Le virus de l'hépatite C (VHC) infecte plus de 170 millions de personnes dans le monde. À l'heure actuelle, les thérapies utilisées contre ce virus sont insatisfaisantes. La protéine de la capside (C) du VHC est impliquée dans l'assemblage viral et l'encapsidation du génome. Les domaines chargés positivement de la moitié NH2-terminale de la protéine C (C 1-82) sont suspectés être responsables de l'interaction avec l'ARN viral génomique. Dans cette étude, différents mutants (ponctuels et de délétion) de la C 1-82 ont été générés et exprimés dans E. coli afin d'identifier une (des) région(s) de la protéine essentielle(s) pour l'assemblage viral. Or, tous les mutants produits dans cette étude ne sont affectés ni dans la reconnaissance de l'ARN ni dans la formation de pseudo-nucléocapsides virales (PNV). Ces résultats suggèrent que c'est la charge globale de la protéine qui est importante pour l'interaction avec l'ARN et non une région précise dans la portion NH2-terminale.

Thèse ou mémoire avec insertion d'articles. / Le virus de l'hépatite E (HEV) provoque des cas sporadiques d'hépatite aiguë dans les pays industrialisés par le biais d'une transmission zoonotique via l'alimentation. Les porcs et plusieurs espèces animales de la faune sauvages ont été identifiés comme hôtes du HEV. La principale source de transmission du HEV à l'humain est la consommation de viande de porc crue ou insuffisamment cuite. Une autre voie potentielle d'exposition pourrait être la consommation de baies, cultivées en plein champs, dans des zones à proximité d'animaux sauvages infectés par le HEV. En effet, les fèces animales infectés contamineraient l'environnement et les fruits par contact direct. Toutefois, les données quantitatives sur la présence du HEV dans les aliments produits au Canada sont limitées. Le but du projet a donc été d'évaluer le niveau de contamination par le HEV dans des bleuets et des produits à base de foie de porc vendus dans deux provinces du Canada. Pour ce faire, 150 échantillons de bleuets ont été récoltés au Québec et au Nouveau-Brunswick. Pour les produits carnés, 83 échantillons de pâtés de foie de porc et 79 échantillons de foies de porc crus ont été collectés uniquement au Québec. La présence ou l'absence de HEV a été déterminée par détection moléculaire. Parmi les 150 échantillons de bleuets testés, aucun n'a été détecté positif au HEV. En revanche, concernant les pâtés de foie de porc et foies de porc crus, de l'ARN de HEV a été trouvé dans respectivement 29 % (24/83) et 4 % (3/79) des échantillons testés. Ces résultats suggèrent que (1) le risque de contamination des bleuets canadiens par le HEV semble être faible et ainsi, que le risque de transmission du HEV aux humains par l'ingestion de bleuets contaminés est probablement minime, (2) l'ARN du HEV peut être retrouvé dans des produits à base de foie de porc vendus dans les épiceries québécoises et potentiellement conduire à une infection par le HEV chez les consommateurs., voire à des formes graves chez les sujets à risque. Les résultats mis en avant dans ce projet incite à mener des études de prévalence plus larges et à surveiller le HEV dans certains produits alimentaires. / The hepatitis E virus (HEV) causes sporadic acute hepatic cases in industrialized countries through a zoonotic transmission and foodborne origin. Pigs and wild animals have been characterized as HEV-hosts. The main source of transmission of HEV to humans is the consumption of raw or undercooked pork products. Another possible route of transmission could be the presence of wild animals carrying the virus in berry fields. They would contaminate the environment and fruit by direct contact with their infected feces. However, quantitative data on the presence of HEV in Canadian food is limited. The aim of this project was to assess the level of HEV contamination in blueberries and pork liver products sold in two provinces of Canada. To do so, 150 blueberry samples were collected in Quebec and New Brunswick. For meat products, 83 samples of pork liver pâtés and 79 samples of raw pork livers were collected in Quebec only. The presence or absence of HEV was determined by molecular detection. Out of the 150 tested blueberry samples, none showed HEV detection. In contrast, 29 % (24/83) pork liver pâtés and 4 % (3/79) raw pork livers were found positive for HEV RNA. These results suggest that (1) the risk of HEV contamination of Canadian blueberries appears to be low and thus the risk of transmission of HEV to humans through ingestion of contaminated blueberries is likely to be minimal, (2) HEV RNA can be found in pork liver products sold in Quebec grocery stores and potentially lead to HEV infection in consumers and even severe forms in at-risk individuals. The results highlighted in this project encourage larger prevalence studies and monitoring of HEV in certain food products.

