IDE (Insulin-Degrading Enzyme) est une métalloenzyme impliquée dans la dégradation de plusieurs peptides physiologiques. Des études lient la maladie d’Alzheimer et le diabète de type II à IDE. En effet, parmi ses substrats, l’enzyme compte le peptide Béta-amyloïde (A-Béta) responsable des plaques séniles de la maladie d'Alzheimer et l’insuline régulant la glycémie. En 2006, l’équipe du Pr. Tang a élucidé la structure cristallographique d'IDE qui a révélée que les substrats se lient à deux sites de l'enzyme : le site catalytique et un exosite. Grâce au criblage d'une chimiothèque, un composé a été découvert modulant de façon substrat-dépendante l'activité d'IDE. Ce composé a été cristallisé dans l’enzyme: il peut se lier aux deux sites importants pour l’hydrolyse des substrats: le site catalytique et l'exosite. Ce mode de liaison est cohérent avec la modulation substrat-dépendante observée. 80 analogues ont été synthétisés pour améliorer l’activité et la perméation cellulaire. La modulation substrat-dépendante de la protéase permet d’envisager l’obtention d’outils chimiques pour l’étude de la fonction de cette enzyme et ouvre de nouvelles perspectives dans des pathologies où des substrats d’IDE seraient impliqués. En parallèle, une réaction de Click Chemistry in situ a été effectuée et a permis l'identification de 32 ligands parmi 180 composés potentiels. 12 ont été resynthétisés et ont montré une activité inhibitrice de l'enzyme. Ces composés possèdent une fonction hydroxamate et se lient donc au site catalytique inhibant l'enzyme quelque soit son substrat. La co-cristallisation d'un des composés avec l'enzyme a confirmé ce mode de liaison. / Insulin-Degrading Enzyme (IDE) is a zinc metalloprotease implicated in the clearance of numerous physiological peptides, in particular beta-amyloid (A[Béta]) peptide and insulin, respectively implicated in Alzheimer’s disease and Diabetes.Tang et al. elucidated the X-ray structure of the human IDE and found that substrates have two anchoring sites : the catalytic site at the zinc and an exosite which are both key features for the binding and hydrolysis.In our laboratory, we have screened a 2080-compound library on the enzyme and found a 5 µM hit inhibitor of A[Béta] hydrolysis. X-ray analysis of ligand-enzyme complexes, revealed that unexpectedly these compounds are either ligands of the catalytically site or the exosite of IDE.Consistently with their peculiar binding mode, these compounds behave as inhibitors or activators of the enzyme in a substrate-dependent manner.We made several chemical modulations on the hit structure and synthesized about 80 analogues to increase both potency and cell permeation.The mode of action of our compounds opens new avenues for the study of the function of IDE and for the design of therapeutic interventions.In the mean time, an in situ Click Chemistry experiment led to the identification of 32 ligands over 180 potential compounds. 12 compounds were resynthesised and showed inhibitory activities on the enzyme for all substrats. Co-crystallisation confirmed the binding to the catalytical site thanks to a hydroxamate function.

