L'infection chronique par le virus de l'hépatite C (VHC) conduit au développement de pathologies hépatiques, telles que la fibrose dont le terme évolutif est la cirrhose sur laquelle peut se développer un carcinome hépatocellulaire. Les observations cliniques indiquent que le VHC interfère avec la voie de signalisation du Transforming Growth Factor β (TGFβ). Entre autres fonctions, cette cytokine induit la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT), ce qui favorise la migration cellulaire et l'invasion tumorale. Le but de cette thèse est d'analyser l'impact des protéines non structurales du VHC sur la voie de signalisation du TGFβ.Nous avons montré que le réplicon subgénomique du VHC induit une augmentation de la signalisation du TGFβ résultant en une plus forte expression de gènes associés à l'EMT et induisant un phénotype d'EMT. L'expression de la protéase virale NS3-4A seule, augmente et prolonge la phosphorylation de Smad2/3 en aval du récepteur du TGFβ et renforce l'expression de certains gènes cibles du TGFβ. L'analyse des interactions entre les protéines du VHC et les protéines de la voie du TGFβ a permis d'identifier l'interaction entre NS3-4A et la protéine Smurf2. Le réplicon subgénomique ou la protéase NS3-4A ont des rôles antagonistes à la protéine Smurf2 sur la voie de signalisation du TGFβ. L'analyse globale des gènes régulés par le TGFβ dans les cellules exprimant le réplicon subgénomique a permis d'identifier, que dans ces cellules, le TGFβ induit une réponse pro-tumorale.Ces résultats montrent que NS3-4A induit une plus forte réponse des cellules au TGFβ, en inhibant la fonction de Smurf2 dans le rétrocontrôle négatif de la voie du TGFβ. Ce nouveau mécanisme d'interférence du VHC avec la voie du TGFβ pourrait contribuer à l'EMT des cellules hépatocytaires infectées favorisant ainsi la cancérisation. Ce travail apporte de nouvelles pistes dans la compréhension des mécanismes associés à la cancérisation chez les patients chroniquement infectés par le VHC.

Le virus de l'hépatite C (VHC) est une menace majeure avec plus de 130 millions de personnes infectées chaque année. Il constitue la principale cause de cancer du foie. Le VHC est un virus transmis par le sang soit au cours de consommation de drogue par voie intraveineuse soit lors de transfusions sanguines. Il s'adapte à l'environnement de l'hôte grâce à un taux de mutation élevé qui amoindrit l’efficacité des traitements. Le virus se multiplie rapidement dans l'hôte et crée ainsi une population de virus génétiquement hétérogènes, appelée quasi-espèces, qui peut ainsi répondre aux pressions sélectives liées au traitement. Les traitement antiviraux existants sont des tri-thérapies contenant des peg-interféron, de la ribavirine et des inhibiteurs de la protéine (PI). Les inhibiteurs comme la telaprevir ou la bocéprévir ciblent la région NS3 du génome en bloquant le mécanisme de réplication. Cependant, en raison de la nature dynamique des quasi-espèces, les séquences cibles sont variables et les inhibiteurs conçus pour se lier à une région génomique particulière sont rendus inefficaces.Nous analysons ces populations virales en utilisant les techniques modernes de séquençage et le pyroséquencage profond qui permet l’analyse à grande échelle des données génétiques. La technique “Amplicon Sequencing” permet de cibler des régions particulières du génome viral, comme les régions NS3 ou NS5B qui participent au mécanisme de réplication et qui sont des cibles pour les thérapies antivirales. Par rapport au séquençage Sanger, notre pipeline NGS permet d’appréhender l’hétérogénéité de la population virale au sein d’un hôte. Pour analyser les données NGS, nous avons implémenté un pipeline d’analyse bioinformatique qui a été automatisé avec eHive.Nous étudions des échantillons de VHC de 40 patients traités par trithérapie. Deux sources de cellules virales sont utilisées pour le séquençage: les cellules du plasma et les cellules mononuclées du sang périphérique. L'objectif est de vérifier si une analyse des mutations de la région génomique NS3 peut aider à prédire le résultat du traitement. Nous constatons que des mutations de résistance aux antiviraux se trouvent à la fois chez les individus qui ont répondu et qui n’ont pas répondu au traitement. Nous avons donc recherché d'autres signatures génétiques de l'échec du traitement. Nous constatons que l'hétérogénéité génétique est plus faible chez les individus qui répondent de manière favorable au traitement. Notre conclusion est que l'hétérogénéité virale est un facteur indépendant pour prédire la réponse à un traitement, en plus de la présence de mutations spécifiques dans les régions ciblées par le traitement.Les techniques NGS permettent également d’étudier l'évolution virale au sein d'un seul hôte. En utilisant de multiples temps d'échantillonnage, nous pouvons mesurer les caractéristiques de l'évolution de la population virale. Pour trois patients avec des échantillons viraux couvrant une période de 13 ans, nous avons utilisé la technique “Amplicon Sequencing“ pour les régions NS3 et NS5B. Des infections mixtes comprenant de multiples génotypes sont retrouvées chez deux patients. Nous avons montré qu’il existe de la structure de populations et des lignées divergentes de VHC au sein de chaque patient. Au cours du traitement, l'hétérogénéité génétique et la taille efficace de la population dans la région NS5B augmente fortement