Le virus de l'hépatite delta humaine (VHD) est un petit virus d'ARN circulaire qui infecte plus de 15 millions d'individus à travers le monde. Ce virus code pour un seul ARN messager (ARNm) et celui-ci génère deux isoformes de l'antigène delta (HDAg), des protéines essentielles au VHD. Le ribozyme delta reconnaît son substrat d'ARN par appariement de paires de bases et la séquence reconnue est : une pyrimidine, suivie d'une guanosine et de six autres nucléotides (PyGN[indice inférieur 6]). Il est théoriquement possible de modifier le domaine de reconnaissance du substrat du ribozyme delta afin d'inactiver n'importe quel substrat d'ARN portant le PyGN[indice inférieur 6]. Le ribozyme delta et d'autres ribozymes possèdent donc un potentiel thérapeutique énorme pour l'inactivation d'ARN indésirables tels que les ARN viraux ou oncogènes. L'objectif de ce projet de recherche est de développer des ribozymes delta qui inactivent l'ARNm du VHD et d'approfondir les connaissances sur la spécificité de reconnaissance du substrat par le ribozyme delta."--Résumé abrégé par UMI.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est la tumeur maligne primitive du foie la plus fréquente (90 % des cas). Le CHC est le cinquième cancer par ordre de fréquence à l'échelon mondial, la troisième cause de décès par cancer dans le monde entier et son incidence est actuellement croissante. Parmi Les principaux facteurs prédictifs de survenue de CHC ; les altérations génétiques, l'alcool et les infections par les virus des hépatites B (VHB) et C (VHC). Les travaux de thèse en cotutelle menés entre l’Universités Paris Sud 11-France et l’Université Mohammed V- Rabat –MAROC ont porté essentiellement sur l’étude de deux facteurs de risque impliqués dans le développement du carcinome hépatocellulaire ; le polymorphisme génétique et l’infection par le virus de l’hépatite C. Dans un premier temps, ce travail de recherche s’est focalisée sur l’éventuelle relation pouvant liée les polymorphismes génétiques des gènes PCAF, P300 au carcinome hépatocellulaire. Sur le plan génétique nous avons constaté que les génotypes Val/Val de EP300 et Ser/Ser de PCAF apparaissent comme les plus associés à l’hépatocarcinome. Par ailleurs, ces derniers se trouvent associés d’une manière significative au carcinome hépatocellulaire. Par la suite, notre travail a consisté à mieux caractériser la variabilité génétique du HCV et l’épidémiologie des souches virales chez la population marocaine pour lesquelles peu de données étaient disponibles. Les analyses phylogénétiques des régions NS5B et E2 et les données épidémiologiques recueillies ont permis de répondre à ces questions. Enfin, La dernière partie des travaux de cette thèse vise à identifier des facteurs cellulaires essentiels à la réplication du VHC, dans l’objectif de définir de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement des hépatites virales C. Nous avons pu identifier la septine 9 comme facteur cellulaire impliqué dans le cycle de vie virale du HCV, ainsi que les protéines PIAS1 et SUMO1 comme protéines régulatrices de la septine 9. De plus nous avons pu établir la relation entre ces protéines cellulaires dont la présence est nécessaire à la fois à la production des protéines virales ( CORE et E2) et à la réplication du virus dans la cellule hôte. / Hepatocellular carcinoma (HCC) is the fifth most common cause of cancer worldwide and the third most common cause of cancer mortality. HCC is one of the few cancers with welldefined major risk factors. Major causes of HCC include hepatitis B, hepatitis