Le tissu adipeux (TA) joue un rôle majeur dans les maladies métaboliques induites par l’obésité. L’activation de l’anti-oncogène p53 dans l’adipocyte a été impliquée dans le développement de la résistance à l’insuline lors de l’obésité. Cependant, les causes et les conséquences de cette activation étaient encore inconnues. Nos travaux montrent que, chez des souris obèses, le niveau d'oxydation de l'ADN est plus élevé et la longueur des télomères réduite dans le TA épididymaire. Nous observons également une augmentation des dommages à l’ADN dans les adipocytes. Ces dommages à l’ADN provoquent l’activation de la voie de réponse aux dommages à l’ADN puisque nous avons observé une activation de la voie p53 (stabilisation de la protéine et expression d’une cible p21). De manière intéressante, nous avons démontré que les dommages à l’ADN et l’activation de la voie p53 dans les adipocytes sont des événements précoces lors du développement de l’obésité qui pourraient être la conséquence d’une augmentation également précoce du stress oxydatif dans le tissu adipeux et les adipocytes. De plus, l’augmentation des dommages à l’ADN et l’activation de p53 dans les adipocytes précèdent l’inflammation du tissu adipeux et la résistance à l’insuline systémique. Nous apportons également des arguments en faveur d’un rôle causal des dommages à l’ADN et de l’activation de p53 dans l’adipocyte dans le développement de l’inflammation du tissu adipeux et la résistance à l’insuline adipocytaire. In vitro, nous montrons que la création expérimentale de dommages à l’ADN avec de la doxorubicine et l’activation pharmacologique de p53 avec l’inhibiteur de l’ubiquitine ligase Mdm2, la nutline3a, dans des adipocytes humains et murins en culture inhibent la signalisation insulinique, le transport de glucose et la translocation de Glut4 stimulés par l’insuline. Ils perturbent également l’activité sécrétoire des adipocytes. En particulier, le sécrétome de ces adipocytes possède une activité chimioattractive pour les neutrophiles et les macrophages. Des résultats préliminaires indiquent qu’il pourrait également affecter les préadipocytes en perturbant leur survie et leur différenciation en 8 adipocytes. In vivo, l’injection de doxorubicine à des souris provoque l’infiltration de neutrophiles et de macrophages dans le TA, l’inflammation du TA, et la résistance à l’insuline adipocytaire. Nous montrons également une induction précoce du locus CDKN2A dans le TA lors de l’obésité. Ce locus code pour p16INK4A, un inhibiteur des kinases dépendantes des cyclines CDK4/6, et p19ARF, un inhibiteur de Mdm2. Nous confirmons que la surexpression de p19ARF dans des adipocytes en culture permet la stabilisation de p53 et étudions actuellement l’impact de l’absence de p19ARF dans les adipocytes in vivo dans le développement des maladies métaboliques lors de l’obésité. En résumé, nos travaux démontrent que les dommages à l’ADN observés précocement dans les adipocytes lors du développement de l’obésité ont le potentiel de déclencher des signaux dépendants de p53 impliqués dans l'altération du métabolisme adipocytaire et de sa fonction sécrétoire conduisant à une inflammation du TA, un dysfonctionnement des adipocytes, et la résistance à l'insuline. / Non disponible

Les inositols phosphoglycans (IPGs) sont des médiateurs de l'action de l'insuline. Le DCI-IPG contenant du D-chiro-inositol (DCI) potentialise l'action de l'insuline en diminuant la glycémie. Il a déjà été observé qu'il y aurait une diminution de l'utilisation ou de la disponibilité tissulaire du DCI chez les femmes SOPK qui sont caractérisées par une résistance à l'insuline (RI). Notre hypothèse est qu'une augmentation de la clairance urinaire de 24h du DCI, (uCl[indice inférieur DCI]) ou de son précurseur le myo-inositol (MYO), pourrait résulter en une disponibilité moindre du DCI pour les tissus et une libération réduite du DCI-IPG par l'insuline, et ainsi contribuer à la RI globale chez l'humain, relié ou non au SOPK. Nous proposons que ce défaut serait corrigé par un agoniste des PPAR[gamma]. Nous