Due to the reversing age pyramid in Germany, more and more people are already suffering from joint cartilage damage. But not only age, but also accidents and sports injuries and being overweight can lead to irreversible cartilage defects. Although there are various treatment options, the previous methods cannot be considered a permanent cure. As part of the international research project BIO-CHIP, a promising treatment method with novel drugs was to be investigated. The patient's own cartilage cells from the nose serve as the starting material for the drug, a manufactured cartilage implant. These are isolated, multiplied and ultimately cultivated on a matrix to form a cartilage implant. In addition to toxicological and biological safety tests, an essential prerequisite for the approval of the implant is the assessment of the viability. This was previously carried out on the basis of histology from the pathology department. The aim of the present work was the development and validation of a standardized and objective viability test for the chondrocytes within the cartilage matrix. For this, the LDH was used as a marker for irreversibly damaged cells. The LDH concentration could be measured with the CyQuant LDH assay by measuring the absorption. It could be proven that LDH has the required stability and detectability in the medium. With the help of the lysis, of cultivated mini-cartilage implants, the maximum achievable LDH concentrations could be determined. A calibration curve was generated using these concentrations. This serves to assess the viability of future measured absorptions of the supernatant medium. The developed method does not require any invasive interventions on the implant and is characterized by its simple implementation, since only the protrusion has to be measured. The validation of the method certified a high level of robustness, linearity, accuracy and precision. / Aufgrund der sich umkehrenden Alterspyramide in Deutschland leiden bereits jetzt immer mehr Menschen an Gelenkknorpelschäden. Doch nicht nur das Alter, sondern auch Unfälle und Sportverletzungen und Übergewicht können zu irreversiblen Knorpeldefekten führen. Obwohl es diverse Behandlungsmöglichkeiten gibt, können die bisherige Methoden nicht als dauerhafte Heilung betrachtet werden. Im Rahmen des internationalen Forschungsprojektes BIO-CHIP sollte eine vielsprechende Behandlungsmethode mit neuartigen Arzneimitteln untersucht werden. Als Ausgangsmaterial des Arzneimittels, ein hergestelltes Knorpelimplantat, dienen patienteneigene Knorpelzellen aus der Nase. Diese werden isoliert, vermehrt und letztlich auf einer Matrix zu einem Knorpelimplantat kultiviert. Wesentliche Voraussetzung für die Implantatfreigabe stellt neben toxikologischen und biologischen Unbedenklichkeitstests die Beurteilung der Viabilität dar. Diese wurde bisher anhand von Histologieschnitten von der Pathologie durchgeführt. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung und Validierung eines standardisierten und objektiven Viabilitätstests für die Chondrozyten innerhalb der Knorpelmatrix. Hierfür wurde die LDH als Marker für irreversibel geschädigte Zellen verwendet. Die LDH Konzentration konnte mit dem CyQuant LDH-Assay durch die Messung der Absorption gemessen werden. Es konnte nachgewiesen werden, dass LDH die erforderliche Stabilität und Nachweisbarkeit im Medium besitzt. Mithilfe der Lyse, analog zum Herstellungsprozess, gezüchteter Mini-Knorpelimplantate, konnten die maximal erreichbaren LDH Konzentrationen ermittelt werden. Mithilfe dieser Konzentrationen wurde eine Eichkurve generiert. Diese dient als Beurteilung der Viabilität zukünftig gemessener Absorptionen des Überstandmediums. Das entwickelte Verfahren erfordert keine invasiven Eingriffe am Implantat und zeichnet sich durch eine einfache Durchführung aus, da nur der Überstand gemessen werden muss. Die durchgeführte Validierung der Methode bescheinigte eine hohe Robustheit, Linearität, Genauigkeit und Präzision.

In dieser Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass plastik-adhärent wachsende, multipotente Vorläuferzellen, die eine für MSCs charakteristische Kombination von Oberflächenantigenen tragen, aus allen vier untersuchten Geweben des arthrotischen Hüftgelenks isoliert werden konnten. MSC-ähnliche Zellen können somit nicht nur in der Spongiosa und im Gelenkknorpel, sondern auch in der anterioren Gelenkkapsel und dem Ligamentum capitis femoris (LCF) des arthrotisch veränderten menschlichen Hüftgelenks nachgewiesen werden. Die FACS Analyse der Oberflächenantigene auf Zellen, die aus den vier unterschiedlichen Geweben eines beispielhaft gewählten Spenders isoliert wurden, zeigte eine deutliche Expression der Antigene CD44, CD73, CD90 und CD105. Unabhängig vom Nativgewebe zeigten somit alle untersuchten Zellen ein für MSCs charakteristisches, aber nicht spezifisches Profil an Antigenen auf ihrer Oberfläche. Eine Übereinstimmung mit den ISCT Kriterien für MSCs war aufgrund der fehlenden Kontrolle hämatopoetischer Marker nicht möglich. Die multipotente Differenzierung der isolierten Zellen erfolgte mithilfe spezifischer Differenzierungsmedien in Monolayer-Kulturen oder für die chondrogene Differenzierung in dreidimensionalen Pellet-Kulturen. Nach 21 Tagen konnten in allen differenzierten Kulturen histologisch und immunhistochemisch klare Zeichen der Osteo- und Adipogenese detektiert werden, während die Auswertung spezifischer Markergene eine klare Steigerung der Expression dieser im Vergleich zu den Negativkontrollen zeigte. Histologische und immunhistochemische Auswertungen bestätigten auch eine erfolgreiche chondrogene Differenzierung der Zell-Pellets aus Spongiosa, Knorpel und Kapsel. Lediglich in den chondrogen differenzierten Zell-Pellets aus dem LCF konnte immunhistochemisch keine Bildung des knorpelspezifischen Matrixproteins Col II nachgewiesen werden. Mikroskopisch zeigten vor allem die differenzierten MSC-Pellets aus Spongiosa und Knorpel morphologisch eine starke Ähnlichkeit zu hyalinem Knorpelgewebe. Trotz dieser Abstufungen zeigten sich für die relative Expression der chondrogenen Markergene AGG, Col II und Sox-9 keine signifikanten Unterschiede zwischen den differenzierten MSC-Kulturen der vier unterschiedlichen Nativgewebe. Ein positiver Nachweis des Markers Col X wies nach 27 Tagen sowohl in differenzierten als auch in undifferenzierten Pellet-Kulturen auf eine leichte chondrogene Hypertrophie hin. Zusammenfassend zeigten sich keine signifikanten Unterschiede im Hinblick auf das osteogene und adipogene Differenzierungspotential aller untersuchten Zellen. Während das chondrogene Differenzierungspotential der Zellen aus Spongiosa, Knorpel und Kapsel sich aus histologischer und immunhistochemischer Sicht ähnelte, zeigten Pellets aus dem LCF ein schwächeres chondrogenes Differenzierungspotential in vitro. Obwohl somit erstmals MSC-ähnliche Zellen aus dem LCF und Gewebsproben, die neben dem Stratum synoviale auch das Stratum fibrosum der Hüftgelenkskapsel beinhalteten, charakterisiert wurden, sind weitere wissenschaftliche Arbeiten notwendig, um das multipotente Differenzierungspotential dieser Zellen zu optimieren. / This study showed for the first time that plastic-adherent growing multipotent progenitor cells carrying a combination of surface antigens characteristic of MSCs could be isolated from four tissues of the arthritic hip joint.MSC-like cells can thus be detected not only in cancellous bone and articular cartilage, but also in the anterior joint capsule and ligamentum capitis femoris (LCF) of the osteoarthritic human hip joint. FACS analysis of surface antigens on cells isolated from the four different tissues of an exemplarily selected donor showed a clear expression of the antigens CD44, CD73, CD90 and CD105. Thus, irrespective of the native tissue, all cells examined showed a profile of antigens on their surface that is characteristic but not specific for MSCs. However, cells did not meet the ISCT criteria since hematopoietic markers were not analyzed. Multipotent differentiation of the isolated cells was performed using specific differentiation media in monolayer cultures or three-dimensional pellet cultures for chondrogenic differentiation. After 21 days, clear signs of osteo- and adipogenesis could be detected histologically and immunohistochemically in all differentiated cultures, while evaluation of specific marker genes showed a clear increase in the expression of these compared with negative controls. Histological and immunohistochemical evaluations also confirmed successful chondrogenic differentiation of cell pellets from cancellous bone, cartilage, and capsule. Chondrogenically differentiated cell pellets from the LCF showed no formation of cartilage-specific matrix protein Col II. Microscopically the differentiated MSC pellets from cancellous bone and cartilage showed strong morphological similarity to hyaline cartilage tissue. Despite these gradations, there were no significant differences between the differentiated MSC cultures of the four different native tissues for the relative expression of the chondrogenic marker genes AGG, Col II, and Sox-9. Positive detection of the marker Col X indicated mild chondrogenic hypertrophy after 27 days in both differentiated and undifferentiated pellet cultures. In conclusion, there were no significant differences in osteogenic and adipogenic differentiation potential of all cells examined. While chondrogenic differentiation potential of progenitor cells isolated from cancellous bone, cartilage, and capsule was similar from a histological and immunohistochemical point of view, pellets from LCF showed a weaker chondrogenic differentiation potential in vitro. Although our current research proved the presence of MSC-like cells in the LCF and full-thickness tissue samples of the hip joint capsule further scientific work is required to evaluate the differentiation of the chondrogenic cells in the LCF. Histological and immunohistochemical evaluations also confirmed successful chondrogenic differentiation of cell pellets from cancellous bone, cartilage, and capsule. Only in the chondrogenically differentiated cell pellets from the LCF could no formation of the cartilage-specific matrix protein Col II be detected by immunohistochemistry. Microscopically, especially the differentiated MSC pellets from cancellous bone and cartilage showed strong morphological similarity to hyaline cartilage tissue. Despite these gradations, there were no significant differences between the differentiated MSC cultures of the four different native tissues for the relative expression of the chondrogenic marker genes AGG, Col II, and Sox-9. Positive detection of the marker Col X indicated mild chondrogenic hypertrophy after 27 days in both differentiated and undifferentiated pellet cultures. In conclusion, there were no significant differences in osteogenic and adipogenic differentiation potential of all cells examined. While the chondrogenic differentiation potential of cells from cancellous bone, cartilage, and capsule were similar from a histological and immunohistochemical point of view, pellets from LCF showed a weaker chondrogenic differentiation potential in vitro. Although our current research proved the presence of MSC-like cells in the LCF and full-thickness tissue samples of the human hip joint capsule further scientific work is required to optimize the multipotent differentiation potential of these cells.