C, alcoholic liver disease, nonalcoholic, steatohepatitis, hereditary hemochromatosis, and geneticalteration. The multifactorial causes of HCC might explain its complex molecular pathogenesis. Detailed understanding of epidemiologic factors and molecular mechanisms associated with HCC ultimately could improve our current concepts for screening and treatment of this disease. With a view toward current concepts for screening of this disease, first, we analyzed a genetic susceptibility to hepatocellular carcinoma. The aim of the current study was to assess the impact of the Ile997Val in EP300 and Asn386Ser in PCAF polymorphisms on the risk of HCC. we found that the Val/Val of the EP300 at codon 997 and Ser/Ser of the PCAF at codon 386 were associated with an increased risk of HCC in the Moroccan population. A higher risk of HCC was observed in HCV-negative subjects. We also found that male with Ser/Ser in thePCAF gene and women with Val/Val genotype of the EP300 had a higher risk to develop HCC. It appears that variants of the transcriptional coactivator genes (EP300 and PCAF) may influence HCC risk in populations with low mutations or hromosomal instability rates. Additional surveys are warranted to confirm this first report. The incidence of HCC is increasing in Western countries, mostly because of the high prevalence of hepatitis C virus (HCV) infection. In this sense, we have tried to identify new host factors involved in replication of HCV. Hepatitis C virus (HCV) replicates in the liver,and chronic infection often leads to cirrhosis, steatosis, and hepatocellular carcinoma. There is no vaccine to protect against HCV infection. Major improvement has been recently achieved regarding treatment of HCV infection however there is already evidence for emergence of resistance due to the high genetic variability of the HCV RNA genome. Thus it should be important, to design therapies which avoid genotypic resistance by targeting cellular proteins. Understanding the mechanisms that allow proper assembly and intracellular trafficking of HCV proteins may have a profound impact on the treatment efficacy. An important hallmark of chronic HCV infection is liver steatosis associated with the accumulation of lipid droplets (LDs). The LDs accumulated in the HCV infected cells and the HCV core protein induces the redistribution of LDs, through the clustering of these organelles in the perinuclear area, providing a platform for virus assembly and in the production of infectious particles. Several host proteins have been proposed to facilitate the replication of HCV however much is needed to elucidate the implicated mechanisms. Here we report that HCV infection increases expression and formation of septin 9 filament surrounding HCV core. Data of our study revealed the highest expression of septin 9 in samples from hepatocellular carcinoma (HCC) from patients with chronic HCV infection. Indeed, we brought newperception of septin 9 function regarding both microtubule and lipid structure organization. We proposed that HCV infection conducts to assembly of septin 9 in filaments through PIAS1. This may provide scaffolds to organize the microtubules network and LDs redistribution required for HCV assembly and replication. This study illuminates a new function of septin 9 in HCV life cycle through its association with lipids and microtubules. These events might depend on septin 9 SUMO1 modification by PIAS1. These findings also provide a step forwards in understanding the relationship between HCV and its host and open new therapeutic directions.