après le début du traitement. Ces résultats mettent en évidence un processus de sélection diversifiante suite au traitement qui augmente l'hétérogénéité génétique virale. Nous mettons ainsi en évidence un processus dit de balayage sélectif doux qui est observé pour la première fois chez des patients infectées par des génotypes multiples du virus VHC.Notre analyse NGS montre que l'hétérogénéité génétique du VHC est liée à l'échec ou à la réussite du traitement et que son évolution permet de mieux comprendre la façon dont les virus s'adaptent au traitement. / Hepatitis C virus (HCV) is a major threat to global health, with over 130 million annual infections. HCV is a blood borne virus transmitted primarily via intravenous drug use or hospital transfusions. It infects the liver cells and is the leading cause of liver cancer. It adapts to the host environment with a high mutation rate and can make efficient treatment very difficult. Due to poor replication proofreading, the virus multiplies rapidly in the host and creates a population of viruses which is genetically heterogeneous enough to escape selective pressures. This HCV population called quasispecies is found within and between infected hosts. Current antiviral treatment consists of a triple therapy of peg-Interferon, ribavirin and protein inhibitors (PI). PIs such as telaprevir, boceprevir target the NS3 region of the genome, blocking the replication mechanism. However due to the highly dynamic nature of the quasispecies, the target sequences are variable and PIs designed to bind to a particular genomic region are therefore rendered ineffective.We analyse viral populations of HCV using Next generation Sequencing (NGS) technologies and ultradeep pyrosequencing, which allow for rapid and large scale analysis of genetic data. Amplicon sequencing allows for targeting particular regions of the viral genome, such as the NS3 or NS5B which form a part of the replication mechanism and hence are targets for antiviral therapy. Compared to Sanger sequencing, our NGS pipeline ascertains viral population heterogeneity within a host. We implemented the bioinformatics workflow manually and in eHive as an automated pipeline.We study HCV samples from 40 patients treated with triple therapy. Two sources of the virus, plasma and peripheral blood mononuclear cells are used for sequencing. The main aim is to check if a baseline analysis of the NS3 genomic region can help to predict the outcome of the treatment. We find that antiviral resistance mutations are found in both responders and non-responders to the treatment. Since no correlation exists between observed mutations and failure of tri-therapy, we look for other genetic signatures of treatment failure. We find that genetic heterogeneity, calculated using Shannon’s entropy, is lower in responders. We conclude that the viral heterogeneity can be used as an independent factor to predict response to treatment, more than presence of specific mutations at baseline.NGS also enables large-scale studies of viral evolution within a single host. Using multiple sampling time points, we gain insights about viral evolutionary characteristics of HCV and responses to selective pressures during infection. For three patients with viral samples covering a period of 13 years, we perform amplicon sequencing on the NS3 and NS5B regions. Mixed infections comprising of multiple genotypes are found in two patients. We find considerable population structure and diverging HCV lineages within each patient. Over the course of treatment, genetic heterogeneity and effective population size in the NS5B regions increases sharply after treatment initiation compared to baseline. These results provide evidence of diversifying selection occurring post-treatment, acting on standing genetic variation resulting in high genetic heterogeneity. These are characteristics of a soft selective sweep, which is observed for the first time in chronic HCV patients infected with multiple genotypes.Our NGS analysis show that genetic heterogeneity in HCV is related to treatment failure and that its evolution provides insights about how viruses adapt to treatment.

La polymérase NS5B du virus de l’hépatite C (VHC) porte une activité ARN polymérase ARN-dépendante essentielle pour la réplication de l'ARN génomique viral. Cette réplication implique la synthèse d'un intermédiaire de réplication de polarité négative. In vitro et probablement in vivo, la NS5B initie la synthèse d'ARN par un mécanisme de novo qui nécessite des interactions spécifiques entre la polymérase virale et des éléments des ARN viraux. Dans une première partie nous avons étudié le rôle du GTP et d’un domaine C-terminal nommé linker de la polymérase. Nos résultats démontrent que des concentrations élevées de GTP sont nécessaires pour la transition de l'initiation à l'élongation de la synthèse de l'ARN. Des mutations dans le linker à la position 556 ne modifient pas la concentration de GTP nécessaire pour la transition. Toutefois, l'initiation de la synthèse d'ARN est augmentée par la mutation S556K. Une analyse structurale menée en parallèle suggère une implication directe du linker dans l'initiation de novo de la synthèse de l'ARN. Dans les deuxièmes et troisièmes parties, nous avons étudié le rôle de motifs ARN dans la traduction et la synthèse de l’'ARN du VHC. Nous avons démontré que la tige boucle SL-E1 formée par la région entre les