Le paludisme demeure une des maladies infectieuses les plus meurtrières au monde. Propagé par la piqûre d’un moustique femelle du genre Anopheles, le parasite du paludisme (Plasmodium) migre dans la circulation sanguine et infecte les cellules hépatiques de la victime. Dans le foie, le parasite se différencie et se reproduit par schizogonie à l’intérieur d’une vacuole parasitophore pour compléter la production de plusieurs milliers de mérozoïtes par cellule hépatique infectée. Ces mérozoïtes sont par la suite libérés dans la circulation sanguine où ils infectent les érythrocytes circulants dans lesquels le parasite subit des cycles d’infection, réplication et libération (processus de sortie actif provoqué par le parasite). Ces cycles répétitifs dans le sang sont à l’origine des symptômes cliniques de la maladie.Des études sur Plasmodium falciparum ont montré que P. falciparum SUB1 (PfSUB1), une protéase à sérine de la famille des subtilisines, est relâchée à l’intérieur de la vacuole parasitophore peu avant la libération des mérozoïtes des hématies. A l’intérieur de cette vacuole, la protéase intervient dans la maturation de protéines membres de la famille des SERA (famille de protéines du type papaïne) ainsi qu’un certain nombre de protéines de surface du mérozoïte (famille des MSP). Un grand intérêt a été porté sur cette protéase, car l’inhibition pharmacologique de l’activité de PfSUB1 bloque le processus de sortie et d’invasion des mérozoïtes dans le stade érythrocytaire du parasite in vitro.Le stade hépatique du parasite est une cible idéale pour le développement de traitements prophylactiques antipaludiques, car il précède la phase symptomatique de la maladie. En conséquence, il est important de mieux comprendre les mécanismes de fonctionnement du parasite à ce stade. Le présent projet avait pour but principal d’effectuer une étude du rôle de SUB1 dans le stade hépatique de Plasmodium. Pour ce faire, ce travail s’est effectué sur l’orthologue de PfSUB1 chez le parasite murin P. berghei. Dans un premier temps, l’expression de PbSUB1 dans les stades hépatiques du parasite a été confirmée en utilisant des anticorps spécifiques et en générant une lignée mutante de P. berghei exprimant la protéine endogène fusionnée à un marqueur hémagglutinine. Par la suite, l’enzyme a été exprimée sous forme recombinante et sa fonction et spécificité ont été partiellement caractérisées. Ce travail confirma que la protéase est capable de cliver des peptides basés sur les séquences de PbMSP1 et PbSERA3, substrats potentiels exprimés dans les stades hépatiques du parasite. Finalement, afin de mieux caractériser la fonction de PbSUB1, deux approches récentes permettant d’effectuer un knock-out conditionnel chez P. berghei ont été testées: le système Tet et la mutagenèse conditionnelle Flp/FRT. Afin d’utiliser cette dernière approche, une nouvelle méthode pour insérer des sites de reconnaissances Flp (sites FRT) dans les régions intergéniques de clones (dans ce cas, un clone comprenant pbsub1 et gènes voisins) provenant d’une bibliothèque génomique de P. berghei a été développée. Pour ce faire, plusieurs techniques d’ingénierie moléculaire ont été utilisées. Ces techniques, basées sur les systèmes de recombinaison de la levure (recombinase Flp) et de phages (recombineering) similaire à ceux utilisés par le projet PlasmoGEM (Pfander et al., 2012), surmontent les problèmes rencontrés par les méthodes conventionnelles pour le placement des sites FRT et sont aussi applicables aux longues séquences codantes. Avec ces nouveaux outils, un knock-out conditionnel de pbsub1 a été généré avec succès in vivo où la délétion du gène est accompagnée de l’expression d’un gène rapporteur (GFP) afin de faciliter l’identification des parasites ayant perdu le gène d’intérêt. A la fin de ce travail, une analyse préliminaire de ces parasites déficients en PbSUB1 suggère un rôle essentiel de cette protéase dans le développement de la phase hépatique du parasite. / Malaria remains one of the deadliest infectious diseases in the world. Propagated by the bite of an infected female Anopheles mosquito, the malaria parasite (Plasmodium) enters the bloodstream and infects hepatocytes. In the liver, the parasite differentiates and reproduces by schizogony within a membrane-bound parasitophorous vacuole (PV) resulting in the production of several thousands of merozoites per infected hepatic cell. These parasites are subsequently released into the blood stream where they infect circulating red blood cells and undergo repetitive cycles of infection, replication, and egress (active release of parasites) which are responsible for the clinical symptoms of the disease.Work on P. falciparum, has shown that P. falciparum SUB1 (PfSUB1), a serine protease of the subtilisin-like family, is discharged into the PV just prior to egress from the erythrocyte and mediates the proteolytic maturation of members of the SERA family (a family of papain-like proteins) as well as a number of merozoite surface proteins (MSPs). Pharmacological inhibition of PfSUB1 activity inhibits both egress and invasion of released merozoites in blood stages in vitro.The liver stage of the parasite is an ideal target for development of prophylactic anti-malarial drugs, as it is clinically silent. It is thus of importance to gain more detailed knowledge about parasite development in this stage. The main aim of this project was to study the role of SUB1 in the liver stage of the parasite life cycle. The work was performed on the orthologue of PfSUB1 in the murine malaria species P. berghei. Initially, expression of PbSUB1 in liver stages was confirmed using specific antibodies and by generating a transgenic P. berghei clone expressing epitope-tagged PbSUB1. Next, recombinant enzymatically-active PbSUB1 was expressed in insect cells and partially characterised with respect to its function and substrate specificity. This confirmed that the protease is able to process substrates based on PbMSP1 and PbSERA3, two putative substrates expressed in late hepatic stages of the parasite.Finally, to further study PbSUB1 function, two conditional gene knock-out approaches were applied to study the phenotypic consequences of loss of PbSUB1 expression. Working from a ~10 kb genomic DNA library clone comprising pbsub1 and flanking genes, a method to insert Flp recombinase recognition (FRT) sites into intergenic regions was developed. This was achieved by combining inducible Flp activation in E. coli with recombinase mediated engineering techniques similar to those that underlie the PlasmoGEM project (Pfander et al., 2012). This strategy overcomes challenges of existing techniques and is also suitable for flanking large genes with FRT sites. With these newly generated tools, an inducible knock-out of pbsub1 was successfully generated in vivo, in which stage-specific excision of the gene was accompanied by concomitant induction of GFP expression, facilitating identification of the knock-out parasites. A preliminary analysis of these PbSUB1-deficient parasites suggests an essential role for the protease in the development of liver stage schizonts.

O fenômeno de detonação que ocorre em motores de combustão interna é uma restrição de desempenho para baixas emissões de poluentes, altas solicitações de torque (as quais resultariam em mais potência entregue pelo motor), economia de combustível e também é uma fonte de ruídos desagradáveis ao condutor do veículo. No Brasil, tal fenômeno pode ter ainda uma utilidade benéfica se identificado de forma leal, tendo em vista que a detonação é mais fácil de ocorrer com gasolina do que com álcool. Assim, a ocorrência de detonação pode ser um auxílio no gerenciamento otimizado da injeção, ignição, bem como pode possibilitar a identificação do tipo de combustível. Para isso, técnicas de processamento de sinais podem ser utilizadas para caracterizar tal fenômeno. Este trabalho tem como foco a identificação (ocorrência) e caracterização (intensidade e duração) do sinal de detonação utilizando filtragem adaptativa e estimadores de potência, onde o desempenho individual e combinado destes algoritmos é avaliado. Inicialmente, um modelo do sinal de detonação é proposto e amostras do sinal real são obtidas e com isso, mostra-se que as técnicas propostas rendem eficientes caracterizadores do fenômeno. / The knock phenomenon that happens in internal combustion engines is a constraint against performance in terms of low pollution rates, higher torque requests (which would imply higher delivered power by the engine), mileage as well as it is an annoying source of noise to the user. In Brazil, such phenomenon may be useful if identified accurately, due to the fact that knock has a higher likelihood to happen with gasoline than ethanol. Thus, the occurrence of knock may be a support in an optimized management of fuel injection and sparking time, as well as it may provide means to identify the fuel being used. In order to achieve such goal, signal processing techniques may be used for characterization of such phenomenon. This work has the focus of identifying (occurrence) and characterize (intensity and duration) of knock signal using adaptive filtering and power estimators, where the individual and combined performance are assessed. To begin with, a knock signal model is proposed as well as samples of the real signal are taken, with that, it is shown that the proposed techniques offer efficient detectors of the phenomenon.