Osteoarthrose ist eine häufige Erkrankung des Menschen, die mit einer deutlichen Morbidität und körperlichen Einschränkungen assoziiert ist. Weil Knorpelgewebe avaskulär ist und die Chondrozyten sich in einem postmitotischen Zustand befinden, besitzt Knorpel nur sehr geringes Selbstheilungspotenzial. Es gibt momentan keine effektive Therapie der Arthrose. Obwohl regenerative Ansätze mit dem Tissue Engineering von Knorpelgewebe vielversprechende Therapiealternativen darstellen, stellt die mangelnde laterale Integration von Knorpelgewebe ein chronisches Problem dar, das die Implantation von Knorpelkonstrukten vor Schwierigkeiten stellt. Die optimale Integrationsmethode sollte das Gewebe stark verbinden, klinisch schnell und einfach angewendet werden können, ein hohes Maß an Biokompatibilität besitzen und außerdem die Gewebereparatur fördern. In dieser Arbeit wurden natives Fibrinogen und unmodifizierte Gelatine in gelöster Form mittels einer neuartigen und schnellen Photooxidationsmethode unter Verwendung von Rutheniumkomplexen und Licht aus dem sichtbaren Spektrum zu Klebern vernetzt. Dabei ließ sich feststellen, dass insbesondere der Kleber aus Ruthenium und Gelatine Potenzial besitzt, Einsatz als Bioadhäsivum im Bereich Tissue Engineering von Knorpelgewebe zu finden. Ausschlaggebend dafür ist die Herstellung einer suffizienten Sofortadhäsion zwischen gegenüberliegenden Knorpelflächen einerseits, sowie die Förderung der Langzeitintegration andererseits, die für eine Stimulierung der Gewebereparatur im echten Knorpeldefekt vielversprechend ist. Weitere Forschung ist jedoch nötig, um die Abgrenzung der mechanischen Integration gegenüber der Kontrollgruppe besser zu unterstreichen und das Material weiteren Untersuchungen wie einer Analyse des Quellverhaltens zu unterziehen. Schließlich sollte das regenerative Potenzial des Gewebeklebers in in vivo Tiermodellen weiter systematisch untersucht werden. Zudem lieferte diese Arbeit vielversprechende Ergebnisse für den potenziellen Einsatz von RuGel im Bereich hydrogelbasiertes Tissue Engineering. / Osteoarthritis is a common human disease associated with significant morbidity and physical limitations. Because cartilage tissue is avascular and chondrocytes are in a post-mitotic state, cartilage has very little self-healing potential. There is currently no effective therapy for osteoarthritis. Although regenerative approaches using tissue engineering of cartilage tissue are promising therapeutic alternatives, the lack of lateral integration of cartilage tissue is a chronic problem that poses difficulties for the implantation of cartilage constructs. The optimal integration method should strongly connect the tissue, be clinically fast and easy to apply, have a high degree of biocompatibility, and also promote tissue repair. In this work, native fibrinogen and unmodified gelatin in dissolved form were crosslinked into adhesives by a novel and rapid photooxidation method using ruthenium complexes and visible spectrum light. It was found that the adhesive made of ruthenium and gelatin in particular has the potential to be used as a bioadhesive in the field of tissue engineering of cartilage tissue. Crucial for this is the establishment of a sufficient immediate adhesion between opposing cartilage surfaces on the one hand, and the promotion of long-term integration on the other hand, which is promising for stimulating tissue repair in real cartilage defects. However, further research is needed to better emphasize the delineation of mechanical integration versus the control group and to subject the material to further investigations such as an analysis of swelling behavior. Finally, the regenerative potential of the tissue adhesive should be further systematically investigated in in vivo animal models. In addition, this work provided promising results for the potential use of RuGel in hydrogel-based tissue engineering.

Die stark limitierte intrinsische Regenerationsfähigkeit des hyalinen Gelenkknorpels stellt auch in der modernen Medizin eine große Herausforderung dar. Während eine Vielzahl von knorpelchirurgischen Techniken am Kniegelenk koexistieren, bleibt die Selektion des am besten geeigneten Therapieverfahrens eine zentrale Herausforderung des orthopädischen Chirurgen. Hierzu bieten in Zeiten evidenzbasierter Medizin medizinische Register die Möglichkeit, klinische Behandlungsdaten systematisch in einem breiten Patientenkollektiv zu erfassen, die klinische Versorgungsrealität adäquat abzubilden sowie neue Behandlungsstrategien und Hypothesen zu generieren. Das Knorpelregister der DGOU bietet als webbasierte Registerform eine besonders moderne, effiziente und unbürokratische Form der Patientennachverfolgung über subjektiv bewertete und validierte Funktionsscores. Für das gesamte Registerkollektiv von 100 Patienten an der Orthopädischen Klinik-König-Ludwig Haus ergaben sich bereits sechs Monate nach dem knorpelchirurgischen Eingriff signifikant höhere Funktionsscores im IKDC und KOOS, welche sich auch im mittelfristigen Verlauf von zwölf Monaten noch signifikant erhöht gegenüber ihren präoperativen Werten zeigten. Die mediale Femurkondyle und knorpelige Patellarückfläche waren im Registerkollektiv am häufigsten von Defekten betroffen. Meist handelte es sich hierbei um drittgradige Defekte nach ICRS degenerativer Genese. Während das mechanische Débridement bei großflächigem, arthrotischem Gelenkknorpelverschleiß keine suffiziente Therapieoption bietet, ist zum Nutzen und Effektivität des Débridements bei fokalen, umschriebenen Gelenkknorpeldefekten bisher nur wenig bekannt. Im Registerkollektiv zeigte sich für das isoliert mechanische Débridement von Gelenkknorpeldefekten eine signifikante Verbesserung der subjektiven Funktionsscores. Im Falle begleitend durchgeführter meniskuschirurgischer Eingriffe zeigt sich die Datenlage deutlich heterogener und bietet Anlass für weiteren wissenschaftlichen Diskurs. / The very limited ability for intrinsic regeneration of the hyaline cartilage poses an enormous challenge even in the days of modern medicine. While there exists a plethora of surgical techniques for cartilage repair, the orthopedic surgeon is regularly faced with the challenge of selecting the most appropriate therapeutic modality. Therefore, in times of evidence-based medicine, medical registries provide the ability of systematic patient evaluation, thereby reflecting data of real word clinical care in the routine setting, which allows for the development of new treatment strategies and hypotheses. The cartilage registry DGOU as a fully web based organized registry provides a particularly modern, efficient and unbureaucratic way for systematic patient evaluation and follow-up with the use of patient reported outcome measures. With respect to the included collective of a total of 100 patients at the orthopedic department König-Ludwig-Haus, significantly improved patient reported outcome measures of the KOOS and IKDC were observed as early as six months after the initial surgical procedure. Patient reported outcomes were still improved significantly in the mid-term follow-up of twelve months after the initial surgery. The medial femoral condyle and the patellar surface turned out to be the most frequent site of cartilage defects. Most of the times, cartilage defects were graded as grade III defects according to ICRS. Cartilage damage was mostly due to degenerative deterioration. According to the literature available, the usage of the mechanical debridement cannot be recommended for the extensive, arthritic type of cartilage defect. However, data on the efficiency of mechanical debridement for focal, non-arthritic cartilage defects are sparse and controversial. In this study, for the patients evaluated, a significant improvement of the patient reported outcome measures were observed after the mechanical debridement of focal cartilage defects. In the cases of concomitantly performed meniscal surgery, data turned out to be of a more heterogenous appearance which gives cause for further scientific discourse.