nt 177 et 222 de l'extrémité 3' de l’ARN (-) est importante pour la synthèse d'ARN in vitro par la NS5B recombinante et dans les cellules Huh7 exprimant le complexe de réplication (RC) du VHC. SL-E1 est impliquée dans l’initiation de la synthèse d’ARN, au moins in vitro. Nous avons également étudié le rôle des tiges boucles SLV et SLVI du gène core. Nos données n'ont pas montré de rôle évident de ces séquences ou de leur complément dans la synthèse de l'ARN in vitro par la NS5B recombinante et en culture cellulaire par le RC du VHC. Nous avons confirmé leur effet négatif sur la traduction IRES dépendante par interaction ARN-ARN longue distance entre SL-VI et le 5'UTR et démontré que le miR122 ne peut pas empêcher cet interaction. Par contre, la présence de SL-VI prévient l’inhibition de la traduction induite par l’interaction entre le domaine III de l’IRES et la tige boucle 5BSL3.2 en 3’ du génome. Ces résultats démontrent la complexité des interactions ARN/ARN et ARN/protéines dans la régulation de la réplication virale. / The hepatitis C virus (HCV) NS5B protein displays a RNA-dependent RNA polymerase activity essential for replication of the viral RNA genome. This replication involves the synthesis of a replication intermediate of negative polarity. In vitro and likely in vivo, the NS5B initiates RNA synthesis by a de novo mechanism which requires specific interactions between the polymerase and viral RNA elements. In the first part of results, we described a combined structural and functional analysis of HCV-NS5B to study the role of a C-terminal segment (termed linker) and of GTP in RNA synthesis. Our results demonstrated that high GTP concentrations are necessary for the transition from the initiation to the elongation of RNA synthesis, and that linker mutations at position S556 did not modify the GTP requirement of NS5B for this transition. However, the initiation of RNA synthesis was greatly enhanced by a S556K mutation. These results together with a structural analysis point to the direct involvement of the linker in the de novo initiation of RNA synthesis. In the second and third parts of results, we studied the role of RNA elements in RNA synthesis. We demonstrated that the SL-E1 stem–loop formed by nucleotides 177–222 from the 3’-end of the HCV (-) RNA is important for RNA synthesis both in vitro by the recombinant NS5B and in Huh7 cells by HCV replication complex (RC). We also showed that SL-E1 is involved in initiation of RNA synthesis, at least in vitro. Then we studied the role of other viral RNA elements in core coding sequences (SLV and SLVI stem loops) and the involvement of the microRNA miR122 in RNA translation and RNA synthesis. For SLV and SLVI, our data did not show any clear role of these core-coding sequences or of their complement in the (-) RNA in RNA synthesis both in vitro by the recombinant NS5B and in cell culture by HCV-RC. We confirmed their negative effect on HCV-IRES translation through long range RNA-RNA interaction between SL-VI sequences and the 5’UTR and demonstrated that miR122 cannot disrupted this interaction and switches the region to an open conformation. Conversely, our data indicated that the SL-VI domain can counteract the negative effect of the interaction between the domain III of IRES and the 5BSL3.2 stem loop localized at the 3’end of the genome. These results point to the complexity of RNA/RNA and RNA/proteins interactions in the HCV replication cycle.

Les protéines APOBEC3 (A3A-A3H) catalysent la désamination des cytidines (C) présentes sur l'ADN simple brin en thymidine (T). Cette activité cytidines désaminase a initialement été décrite comme impliquée dans la restriction des rétrovirus et de certains virus à ADN par leur capacité à induire de nombreuses mutations C->T, ou hypermutations, sur les génomes viraux. Il apparait néanmoins que leur activité n'est pas restreinte aux génomes viraux et que certaines A3 peuvent induire des mutations sur l'ADN mitochondrial (A3A, C, F, G et H) et nucléaire (A3A et A3B). Ainsi, l'impact somatique des A3 est désormais établi dans la formation de certains cancers, dont la majorité des mutations, portent signatures des APOBEC3. Aux vues de ces observations, nous nous sommes intéressés à la façon dont sont régulées ces enzymes dans le contexte du stress cellulaire viro-induit ou endogène. La première partie de nos travaux a porté sur la protéine A3DE, seul membre de la famille APOBEC3 ne possédant pas d'activité cytidine désaminase. De façon intéressante, il apparait qu'A3DE est surexprimée dans les cirrhoses infectées par le VHB, VHC ou co-infectées par le VHC et le VHB. Nous avons pu mettre en évidence qu'A3DE interagit et module l'activité d'A3F et d'A3G, deux cytidines désaminases exprimées dans le foie et impliquées dans la restriction du VHB. Dans un second temps, nous nous sommes intéressés à la caractérisation du potentiel génotoxique de la protéine A3B. Cette protéine, de par sa localisation strictement nucléaire, constitue la seule A3 à double domaine n'interagissant pas avec A3DE. Contrairement à A3A, A3B est faiblement active sur l’ADN nucléaire et n’induit pas de cassures de l’ADN double brin. Nous avons pu mettre en évidence par mutagénèse les régions de la protéine impliquées dans l’atténuation de la génotoxicité d’A3B par rapport à A3A et que cette atténuation est conservée chez les primates. Enfin, nous avons étudié le rôle et la