Le Virus de l’Hépatite C (HCV) est un problème majeur de santé publique qui touche plus de 170 millions de personnes dans le monde. Le HCV cible essentiellement les hépatocytes où il effectue son cycle de réplication qui peut-être divisé en trois étapes majeures : l’entrée de la particule virale qui aboutit à la libération de l’ARN viral dans le cytoplasme, la traduction/réplication du génome viral et l’assemblage/sécrétion des particules néosynthétisées. Durant ma thèse, nous nous sommes intéressés à l’étape d’entrée qui est un processus complexe multiséquentiel faisant intervenir de nombreux facteurs cellulaires. Le virus se lie d’abord à la surface cellulaire via des facteurs d’attachement puis interagit avec des facteurs d’entrée spécifiques tels que la tétraspanine CD81, le récepteur scavenger B1 et les protéines de jonctions serrées CLDN-1, -6, -9 et OCLN. La particule virale est ensuite internalisée via une endocytose dépendante de la clathrine, puis sous l’action du pH acide des endosomes les enveloppes virale et cellulaire fusionnent permettant la libération de la capside virale dans le cytoplasme de la cellule infectée. Parmi les facteurs cellulaires impliqués dans l’entrée du HCV, deux protéines de la famille des tétraspanines ont été identifiées, CD81 et CD63. Les tétraspanines sont des protéines transmembranaires capables de former des microdomaines enrichis en tétraspanines en interagissant entre elles ainsi qu’avec des protéines dites partenaires. Nous avons testé l’implication dans l’entrée virale des tétraspanines exprimées dans les hépatocytes. Ainsi, nous avons montré que CD151 semble également important pour l’entrée du HCV. CD151 aurait un rôle indirect sur l’entrée en jouant sur l’organisation membranaire, en empêchant CD81 de former des clusters qui restreignent l’entrée du virus. Nous avons aussi étudié le rôle que pouvait jouer les polymorphismes de facteurs d’entrée sur l’entrée virale. Sur une cohorte de patients toxicomanes infectés par le HIV mais non infectés par le HCV, deux mutations ont été identifiées, R209Q dans CLDN-6 et P24A dans OCLN, qui n’étaient pas présentes dans les populations contrôles ou coinfectées par le HCV. Chez les patients toxicomanes, il est très rare que les patients infectés par le HIV ne le soient pas par le HCV, suggérant une résistance naturelle de ces patients à l’infection. Nous avons émis l’hypothèse que ces deux mutations pouvaient bloquer l’entrée du HCV. Cependant, la caractérisation de ces mutations a montré qu’elles n’avaient pas d’effet fonctionnel in vitro. Enfin, nous avons exploré l’effet de la Monensine, un ionophore polyéther, sur l’infection par le HCV. Cette molécule augmente le pH des endosomes via ses capacités de transfert d’ions à travers les membranes cellulaires. Nous avons montré qu’elle inhibe l’entrée du HCV en bloquant la fusion. De manière intéressante, la transmission cellule-cellule, un mécanisme d’entrée du virus encore mal caractérisé, était également bloquée par la Monensine, suggérant une étape de fusion dépendante du pH pour cette voie. Nous avons généré des mutants de résistance à la Monensine, notamment le clone FL-8 qui portait deux mutations dans les glycoprotéines d’enveloppe, Y297H dans E1 et I399T dans E2. Les particules virales portant ces deux mutations infectaient les cellules de manière indépendante du pH, présentaient des propriétés physicochimiques différentes et ne se transmettaient plus de cellule à cellule. En conclusion ces études soulignent l’importance de l’organisation membranaire pour l’entrée du virus via certains facteurs cellulaires tels que CD151. Par ailleurs, nous avons mis en évidence que la transmission cellule-cellule était dépendante du pH et que des mutations ponctuelles dans E1 et E2 permettent une fusion indépendante du pH. En revanche, des polymorphismes naturels de CLDN-6 et OCLN n’affectent pas leur capacité à supporter l’entrée virale. / Hepatitis C Virus (HCV) is a global health problem with over 170 million infected people worldwide. HCV targets mainly the hepatocytes and its lifecycle is divided into three steps. Viral particle entry leads to the release of viral genomic RNA into the cytoplasm where translation and replication take place. Then, new viral particles are assembled and secreted. During my thesis, we focused on the entry step. Indeed, HCV entry is a complex multistep process that requires numerous cellular factors. First, the virus interacts with attachment factors and then interacts with specific cellular factors including the tetraspanin CD81, the scavenger receptor B1 and the tight junction proteins CLDN-1, -6, -9 and OCLN. The