Depuis quelques années, le poisson zèbre (Danio rerio) est devenu un modèle de choix pour l'étude du système nerveux et de ses fonctions. Récemment, des technologies nouvelles d'édition du génome permettent la génération d'allèles mutés de manière constitutionnelle et l'étude fonctionnelle de gènes chez ce modèle vertébré. Néanmoins, certains loci nécessite une inactivation spatiotemporelle précise et contrôlée. La première partie de ma thèse décrit la mise au point d'une nouvelle stratégie de disruption génétique de manière tissu-spécifique, basée sur la technologie du CRISPR/Cas9 et du système UAS/Gal4. Cette technique permet l'introduction de mutations somatiques dans des tissus, des clones ou des cellules individuelles préalablement génétiquement marqués, rendant ainsi possible le suivi in vivo de l'effet de la mutation générée grâce au gène rapporteur. La seconde partie de ma thèse se centre sur l'étude fonctionnelle d'une famille des gènes, les meteorines, durant le développement du système nerveux et lors du ciblage axonale chez le poisson zèbre. Les Meteorines sont des protéines conservées chez les vertébrés qui ont été impliquées dans la prolifération, la différentiation des progéniteurs de neurones et notamment dans l'élongation axonale in vitro. Nous avons pu mettre en évidence que les meteorines sont exprimées le long de la ligne médiane du système nerveux chez les larves et au niveau du plancher de la partie postérieure du cerveau et de la moelle épinière. Par l'utilisation du CRISPR/Cas9, nous avons généré des lignées mutantes pour chaque gène meteorine et avons ainsi procédé à l'analyse de l'établissement des projections axonales dans ces lignées mutantes. / In recent years, the zebrafish (Danio rerio) has emerged as a powerful model organism to study neuronal circuit development and function. To date, different genome editing technologies allow the generation of constitutive mutant alleles, permitting the study of gene loss-of-function in this vertebrate model. Nevertheless, to assess the role of certain loci it might be required a precise spatiotemporal control of gene inactivation. The rst part of my thesis describes a novel strategy for tissue-specific gene disruption based on the CRISPR/Cas9 and the Gal4/UAS systems. The described technique allows the induction of somatic mutations in genetically labeled tissues, cell clones or single cells, making it possible to follow the effect of gene disruption in vivo via reporter gene expression. The second part of the thesis focuses on the functional analysis of the role of the meteorin gene family during neuronal development and axonal targeting in zebra sh. Meteorin family is conserved among vertebrates and its members have been shown to be involved in neuronal progenitor proliferation and differentiation and axonal elongation, in vitro. We used the zebrafish nervous system as a model to dissect the role of Meteorins during embryonic development, focusing on their potential role as novel guidance molecules. Interestingly, we found that genes belonging to the meteorin family are expressed along the midline of the larval central nervous system and at the floor plate in the hindbrain and spinal cord. We generated CRISPR/Cas9 mutant lines carrying out-of-frame deletions in the coding sequence of each member of the zebrafish meteorin family and we performed a comprehensive analysis of the establishment of axonal projections in the mutants. Our data pointed out that metrns loss-of-function affects the earliest process of axonal development, demonstrating a crucial role in the process of axonal outgrowth for this new family of evolutionary conserved guidance molecules.