régulation d’A3A dans le catabolisme. Nous avons mis en évidence que l’ADN mitochondrial cytoplasmique (ADNcymt) active la voie RIG-I/ARN polymérase III ce qui a pour effet d’induire la production d’IFN qui va activer l’expression d’A3A. A3A va ainsi jouer un rôle dans le catabolisme de l’ADNcymt et contribue à l'élimination de cette source de stress cellulaire, mais occasionnant par la même des dommages sur l’ADN nucléaire. Les A3 sont des enzymes fondamentales de la défense immunitaire innée et du catabolisme de l’ADN. Nous montrons qu’A3DE a pour fonction de moduler l’activité d’A3F et d’A3G tandis qu’A3B, possède un phénotype atténué chez tous les primates et s’avère moins génotoxique que’A3A. Cette dernière participe à la dégradation de l’ADN cytoplasmique, limitant ainsi l’inflammation. Néanmoins, A3A peut s’avérer dangereuse pour l’intégrité génomique et contribuer à l’émergence de cancers, notamment en cas d’inflammation chronique. / APOBEC3 proteins (A3A-A3H) catalyse the deamination of cytosine (C) to thymidine (T) on single stranded DNA. This activity, called cytidine deaminase, has initially been described as a mechanism involved in restriction against retroviruses and DNA viruses by massively inducing C->T mutations on viral genome : this phenomenon is called "hypermutations". Nevertheless, this activity is not virus-specific and some A3 can induce mutations on mitochondrial DNA (A3A, C, F, G, H) and nuclear DNA (A3A and A3B). Thus, the impact of those proteins on cancer formation is now established in cancers where mutations mostly show an APOBEC3 signature. In view of those considerations, we decided to study how those enzymes are regulated in the context of a viral cellular stress or an endogenous cellular stress. The first part of our work is focused on A3DE, the only APOBEC3 lacking a cytidine deaminase activity. Interestingly, A3DE is upregulated in cirrhotic livers infected by HBV, HCV or coinfected with HBV & HCV. We show that A3DE inhibits A3F & A3G activity by interacting with those HBV restriction involved A3. Then, we studied the attributes of the genotoxicity potential of A3B. This protein, by his strictly nuclear localization, constitutes the only double domain A3 which is not regulated by A3DE. Unlike A3A, A3B is weakly active on nuclear DNA and does not induce double strand breaks. We determine by directed mutagenesis the clusters of A3B involved in genotoxicity attenuation compared with A3A. We also show that this attenuation is conserved among primates. Finally, we investigated the role and regulation of A3A in the context of DNA catabolism. We proved that mitochondrial cytoplasmic DNA (mtcyDNA) triggers the RIG-I/DNA polymerase III pathway, which induces IFN production leading to A3A expression. So A3A will be involved in mtcyDNA catabolism and contribute to the clearance of this stress signal, but will also induce double strand breaks on nuclear DNA. A3 are major enzymes of the innate immune response and DNA catabolism. We show that A3DE modulates A3F and A3G activity while A3B is attenuated among primates and is less genotoxic than A3A. A3A participates to cytoplasmic DNA catabolism and limits inflammation. Nevertheless, A3A could be dangerous for the genomic integrity and contributes to cancer, especially in cases of chronic inflammation.

L’entrée du virus de l’hépatite C (VHC) dans les hépatocytes est un événement multi-étapes complexe, impliquant un certain nombre de facteurs cellulaires. Elle est initiée par la fixation des particules virales sur des structures d’héparanes sulfates (HS) présentes à la surface de l’hépatocyte. Cette étape initiale reste cependant peu comprise. En effet, en raison de l’interaction de la particule virale du VHC avec des lipoprotéines, la contribution exacte des différents composants du virion à cette interaction reste controversée. Au cours de cette thèse, nous avons étudié le rôle potentiel de protéines d'enveloppe du VHC et de l'apolipoprotéine E dans l'étape de liaison aux HS. Nous avons d’abord montré que la délétion de la région hypervariable 1 (HVR1), une région précédemment proposée pour participer à l’interaction avec les HS, n'avait aucun effet sur la liaison du virion aux HS, indiquant que cette région n'est pas impliquée dans cette interaction. Nous avons également utilisé des anticorps monoclonaux neutralisants reconnaissant différentes régions des glycoprotéines d'enveloppe du VHC dans un test de compétition utilisant des billes d’agarose couplées à l’héparine, un homologue structural des HS, pour précipiter le virus. Bien que les glycoprotéines d’enveloppe du VHC dissociées de la particule virale interagissaient avec l'héparine, aucun de ces anticorps n’était capable d'interférer avec l'interaction entre la particule virale et l’héparine, suggérant fortement que les glycoprotéines d'enveloppe du VHC présente à la surface des virions ne sont pas accessibles pour interagir avec les HS. En revanche, nos résultats d’études cinétiques, d’interaction avec l’héparine ainsi que les expériences d'inhibition avec des anticorps anti-apolipoprotéine E indiquent que cette apolipoprotéine joue un rôle majeur dans l'interaction initiale entre le VHC et les HS. Enfin, la caractérisation des déterminants structuraux des HS nécessaires à l'infection par le VHC, à l’aide d’ARN interférents ciblant des enzymes impliquées dans la voie de biosynthèse des HS et par compétition avec