The key hypothesis of this work represented the question, if mimicking the zonal composition and structural porosity of musculoskeletal tissues influences invading cells positively and leads to advantageous results for tissue engineering. Conventional approaches in tissue engineering are limited in producing monolithic “scaffolds” that provide locally variating biological key signals and pore architectures, imitating the alignment of collagenous fibres in bone and cartilage tissues, respectively. In order to fill this gap in available tissue engineering strategies, a new fabrication technique was evolved for the production of scaffolds to validate the hypothesis. Therefore, a new solidification based platform procedure was developed. This process comprises the directional solidification of multiple flowable precursors that are “cryostructured” to prepare a controlled anisotropic pore structure. Porous scaffolds are attained through ice crystal removal by lyophilisation. Optionally, electrostatic spinning of polymers may be applied to provide an external mesh on top or around the scaffolds. A consolidation step generates monolithic matrices from multi zonal structures. To serve as matrix for tissue engineering approaches or direct implantation as medical device, the scaffold is sterilized. An Adjustable Cryostructuring Device (ACD) was successively developed; individual parts were conceptualized by computer aided design (CAD) and assembled. During optimisation, a significant performance improvement of the ACDs accessible external temperature gradient was achieved, from (1.3 ± 0.1) K/mm to (9.0 ± 0.1) K/mm. Additionally, four different configurations of the device were made available that enabled the directional solidification of collagenous precursors in a highly controlled manner with various sample sizes and shapes. By using alginate as a model substance the process was systematically evaluated. Cryostructuring diagraphs were analysed yielding solidification parameters, which were associated to pore sizes and alignments that were determined by image processing. Thereby, a precise control over pore size and alignment through electrical regulation of the ACD could be demonstrated. To obtain tissue mimetic scaffolds for the musculoskeletal system, collagens and calcium phosphates had to be prepared to serve as raw materials. Extraction and purification protocols were established to generate collagen I and collagen II, while the calcium phosphates brushite and hydroxyapatite were produced by precipitation reactions. Besides the successive augmentation of the ACD also an optimization of the processing steps was crucial. Firstly, the concentrations and the individual behaviour of respective precursor components had to be screened. Together with the insights gained by videographic examination of solidifying collagen solutions, essential knowledge was gained that facilitated the production of more complex scaffolds. Phenomena of ice crystal growth during cryostructuring were discussed. By evolutionary steps, a cryostructuring of multi-layered precursors with consecutive anisotropic pores could be achieved and successfully transferred from alginate to collagenous precursors. Finally, very smooth interfaces that were hardly detectable by scanning electron microscopy (SEM) could be attained. For the used collagenous systems, a dependency relation between adjustable processing parameters and different resulting solidification morphologies was created. Dehydrothermal-, diisocyanate-, and carbodiimide- based cross linking methods were evaluated, whereby the “zero length” cross linking by carbodiimide was found to be most suitable. Afterwards, a formulation for the cross linking solution was elaborated, which generated favourable outcomes by application inside a reduced pressure apparatus. As a consequence, a pore collapse during wet chemical cross linking could be avoided. Complex monolithic scaffolds featuring continuous pores were fabricated that mimicked structure and respective composition of different areas of native tissues by the presence of biochemical key stimulants. At first, three types of bone scaffolds were produced from collagen I and hydroxyapatite with appropriate sizes to fit critical sized defects in rat femurs. They either featured an isotropic or anisotropic porosity and partly also contained glycosaminoglycans (GAGs). Furthermore, meniscus scaffolds were prepared by processing two precursors with biomimetic contents of collagen I, collagen II and GAGs. Here, the pore structures were created under boundary conditions, which allowed an ice crystal growth that was nearly orthogonal to the external temperature gradient. Thereby, the preferential alignment of collagen fibres in the natural meniscus tissue could be mimicked. Those scaffolds owned appropriate sizes for cell culture in well plates or even an authentic meniscus shape and size. Finally, osteochondral scaffolds, sized to either fit well plates or perfusion reactors for cell culture, were fabricated to mimic the composition of subchondral bone and different cartilage zones. Collagen I and the resorbable calcium phosphate brushite were used for the subchondral zone, whereas the cartilage zones were composed out of collagen I, collagen II and tissue mimetic contents of GAGs. The pore structure corresponded to the one that is dominating the volume of natural osteochondral tissue. Energy dispersive X-ray spectroscopy (EDX) and SEM were used to analyse the composition and pore structure of the individual scaffold zones, respectively. The cross section pore diameters were determined to (65 ± 25) µm, (88 ± 35) µm and(93 ± 42) µm for the anisotropic, the isotropic and GAG containing isotropic bone scaffolds. Furthermore, the meniscus scaffolds showed pore diameters of (93 ± 21) µm in the inner meniscus zone and (248 ± 63) µm inside the outer meniscus zone. Pore sizes of (82 ± 25) µm, (83 ± 29) µm and (85 ± 39) µm were present inside the subchondral, the lower chondral and the upper chondral zone of osteochondral scaffolds. Depending on the fabrication parameters, the respective scaffold zones were also found to feature a specific micro- and nanostructure at their inner surfaces. Degradation studies were carried out under physiological conditions and resulted in a mean mass loss of (0.52 ± 0.13) %, (1.56 ± 0.10) % and (0.80 ± 0.10) % per day for bone, meniscus and osteochondral scaffolds, respectively. Rheological measurements were used to determine the viscosity changes upon cooling of different precursors. Micro computer tomography (µ-CT) investigations were applied to characterize the 3D microstructure of osteochondral scaffolds. To obtain an osteochondral scaffold with four zones of tissue mimetic microstructure alignment, a poly (D, L-lactide-co-glycolide) mesh was deposited on the upper chondral zone by electrostatic spinning. In case of the bone scaffolds, the retention / release capacity of bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) was evaluated by an enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). Due to the high presence of attractive BMP binding sites, only less than 0.1 % of the initially loaded cytokine was released. The suitability of combining the cryostructuring process with 3D powder printed calcium phosphate substrates was evaluated with osteochondral scaffolds, but did not appear to yield more preferable results than the non-combined approach. A new custom build confined compression setup was elaborated together with a suitable evaluation procedure for the mechanical characterisation under physiological conditions. For bone and cartilage scaffolds, apparent elastic moduli of (37.6 ± 6.9) kPa and (3.14 ± 0.85) kPa were measured. A similar behaviour of the scaffolds to natural cartilage and bone tissue was demonstrated in terms of elastic energy storage. Under physiological frequencies, less than 1.0 % and 0.8 % of the exerted energy was lost for bone and cartilage scaffolds, respectively. With average relaxation times of (0.613 ± 0.040) sec and (0.815 ± 0.077) sec, measured for the cartilage and bone scaffolds, they respond four orders of magnitude faster than the native tissues. Additionally, all kinds of produced scaffolds were able to withstand cyclic compression at un-physiological frequencies as high as 20 Hz without a loss in structural integrity. With the presented new method, scaffolds could be fabricated whose extent in mimicking of native tissues exceeded the one of scaffolds producible by state of the art methods. This allowed a testing of the key hypothesis: The biological evaluation of an anisotropic pore structure in vivo revealed a higher functionality of immigrated cells and led finally to advantageous healing outcomes. Moreover, the mimicking of local compositions in combination with a consecutive anisotropic porosity that approaches native tissue structures could be demonstrated to induce zone specific matrix remodelling in stem cells in vitro. Additionally, clues for a zone specific chondrogenic stem cell differentiation were attained without the supplementation of growth factors. Thereby, the hypothesis that an increased approximation of the hierarchically compositional and structurally anisotropic properties of musculoskeletal tissues would lead to an improved cellular response and a better healing quality, could be confirmed. With a special focus on cell free in situ tissue engineering approaches, the insights gained within this thesis may be directly transferred to clinical regenerative therapies. / Die Schlüsselhypothese dieser Arbeit bestand darin zu