Ökande antibiotikaresistens utgör en allvarlig samhällsutmaning. För resistensbestämning av bakterier används standardmetoden buljongspädning. Då bestäms minsta inhiberande koncentration (MIC) som den lägsta koncentration av antibiotika som kan förhindra tillväxt. Examensarbetets syfte var att undersöka om val av odlingsbuljong påverkar MIC-värdet för Gramnegativa bakterier. En litteraturundersökning genomfördes av studier som jämfört resistensbestämning i standardbuljong med alternativ buljong. Därutöver gjordes en experimentell jämförelse. Litteraturstudien visade att buljongens sammansättning kan ha betydelse för MIC-värdet, men resultatet varierade med både bakteriearter och typer av antibiotika. Viktigt att beakta är det begränsade materialet i studien, möjliga förklaringar till MIC-varianser är exempelvis bikarbonat och antibiotikums olika känslighet för ämnet. Den experimentella studien visade att buljongvalet inte hade någon inverkan på MIC-värdet när det undersöktes för Klebsiella pneumoniae och antibiotikan meropenem. Det kan möjligen förklaras av att effekten av meropenem inte påverkas av buljongvalet. Slutsatsen är att många faktorer påverkar MIC-värdet och att standardbuljongen är en tillgång med stor mängd historiska data som kan nyttjas för att följa resistensutvecklingen, även om alternativa buljonger i vissa fall kan vara bättre lämpade för att förutsäga behanlingsbarheten. Buljongval bör väljas med noggrannhet efter rådande omständigheter. / Increasing antibiotic resistance is a concerning societal challenge. The standard test for measuring antibiotic susceptibility of bacteria is the method of broth microdilution. This method is used to determine the minimum inbibitory concentration (MIC), defined as the lowest concentration of an antibiotic that can inhibit the growth of a specific strain of a bacterium. This study aimed to investigate whether the choice of broth affects the MIC-value for Gram-negative bacteria. A literature review was conducted to examine studies comparing standard broth against alternative broth, alongside an experimental comparison of the same. The result of the literature review indicated that the composition of the broth does have an effect. However, the effect varies depending on the bacterial species and type of the antibiotic that was analyzed. Its important to note the limited amount of data from both prior work and this study, but one possible explanation to the variance in MIC-values could be e.g., bicarbonate and the specific antibiotic´s sensitivity to this substance. The experimental part of this study concluded that the choice of broth did not affect the resulting MIC-value when the antibiotic susceptibility of Klebsiella pneumoniae to meropenem was analyzed. This could be attributed to the efficacy of meropenem being unaffected by the broths used in this study. The conclusing of this study is that multiple factors contribute to the resulting MIC-value, and that the standard broth with its large volume of historical data, is a valuable asset to use when tracking the evolution of antibiotic resistance, even though an alternative broth may be better suited to predict treatability. The choice of broth should be made with great care and be adapted to actual circumstances and conditions.

