodemus flavicollis) was explored in North-Eastern Italian Alps with the aim to describe the major patterns and identify the factors affecting parasite community structure. Despite the observed spatial variability it has been found that differences within the host population such age and secondly sex and breeding conditions, were the major factors acting on parasite occurrence and intensity. Habitat differences had a less apparent effect on parasite community structure. The consequences of H. polygyrus infection on other parasite species infections have been analysed, in specific the infestation of the tick Ixodes ricinus in populations of A. flavicollis. H. polygyrus load and tick infestation were monitored as well as were carried out field manipulations of H. polygyrus intensity and were monitored changes in tick infestation. It has been found that H. polygyrus load was negatively related to I. ricinus infestations. Host factors mediated the H. polygyrus-I. ricinus interaction such that young and non-breeding mice exhibited higher I. ricinus to H. polygyrus intensity respect breeding adults. The role of host sex on parasite abundance was then investigated carrying out a field experiment where the H. polygyrus intensity were manipulated in relation to mice gender. In specific, H. polygyrus was removed alternately from either sexes and the parasite load was analysed in the untreated sex. It was found that males mice were responsible to drive parasite transmission in the host population and this was observed in absence of sex-bias in parasite infection, suggesting that this pattern was not a mere consequence of quantitative differences in parasite loads between sexes. To disentangle the possible mechanism causing this sex bias in parasite transmission mathematical simulations based on parameters obtained for the field experiment were used. Two non mutually exclusive hypotheses causing sex bias in parasite transmission were tested: a- males immune response is less efficient and this causes the development of more successful parasite infective stages or b-males behaviours allow them to be more efficient is spreading in more exposed areas parasite infective stages. Multi-host models were developed and simulations were compared with field results. While it was not disentangled the most dominant mechanism causing sex bias in parasite transmission this study underlined the importance of host sexes in affecting parasite dynamics and host-parasite interaction. In conclusion this thesis highlighted the importance of considering host and environmental differences when investigating host parasite interactions. This finding could be extremely important when planning measured of disease control or to avoid disease outbreak. Controlling target group of individuals host could avoid economical losses and a more effective measure of intervention.

De nombreuses études suggèrent que linhibition de la voie alterne du complément de lhôte est nécessaire aux parasites hématophages pour leur permettre daccomplir leur repas sanguin. Une revue décrivant ces études a été publiée dans Developmental and Comparative Immunology (Schroeder et al., (2009) Dev. Comp. Immunol. 33, 5-13). Plusieurs études suggèrent que linhibition de la voie alterne de lhôte par les protéines salivaires de tiques est importante pour lacquisition du repas sanguin et la transmission subséquente de pathogènes à lhôte infesté. Confortant cette hypothèse, une protéine salivaire capable dinhiber la voie alterne du complément a été clonée chez la tique américaine Ixodes scapularis (Valenzuela et al., (2000) J. Biol. Chem. 275, 18717-18723). Cette protéine, appelée Isac, ne présente aucune homologie avec les autres molécules anti-complément connues à ce jour, suggérant que cette protéine a été acquise au cours de lévolution par un mécanisme dévolution convergente. En plus de cet aspect fondamental, Isac représente un candidat antigénique prometteur pour le développement dun vaccin anti-tique potentiellement capable dinduire le rejet de la tique et/ou de prévenir la transmission des pathogènes. Le but initial de cette thèse était didentifier le ou les homologue(s) de la protéine Isac de la tique américaine Ixodes scapularis chez la tique européenne Ixodes ricinus. De façon intéressante, deux séquences différentes ont été isolées du transcriptome des glandes salivaires de la tique I. ricinus (Daix et al., (2007) Insect Mol. Biol. 16 (2), 155-166). Lexpression de ces séquences a révélé quelles codent pour des protéines secrétées capables dinhiber la voie alterne du complément. Ces protéines ont été appelées IRAC I et II pour « Ixodes ricinus anti-complement protein I and II ». La caractérisation des IRACs à laide danticorps monoclonaux a permis de révéler que ces deux protéines sont exprimées de façon constitutive au sein des glandes salivaires de la tique Ixodes ricinus et sont sur-exprimées au cours du repas sanguin. Létude de lexpression des protéines IRAC I et IRAC II au sein de la population dIxodes ricinus a révélé que ces deux protéines sont des paralogues codés par des gènes différents et non par des allèles dun même locus. Enfin, des analyses phylogéniques portant sur les différentes séquences codant pour les protéines homologues à Isac isolées chez les tiques Ixodes scapularis, Ixodes ricinus et Ixodes pacificus ont révélé que les tiques appartenant au complexe Ixodes ricinus codent pour une famille encore non décrite de molécules anti complément qui se sont diversifiées au cours de lévolution par un processus de sélection darwinienne positive. Les analyses phylogéniques des IRACs suggèrent que ces séquences ont subi une diversification par un processus de pression de sélection darwinienne positive, menant probablement à des molécules possédant des propriétés biologiques différentes. Dans la seconde étude, nous avons testé lhypothèse de travail selon laquelle chaque paralogue pourrait posséder des activités inhibitrices différentes à lencontre du complément de différentes espèces dhôtes naturels, contribuant ainsi à élargir le spectre dhôte des tiques I. ricinus. Les résultats obtenus démontrent que cette hypothèse est correcte (Schroeder et al., (2007) Microbes Infect. 