avons déjà démontré et publié que les frères de femmes SOPK sont de bons modèles de RI et qu'ils présentent aussi une altération dans le métabolisme des inositols. Un groupe de 11 frères et 21 hommes contrôles ont été étudiés et les résultats ont fait l'objet d'un article original que j'ai écrit et inclus dans ce mémoire. Dans cette étude, nous avons déterminé que la uCl[indice inférieur DCI] était diminuée de moitié et qu'au contraire les concentrations plasmatiques à jeun du DCI étaient plus que 3 fois augmentées pour le groupe des frères par rapport au groupe témoin. Par ailleurs, 16 hommes et 9 femmes témoins ainsi que 2 femmes SOPK ont été recrutés dans le cadre d'un autre projet pilote au cours duquel une hyperglycémie provoquée orale (HGPO) et un clamp euglycémique-hyperinsulinémique ont été effectués. Le rythme d'apparition des acides gras libres (Ra[indice inférieur AGL]), la production endogène du glucose, les métabolismes oxydatif et non-oxydatif des hydrates de carbone (HC), la uCl[indice inférieur DCI], les concentrations plasmatiques du DCI et du MYO ainsi que la bioactivité du DCI-IPG ont été déterminés.Les résultats obtenus au cours de cette étude pilote ont été analysés avec les résultats obtenus pour les frères de femmes SOPK et inclus dans la section 2 de ce mémoire. Nous avons mesuré une sensibilité à l'insuline plus basse ainsi que des valeurs d'aire sous la courbe (AUC) pour le glucose et l'insuline plus élevées pour les frères que pour les groupes témoins. En regard des inositols plasmatiques, les niveaux de DCI des femmes sont plus bas que ceux des hommes peu importe le groupe et une uCl[indice inférieur DCI] plus élevée a été observée chez les 2 groupes témoins par rapport au groupe des frères. Nos résultats démontrent donc que les frères sont de bons modèles de RI. Nos hypothèses de départ n'ont pu être vérifiées étant donné le peu de patients insulinorésistants inclus dans l'étude pilote. Cependant, pour les hommes, nous avons observé une corrélation positive entre la uCI[indice inférieur DCI] et les niveaux d'insuline. Ce projet est toujours en cours dans le but de recruter des sujets possédant un plus large éventail de RI afin de vérifier nos hypothèses.

L'hormone angiotensine II (Ang II) possède deux principaux récepteurs, le récepteur AT1 (R-AT1) et le récepteur AT2 (R-AT2). Le R-AT1 est reconnu pour assurer la majorité des effets de l'Ang II, alors que les rôles et les mécanismes d'action du R-AT2 font l'objet de nombreux débats. Ces controverses peuvent être expliquées, d'une part par les nombreux modèles cellulaires ou animaux utilisés, de par son faible niveau d'expression et d'autre part par l'absence de ligand sélectif non-peptidique ciblant celui-ci. Dans le laboratoire, nous avons caractérisé un nouvel agoniste hautement sélectif pour le R-AT2 et non peptidique appelé le composé 21 (C21) ou M24. Grâce à ce composé, nous avons pu étudier une partie des rôles associés au R-AT2 dans la fonction adipocytaire. Tout d'abord, nous avons utilisé un modèle de cultures primaires de préadipocytes de rats pour étudier la différenciation des préadipocytes provenant de différents dépôts de tissus adipeux. Dans un deuxième temps, nous avons utilisé un modèle animal de résistance à l'insuline qui a été induit par une diète riche en gras et en fructose (HFHF). Les objectifs de mon projet étaient de déterminer 1) le rôle du R-AT2 sur l'adipogenèse et 2) l'effet de l'activation du R-AT2 dans un modèle de rats résistants à l'insuline. Nos résultats montrent que l'expression protéique du R-AT2 est plus importante en début de différenciation. Par ailleurs, l'activation du R-AT2, par le M24 (1 nM), augmente l'expression de PPAR[gamma]. De plus, l'activation du R-AT2 augmente l'accumulation de lipides dans les adipocytes sous-cutanés, mais pas dans les adipocytes rétropéritonéaux, tandis que le R-AT1 diminue l'accumulation de lipides dans les deux types cellulaires. Les résultats obtenus avec un shARN contre le R-AT2, dans ces mêmes cultures, indiquent que l'absence du R-AT2 empêche la