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INTRODUÇÃO: O aumento da incidência de infecções causadas por bactérias resistentes a múltiplos antimicrobianos limita cada vez mais as opções terapêuticas, dificultando o tratamento e aumentando os índices de morbidade e mortalidade, além dos gastos em saúde. Ao longo dos últimos cinco anos, essa limitação tem levado ao reestabelecimento do uso de antimicrobianos consideradas ultrapassados, como as polimixinas. Este grupo passou a ser utilizado com cada vez mais frequência no tratamento de infecções causadas por microrganismos gram-negativos resistentes aos carbapenêmicos. As enterobactérias, em particular a espécie Klebsiella pneumoniae, tem apresentado frequentemente esse perfil, porém, a resistência à polimixinas têm sido relatada, eliminando essa importante alternativa terapêutica. Apesar da importância do tema, são escassas as publicações sobre frequência de resistência às polimixinas em K. pneumoniae e a relação clonal entre isolados resistentes à polimixina B no Brasil. OBJETIVOS: Avaliar a relação genética, perfil de sensibilidade antimicrobiana e mecanismos de resistência às polimixinas em K. pneumoniae. MATERIAIS E MÉTODOS: A execução deste trabalho dividiu-se em duas partes principais: (i) levantamento de dados de culturas positivas para K. pneumoniae da rotina de pacientes hospitalizados em instituições atendidas pelo serviço de análises clínicas do Fleury Medicina e Saúde; (ii) confirmação das concentrações inibitórias mínimas (CIM) para polimixina B, avaliação da relação clonal por eletroforese em campos pulsados (PFGE),e sequenciamento de múltiplos loci (MLST), avaliação da integridade do gene mgrB e da presença do gene mcr-1 por PCR entre isolados resistentes à polimixina B e aos carbapenêmicos (CPRKp). RESULTADOS e CONCLUSÕES: Na análise de 3.085 isolados de K. pneumoniae obtidos de pacientes internados em 11 hospitais da Grande São Paulo entre os anos de 2011 e 2015, foi evidenciado um aumento estatisticamente significativo na resistência aos carbapenêmicos de 6,8% em 2011 para 35,5% em 2015. Em 2015, KPC foi detectada em 96,2% dos isolados resistentes aos carbapenêmicos. A distribuição das concentrações inibitórias mínimas de polimixina B entre todos os isolados de K. pneumoniae evidenciou uma distribuição bimodal com a CIM de 2 mg/L como o valor de ponto de corte para a susceptibilidade à polimixina B; assim, 3,6% do número total de isolados sensíveis aos carbapenêmicos foram interpretados como resistentes enquanto essa proporção foi de 22,5% entre as resistentes aos carbapenêmicos (CRKp). Entre esses últimos isolados também houve um aumento estatisticamente significativo na tendência anual de resistência à polimixina B, de 0% em 2011 para 27,1% em 2015. Estas taxas variaram de 0,7% em 2011 para 3,9% até junho de 2014 entre os sensíveis aos carbapenêmicos. Entre os antimicrobianos alternativos, a amicacina e a tigeciclina foram os compostos mais ativos. A análise por PFGE de 60 isolados de CPRKp obtidos de pacientes distintos nos anos de 2014 e 2015 evidenciou dois grandes grupos clonais: CPRKp1 e CPRKp2, os quais segundo a análise por MLST pertencem, respectivamente, aos grupos ST11 e ST437, ambos do complexo clonal 258. Foi observado o mesmo grupo ST entre isolados obtidos dentro de um mesmo hospital e também entre diferentes hospitais, públicos e privados. O mecanismo de resistência mais comum entre os isolados de CPRKp foi a presença de sequências de inserção interrompendo o gene mgrB. O gene mcr-1 não foi detectado em nenhum dos isolados. / INTRODUCTION: The increasing incidence of infections caused by bacteria resistant to multiple antimicrobials increasingly limits therapeutic options, making treatment difficult and increasing the morbidity and mortality and health spending. Over the past five years, this limitation has led to the reestablishment of the use of antimicrobials deemed outdated, such as polymyxins. This group is now used with increasing frequency to treat infections caused by carbapenem-resistant gram-negative microorganisms. Enterobacteria, especially Klebsiella pneumoniae, have often presented this profile, however, resistance to polymyxins have been also reported, eliminating this important therapeutic alternative. Despite the importance of this issue, the publications are scarce on the polymyxins resistance frequency in K. pneumoniae and clonal relationship among