überprüfen, ob eine Nachahmung der zonalen Zusammensetzungen und Porenstruktur muskulo-skelettaler Gewebe einwandernde Zellen beeinflusst und zu vorteilhafteren Ergebnissen im Tissue Engineering führt. Obwohl bereits zahlreiche konventionelle Ansätze existieren, so sind diese in ihrem Vermögen spezielle Zellträgermatrices („Scaffolds“) herzustellen limitiert. Insbesondere können dabei lokal variierende biologische Schlüsselreize nicht mit einer Porenstruktur, welche die Ausrichtung der Kollagenfasern in Knochen- und Knorpelgeweben imitiert, kombiniert werden. Um diese Lücke in den verfügbaren Tissue Engineering Strategien zu schließen, wurde ein neues Verfahren entwickelt. Dieses erlaubte die Herstellung monolithischer Scaffolds, welche eine Validierung der Hypothese ermöglichten. Das neue Plattform-Verfahren basiert auf der gerichteten Erstarrung mehrerer fließfähiger Vorstufen, um somit eine kontrollierte anisotrope Porenstruktur vorzubereiten. Ein Entfernen der erstarrten Lösungsmittel durch Lyophilisation führt zu porösen Scaffolds. Optional besteht die Möglichkeit, Polymere mittels elektrostatischem Verspinnen als umhüllendes Vlies zu inkorporieren. Nach einem Vernetzungsschritt resultieren monolithische Matrices, bestehend aus mehreren Zonen mit unterschiedlichen Zusammensetzungen. Vor einer Verwendung als Tissue Engineering Matrix oder implantierbares Medizinprodukt erfolgt eine Sterilisation. Hierfür wurde ein “Adjustable Cryostructuring Device“ (ACD) entwickelt, einzelne Bauteile mit Computer Aided Design entworfen und zu einer Apparatur montiert. Die Optimierung der Anlage ermöglichte eine signifikante Erhöhung des verfügbaren externen Temperaturgradienten von (1.3 ± 0.1) K/mm auf (9.0 ± 0.1) K/mm. Außerdem erlauben vier unterschiedliche Konfigurationen des ACD die gerichtete Erstarrung von kollagenen Vorstufen in einer besonders kontrollierten Art und Weise bei einer Vielzahl an Probengrößen und Formen. Die systematische Evaluation des Prozesses erfolgte mit Alginat als Modell-Substanz. Aus den zeitlichen Verläufen der Gefrierstrukturierung resultierten Erstarrungsparameter, die mittels Bildverarbeitung den entstandenen Porengrößen und -ausrichtungen zugeordnet wurden. Dies demonstrierte eine präzise Kontrolle der Ergebnisse durch elektrische Ansteuerung der ACD. Zur Erzeugung von Rohmaterialien war eine Etablierung von Extraktions- und Aufreinigungsprotokollen für Kollagen I und Kollagen II notwendig, während eine Herstellung der Calciumphosphate Bruschit und Hydroxylapatit mittels Präzipitations-Reaktionen verlief. Neben der sukzessiven Verbesserung des ACD, stellte auch die Optimierung einzelner Prozessschritte wichtige Aspekte dar. Die Untersuchung und Diskussion des Verhaltens einzelner Vorstufenkomponenten sowie der Erstarrungs-phänomene von Kollagenlösungen führte zu einem Verständnis welches die Produktion von komplexeren Scaffolds zuließ. Somit war es auch möglich eine Abhängigkeitsrelation der einstellbaren Prozessparameter zu den resultierenden Erstarrungsmorphologien der verwendeten Kollagensysteme abzuleiten. Die Gefrierstrukturierung von mehreren Lagen unterschiedlicher Vorstufen konnte erfolgreich von Alginat- auf Kollagenvorstufen transferiert werden. Nach einer Optimierung der jeweiligen Grenzflächenübergänge, waren diese selbst mittels Rasterelektronenmikroskopie kaum noch zu erkennen. Eine Evaluierung von dehydrothermal-, diisocyanat- und carbodiimid- basierten Quervernetzungs-methoden zeigte die vorteilhaftesten Ergebnisse für die Vernetzung durch Carbodiimide. Zusätzlich wurde eine Zusammensetzung der Vernetzungslösung ermittelt, welche beim Einsatz in einer Unterdruckapparatur einen Porenstrukturkollaps durch nasschemische Vernetzung vermeidet. Eine erweiterte Kontrolle der Gefrierprozesse erlaubte es Struktur und Zusammensetzung verschiedener Zonen nativer Gewebe durch eine monolithische Zellträgermatrix mit durchgängiger Porenstruktur und biochemischen Schlüsselreizen nachzuahmen. Zuerst wurden drei Arten von Knochenscaffolds aus Kollagen I und Hydroxylapatit hergestellt, die Defekten kritischer Größe in Rattenoberschenkel-knochen entsprachen. Diese zeichneten sich durch eine isotrope oder eine anisotrope Porenstruktur aus und enthielten teilweise Glycosaminoglycane (GAGs). Weiterhin erfolgte die Produktion von Meniskusscaffolds aus zwei Vorstufen mit biomimetischen Anteilen an Kollagen I, Kollagen II und GAGs. Dabei verlief die Gefrierstrukturierung unter Grenzbedingungen, welche ein nahezu senkrechtes Eiskristallwachstum zu dem äußeren Temperaturgradienten erlaubten. Somit konnte der bevorzugte Verlauf von Kollagenfasern in nativem Meniskusgewebe nachgeahmt werden. Die Scaffolds waren entweder passend für „Well Plates“ der Zellkultur bemaßt oder besaßen sogar Form und Größe von authentischen Menisken. Zuletzt wurden osteochondrale Scaffolds hergestellt, deren Zusammensetzung den jeweiligen Bereichen von Subchondralzone und verschiedenen Gelenkknorpelzonen entsprach. Kollagen I und die bioresorbierbare Calciumphosphatphase Bruschit fanden Verwendung in der Subchondralzone, während die Knorpelzonen aus Kollagen I, Kollagen II und entsprechenden biomimetischen Anteilen an GAGs bestanden. Außerdem bildete die Scaffoldporenstruktur die Volumendominierende in natürlichem Osteochondralgewebe nach, wobei die Dimensionierungen der Scaffolds Well Plates oder Perfusionsreaktoren der Zellkultur angepasst waren. Mittels energiedispersiver Röntgenspektroskopie und Rasterelektronenmikroskopie erfolgte die Analyse von Zusammensetzung und Porenstruktur der jeweiligen Scaffoldzonen. Die Größe der Porenquerschnitte betrug (65 ± 25) µm, (88 ± 35) µm und (93 ± 42) µm für die anisotropen, die isotropen und die GAG-haltigen isotropen Knochenscaffolds. Die Meniskusscaffolds besaßen Porendurchmesser von (93 ± 21) µm in der inneren Meniskuszone und (248 ± 63) µm innerhalb der äußeren Meniskuszone. Im Falle der osteochondralen Scaffolds wurden Porengrößen von (82 ± 25) µm, (83 ± 29) µm und (85 ± 39) µm in der subchondralen, der unteren chondralen und der oberen chondralen Zone gemessen. In Abhängigkeit von den Prozessparametern zeigten die inneren Oberflächen der jeweiligen Scaffoldzonen eine spezifische Mikro- und Nanostruktur. Eine Prüfung des Degradationsverhaltens unter physiologischen Bedingungen ergab einen mittleren Massenverlust von (0.52 ± 0.13) %, (1.56 ± 0.10) % und (0.80 ± 0.10) % pro Tag für die Knochen-, Meniskus- und osteochondralen Scaffolds. Die Untersuchung der Viskositätsveränderungen während der Abkühlung unterschiedlicher Vorstufen geschah mit rheologischen Messungen. Weiterhin wurde die 3D Mikrostruktur von osteochondralen Matrices mit Mikro Computer Tomographie charakterisiert. Um einen osteochondralen Scaffold mit vier Zonen gewebeähnlich ausgerichteter Mikrostruktur zu erhalten, konnte die Scaffoldoberfläche durch ein elektroversponnenes Poly (D, L-Lactid-co-Glycolid) Vlies modifiziert werden. Ein „enzyme linked immunosorbent assay“ (ELISA) diente zur Evaluation des Rückhalte- bzw. Freisetzungsverhaltens von „bone morphogenetic protein 2“ (BMP-2) in Knochenscaffolds. Bedingt durch die hohe Präsenz von attraktiven BMP Bindungsstellen betrug die freigesetzte Menge des initial beladenen Zytokins nur weniger als 0.1 %. Die Eignung einer Kombination des Gefrierstrukturierungsprozesses mit 3D gedruckten Calciumphosphatsubstraten wurde anhand von osteochondralen Scaffolds überprüft, aber zeigte keine vorteilhafteren Resultate als die nicht kombinierte Vorgehensweise. Für die mechanische Charakterisierung unter physiologischen Bedingungen konnte ein neues Test-Setup mitsamt Auswertungsverfahren entwickelt werden. Die gemessenen Elastizitätsmoduln betrugen (37.6 ± 6.9) kPa für Knochen- und (3.14 ± 0.85) kPa für Knorpelscaffolds. Da unter physiologischen Frequenzen nur weniger als 1.0 % der eingebrachten Energie verloren ging, entsprach die Fähigkeit der Zellträgermatrices zur elastischen Energiespeicherung dem von natürlichem Knochen- und Knorpelgewebe. Bei mittleren Relaxationszeiten von (0.613 ± 0.040) sec und (0.815 ± 0.077) sec für Knorpel- und Knochenscaffolds reagieren diese vier Größenordnungen schneller als die nativen Gewebe. Außerdem waren alle produzierten Matrices dazu in der Lage zyklischen Kompressionen bei unphysiologisch hohen Frequenzen von 20 Hz zu wiederstehen, ohne an struktureller Integrität zu verlieren. Mit dem vorgestellten neuen Verfahren konnten Scaffolds hergestellt werden, deren Ausmaß in der Nachahmung nativer Gewebe mit etablierten Methoden nicht erreichbar war und welche eine Überprüfung der Schlüsselhypothese erlaubten: Die biologische Evaluation einer anisotropen Porenstruktur in vivo zeigte eine höhere Funktionalität eingewanderter Zellen, was zu vorteilhafteren Heilungsergebnissen führte. Darüber hinaus demonstrierte eine Imitation der lokalen Zusammensetzungen in Kombination mit einer durchgängigen anisotropen Porenstruktur, welche an diejenige in nativen Geweben angenähert ist, eine Induktion von zonenspezifischer Matrixremodellierung von Stammzellen in vitro. Außerdem waren Hinweise auf eine zonale chondrogene Stammzelldifferenzierung ohne eine gesonderte Zugabe von Wachstumsfaktoren zu beobachten. Somit konnte die Hypothese, dass eine verbesserte Nachahmung der hierarchischen Zusammensetzung und anisotroper Struktur von muskuloskelettalen Geweben zu einer optimierten zellulären Reaktion und somit einer besseren Heilungsqualität führt, bestätigt werden. Mit einem speziellen Fokus auf zellfreies in situ Tissue Engineering, könnten die Erkenntnisse dieser Arbeit direkt für klinische Therapien eingesetzt werden.