des héparines modifiées, indique que la N-sulfatation et la 6-O-sulfatation sont nécessaires pour l’initiation de l'infection par le VHC. Par contre la 2-O-sulfatation n’est pas indispensable pour l’étape d’entrée cellulaire du VHC. Enfin, nous avons également montré que la taille minimale des oligosaccharides d’HS requise pour l'infection par le VHC est un decasaccharide. En conclusion, l’ensemble de ces données indique que le VHC détourne l'apolipoprotéine E pour initier son interaction avec des structures d’HS spécifiques. / Hepatitis C virus (HCV) entry into hepatocytes is a complex multistep process involving a series of cellular factors. HCV entry is initiated by the binding of viral particles to cell surface heparan sulfate (HS) structures. However, due to the lipoprotein-like structure of HCV, the exact contribution of virion components to this interaction remains controversial. Here, we investigated the relative contribution of HCV envelope proteins and apolipoprotein E in the HS-binding step. Deletion of hypervariable region 1, a region previously proposed to be involved in HS-binding, did not alter HCV virion binding to HS, indicating that this region is not involved in this interaction. Neutralizing monoclonal antibodies recognizing different regions of HCV envelope glycoproteins were also used in a pull-down assay with beads coated with heparin, a close HS structural homologue. Although isolated HCV envelope glycoproteins could interact with heparin, none of these antibodies was able to interfere with virion-heparin interaction, strongly suggesting that, at the virion surface HCV envelope glycoproteins are not accessible for HS binding. In contrast, results from kinetic studies, heparin pull-down and inhibition experiments with anti-apolipoprotein E antibodies indicate that this apolipoprotein plays a major role in HCV-HS interaction. Finally, characterization of HS structural determinants required for HCV infection by silencing enzymes involved in the HS biosynthesis pathway and by competition with modified heparin indicated that N- and 6-O-sulfation but not 2-O-sulfation are required for HCV infection, and that the minimum HS oligosaccharide length required for HCV infection is a decasaccharide. Together, these data indicate that HCV hijacks apolipoprotein E to initiate its interaction with specific HS structures.

Le virus de l’hépatite B (VHB) est un virus du foie qui cause 1 à 2 millions de morts chaque année. Approximativement 400 millions d’individus sont infectés chroniquement. Le VHB est un virus enveloppé et comprend un génome ADN de ~3.2 kbp au sein d’une capside icosaédrique. La capside est formée de 240 copies d’une protéine unique appelée Core ou protéine de la capside. Durant l’infection, la capside est importée dans le noyau pour libérer le génome viral. L’import est facilité au travers du complexe du pore nucléaire (NPC) en utilisant des récepteurs de transport nucléaire. Des biopsies réalisées sur des patients infectés par le VHB ont montrées que les capsides nucléaires sont issues de l’entrée nucléaire mais aussi de protéines Core nouvellement traduites.Ce travail analyse l’import nucléaire de la capside du VHB et la libération du génome viral. Nous avons montré que les imports des protéines Core et de la capside suivent des systèmes d’import différents. Il a été démontré à partir de tests d’import nucléaire basés sur des cellules perméabilisées par la digitonine que les capsides utilisent l’hétérodimère des importines α et β. Cette découverte est en accord avec de précédentes observations qui ont également démontrées l’exposition de NLS à la surface de la capside, sur lequel s’attache l’importine α. Des expériences de contrôle utilisant le GST-NLS ont permis de démontrer que la fixation du NLS sur l’importine nécessite une interaction avec l’importine  pour la stabilisation du complex de l’import. En analysant l’import nucléaire de la protéine Core non assemblée, nous avons pu observer un import basé uniquement sur l’interaction avec l’importine β, ce qui implique que la protéine Core présente un domaine IBB et non un NLS. Le transport a travers le NPC se termine par l’arrivée des capsides dans le panier nucléaire, qui est une structure en cage, du côté nucléaire. En accord avec la littérature, nous avons observé une liaison de l’importine β sur le domaine C-terminal de la Nup153. L’ajout de RanGTP, qui dissocie les complexes d’import, ne dissocie pas l’importine β de ce domaine, ce qui permet d’émettre l’hypothèse qu’un autre domaine de la Nup153 est impliqué. Contrairement aux autres cargos, la capside du VHB est stoppée dans le panier nucléaire par sont interaction avec la Nup153. Puisque le domaine de liaison de l’importine β chevauche celui de la capside, l’importine β doit se dissocier de la Nup153. L’interaction capside-Nup153 est supposée déstabiliser la capside et permettre la libération du génome viral dans le noyau et la diffusion des protéines Core en supériorité numérique par rapport à la Nup153.En conséquence, les capsides montrent une instabilité, comme nous l’avons démontré par chromatographie d’exclusion de taille, révélant non seulement la capside mais aussi ses intermédiaires d’association/dissociation. Ces expériences sont limitées aux capsides recombinantes car elles nécessitent une grande quantité d’échantillons. Dans le but de confirmer l’instabilité des autres capsides (matures et