isolates resistant to polymyxin B in Brazil. OBJECTIVES: To evaluate the genetic relationship, antimicrobial susceptibility profile and polymyxin B resistance mechanisms in K. pneumoniae. MATERIALS AND METHODS: The execution of this work was divided into two main parts: (i) survey data on routine cultures positive for K. pneumoniae from patients hospitalized in institutions attended by the clinical analysis service of Fleury Health and Medicine; (ii) confirmation of to polymyxin B minimum inhibitory concentrations (MIC), evaluation of clonal relationship by electrophoresis pulsed field gel electrophoresis (PFGE), multilocus sequence typing (MLST), evaluation of the integrity of the mgrB gene and the presence of mcr-1 gene by PCR among isolates resistant to polymyxin B and carbapenems (CPRKp). RESULTS AND CONCLUSIONS: The analysis of 3,085 K. pneumoniae isolates obtained from inpatients from 11 hospitals in the São Paulo urban area between 2011 and 2015, has shown a statistically significant increase in carbapenem resistance from 6.8% in 2011 to 35.5% in 2015. In 2015, KPC was detected in 96.2% of isolates resistant to carbapenems. The polymyxin B MIC distribution of all Klebsiella pneumoniae showed a bimodal distribution with the MIC of 2 mg/L as the cutoff value for polymyxin B susceptibility; thus, 3.6% of the total number of isolates susceptible to carbapenems were interpreted as resistant while this proportion was 22.5% among carbapenem-resistant isolates (CRKp). Among these isolates there was also a statistically significant increase in the annual trend of polymyxin B resistance, from 0% in 2011 to 27.1% in 2015. These rates ranged from 0.7% in 2011 to 3.9% by June 2014 between carbapenem-susceptible isolates. Among alternative antimicrobials, amikacin and tigecycline were the most active compounds. The analysis by PFGE of 60 CPRKp isolates obtained from different patients in the years 2014 and 2015 showed two major clonal groups: CPRKp1 and CPRKp2, which according to the analysis by MLST belong respectively to ST11 and ST437 groups, both from clonal complex 258. We observed the same ST group of isolates obtained within a hospital and between different public and private hospitals. The most common mechanism of polymyxin B resistance among CPRKp isolates was the presence of insertion sequences interrupting the mgrB gene. The mcr-1 gene was not detected in any of the isolates.

O 1,3-propanodiol é um composto produzido a partir da fermentação do glicerol por bactérias como a do gênero Klebsiella e que pode ser utilizado para diversas aplicações na indústria, como a produção de PTT (politrimetileno tereftalato). Esse trabalho focou na produção de 1,3-propanodiol utilizando os genes que codificam as enzimas da via retirados de uma cepa de Klebsiella previamente isolada (GLC29). Os genes foram inseridos em um plasmídeo e este em cepa hospedeira de Escherichia coli com alteração na afinidade da enzima isocitrato desidrogenase pelo seu cofator. A enzima foi modificada no genoma da bactéria e utiliza como cofator NAD em vez do NADP original. Ensaios preliminares em agitador rotativo mostraram uma melhoria de produção da cepa mutada em comparação com a Escherichia coli selvagem. Em ensaios em biorreator, variando a concentração de oxigênio dissolvido no meio, a cepa mutante apresentou uma produção 25% maior que a cepa selvagem na condição de maior produção com 5% de oxigênio dissolvido. / The 1,3-propanediol is a compound produced from glycerol fermentation by bacteria such as Klebsiella and which can be used for various applications in industry, such as the production of PTT (polytrimethylene terephthalate). This work focused on the production of 1,3-propanediol using genes encoding the enzymes of the pathway taken from a Klebsiella strain previously isolated (GLC29). The genes were inserted into a plasmid and in the host strain of Escherichia coli with changes in the affinity of the enzyme isocitrate dehydrogenase for its cofactor. The enzyme was modified in the genome of the bacteria using the cofactor NAD instead of the original NADP. Preliminary tests on shaker showed an improvement of production by the mutated strains in comparison to the wild Escherichia coli. In biorreactor cultivation, varying the concentration of dissolved oxygen in the medium, the mutant strain showed a production 25% higher than the wild type strain in the condition with 5% of dissolved oxygen.