Atherosklerotisch bedingte Herz-Kreislauferkrankungen zählen weltweit zu den häufigsten Todesursachen. Die vorliegende Arbeit befasst sich in einem Mausmodell mit der Identifikation neuer Genorte, welche die Ausprägung der Atherosklerose und deren Kofaktoren beeinflussen. Zu diesem Zweck wurde eine Kopplungsuntersuchung in einer Kreuzung Atherosklerose-empfindlicher C57BL/6 und BALB/c Mäuse auf dem LDL-Rezeptor defizienten Hintergrund durchgeführt. Außer der Größe der atherosklerotischen Läsionen wurden 61 weitere Phänotypen bestimmt. Als Hauptergebnis konnte ein neuer Genlocus auf dem proximalen Chromosom 2 identifiziert werden, welcher einen Einfluss auf die Größe der atherosklerotischen Läsionen an der Aortenwurzel hat. Des Weiteren zeigte sich eine Co-Segregation von Lipoproteinen (Very-Low-Density Lipoprotein (VLDL) Cholesterin und High-Density Lipoprotein (HDL) Cholesterin mit diesem Locus sowie eine Korrelation dieser Lipide mit der Läsionsgrösse. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass der Effekt des Chromosom 2 Lokus auf die Atherosklerose durch genetische Faktoren des Fettstoffwechsels bedingt ist. Weitere Experimente sind notwendig um den QTL weiter einzuengen und die verantwortlichen Gene zu identifizieren.

O fenômeno de detonação que ocorre em motores de combustão interna é uma restrição de desempenho para baixas emissões de poluentes, altas solicitações de torque (as quais resultariam em mais potência entregue pelo motor), economia de combustível e também é uma fonte de ruídos desagradáveis ao condutor do veículo. No Brasil, tal fenômeno pode ter ainda uma utilidade benéfica se identificado de forma leal, tendo em vista que a detonação é mais fácil de ocorrer com gasolina do que com álcool. Assim, a ocorrência de detonação pode ser um auxílio no gerenciamento otimizado da injeção, ignição, bem como pode possibilitar a identificação do tipo de combustível. Para isso, técnicas de processamento de sinais podem ser utilizadas para caracterizar tal fenômeno. Este trabalho tem como foco a identificação (ocorrência) e caracterização (intensidade e duração) do sinal de detonação utilizando filtragem adaptativa e estimadores de potência, onde o desempenho individual e combinado destes algoritmos é avaliado. Inicialmente, um modelo do sinal de detonação é proposto e amostras do sinal real são obtidas e com isso, mostra-se que as técnicas propostas rendem eficientes caracterizadores do fenômeno. / The knock phenomenon that happens in internal combustion engines is a constraint against performance in terms of low pollution rates, higher torque requests (which would imply higher delivered power by the engine), mileage as well as it is an annoying source of noise to the user. In Brazil, such phenomenon may be useful if identified accurately, due to the fact that knock has a higher likelihood to happen with gasoline than ethanol. Thus, the occurrence of knock may be a support in an optimized management of fuel injection and sparking time, as well as it may provide means to identify the fuel being used. In order to achieve such goal, signal processing techniques may be used for characterization of such phenomenon. This work has the focus of identifying (occurrence) and characterize (intensity and duration) of knock signal using adaptive filtering and power estimators, where the individual and combined performance are assessed. To begin with, a knock signal model is proposed as well as samples of the real signal are taken, with that, it is shown that the proposed techniques offer efficient detectors of the phenomenon.