viral particle is next internalized through a clathrin-dependent endocytosis. Finally, fusion at low pH occurs between viral and endosomal membranes leading to the release of the capsid into the cytoplasm. Among cellular factors involved in HCV entry, two members of the tetraspanin superfamily were identified, CD81 and CD63. Tetraspanins are transmembrane proteins able to organize themselves in tetraspanin-enriched microdomains through tetraspanin-tetraspanin interactions and interactions with partner proteins. We tested the involvement in HCV entry of tetraspanins expressed in hepatocytes. Interestingly, we showed that CD151 is also involved in HCV entry. CD151 seems to play an indirect role in HCV entry through regulating membrane organization, especially by preventing CD81 clustering, which is unfavourable to HCV entry. We also studied the effect of some entry factors polymorphisms on viral entry. In a cohort of drug users infected by HIV but not by HCV, we identified two mutations, R209Q in CLDN-6 and P24A in OCLN, not found in control or coinfected patients. It is very rare for drug users patients infected by HIV not to be infected by HCV, suggesting a natural resistance of these patients to HCV infection. We hypothesized that the two mutations identified might impair HCV entry. However, the characterization of these mutations showed that they did not have a functional effect in vitro. Finally, we investigated the effect of Monensin, a polyether ionophore, on viral entry. This molecule increases endosomal pH through its ions transfer properties across cell membranes. We showed that Monensin inhibits HCV entry through impairing the fusion step. Interestingly, HCV cell-to-cell transmission, another poorly characterized entry pathway, was also blocked by Monensin, suggesting that a pH-dependent fusion step is also required for this transmission route. We generated resistant mutants to Monensin, notably the FL-8 mutant carrying two mutations in envelope glycoproteins, namely Y297H in E1 and I399T in E2. Viral particles expressing these two mutations infected cells in a pH-independent manner, displayed different biophysical properties and were not cell-to-cell transmitted. To conclude, these studies highlight the importance of membrane organization for viral entry through cell factors like CD151. We also pointed out that cell-to-cell transmission is a pH-dependent process. In addition, point mutations in E1 and E2 are sufficient to enable HCV to be pH-independent for its entry. However, polymorphisms in CLDN-6 and OCLN seem to have no effect on viral entry.

L'hépatite C est un problème de santé publique majeur aggravé par l'efficacité limitée des thérapies actuelles et l'absence de vaccin. Il est donc important d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles et pour cela une meilleure connaissance du cycle infectieux du virus de l'hépatite C (VHC) est indispensable. Comme pour de nombreux autres virus à ARN de polarité positive, l'étape de réplication du VHC est associée à d'importants remaniements membranaires qui conduisent à la formation d'un réseau membranaire désigné membranous web et de structures membranaires plus petites associées au reticulum endoplasmique. Cependant, la formation des complexes de réplication du VHC, en association étroite avec ces membranes cellulaires modifiées reste énigmatique. Au niveau cellulaire, de petites GTPases sont connues pour réguler la dynamique des membranes. Nos travaux montrent que l'infection par le VHC est inhibée, de façon dose-dépendante, par la bréfeldine A (BFA), un inhibiteur spécifique de l'action de GTPases de la famille ARF. L'activation des petites GTPases ARF est médiée par des facteurs d'échange nucléotidiques. En utilisant des ARN interférants ciblant les trois facteurs d'échange nucléotidique sensibles à la BFA nous avons observé que seule la réduction de l'expression de l'un d'entre eux, appelé GBF1, inhibe l'infection par le VHC. Ces résultats ont été confirmés par l'utilisation d'un inhibiteur chimique spécifique. D'autre part, la surexpression d'un mutant de GBF1 résistant à la BFA permet de restaurer l'infection par le VHC en présence de BFA. Par ailleurs, des analyses en immunofluorescence et microscopie électronique réalisées dans un contexte non réplicatif montrent que la BFA n'inhibe pas les réarrangements membranaires associés à la mise en place du membranous web. Collectivement nos résultats suggèrent que GBF1 est impliqué dans l'activité des complexes de réplication du VHC et notre travail établit un lien entre la voie de sécrétion de la cellule hôte et la réplication de l'ARN du VHC.