G-CSF besitzt direkte Effekte auf die Aktivierung bakterizider Eigenschaften neutrophiler Granulozyten und verbessert das Überleben bakteriell infizierter Tiere. Daher wurde in der hier vorliegenden Arbeit der Effekt einer prophylaktischen oder therapeutischen Gabe von G-CSF bei experimenteller Pneumonie durch Klebsiella pneumoniae in Mäusen untersucht. Unerwarteterweise verschlechterte aber eine prophylaktische G-CSF-Gabe das Überleben und führte dosisabhängig zu einer Steigerung der bakteriellen Dissemination von der Lunge in Leber und Milz. Im Gegensatz dazu konnte ein spezifisch gegen K2-Kapselpolysaccharid (K2-KPS) von K. pneumoniae gerichteter monoklonaler Antikörper signifikant die Vermehrung der Bakterien in Lunge, Leber und Milz reduzieren. Die Blockierung von TNF?? durch Pentoxifyllin hingegen verzögerte die Letalität nach Induktion der Pneumonie, verhinderte sie jedoch nicht. In vitro konnte hier nachgewiesen werden, daß G-CSF spezifisch an K. pneumoniae bindet und daß diese Bindung an mehrere Proteine mit einem Molekulargewicht von 41, 25 und 21 kDa erfolgt. Die Bindung von G-CSF an K. pneumoniae führte zu einer signifikant erhöhten Produktion des wichtigsten Virulenzfaktors, K2-KPS. Dies verminderte in vitro signifikant eine Phagozytose der Bakterien durch neutrophile Granulozyten. Damit gelang es zum ersten Mal, die Bindung von G-CSF an ein gram-negatives Bakterium, K. pneumoniae, nachzuweisen und zu zeigen, daß diese Bindung in vitro zu einer erhöhten Produktion des wichtigsten Virulenzfaktors und in vivo zur Verschlechterung einer experimentellen Pneumonie durch erhöhte bakterielle Disseminierung bei prophylaktischer Gabe von G-CSF vor Infektion führt. Die weitere Untersuchung dieser Phänomene hinsichtlich einer möglichen Bindung von G-CSF auch an andere Bakterien könnte zu einer differenzierten supportiven Therapie bakterieller Infektionen mit G-CSF in nicht neutropenischen Patienten führen. / Besides its well-established effects on granulocytopoiesis, granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) has been shown to have direct effects on the recruitment and bactericidal ability of neutrophils, resulting in improved survival of experimentally infected animals. The effect of G-CSF on the course of experimental pneumonia induced by Klebsiella pneumoniae was studied. Using a highly reproducible murine model, the paradoxical finding that mortality from infection was significantly increased when animals received G-CSF before induction of pneumonia could be demonstrated. Administration of G-CSF promoted replication of bacteria in the liver and spleen, thus indicating an impairment rather than an enhancement of antibacterial mechanisms. By contrast, a monoclonal antibody against Klebsiella K2 capsule significantly reduced bacterial multiplication in the lung, liver, and spleen, and abrogated the increased mortality caused by G-CSF. Blocking of TNF-? with pentoxifylline, however, could not prevent increased mortality caused by G-CSF. In vitro studies showed a direct effect of G-CSF on K pneumoniae resulting in inreased capsular polysaccharide (CPS) production. When bacteria were coincubated with therapeutically achievable concentrations of G-CSF, phagocytic uptake and killing by neutrophils was impaired. Western blot analysis showed three binding sites of G-CSF to K pneumoniae. Thus, in this model, the direct effect of G-CSF on a bacterial virulence factor, CPS production, outweighed any beneficial effect of G-CSF on recruitment and stimulation of leukocytes. Further investigations of possible binding of G-CSF to other bacteria might influence a differentiated supportive therapy of bacterial infections in non-neutropenic patients with this growth factor.