Même si les acteurs majeurs du développement musculaire ont été identifiés et les voies de transductions décrites, d’autres régulateurs restent encore à découvrir. Un crible ARNi pratiqué sur un modèle cellulaire couramment utilisé, la lignée myoblastique C2C12, a identifié 20 nouveaux gènes potentiellement impliqués dans la myogenèse in vitro. Au cours de ma thèse, deux de ces gènes ont été invalidés sur modèle souris en utilisant la technologie CRISPR/Cas9 pour valider in vivo leur implication. Pour l’un d’entre eux, seuls les animaux hétérozygotes ont pu être étudiés puisqu’une létalité précoce a été observée chez les homozygotes mutés. Aucune anomalie du développement musculaire n’a été mise en évidence. Une étude plus fine dans les premières phases du développement embryonnaire nous a permis de montrer le rôle indispensable de cette protéine précocement. L’étude du second gène – dont les analyses se poursuivent – semble confirmer in vivo le rôle de ce gène au cours de la myogenèse. Pour éviter la survenue de létalité embryonnaire et observer rapidement les effets de l’invalidation d’autres gènes, une technique de transgenèse somatique s’appuyant sur l’ARN interférence a été mis en place via l’injection de lentivirus contenant une cassette d’expression de shRNA directement dans le tibialis antérieur des souris. La validation de cette approche a été faite sur le gène de la myostatine, régulateur négatif du développement musculaire, et a montré une diminution de l’expression du gène associée à une augmentation de l’aire des fibres musculaires. La même approche appliquée à trois autres gènes renforce l’hypothèse de l’implication d’un des gènes dans le développement musculaire. Cette approche permet donc un crible rapide « in vivo » de gènes identifiés in vitro. Cependant, certaines améliorations doivent être apportées au protocole au regard des résultats obtenus. / Even if the major actors and transduction pathways of muscle development have been identified, there are still unknown regulatory factors. An in vitro RNAi screening performed on C2C12 myoblastic cells has permitted to identify 20 novel genes potentially implicated in myogenesis. During my thesis, two of these genes were invalidated on mouse model using CRISPR/Cas9 technology in order to confirm their implication in vivo. For the first gene, due to an early lethality occurring in homozygous mutated animals, only heterozygous animals were studied and there was no muscular development anomaly detected. A refined study of earlier stages of embryonic development permitted to show the essential role of the protein in these phases. The study of the second gene, still in progress, seems to confirm in vivo the implication of the gene on the myogenesis. In order to avoid embryonic lethality due to germline invalidation and to observe more rapidly the effects of gene invalidation in muscle, we developed a technique of somatic transgenesis based on RNA interference. Lentivirus containing a shRNA expression cassette was injected directly into the tibialis anterior of mice. We validated this approach on Myostatin gene, a well-known negative regulator of muscle development, showing that the decrease of Myostatin gene expression was associated to an increase of muscle fibers area. The same approach was used with three genes and support the hypothesis of the implication of one of them in muscle development. Thus, this approach allows a rapid “in vivo” screening of in vitro identified genes. Nonetheless, some improvements should be brought on the protocol according to the first results.