9 (2), 247-250). Dans la troisième et dernière étude de ce manuscrit, nous avons testé le potentiel des protéines IRACs comme candidat antigénique pour le développement dun vaccin anti tique. Des recombinants de lherpèsvirus bovin 4 (BoHV-4) exprimant IRAC I ou IRAC II ont été produits. De façon intéressante, nous avons observé que bien que les recombinants BoHV-4 expriment de hauts taux de protéines IRACs fonctionnelles in vitro, les lapins immunisés à laide des recombinants BoHV-4 exprimant les IRACs ne développent pas de réponse humorale détectable à lencontre des transgènes. Dans le but daugmenter limmunogénicité des IRACs exprimés comme transgène, une seconde génération de recombinants BoHV-4 a été produite. Ceux-ci induisent lexpression des IRACs sous la forme de protéines de fusion transmembranaires à la surface des cellules infectées. Linoculation de ces recombinants à des lapins a engendré le développement dune forte réponse humorale à lencontre des IRACs. Néanmoins, cette réponse immune na pas engendré deffet majeur sur le repas sanguin de femelles Ixodes ricinus placées sur les lapins immunisés. / An increasing number of studies demonstrate that inhibition of host complement activation is crucial for completion of the blood feeding process of hematophagous parasites. A review of these studies has been published in Developmental and Comparative Immunology (Schroeder et al., (2009) Dev. Comp. Immunol. 33, 5-13). Several observations suggest that inhibition of the host complement alternative pathway by tick salivary proteins is crucial for the achievement of blood feeding and efficient transmission of the pathogens transmitted by the parasite. Strongly supporting this conclusion, a salivary protein able to inhibit the alternative pathway was cloned from the American tick Ixodes scapularis (Valenzuela et al., (2000) J. Biol. Chem. 275, 18717-18723). Interestingly, this molecule, termed Isac, has no similarity to any previously reported anti-complement molecules suggesting that it has been acquired through a mechanism of convergent evolution. In addition to this fundamental aspect, Isac is also a promising candidate antigen for the development of an anti-tick vaccine potentially able to induce the reject of the tick and/or to prevent the transmission of the pathogens. The initial goal of the present work was to clone the orthologue of Isac from the European tick Ixodes ricinus. Interestingly, two different sequences were isolated from the transcriptome of I. ricinus salivary glands (Daix et al., (2007) Insect Mol. Biol. 16 (2), 155-166). Expression of these sequences revealed that they both encode secreted proteins able to inhibit the complement alternative pathway. These proteins were called I. ricinus anticomplement (IRAC) protein I and II. Further characterization of IRACs using monoclonal antibodies revealed that both proteins are expressed constitutively in I. ricinus salivary glands and are up-regulated during blood feeding. Analysis of a series of individual ticks revealed that all ticks tested express both IRAC I and IRAC II, demonstrating that they are the products of different genes and not of alleles of the same locus. Finally, phylogenetic analyses of the I. ricinus IRAC I and II sequences together with homologues from I. scapularis and I. pacificus demonstrates that ticks belonging to the Ixodes ricinus complex encode a new family of relatively small anti-complement molecules undergoing diversification by positive Darwinian selection. Phylogenetic analyses of IRACs suggested that these sequences were diversifying by a process of positive Darwinian selection, possibly leading to molecules with different biological properties. In the second study, we tested the hypothesis that each paralogue may have different inhibitory activities against the complement of different natural host species, thereby contributing to broaden the host range of I. ricinus ticks. The data obtained demonstrated that this working hypothesis is correct (Schroeder et al., (2007) Microbes Infect. 9 (2), 247-250). In the third and last chapter of the present manuscript, we addressed the potential of IRAC I and II as candidate antigens for the development of an anti-tick vaccine. Bovine herpesvirus 4 (BoHV-4) recombinants expressing IRAC I or II were produced. Interestingly, we observed that although both recombinants expressed high levels of functional IRAC proteins in vitro, our attempts to immunize rabbits against IRACs via infection with these viruses invariably failed. In order to improve the immunogenicity of IRACs expressed as transgene, a second generation of BoHV-4 recombinants was produced. The latter expressed IRACs as transmembrane fusion proteins on cell surface. Comparison of the vaccine potential of BoHV-4 recombinant viruses expressing either secreted or transmembrane IRAC proteins revealed that while the former did not induce a detectable immune response against IRACs, the latter led to high titers of anti-IRAC antibodies. However, the immune response induced against IRACs did not lead to the reject of the tick but only slightly increased the duration of the blood feeding process.