O objetivo desta dissertação foi descrever a investigação de um surto de Klebsiella pneumoniae em uma unidade de terapia intensiva neonatal cujo elo entre os casos foi a mão, persistentemente colonizada pelo agente, de uma técnica de enfermagem que apresentava onicomicose em primeiro quirodáctilo esquerdo. Revisou-se a história da aplicação do método epidemiológico na investigação de surtos de infecção relacionada à assistência à saúde. Foi revisada também a literatura pertinente à investigação de surtos na busca de situações semelhantes. Embora seja bem conhecido o papel das mãos de profissional de saúde na transmissão cruzada de agentes causadores de infecção nosocomial, poucos surtos foram publicados em que estes profissionais atuaram como fonte comum e persistente de infecção. É mais freqüente Gram-positivos envolvidos, havendo cinco relatos de Gram-negativos neste contexto. A contribuição desta dissertação é alertar para o risco que profissionais de saúde com alterações tróficas em mãos e anexos podem representar quando atuam em unidades críticas de assistência, assim como durante investigações de surto em que a evidências apontam para uma fonte comum, a busca de profissional com tais alterações deve ser considerada / The aim of this study was to describe the investigation of an outbreak of Klebsiella pneumoniae at a neonatal intensive care unit, associated with the persistently colonized hands of a nurse who had onychomycosis on her left thumb. We reviewed the use of the epidemiological method for investigating healthcare related outbreaks of infections. We also reviewed the literature concerning the hands of health care personnel. Although the hands of healthcare workers (HCW) play a role in the cross-transmission of nosocomial pathogens, there are few reports in which the persistently colonized hands act as a common source perpetuating an outbreak. In this setting, Gram-positive outbreaks are frequently reported and five Gramnegative outbreaks were reported. By means of this work, we have sought to draw attention to the role of the healthcare professional with chronic lesions on the hand skin and/or fingernails. They may pose a risk of persistent transmission of nosocomial pathogens, especially for critical patients with invasive devices. During healthcare infection outbreaks, examination of the hands of HCW should be included in the investigation

Introdução: O leite pode ser considerado um dos alimentos mais completos por apresentar alto teor de proteínas e sais minerais, porém, também é considerado excelente meio de cultura para microrganismos. Objetivos: Identificar o número de UFC de Staphylococcus spp. e Klebsiella pneumoniae, cultivados isoladamente ou em associação, em leite integral estéril, a 6 oC, 27 oC e 37 oC e descrever a curva de morte térmica, quando submetidas ao processo de pasteurização lenta isoladamente ou em associação. Material e Métodos: Avaliação através da contagem das UFC, do comportamento de Staphylococcus spp. e K. pneumoniae, isoladas de tanque de refrigeração de leite, submetidas a temperaturas que simulam o leite em condições de refrigeração (6 °C), condições ambientais (25 °C) e na temperatura ideal de crescimento de patógenos mesófilos (36°C). Avaliação da sensibilidade de Staphylococcus spp. e K. pneumoniae isoladas e em associações ao processo de pasteurização lenta. Resultados: Na escala 1 de Mac Farland a média de UFC de K. pneumoniae foi maior que a de Staphylococcus spp. A 6 °C as bactérias no leite, isoladas ou em associação crescem na mesma velocidade. A 25 °C a K. pneumoniae cresce mais que o Staphylococcus spp. A 25 °C K. pneumoniae associada ao Staphylococcus spp. cresce mais do que quando encontra-se isolada. A 36 °C K. pneumoniae associada ao Staphylococcus spp. cresce mais do que quando encontra-se isolada e ainda mais que a 25 °C. A pasteurização lenta foi efetiva, pois reduziu em no mínimo 90% as UFC no leite após 30 minutos a 65 °C. Conclusão: a medida que aumenta a temperatura, até 36 °C, a Klebsiella pneumoniae apresenta crescimento superior ao Staphylococcus spp., a contaminação de leite por Klebsiella pneumoniae (contaminação ambiental) irá influenciar mais na qualidade do produto final, comparando-se à contaminação por Staphylococcus spp., oriundo de mastite e a interação de microrganismos altera a morte dos mesmos, recomendando-se que novos estudos sejam realizados para que se entenda