Improved treatment options for the degenerative joint disease osteoarthritis (OA) are of major interest, since OA is one of the main sources of disability, pain, and socioeconomic burden worldwide [202]. According to epidemiological data, already 27 million people suffer from OA in the US [23]. Moreover, the WHO expects OA to be the fourth most common cause of disability in 2020 [203], illustrating the need for effective and long-lasting therapy options of severe cartilage defects. Despite numerous clinically available products for the treatment of cartilage defects [62], the development of more cartilage-specific materials is still at the beginning. Hyaluronic acid (HA) is a major component of the cartilaginous extracellular matrix (ECM) and inherently creates a cell-friendly niche by providing cell attachment and migration sites. Furthermore, it is known that the functional groups of HA are well suited for chemical modification. These characteristics render HA an attractive material for hydrogel-based tissue engineering approaches. Poly(glycidol) (PG) as chemical crosslinker basically features similar chemical characteristics as the widely used poly(ethylene glycol) (PEG), but provides additional side groups at each repeating unit that can be further chemically functionalized. With the introduction of PG as multifunctional crosslinker for HA gels, a higher cross-linking density and, accordingly, a greater potential for biomimetic functionalization may be achieved. However, despite the mentioned potential benefits, PG has not been used for cartilage regeneration approaches so far. The initial aim of the study was to set up and optimize a HA-based hydrogel for the chondrogenic differentiation of mesenchymal stromal cells (MSCs), using different amounts and variations of cross-linkers. Therefore, the hydrogel composition was optimized by the utilization of different PEG diacrylate (PEGDA) concentrations to cross-link thiol-modified HA (Glycosil, HA-SH) via Michael addition. We aimed to generate volumestable scaffolds that simultaneously enable a maximum of ECM deposition. Histological and biochemical analysis showed 0.4% PEGDA as the most suitable concentration for these requirements (Section 5.1.2). In order to evaluate the impact of a differently designed cross-linker on MSC chondrogenesis, HA-SH was cross-linked with PEGTA (0.6%) and compared to PEGDA (0.4%) in a next step. Following this, acrylated PG (PG-Acr) as multifunctional cross-linker alternative to acrylated PEG was evaluated. It provides around five times more functional groups when utilized in PG-Acr (0.6%) HA-SH hydrogels compared to PEGTA (0.6%) HA-SH hydrogels, thus enabling higher degrees of biomimetic functionalization. Determination of cartilage-specific ECM components showed no substantial differences between both cross-linkers while the deposition of cartilaginous matrix appeared more homogeneous in HA-SH PG-Acr gels. Taken together, we were able to successfully increase the possibilities for biomimetic functionalization in the developed HA-SH hydrogel system by the introduction of PG-Acr as cross-linker without negatively affecting MSC chondrogenesis (Section 5.1.3). The next part of this thesis focused extensively on the biomimetic functionalization of PG-Acr (0.6%) cross-linked HA-SH hydrogels. Here, either biomimetic peptides or a chondrogenic growth factor were covalently bound into the hydrogels. Interestingly, the incorporation of a N-cadherin mimetic (HAV), a collagen type II binding (KLER), or a cell adhesion-mediating peptide (RGD) yielded no improvement of MSC chondrogenesis. For instance, the covalent binding of 2.5mM HAV changed morphology of cell nuclei and reduced GAG production while the incorporation of 1.0mM RGD impaired collagen production. These findings may be attributed to the already supportive conditions of the employed HA-based hydrogels for chondrogenic differentiation. Most of the previous studies reporting positive peptide effects on chondrogenesis have been carried out in less supportive PEG hydrogels or in significantly stiffer MeHA-based hydrogels [99, 101, 160]. Thus, the incorporation of peptides may be more important under unfavorable conditions while inert gel systems may be useful for studying single peptide effects (Section 5.2.1). The chondrogenic factor transforming growth factor beta 1 (TGF-b1) served as an example for growth factor binding to PG-Acr. The utilization of covalently bound TGF-b1 may thereby help overcome the need for repeated administration of TGF-b1 in in vivo applications, which may be an advantage for potential clinical application. Thus, the effect of covalently incorporated TGF-b1 was compared to the effect of the same amount of TGF-b1 without covalent binding (100nM TGF-b1) on MSC chondrogenesis. It was successfully demonstrated that covalent incorporation of TGF-b1 had a significant positive effect in a dose-dependent manner. Chondrogenesis of MSCs in hydrogels with covalently bound TGF-b1 showed enhanced levels of chondrogenesis compared to hydrogels into which TGF-b1 was merely mixed, as shown by stronger staining for GAGs, total collagen, aggrecan and collagen type II. Biochemical evaluation of GAG and collagen amounts, as well as Western blot analysis confirmed the histological results. Furthermore, the positive effect of covalently bound TGF-b1 was shown by increased expression of chondrogenic marker genes COL2A1, ACAN and SOX9. In summary, covalent growth factor incorporation utilizing PG-Acr as cross-linker demonstrated significant positive effects on chondrogenic differentiation of MSCs (Section 5.2.2). In general, PG-Acr cross-linked HA hydrogels generated by Michael addition represent a versatile hydrogel platform due to their high degree of acrylate functionality. These hydrogels may further offer the opportunity to combine several biological modifications, such as the incorporation of biomimetic peptides together with growth factors, within one cell carrier. A proof-of-principle experiment demonstrated the suitability of pure PG gels for studying single peptide effects. Here, the hydrogels were generated by the utilization of thiol-ene-click reaction. In this setting, without the supportive background of hyaluronic acid, MSCs showed enhanced chondrogenic differentiation in response to the incorporation of 1.0mM HAV. This was demonstrated by staining for GAGs, the cartilage-specific ECM molecules aggrecan and type II collagen, and by increased GAG and total collagen amounts shown by biochemical analysis. Thus, pure PG gels exhibit the potential to study the effects and interplay of peptides and growth factors in a highly modifiable, bioinert hydrogel environment. The last section of the thesis was carried out as part of the EU project HydroZONES that aims to develop and generate zonal constructs. The importance of zonal organization has attracted increased attention in the last years [127, 128], however, it is still underrepresented in tissue engineering approaches so far. Thus, the feasibility of zonal distribution of cells in a scaffold combining two differently composed hydrogels was investigated. A HA-SH(FMZ) containing bottom layer was generated and a pure PG top layer was subsequently cast on top of it, utilizing both times thiol-ene-click reaction. Indeed, stable, hierarchical constructs were generated that allowed encapsulated MSCs to differentiate chondrogenically in both zones as shown by staining for GAGs and collagen type II, and by quantification of GAG amount. Thus, the feasibility of differently composed zonal hydrogels utilizing PG as a main component was successfully demonstrated (Section 5.4). With the first-time utilization and evaluation of PG-Acr as versatile multifunctional cross-linker for the preparation of Michael addition-generated HA-SH hydrogels in the context of cartilage tissue engineering, a highly modifiable HA-based hydrogel system was introduced. It may be used in future studies as an easily applicable and versatile toolbox for the generation of biomimetically functionalized hydrogels for cell-based cartilage regeneration. The introduction of reinforcement structures to enhance mechanical resistance may thereby further increase the potential of this system for clinical applications. Additionally, it was also demonstrated that thiol-ene clickable hydrogels can be used for the generation of cell-laden, pure PG gels or for the generation of more complex, coherent zonal constructs. Furthermore, thiol-ene clickable PG hydrogels have already been further modified and successfully been used in 3D bioprinting experiments [204]. 