immatures), nous avons analysé l’accessibilité des acides nucléiques encapsidés pour la nucléase S7. Les résultats ont confirmé une dissociation in vitro partielle pour toutes les capsides, mais avec une cinétique lente, ce qui n’est pas cohérent avec la réaction in vivo. En analysant l’impact de la Nup153 sur cette accessibilité, nous observons qu’un facteur nucléaire supplémentaire, présent du moins dans les cellules hépatiques, accélère la cinétique de dissociation. / The hepatitis B virus (HBV) is a hepatotropic virus which causes 1 to 2 million of death every year. Approximately 400 million individuals are chronically infected. HBV is enveloped and comprises a DNA genome of ~3.2 kbp within an icosaedral capsid. The capsid is formed by 240 copies of one single protein species termed core or capsid protein. During the infection, the capsid is imported to the nucleus in order to release the viral genome. The import is facilitated through the nuclear pore complex (NPC) using nuclear transport receptors. Biopsies of HBV-infected patients show nuclear capsids, which are derived from nuclear entry of the capsid but also from nuclear import of progeny core proteins.This work investigates the nuclear import of the HBV capsid and the release of the viral genome. We showed that the imports of core protein and capsid follow different pathways. Capsids were shown to use the heterodimer of importin α and β for nuclear import as it was demonstrated by nuclear import essay, based on digitonin-permeabilised cells. This finding is consistent with earlier observations, which also demonstrated the exposure of NLS on the capsid surface, to which importin  attaches. Control experiments using GST-NLS demonstrated that binding of the NLS to importin  required interaction with importin  for stabilization of the import complex. Analysing the nuclear import of the unassembled core protein we observed an import based on interaction with only importin β implying that the core protein expose an importin -binding domain rather than an NLS.The transport through the NPC is terminated with the arrival of a cargo capsid in the nuclear basket, which is a cage like structure at the nuclear side of the NPC. Consistent with the literature we observed an attachment of importin  to the C terminal domain of Nup153. Addition of RanGTP, which dissociates import complexes, did not dissociate importin  from this domain, which led to the hypothesis that other Nup153 domains are involved. In contrast to other karyophilic cargos HBV capsids become arrested within the nuclear basket by capsid-Nup153 interaction. As the binding site of importin overlaps with the binding site of the capsid such importin -Nup153 interaction has to be dissociated. The subsequent capsid-Nup153 interaction was thought to destabilize the capsid allowing liberation of the viral genome into the nuclear and the diffusion of core proteins, supernumerous with regard to the Nup153 molecules, deeper into the nucleus. Accordingly, capsids show an imminent instability as we demonstrated by separation of capsids using size exclusion chromatography revealing not only capsids but assembly/disassembly intermediates. These experiments were limited to recombinant, E. coli-expressed due to the high amounts needed. To confirm the instability of other capsids e.g. genome-containing ones, we analyzed the accessibility of the capsid enclosed nucleic acids to the S7 nuclease. The results confirmed partial dissociation in vitro similar for all capsids but with a slow kinetic, which is not coherent with the in vivo reaction. Investigating the impact of Nup153 we observed that an additional nuclear factor, present in at least hepatoma cells accelerates the dissociation kinetic.

L’entrée cellulaire du virus de l’Hépatite C (VHC) est un processus complexe qui met en jeu plusieurs facteurs cellulaires. L’un d’eux est un récepteur des lipoprotéines, le « Scavenger Récepteur B1 » (SR-BI). SR-BI a initialement été proposé comme récepteur viral de par son interaction avec la glycoprotéine (GP) E2 du VHC. L’importance de SR-BI pour l’entrée cellulaire du VHC n’était, jusqu’alors suggérée que par des preuves indirectes. En outre, les mécanismes par lesquels SR-BI permet l’entrée du VHC restent peu connus. Néanmoins, grâce à l’identification de cellules hépatiques présentant un très faible niveau d’expression - non détectable - de ce récepteur et devenant susceptibles à l’infection par le VHC par l’expression ectopique de SR-BI, nous avons clairement démontré que SR-BI est indispensable pour l’entrée du VHC. Afin d’étudier le rôle de SR-BI dans l’entrée cellulaire du VHC, qui présente une singulière hétérogénéité en terme de propriétés biochimiques et de composition en protéines cellulaires intégrées à la surface des particules virales, celles-ci ont été séparées par centrifugation analytique en gradient de densité. Nous avons ainsi défini trois fonctions de SR-BI permettant l’entrée de sous-populations du VHC. D’un part, une fonction d’attachement, correspondant à la capture des particules de densités intermédiaires à la surface cellulaire. Cet attachement résulte de l’interaction entre SR-BI et des composants des lipoprotéines présents à la surface des particules virales, sans mettre en jeu d’interaction avec les GP virales. D’autre part, nous avons défini une fonction d’accès, requise pour toutes les sous-populations du VHC. Cette fonction, elle