melhor esse processo. / Introduction: The milk can be considered one of the most complete food for its high contents of protein and minerals, but also it is considered an excellent medium of culture for microorganisms. Objective: To identify the number of the Colony Forming Units of Staphylococcus spp. and Klebsiella pneumoniae, in integral sterile milk, at different temperatures (6ºC, 27ºC e 37ºC) and to describe a thermal curve death, when submitted to the process of slow pasteurization isolated or in association. Materials and methods: Evaluation by counting of the colony forming units and the behavior of the Staphylococcus spp. and Klebsiella pneumoniae, isolated and in association occurred in the cooling tank, submitted to temperatures that simulate the conditions of milk in cooling (6ºC), environmental condition (25ºC) and the optimal temperature for the growth of microorganisms (36ºC). Evaluation of the sensibility of Staphylococcus spp. and Klebsiella pneumoniae isolated and in association during the pasteurization process. Results: In Scale 1 of Mac Farland the average of the colony form units of the K. pneumoniae was greater than the colony of Staphylococcus spp. At 6ºC the microorganisms in the milk isolated or in association grew at the same speed. At 25ºC K. pneumoniae associated with Staphylococcus spp. grew more than when they were isolated. At 36ºC K. pneumoniae associated with Staphylococcus spp. grew more then when it was isolated and more than at 25ºC. So we can conclude that the slow pasteurization was effective, because it has reduced at least 90% of the colony form unity in the milk after 30 minutes at 65ºC. Conclusion: By raising the temperature up to 36ºC, a Klebsiella pneumoniae had a superior growth when compared with Staphylococcus spp.; the contamination of milk by Klebsiella pneumoniae (environmental contamination) influences the most the quality of the final product when compared to the contamination by Staphylococcus spp. from mastitis, we can also conclude that the interaction of microorganisms modify the death rate of them. New studies and researches are recommended to a deeper and better comprehension of this process.

O objetivo desta dissertação foi descrever a investigação de um surto de Klebsiella pneumoniae em uma unidade de terapia intensiva neonatal cujo elo entre os casos foi a mão, persistentemente colonizada pelo agente, de uma técnica de enfermagem que apresentava onicomicose em primeiro quirodáctilo esquerdo. Revisou-se a história da aplicação do método epidemiológico na investigação de surtos de infecção relacionada à assistência à saúde. Foi revisada também a literatura pertinente à investigação de surtos na busca de situações semelhantes. Embora seja bem conhecido o papel das mãos de profissional de saúde na transmissão cruzada de agentes causadores de infecção nosocomial, poucos surtos foram publicados em que estes profissionais atuaram como fonte comum e persistente de infecção. É mais freqüente Gram-positivos envolvidos, havendo cinco relatos de Gram-negativos neste contexto. A contribuição desta dissertação é alertar para o risco que profissionais de saúde com alterações tróficas em mãos e anexos podem representar quando atuam em unidades críticas de assistência, assim como durante investigações de surto em que a evidências apontam para uma fonte comum, a busca de profissional com tais alterações deve ser considerada / The aim of this study was to describe the investigation of an outbreak of Klebsiella pneumoniae at a neonatal intensive care unit, associated with the persistently colonized hands of a nurse who had onychomycosis on her left thumb. We reviewed the use of the epidemiological method for investigating healthcare related outbreaks of infections. We also reviewed the literature concerning the hands of health care personnel. Although the hands of healthcare workers (HCW) play a role in the cross-transmission of nosocomial pathogens, there are few reports in which the persistently colonized hands act as a common source perpetuating an outbreak. In this setting, Gram-positive outbreaks are frequently reported and five Gramnegative outbreaks were reported. By means of this work, we have sought to draw attention to the role of the healthcare professional with chronic lesions on the hand skin and/or fingernails. They may pose a risk of persistent transmission of nosocomial pathogens, especially for critical patients with invasive devices. During healthcare infection outbreaks, examination of the hands of HCW should be included in the investigation