En France, le virus de l'hépatite E (VHE) est responsable de cas d'hépatites aigües sporadiques dont les origines et les modes de transmission sont incertains. Or, le VHE est le seul virus des hépatites à infecter d'autres espèces animales que l'homme. Les objectifs de cette thèse ont été d'évaluer le risque de transmission zoonotique du VHE porcin pour l'Homme. Une première étude d'épidémiologie moléculaire a montré une circulation active du VHE entre les populations porcines et humaines, préférablement par voie alimentaire. Une deuxième étude par séquençage haut-débit a montré l'adaptation totale du génome consensus et de la quasiespèce du VHE lors de la transmission inter-espèce. Une troisième étude de trois nouveaux génomes complets porcins comparé aux génomes VHE humains déjà disponibles n'a pas révélé de déterminants majeurs de restriction d'hôte au sein du génotype 3. Par contre cette étude a mis en avant le besoin de revoir la classification en sous-types du VHE au vu des nouvelles séquences disponibles. Enfin, un système de génétique inverse a été mis en place afin de permettre l'étude phénotypique de nouvelles souches humaines et porcines du VHE dans des lignées hépatocytaires. Ces travaux ont permis de montrer le risque zoonotique du VHE du porc consommé en France et son adaptation génomique complète à ses deux espèces hôtes. Le VHE est un virus zoonotique à ARN particulier dont la variabilité génétique dépend de son épidémiologie singulière, qui inclue la possibilité de transmissions alimentaires à partir d'un réservoir animal domestique. Ce travail permet enfin de poser les perspectives d'études phénotypiques du VHE

Le virus de l'hépatite C (HCV) est l'agent responsable de l'hépatite C, maladie qui touche environ 3% de lapopulation mondiale. Une des caractéristiques de cette infection est son évolution dans 60 à 90% des casvers des formes chroniques avec des complications sévères telles que la cirrhose et le carcinomehépatocellulaire. Un des handicaps majeurs de la recherche sur le HCV est l'absence de systèmes decultures in vitro efficaces et de modèles animaux adaptés car le HCV n'infecte que l'homme et le chimpanzé.l'anticorps D32.10. Pour cela, nous avons développé un test de cellbindinget nous avons montré quel'interaction des particules virales sériques (HCVsp) radiomarquées à l'Iode 125 avec les celluleshépatocytaires (Huh‐7 et HepaRG) est spécifique et saturable impliquant des sites de haute et faible affinité.De plus, l'anticorps D32.10 est capable d'inhiber spécifiquement et efficacement les interactions de hauteaffinité entre les HCVsp et les cellules HepaRG avec une IC50 ≤ 0,5 μg/ml. Nous avons mis en évidence quel'inhibition est plus efficace lorsque nous utilisons sélectivement une population de particules HCVenveloppées exprimant fortement E1E2. Récemment, nous avons développé un système d'infection originaldes cellules HepaRG qui sont des cellules progénitrices du foie par les HCVsp et avons montré quel'infection, la réplication et la propagation dépendent de l'état de prolifération/différenciation de cescellules. Nous avons aussi démontré que les particules virales produites dans ce système contiennent del'ARN viral, expriment les protéines d'enveloppe E1E2 et sont infectieuses. Des études préliminairesmontrent que l'anticorps D32.10 inhibe fortement l'infection (95% à 80% aux jours 14 et 21 aprèsinfection) vraisemblablement au niveau des étapes précoces du cycle viral.Dans un second temps, nous avons recherché la prévalence des anticorps de même spécificité que le D32.10(anti‐E1E2A,B) dans différents groupes de patients HCV positifs afin de déterminer leur significationbiologique. Par un test ELISA utilisant les peptides biotinylés E1, E2A et E2B dans la phase de capture, nousavons démontré que la réponse anticorps anti‐E1E2A,B était présente dans 90% des cas chez les patientsqui guérissent spontanément avec des titres élevées (≥ 1/1000). Cette réponse humorale est absente ourare (< 10%) chez les patients porteurs chroniques non traités ou non répondeurs aux traitementsantiviraux. Une étude longitudinale a été réalisée chez des patients non répondeurs ou répondeursdéveloppant une réponse virologique soutenue à une bithérapie standard, interféron pégylé plus ribavirine.L'analyse statistique des résultats a montré que les anticorps anti‐E1E2A,B pouvaient être prédictifs de laréponse au traitement avec une spécificité et une valeur prédictive positive de 100%.La convergence des résultats in vitro et in vivo supporte un rôle neutralisant de l'anticorps monoclonalD32.10, permettant d'envisager son utilisation en immunothérapie.