aussi indépendante de l’interaction directe entre la GP E2 et SR-BI, requiert la fonction physiologique de transfert de lipides de SR-BI. En effet, le blocage de cette fonction de transfert à l’aide de molécules inhibitrices ou par insertion de mutations invalidantes de SR-BI réduit significativement l’entrée du VHC. Enfin, nous avons mis en évidence une troisième fonction, appelée fonction de stimulation, nécessitant l’interaction de la GP E2 et SR-BI, ainsi que la fonction de transfert lipidique deSR-BI et qui, par ailleurs, est régulée par des composants des lipoprotéines. Par l’analyse fonctionnelle de mutants, nous avons défini des déterminants viraux, dans la région HVR1 à l’extrémité N-terminale de la GP E2, et cellulaires, dans la partie N-terminale de SR-BI, critiques pour l’interaction entre E2 et SR-BI et, par conséquent, régulent la fonction destimulation. En conclusion, nous avons démontré que le VHC exploite SR-BI de diverses façons et via des interactions à la fois avec des composants viraux et cellulaires incorporés dans les particules du VHC et ainsi permet l’entrée de particules virales très hétérogènes. / Hepatitis C virus (HCV), which is characterised by its highly heterogeneous biophysical properties, is thought to enter the cell in a slow and multistep manner involving several cell surface molecules. One of these cellular molecules is the Scavenger Receptor B1 (SR-BI), which was identified as an HCV receptor due to its interaction with the HCV glycoprotein E2.Until now, the exact usage of SR-BI by HCV and SR-BI mediated mechanism during cell entry remained unknown. In order to understand SR-BI functions during HCV cell entry, we wanted to study (1) the relevance of HCV E2 binding to SR-BI, (2) the implication of the physiological function of SR-BI itself and (3) how SR-BI mediates cell entry of heterogeneous HCV particles. Owing to the identification of two cell lines that express very low levels of endogenous SRBI, receptor complementation assays revealed, that the ectopic expression of SR-BI is indispensible for HCV entry. Accordingly, we showed for the first time, that SR-BI is an essential HCV entry factor. In order to study HCVcc populations that differ in biophysical properties and host protein composition, we separated them by density gradient analysis and assigned three different SR-BI functions to entry of particular HCV sub-populations. First, an attachment function, that leads to the initial capture of HCV particles of intermediate densities to the cell surface. This attachment function is mediated by an interaction between SR-BI and lipoprotein components on the viral particles but not by the viral glycoproteins. Second, we defined an access function, which is important for all different HCV sub-populations. This access function is also not dependent on the interaction between HCV E2 and SR-BI but involves the physiological function of the receptor. Blocking the lipid transfer function of SRBI upon either mutation or by a specific inhibitor abrogated strongly HCV entry. Finally we defined a third function of SR-BI, that we call enhancement function. This function is triggered upon E2-SR-BI interaction, is dependent on lipoprotein components and involves the lipid transfer function of SR-BI. Upon functional mutagenesis studies, we identified as critical determinants HVR1 (Hypervariable Region 1) residues in E2 and the N-terminus of SR-BI, allowing E2-SR-BI interaction and consequently the implementation of the enhancement function. In conclusion we demonstrate that SR-BI is an unparalled virus entry factor. Its usage by HCV to enter the cell is manifold and intriguingly, owing to the heterogeneous nature of HCV particles, involves different viral components exploiting different aspects of SR-BI.

Les résultats fondamentaux et biocliniques que nous présentons au travers de cette thèse illustrent la difficulté d’évaluer la part liée au virus et celle liée à des facteurs de l’hôte dans l’induction d’une stéatose hépatique chez les patients chroniquement infectés par le HCV. Les données in vitro suggèrent que le virus joue un rôle direct dans l’induction d’une stéatose, notamment par les propriétés de sa protéine de capside, et que la variabilité du virus peut avoir un impact sur l’intensité de cette stéatose. Notre étude bioclinique suggère que la variabilité du virus semble avoir un rôle beaucoup plus modéré in vivo. Ainsi, chez les patients chroniquement infectés par le HCV, les facteurs de l’hôte joueraient un rôle majeur pour moduler le degré de la stéatose associée au virus et de prochaines études seront nécessaires pour établir la nature de ces facteurs. / The results presented in this thesis illustrate the difficulty of assessing the part related to the virus and that related to host factors in the induction of hepatic steatosis in patients chronically infected with HCV. In vitro data suggest that the virus plays a direct role in the induction of steatosis, due to the properties of its capsid protein, and that the variability of the virus can affect the intensity of the steatosis. Our bio-clinical study suggests that this variability seems to have a much more moderate impact in vivo. Thus, in patients chronically infected with HCV, host factors seem to play a major role to modulate the degree of steatosis associated with the virus. Further studies are needed to establish the nature of these factors.