Introdução: O leite pode ser considerado um dos alimentos mais completos por apresentar alto teor de proteínas e sais minerais, porém, também é considerado excelente meio de cultura para microrganismos. Objetivos: Identificar o número de UFC de Staphylococcus spp. e Klebsiella pneumoniae, cultivados isoladamente ou em associação, em leite integral estéril, a 6 oC, 27 oC e 37 oC e descrever a curva de morte térmica, quando submetidas ao processo de pasteurização lenta isoladamente ou em associação. Material e Métodos: Avaliação através da contagem das UFC, do comportamento de Staphylococcus spp. e K. pneumoniae, isoladas de tanque de refrigeração de leite, submetidas a temperaturas que simulam o leite em condições de refrigeração (6 °C), condições ambientais (25 °C) e na temperatura ideal de crescimento de patógenos mesófilos (36°C). Avaliação da sensibilidade de Staphylococcus spp. e K. pneumoniae isoladas e em associações ao processo de pasteurização lenta. Resultados: Na escala 1 de Mac Farland a média de UFC de K. pneumoniae foi maior que a de Staphylococcus spp. A 6 °C as bactérias no leite, isoladas ou em associação crescem na mesma velocidade. A 25 °C a K. pneumoniae cresce mais que o Staphylococcus spp. A 25 °C K. pneumoniae associada ao Staphylococcus spp. cresce mais do que quando encontra-se isolada. A 36 °C K. pneumoniae associada ao Staphylococcus spp. cresce mais do que quando encontra-se isolada e ainda mais que a 25 °C. A pasteurização lenta foi efetiva, pois reduziu em no mínimo 90% as UFC no leite após 30 minutos a 65 °C. Conclusão: a medida que aumenta a temperatura, até 36 °C, a Klebsiella pneumoniae apresenta crescimento superior ao Staphylococcus spp., a contaminação de leite por Klebsiella pneumoniae (contaminação ambiental) irá influenciar mais na qualidade do produto final, comparando-se à contaminação por Staphylococcus spp., oriundo de mastite e a interação de microrganismos altera a morte dos mesmos, recomendando-se que novos estudos sejam realizados para que se entenda melhor esse processo. / Introduction: The milk can be considered one of the most complete food for its high contents of protein and minerals, but also it is considered an excellent medium of culture for microorganisms. Objective: To identify the number of the Colony Forming Units of Staphylococcus spp. and Klebsiella pneumoniae, in integral sterile milk, at different temperatures (6ºC, 27ºC e 37ºC) and to describe a thermal curve death, when submitted to the process of slow pasteurization isolated or in association. Materials and methods: Evaluation by counting of the colony forming units and the behavior of the Staphylococcus spp. and Klebsiella pneumoniae, isolated and in association occurred in the cooling tank, submitted to temperatures that simulate the conditions of milk in cooling (6ºC), environmental condition (25ºC) and the optimal temperature for the growth of microorganisms (36ºC). Evaluation of the sensibility of Staphylococcus spp. and Klebsiella pneumoniae isolated and in association during the pasteurization process. Results: In Scale 1 of Mac Farland the average of the colony form units of the K. pneumoniae was greater than the colony of Staphylococcus spp. At 6ºC the microorganisms in the milk isolated or in association grew at the same speed. At 25ºC K. pneumoniae associated with Staphylococcus spp. grew more than when they were isolated. At 36ºC K. pneumoniae associated with Staphylococcus spp. grew more then when it was isolated and more than at 25ºC. So we can conclude that the slow pasteurization was effective, because it has reduced at least 90% of the colony form unity in the milk after 30 minutes at 65ºC. Conclusion: By raising the temperature up to 36ºC, a Klebsiella pneumoniae had a superior growth when compared with Staphylococcus spp.; the contamination of milk by Klebsiella pneumoniae (environmental contamination) influences the most the quality of the final product when compared to the contamination by Staphylococcus spp. from mastitis, we can also conclude that the interaction of microorganisms modify the death rate of them. New studies and researches are recommended to a deeper and better comprehension of this process.

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