3D bioprinting, as part of the evolving biofabrication field [205], offers the possibilities to generate complex and hierarchical structures, and to exactly position defined layers, yet at the same time alters the requirements for the utilized hydrogels [159, 206–209]. Since a robust chondrogenesis of MSCs was demonstrated in the thiol-ene clickable hydrogel systems, they may serve as a basis for the development of hydrogels as so called bioinks which may be utilized in more sophisticated biofabrication processes. / Es ist von großem Interesse die Therapieoptionen für die degenerative Gelenkerkrankung Osteoarthrose (OA) zu verbessern, da OA als eine der weltweit häufigsten Ursachen von Bewegungseinschränkungen und Schmerzen gilt und somit eine sozioökonomische Belastung darstellt [202]. Laut epidemiologischen Studien leiden bereits 27 Millionen Menschen in den USA an OA [23]. Darüber hinaus geht die WHO davon aus, dass OA bereits im Jahr 2020 die vierthäufigste Ursache von körperlichen Behinderungen sein wird [203], was die Notwendigkeit für effektive und langanhaltende Therapien von schweren Knorpeldefekten zeigt. Obwohl sich bereits eine Vielzahl von Therapien in klinischer Anwendung für die Behandlung von Knorpeldefekten befindet [62], ist die Entwicklung von knorpelspezifischen Produkten noch nicht weit fortgeschritten. Hyaluronsäure (HA), als Hauptbestandteil der Extrazellulären Matrix (ECM) von Knorpel, stellt eine generell zytokompatible Umgebung dar, die Zellen von Natur aus Bindungsstellen zur Adhäsion und Fortbewegung bietet. Zudem ist bekannt, dass die funktionellen Gruppen von HA besonders gut für chemische Modifikationen geeignet sind. Aufgrund dieser Eigenschaften wird HA häufig als Material für das hydrogelbasierte Tissue Engineering verwendet. Durch die Verwendung von Poly(glycidol) (PG) als Cross-linker stehen die gleichen chemischen Eigenschaften wie bei der Verwendung des gängigen Cross-linkers Poly(ethylene glycol) (PEG) zur Verfügung, allerdings bietet es zusätzliche Seitenketten an jeder Wiederholungseinheit. Durch die Einführung von PG als multifunktionalem Cross-linker zur Herstellung von HA-Gelen ergibt sich letztlich eine höhere Vernetzungsdichte und damit auch ein größeres Potenzial für biomimetische Funktionalisierungen. Trotz dieser genannten Vorteile wird PG bisher noch nicht im Bereich der Knorpelregeneration verwendet. Das erste Ziel dieser Arbeit beinhaltete die Etablierung und Optimierung eines HA-basierten Hydrogels für die chondrogene Differenzierung von Mesenchymalen Stromazellen (MSCs). Hierzu wurden verschiedene Mengen und Derivate von Cross-linkern eingesetzt. Zunächst wurde die Hydrogelzusammensetzung mithilfe von verschiedenen PEG-Diacrylat (PEGDA)-Konzentrationen zur Vernetzung von thiolmodifizierter HA (Glycosil, HASH) mittels Michael-Addition optimiert. Das Ziel war hierbei die Herstellung eines volumenstabilen Konstrukts, das gleichzeitig die größtmögliche Ablagerung von ECM erlaubt. Histologische und biochemische Analysen zeigten in Bezug darauf, dass eine Konzentration von 0,4% PEGDA die zuvor genannten Anforderungen am besten erfüllte (Abschnitt 5.1.2). Um im weiteren Verlauf den Einfluss von verschiedenen Cross-linkern auf die chondrogene Differenzierung von MSCs zu untersuchen, wurde die HA-SH vergleichend mit PEGTA (0,6%) und PEGDA (0,4%) vernetzt. Nachfolgend wurde acryliertes PG (PG-Acr) als eine Alternative zu acrylierten PEG-Derivaten evaluiert. Der Vorteil in der Verwendung von PG-Acr (0,6%) im Vergleich zu PEGTA (0,6%) liegt darin, dass es eine ca. fünfmal höhere Anzahl an funktionellen Gruppen bietet, was wiederum ein deutlich höheres Maß an biomimetischer Funktionalisierung ermöglicht. Hierbei zeigte die Untersuchung der knorpelspezifischen ECM-Bestandteile keine grundlegenden Unterschiede zwischen beiden Cross-linkern, wobei durch die Verwendung von PG-Acr eine gleichmäßigere Ablagerung von Knorpelmatrix in die entsprechenden Gele zu erkennen war. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass die Möglichkeiten für eine biomimetische Funktionalisierung durch die Verwendung von PG-Acr deutlich erhöht wurden, ohne dabei die Chondrogenese von MSCs negativ zu beeinträchtigen (Abschnitt 5.1.3). Der nächste Teil dieser Arbeit befasste sich mit der umfangreichen biomimetischen Funktionalisierung von mit PG-Acr (0,6%) vernetzten HA-SH Hydrogelen. Hierzu wurden entweder biomimetische Peptide oder ein chondrogener Wachstumsfaktor kovalent in das Hydrogel eingebunden. Interessanterweise führte weder das Einbringen des N-Cadherin-mimetischen (HAV), des Kollagen II-bindenden (KLER), noch des Zelladhäsions-vermittelnden (RGD) Peptids zu einer Verbesserung der chondrogenen Differenzierung der MSCs. Beispielsweise führte das kovalente Anbinden von 2,5mM HAV zu einer Veränderung der Zellkernmorphologie und einer Verringerung der Glykosaminoglykan (GAG)-Produktion, wohingegen das Einbringen von 1,0mM RGD die Kollagenproduktion hemmte. Diese Ergebnisse könnten möglicherweise darauf zurückzuführen sein, dass die hier verwendeten HA-SH-Hydrogele selbst bereits ausreichend effizient für die chondrogene Differenzierung von MSCs sind. Im Vergleich dazu wurden die vorherigen Studien, die positive Effekte von Peptiden nachweisen konnten, entweder in neutralen PEG-Hydrogelen oder in wesentlich festeren MeHA-Hydrogelen durchgeführt [99, 101, 160]. Daraus lässt sich folgern, dass die Verwendung von Peptiden gerade unter ungünstigen Bedingungen von Bedeutung sein könnte und ein neutrales Gelsystem für die Untersuchung von einzelnen Peptideffekten geeignet scheint (Abschnitt 5.2.1). Als nächstes wurde exemplarisch der chondrogene Wachstumsfaktor Transforming Growth Factor Beta 1 (TGF-b1) kovalent an PG-Acr angebunden. Durch die Verwendung von kovalent gebundenem TGF-b1 könnte somit die Notwendigkeit einer wiederholten Zugabe von TGF-b1 bei in vivo-Anwendungen vermieden werden, was wiederum bei einer potentiellen klinischen Anwendung von Vorteil sein könnte. Deshalb wurde der Einfluss von kovalent gebundenem TGF-b1 auf die Chondrogenese von MSCs mit der gleichen Menge ungebundenem TGF-b1 (100nM TGF-b1) verglichen. Hierbei wurde ein signifikant positiver, dosisabhängiger Effekt von kovalent gebundenem TGF-b1 erfolgreich nachgewiesen. Die Chondrogenese von MSCs in Hydrogelen mit kovalent gebundenem TGF-b1 war dabei der Chondrogenese von MSCs in Hydrogelen, in die TGF-b1 lediglich gemischt wurde, deutlich überlegen. Dies wurde anhand von stärkeren Färbungen für GAGs, Gesamtkollagen, Aggrecan und Kollagen II in den TGF-b1-modifizierten Gelen gezeigt. Darüber hinaus bestätigten sowohl biochemische Analysen des GAG- und Kollagengehalts, als auch Western Blot-Analysen die histologischen Daten. Zusätzlich wurde der positive Effekt von kovalent gebundenem TGF-b1 durch erhöhte Expressionsraten der chondrogenen Markergene COL2A1, ACAN und SOX9 nachgewiesen. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass durch die kovalente Bindung des Wachstumsfaktors TGF-b1 ein signifikant positiver Effekt auf die chondrogene Differenzierung von MSCs entsteht (Abschnitt 5.2.2). Generell stellen die auf Basis von Michael-Addition hergestellten PG-Acr-HA-SH-Hydrogele aufgrund ihrer hohen Acrylat-Funktionalität eine vielseitige Hydrogelplattform dar. So bieten diese Hydrogele zahlreiche Möglichkeiten für das Einbringen von verschiedensten biologischen Modifikationen wie die kovalente Bindung von biomimetischen Peptiden zusammen mit Wachstumsfaktoren in ein und demselben Zellträger. Anhand eines Proof-of-principle-Experiments wurde die generelle Eignung von reinen PG-Hydrogelen für die Evaluation von einzelnen Peptideffekten demonstriert. Dazu wurden die Hydrogele unter Verwendung der Thiol-ene-click-Reaktion hergestellt. In diesem Hydrogelsystem, ohne den unterstützenden Effekt von HA, zeigten MSCs eine verstärkte chondrogene Differenzierung in Anwesenheit von 1,0mM HAV. Diese ließ sich anhand von stärkeren Färbungen für GAGs, Aggrecan und Kollagen II nachweisen. Außerdem waren die GAG- und Gesamtkollagen-Werte deutlich erhöht. Hiermit wurde gezeigt, dass sich die vielseitig modifizierbaren, reinen PG-Hydrogele für die Analyse von Peptideffekten und deren Interaktion mit Wachstumsfaktoren eignen (Abschnitt 5.3). Der letzte Teil dieser Arbeit wurde im Rahmen des EU-Projektes HydroZONES durchgeführt, welches an der Entwicklung und Herstellung von zonalen Konstrukten arbeitet. Der Aspekt der zonalen Organisation von Knorpel rückte in den letzten Jahren verstärkt in den Fokus [127, 128], jedoch findet er im Bereich des Tissue Engineering noch immer wenig Beachtung. Deshalb wurde im Folgenden die zonale Verteilung von Zellen innerhalb eines Zellträgers realisiert. Dazu wurden zwei unterschiedlich zusammengesetzte Hydrogele mithilfe der Thiol-ene-click-Reaktion hergestellt: eine aus HA-SH(FMZ) bestehende untere Lage und eine darauf liegende Lage aus reinem PG. Hierbei gelang es stabile, zonale Konstrukte herzustellen, in denen MSCs in beiden Zonen chondrogen differenzierten, was anhand von GAG- und Kollagen II-Färbungen, sowie durch die Quantifizierung des GAG-Gehalts bestätigt wurde. Hiermit konnte ein aus zwei verschiedenen Hydrogelen zusammengesetztes zonales Konstrukt erfolgreich hergestellt werden (Abschnitt 5.4). Durch den erstmaligen Einsatz des multifunktionalen Cross-linkers PG-Acr für das Tissue Engineering von Knorpel wurde ein auf Michael-Addition basierendes, vielseitiges HA-SH-Hydrogelsystem etabliert. Das hier vorgestellte Hydrogelsystem besitzt das Potenzial zukünftig als eine einfach anwendbare und vielseitige Toolbox zur Herstellung von biomimetischen Hydrogelen für die zellbasierte Knorpelregeneration verwendet zu werden. Vor allem könnte dabei der Einsatz von Stützstrukturen von entscheidender Bedeutung sein, um die mechanische Widerstandskraft der Zellträger zu erhöhen und somit das Potenzial für klinische Anwendungen zu vergrößern. Zusätzlich wurde gezeigt, dass Thiol-ene-click-Hydrogele sowohl zur Herstellung von zellbeladenen, reinen PG-Gelen, als auch zur Herstellung von deutlich komplexeren, zonalen Konstrukten geeignet sind. Diese Thiol-ene-click-Hydrogele wurden bereits erfolgreich weiterentwickelt und für 3D-Bioprinting-Prozesse verwendet [204]. 3D-Bioprinting ist eine Teildisziplin des sich immer weiter entwickelnden Feldes der Biofabrikation [205]. Die Verwendung in diesem Bereich verändert zwar die Anforderungen an die hierfür verwendeten Hydrogele, ermöglicht es aber gleichzeitig deutlich komplexere sowie hierarchische Strukturen herzustellen und kleinere Lagen noch exakter zu positionieren [159, 206–209]. Da in den hier vorgestellten Thiol-ene-click-Hydrogelen eine deutliche chondrogene Differenzierung von MSCs nachgewiesen wurde, ist es vorstellbar, dass sie als Basis für die Herstellung sogenannter Bioinks dienen, welche in zukünftigen, anspruchsvollen Biofabrikationsprozessen Anwendung finden sollen.

Eine traumatische Läsion am artikulären Knorpel stellt eine noch ungelöste Herausforderung für den behandelnden Arzt dar. Bei den betroffenen Patienten handelt es sich häufig um junge, sportlich aktive Menschen im Arbeitsprozess {Hjelle et al. 2002}, bei denen eine längerfristige Belastungs- und Bewegungseinschränkung oder sogar eine Verminderung der Erwerbsfähigkeit zwingend vermieden werden muss. Jedoch existiert für den traumatischen Gelenkknorpelschaden derzeit noch keine Therapie mit sehr gutem, funktionellem Langzeitergebnis {Richter 2005}. Die konservativen Therapieformen haben immer eine narbige Ausheilung zur Folge. Aber auch mit der chirurgischen Basisversorgung, bestehend aus Debridement und Lavage des betroffenen Gelenks, kann keine Ausheilung erreicht werden. Regenerierende Verfahren, die auf der Grundlage der Penetration des subchondralen Knochens basieren, sollen durch das Einspülen von körpereigenen Stammzellen in den Defekt eine autologe Regeneration induzieren. Langzeitstudien zeigen, dass trotz der oft erreichten, guten funktionellen Ergebnisse histomorphologisch keine Wiederherstellung von intaktem, hyalinem Gelenkknorpel erreicht werden kann {Gaissmaier et al. 2003, Bernholt/Höher 2003}. Vielversprechende neue Therapiekonzepte liefert derzeit das „Tissue Engineering“ am Gelenkknorpel. Vor allem die Autologe Chondrozytentransplantation (ACT) eröffnet vollkommen neue Behandlungsstrategien. Bei der ACT werden arthroskopisch patienteneigene Chondrozyten gewonnen, die in dreidimensionale Gele eingesät und in Zellkultur gebracht werden. Durch verschiedene Stimulationstechniken werden die Zellen zur Proliferation und Produktion von Extrazellulärer Matrix (ECM), insbesondere Kollagen und Proteoglykan, angeregt. Nach drei bis sechs Wochen Kultivierung erfolgt die Implantation in den aufbereiteten Knorpeldefekt des Patienten. Aktuelle Studien konnten zeigen, dass das Transplantat mittelfristig ohne Narbenbildung in den bestehenden Gelenkknorpel einwächst und so die Inkongruenz des Gelenks, welche präarthrotisch wirkt, aufhebt {Brittberg et al. 1996, Peterson et al. 2000, Horas et al. 2000}. Um dieses neuartige Verfahren schnell im klinischen Alltag zu etablieren, bedarf es ausgereifter analytischer Methoden, die eine Qualitätsprüfung des biotechnologisch hergestellten Knorpels ermöglichen. MALDI-TOF MS (matrix-assisted laser desorption and ionization time-of-flight mass spectrometry) ist eine schnelle und sehr sensitive Methode, um die molaren Massen von Stoffen genau zu bestimmen und komplex zusammengesetzte Proben zu analysieren. Ziel dieser Arbeit war es, MALDI-TOF Massenspektrometrie als Analyseverfahren zu nutzen, um die Zusammensetzung des natürlichen Knorpels zu bestimmen und die hier gewonnenen Erkenntnisse auf biotechnologisch hergestellten Knorpel anzuwenden. Somit war die Überprüfung der Anwendbarkeit dieser massenspektrometrischen Untersuchungsmethode auf das komplexe biologische System Knorpel die erste Fragestellung in dieser Arbeit. Es erfolgte daher zunächst die Anpassung und Optimierung der Präparations- und Messmethoden mit dem Ziel, standardisierte Protokolle festzulegen, welche zu reproduzierbaren Spektren führen. Es schloss sich die Analyse der kommerziell verfügbaren Hauptbestandteile der ECM - Proteoglykane und Kollagene – mittels MADI-TOF MS an. Hierzu wurden Chondroitinsulfat und