Le virus de l’hépatite A et les norovirus humains sont les principaux agents viraux causant des maladies d’origine alimentaire mondialement. Contrairement aux bactéries, une contamination des aliments par ces virus n’est pas facilement détectable et ceux-ci y sont présents en très faible quantité. Malheureusement, une faible concentration de ces virus sur les aliments suffit à provoquer une infection. Afin d’effectuer une détection sensible et éviter des éclosions, il est primordial d’effectuer une concentration de ces virus. L’objectif de ce projet était donc de développer deux méthodes de concentration, l’une possédant une affinité spécifique basée sur les anticorps spécifiques et l’autre possédant une affinité à large spectre utilisant l’apolipoprotéine H. La méthode basée sur les anticorps a été élaborer à partir d’autres méthodes similaires présenté dans la littérature. La méthode basée sur l’apolipoprotéine H, pour sa part, est méthode élaborer et optimiser durant ce projet de recherche. La caractérisation de l’affinité de l’apolipoprotéine H et son utilisation dans une méthode de concentration virale étant très peu détaillé par la communauté scientifique. Étant donné que les résultats obtenus pour la méthode de concentration basée sur les anticorps spécifiques étaient insatisfaisants. En effet, la sensibilité de la méthode ainsi que ça répétabilité était faible. Les efforts ont été dirigés vers la méthode de concentration basée sur l’apolipoprotéine H qui présentait des résultats prometteurs. À ce jour, aucune étude n’a démontré une affinité entre le virus de l’hépatite A et l’apolipoprotéine H et l’applicabilité de cette méthode à concentrer ces virus dans les aliments. Dans ce projet de recherche, la méthode basée sur l’apolipoprotéine H a été testée sur des fraises et des framboises fraîches et congelées contaminés expérimentalement par le virus de l’hépatite A et le norovirus humain GII.4 et comparée à la méthode référence ISO 15216 : 1. / Hepatitis A virus and human noroviruses are the major viral agents causing foodborne illness worldwide. Unlike bacteria, food contamination by these viruses is not easily detectable and they are present in very small quantities. Unfortunately, a low concentration of these viruses on food is enough to cause infection. In order to carry out a sensitive detection and avoid outbreaks, it is essential to carry out a concentration of these viruses. The objective of this project was therefore to develop two concentration methods, one with specific affinity based on specific antibodies and the other with broad-spectrum affinity using apolipoprotein H.The antibody-based method has been developed from other similar methods presented in the literature. The method based on apolipoprotein H, for that part, is a method developed and optimized during this research project. The characterization of the affinity of apolipoproteinH and its use in a method of viral concentration being very little detailed by the scientific community. Since the results obtained for the concentration method based on specific antibodies were unsatisfactory. Indeed, the sensitivity of the method as well as its repeatability was low. Efforts were directed towards the concentration method based on apolipoprotein H which showed promising results. To date, no study has demonstrated an affinity between the hepatitis A virus and apolipoprotein H and the applicability of this method to concentrate these viruses in food. In this research project, the method based on apolipoprotein H wastested on fresh and frozen strawberries and raspberries experimentally contaminated with the hepatitis A virus and the human norovirus GII.4 and compared with the ISO reference method. 15216: 1.

Le virus de l'hépatite A et les norovirus humains sont les principaux agents viraux causant des maladies d'origine alimentaire mondialement. Contrairement aux bactéries, une contamination des aliments par ces virus n'est pas facilement détectable et ceux-ci y sont présents en très faible quantité. Malheureusement, une faible concentration de ces virus sur les aliments suffit à provoquer une infection. Afin d'effectuer une détection sensible et éviter des éclosions, il est primordial d'effectuer une concentration de ces virus. L'objectif de ce projet était donc de développer deux méthodes de concentration, l'une possédant une affinité spécifique basée sur les anticorps spécifiques et l'autre possédant une affinité à large spectre utilisant l'apolipoprotéine H. La méthode basée sur les anticorps a été élaborer à partir d'autres méthodes similaires présenté dans la littérature. La méthode basée sur l'apolipoprotéine H, pour sa part, est méthode élaborer et optimiser durant ce projet de recherche. La caractérisation de l'affinité de l'apolipoprotéine H et son utilisation dans une méthode de concentration virale étant très peu détaillé par la communauté scientifique. Étant donné que les résultats obtenus pour la méthode de concentration basée sur les anticorps spécifiques étaient insatisfaisants. En effet, la sensibilité de la méthode ainsi que ça répétabilité était faible. Les efforts ont été dirigés vers la méthode de concentration basée sur l'apolipoprotéine H qui présentait des résultats prometteurs. À ce jour, aucune étude n'a démontré une affinité entre le virus de l'hépatite A et l'apolipoprotéine H et l'applicabilité de cette méthode à concentrer ces virus dans les aliments. Dans ce projet de recherche, la méthode basée sur l'apolipoprotéine H a été testée sur des fraises et des framboises fraîches et congelées contaminés expérimentalement par le virus de l'hépatite A et le norovirus humain GII.4 et comparée à la méthode référence ISO 15216 : 1. / Hepatitis A virus and human noroviruses are the major viral agents causing foodborne illness worldwide. Unlike bacteria, food contamination by these viruses is not easily detectable and they are present in very small quantities. Unfortunately, a low concentration of these viruses on food is enough to cause infection. In order to carry out a sensitive detection and avoid outbreaks, it is essential to carry out a concentration of these viruses. The objective of this project was therefore to develop two concentration methods, one with specific affinity based on specific antibodies and the other with broad-spectrum affinity using apolipoprotein H. The antibody-based method has been developed from other similar methods presented in the literature. The method based on apolipoprotein H, for that part, is a method developed and optimized during this research project. The characterization of the affinity of apolipoprotein H and its use in a method of viral concentration being very little detailed by the scientific community. Since the results obtained for the concentration method based on specific antibodies were unsatisfactory. Indeed, the sensitivity of the method as well as its repeatability was low. Efforts were directed towards the concentration method based on apolipoprotein H which showed promising results. To date, no study has demonstrated an affinity between the hepatitis A virus and apolipoprotein H and the applicability of this method to concentrate these viruses in food. In this research project, the method based on apolipoprotein H was tested on fresh and frozen strawberries and raspberries experimentally contaminated with the hepatitis A virus and the human norovirus GII.4 and compared with the ISO reference method. 15216: 1.