Ein durch „Ca2+ Release Activated Ca2+ (CRAC)“-Kanal vermittelter Ca2+-Einstrom ist unverzichtbar für die vollständige Aktivierung von T-Zellen und eine produktive Immunantwort. Im Jahr 2006 führte die Entdeckung des transmembranen Proteins Orai1, einer porenbildenden Untereinheit des CRAC-Kanals, zu einem besseren Verständnis dieses Signalweges. Eine Mutation in Orai1 hat durch die Aufhebung der CRAC-Kanal Funktion eine schwere kombinierte Immundefizienz (SCID) zur Folge (Feske, S. et al. 2006). Die im Rahmen dieser Arbeit präsentierten Experimente hatten die nähere Erforschung der Rolle von Orai1 in Bezug auf die Aktivierung und Entwicklung von Lymphozyten sowie auf die pathogenetische Bedeutung für humane Immundefektsyndrome zum Ziel. So konnte hier durch das Sequenzieren genomischer DNA mehrerer SCID-Patienten eine neue Mutation in Orai1 aufgedeckt werden. Mithilfe intrazellulärer Durchflusszytometrie und Real-Time-PCR gelang es, die Expression von Orai1 auf humanen und murinen Immunzellen, einschließlich T- und B-Lymphozyten, nachzuweisen. Darüber hinaus wurden Orai1 „knock-in“ Mäuse analysiert, welche transgen für eine bei zwei SCID-Patienten gefundene Mutation (R91W) (Feske, S. et al. 2006) sind. Dadurch war es möglich die Funktion von Orai1 und die des CRAC-Kanal vermittelten Ca2+-Einstroms für die Entwicklung und Aktivierung von Lymphozyten zu analysieren. Diese transgenen Mäuse stellen das zu diesem Zeitpunkt erste Tiermodell dar, mit dessen Hilfe die Rolle von CRAC-Kanälen in vivo studiert werden kann.

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Le lupus érythémateux disseminé (LED) est une maladie chronique auto-immune caractérisée par la production d'autoanticorps dirigés contre les antigènes nucléaires. Des nombreuses études indiquent un rôle des récepteurs Toll-like (TLR). Des études antérieures de notre laboratoire ont révélé que le TLR8 murin contrôle la fonction de TLR7 dans les cellules dendritiques et est aussi impliqué dans le lupus. TLR9 contrôle également le lupus dépendant de TLR7. Mon projet de thèse avait deux objectifs dont le premier était de comprendre comment le TLR8 et TLR9 contribuent au lupus dépendant de TLR7. En outre, nous avons révélé que TLR8 contrôle l'expression de TLR7 dans les cellules dendritiques, tandis que le TLR9 contrôle la fonction de TLR7 dans les cellules B. Le deuxième objectif était d'étudier l'implication du répresseur transcriptionnel Gfi-1 dans la signalisation des TLR et le développement de lupus en utilisant des souris Genista qui portent une mutation ponctuelle dans le gène Gfi-1. Nous avons constaté que les souris Genista développent un lupus dépendant de TLR7 et que Gfi-1 agit comme un répresseur de la transcription en aval de TLR7 et contrôle l'expression d'Interféron de type I dépendante des TLR. Ainsi, le déséquilibre des interactions entre TLR ainsi que les facteurs transcriptionnels en aval de ces TLR peuvent conduire à des mécanismes d'inflammation et d'auto-immunité qu'il est important de prendre en compte dans le développement d'approches thérapeutiques nouvelles ciblant les TLRs. / Systemic lupus erythematosus is a chronic autoimmune disease characterized by production of autoantibodies against nuclear antigens. Many studies indicate a role for Toll-like receptors (TLRs) in the initiation and establishment of systemic lupus erythematosus (SLE). Previous studies in the lab revealed that murine TLR8 controls TLR7 function in dendritic cells (DCs) and is implicated in SLE. TLR9 also controls TLR7-mediated lupus. My thesis had two aims: the first was to understand how the cooperation of TLR8 and TLR9 contributes to TLR7-mediated lupus. By studying double TLR8/9-deficient mice we found that TLR8 and TLR9 have an additive effect on controlling TLR7-mediated lupus, where TLR8 controls TLR7 function on DCs, while TLR9 restrains TLR7 responses in B cells. The second aim of my thesis was to investigate the implication of Gfi-1 in lupus and TLR signaling by studying Genista mice that carry a hypomorphic mutation of Gfi-1. We found that Genista mice develop TLR7-dependent lupus and that Gfi-1 acts as a transcriptional repressor downstream of TLR7 and controls type-I IFN expression. Thus, unbalancing TLR-interactions and transcription factors downstream of TLRs can lead to inflammation and autoimmunity and these mechanisms have to be taken into account when novel therapeutic approaches are developed that target TLRs.