Kollagen verschiedener Typen enzymatisch verdaut und analysiert. So konnten Referenzspektren erstellt werden, welche die Grundlage für die Analyse des wesentlich komplexeren Systems des natürlichen Knorpels bildeten. Durch den Einsatz von Trypsin zur Hydrolyse nach thermischer Denaturierung des Kollagens wurde die Differenzierung zwischen den verschiedenen Kollagentypen ermöglicht. Es schlossen sich Studien zur Quantifizierung der enzymatischen Verdauungsprodukte der ECM an, welche das Ziel verfolgten, neben der stofflichen Zusammensetzung Aussagen zu den relativen Anteilen der einzelnen Bestandteile zu erlauben. Nachdem die grundsätzliche Eignung der Methode gezeigt werden konnte, diente der zweite Teil der hier dargelegten Forschungsarbeit der Beantwortung der Frage, ob die Erkenntnisse, welche bei der Analyse der Einzelbestandteile gewonnen wurden, auf natürliches Knorpelgewebe anwendbar sind. Der artikuläre Schweineknorpel ähnelt im Aufbau und den biomechanischen Eigenschaften dem menschlichen Knorpel. Da er zudem noch günstig und in adäquaten Mengen zur Verfügung gestellt werden kann, wurde der Gelenkknorpel des Schweins als Modellgewebe für die Anwendbarkeit der Methode auf natürlichen Knorpel genutzt. Ziel war es, die Hauptbestandteile der ECM einwandfrei zu identifizieren, Untersuchungen zur Quantifizierung anzustellen und Unterschiede zwischen den Knorpeltypen verschiedener Spezies nachzuweisen. Im letzten Abschnitt dieser Arbeit erfolgte die Analyse von biotechnologisch hergestelltem Knorpel und somit die Anwendung der bisher erworbenen, vor allem einem theoretisch-wissenschaftlichem Interesse folgenden Erkenntnisse auf eine praktisch-klinische Fragestellung nach der tatsächlichen Beschaffenheit des zu transplantierenden Konstrukts. Dazu wurden Konstrukte, welche zum einem aus dreidimensionalen Agarosegele bestückt mit Chondrozyten, zum anderen aus Kollagengel mit eingesäten Stammzellen oder Chondrozyten bestanden, untersucht. Dieser Schritt erfolgte in Zusammenarbeit mit dem Biotechnologisch-Biomedizinischen Zentrum Leipzig. Ziel war es, die bis dahin etablierten Probenpräparations- und Messbedingungen auf den künstlichen Knorpel anzuwenden und mit Referenzspektren von Bestandteilen der ECM sowie des natürlichen Schweineknorpels zu vergleichen. Durch die Analyse des Materials zu verschiedenen Kultivierungszeitpunkten sollte eine Aussage über die Qualität und die Menge der de novo synthetisierten ECM erreicht werden. Mit dieser Arbeit wurde die Grundlage geschaffen, die MALDI-TOF MS als geeignetes analytisches Verfahren zur Bestimmung der Konstruktqualität einzuführen. Perspektivisch sollte es so möglich sein, die Qualität der Konstrukte, welche für die Autologe Chondrozytentransplantation bestimmt sind, zu bewerten und zu überwachen.

Techn. Universiẗat, Diss., 2005--München.

Knorpel ist ein kompliziertes System aus einem kollagenen Netzwerk, gefüllt mit wasserbindenden Makromolekülen (Proteoglykanen) und darin eingebetteten Zellen. Störungen in den komplexen Wechselbeziehungen können zur Gefährdung der strukturellen Integrität des Knorpels führen. Die hochauflösende Magnetresonanztomographie (NMR-Mikroskopie) kann über die Analyse der Signalintensität interne Knorpelstrukturen darstellen (hypo- und hyperintense Zonen). Mit Hilfe ionenmikroskopischer Analysemethoden (PIXE, RBS, ERDA) wurden im Knorpel (femorale und tibiale Kondyle des Hausschweins) im Querschnitt die zweidimensionalen Verteilungen der Knorpelelemente (H, C, N, O, P, S, Cl, K und Ca) aufgenommen sowie die Konzentrationen in ausgewählten Zonen bestimmt. Ergänzend wurde mit STIM die Dichteverteilung im Knorpel untersucht. Es gelang auch mit STIM, erstmalig kollagene Fasern in ihrer, bis auf den Wasserentzug natürlichen, Umgebung im Knorpel und damit unverändert in ihrer Anordnung sichtbar zu machen (keine chemische Demaskierung nötig). Die Ergebnisse wurden mit NMR- und polarisationsmikroskopischen Untersuchungen verglichen und in ihrem Zusammenhang mit den histologischen Knorpelzonen diskutiert. In den NMR-hypointensen Zonen fanden sich eine erhöhte Chlorkonzentration und punktförmige Calciumanreicherungen. Diese Zonen waren (im gefriergetrockneten Zustand) durch eine, bis zu einem Faktor vier höhere Dichte gekennzeichnet, die im maximalen Gehalt der Matrixelemente, H, C, N, O, (höchste Kollagendichte) begründet liegt. Im tibialen Knorpel konnten in der NMR-hypointensen Zone radial verlaufende einzelne Kollagenfasern nachgewiesen werden. Im femoralen Knorpel wurden in dieser Zone keine Einzelfasern nachgewiesen. Es deutete sich eine tubuläre Anordnung der Kollagenfasern an. In der hypertrophen Zone zeigten sich hohe Konzentrationen an Phosphor (Zellorganellen), Schwefel (Proteoglykane), Kalium (alkalisches Milieu) und Calcium (Vorstufe der Kalzifizierung). Die Chlorkonzentration hatte dort ihr Minimum. In dieser Zone verlaufen die Kollagenfasern radial und münden senkrecht in den Kalkknorpel. In der Tangentialfaserschicht wurde eine erhöhte Konzentration an Calcium und Phosphor beobachtet (Einlagerung von Calciumphosphaten). In dieser Zone wurden tangential verlaufende Kollagenfasern und ihr Übergang zur stärkeren Vernetzung mit teilweise arkadenförmiger Überstruktur sichtbar gemacht. Zur genaueren Aufklärung der dreidimensionalen Anordnung der Kollagenen Strukturen wurden erste Experimente zur STIM-Tomographie durchgeführt.

Diese Arbeit untersucht die humanen chondrogenen Progenitorzellen (CPC) auf ihre Eignung für einen möglichen Therapieansatz der Osteoarthrose (OA). Hierbei zeigte sich, dass die CPC die Fähigkeit zur Migration sowohl in vitro als auch ex vivo besitzen. In vitro steigerte der Einsatz von TGF-ß3 die Migrationsrate, was von therapeutischem Nutzen sein könnte. Die CPC wanderten ex vivo ebenso in Knorpelgewebe aus makroskopisch unauffälligen Bereichen wie in an den Hauptdefekt angrenzendes Gewebe ein. Mit der Versuchsdauer nahm die Einwanderungstiefe zu, wobei dies im unauffällig erscheinenden Knorpel ausgeprägter war und hier auch größere Eindringtiefen gemessen wurden. Dies spricht für eine Zielzone, die die CPC anstreben und die im Knorpel neben dem Hauptdefekt früher erreicht wird. Bezüglich der Migrationsgeschwindigkeit weisen die CPC eine Heterogenität auf, verglichen mit anderen Zelltypen im menschlichen Organismus ist sie insgesamt allerdings gering. Über die gesamte Versuchsdauer ließen sich in beiden Gewebetypen proliferationsfähige CPC nachweisen. Eine Genexpressionsanalyse zeigte, dass die CPC dedifferenzierten Chondrozyten am ähnlichsten sind und eine kurzfristige Kultivierung sie kaum beeinflusst. Die Transfektion veränderte die Ausrichtung der CPC nicht, sondern führte vornehmlich zu einer vorübergehenden generellen Herabregulierung der Genexpression. Die Ergebnisse zeigen, dass ein therapeutischer Einsatz der CPC möglich wäre, da die Zellen auf einfache und komplikationsarme Weise gewonnen und kultiviert werden können. Zudem eröffnen die ausgeprägten migratorischen Fähigkeiten der CPC einfache Applikationswege, z. B. im Rahmen einer intraartikulären Injektion oder Arthroskopie. Ebenso viel versprechend ist die Erkenntnis, dass die Zellen innerhalb des Gewebes vital bleiben und so an einer Regeneration teilhaben könnten. Vor einer zukünftigen Anwendung der CPC bleiben allerdings noch einige Fragen zu beantworten. So ist die Rolle der CPC in der Pathogenese der OA noch nicht vollständig geklärt. Außerdem bleibt offen, wie lange die CPC im Gewebe vital bleiben und ob sie in der Lage sind, im Gewebe hyaline Knorpel-EZM herzustellen. Die Ergebnisse dieser Arbeit geben daher Anlass für weitere Forschung auf diesem Gebiet.