différenciation des préadipocytes en adipocytes matures. D'autre part, chez les rats soumis à la diète HFHF, nos résultats montrent que le M24, ainsi que le losartan, préviennent la résistance à l'insuline. Par ailleurs, nous avons observé d'importants changements morphologiques dans les tissus adipeux après traitements au M24. En effet, le M24 diminue le nombre de gros adipocytes dans le tissu adipeux sous-cutané. Sachant que les nouveaux petits adipocytes sous-cutanés corrèlent avec une meilleure sensibilité à l'insuline, nos études suggèrent que le M24 améliore la sensibilité à l'insuline de nos animaux, principalement, en régulant la physiologie du tissu adipeux. Ensemble, mes résultats montrent que le R-AT2 joue un rôle important dans la physiologie des adipocytes et par conséquent du tissu adipeux. De plus, l'agoniste M24 ouvre la porte à de nouvelles études sur le R-AT2 pour étudier son potentiel thérapeutique dans les pathologies métaboliques telles que la résistance à l'insuline, le diabète de type 2 et l'obésité.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

La grossesse est caractérisée par une augmentation progressive de la résistance à l'insuline et par une sécrétion compensatoire d'insuline par les cellules f3 du pancréas pour maintenir l'état euglycémique. Le diabète gestationnel (DG), quant à lui, constitue un déséquilibre entre la résistance à l'insuline et la capacité de sécrétion d'insuline par les cellules 13, ce qui entraîne une hyperglycémie maternelle. Plusieurs mécanismes de l'augmentation de la résistance à l'insuline en grossesse ont été proposés à ce jour, et parmi ceux-ci on retrouve la diminution de l'adiponectine, une adipokine dont les rôles suspectés incluent le maintien de la sensibilité à l'insuline ainsi que des propriétés anti-inflammatoires. Dans bon nombre d'études, un niveau bas d'adiponectine a été fortement associé à une résistance à l'insuline élevée et à un risque augmenté de développer un diabète de type 2. Puisque la physiopathologie du diabète gestationnel est similaire à celle observée chez les diabétiques de type 2, l'adiponectine pourrait également être impliquée dans la physiopathologie du DG. Cependant, les études portant sur l'association entre l'adiponectine et le DG sont peu nombreuses et contradictoires. Ainsi, les objectifs de mon étude dans le cadre de ma maîtrise sont de déterminer s'il existe une association entre : 1) les concentrations plasmatiques d'adiponectine au 1er trimestre et le risque de développer un DG au 2e trimestre de la grossesse, et 2) les concentrations plasmatiques d'adiponectine des 1er et 2e trimestres et les indices de résistance/sensibilité à l'insuline, de fonction et de compensation des cellules p du 2e trimestre de la grossesse. Les résultats de notre étude ont confirmé que les niveaux d'adiponectine étaient plus bas chez les femmes avec DG (n = 38) que chez les normoglycémiques (NG; n = 407) aux 1er et 2e trimestres de la grossesse. Également, nos résultats ont démontré que des niveaux bas d'adiponectine au 1er trimestre étaient associés à un risque augmenté de développer un DG au cours du 2e trimestre et ce, indépendamment de l'âge, de l'adiposité et de la régulation glycémique du 1er trimestre. De plus, nos résultats ont montré que les niveaux d'adiponectine des 1er et 2e trimestres étaient inversement associés au niveau de résistance à l'insuline au 2e trimestre, indépendamment de l'âge, de l'adiposité et de la sécrétion d'insuline. Les niveaux d'adiponectine des 1er et 2e trimestres n'étaient pas associés à la sécrétion d'insuline ou à la fonction des cellules 13 du trimestre, mais ils étaient associés à la compensation des cellules 13 face à la résistance à l'insuline au 2e trimestre et ce, indépendamment de l'âge et de l'adiposité. Enfin, contrairement aux écrits scientifiques publiés à ce jour sur ce sujet, nos résultats ont montré que le changement des niveaux d'adiponectine entre les 1er et 2e trimestres n'était pas significatif, autant chez les femmes NG, que celles présentant un DG. Ainsi, les résultats de notre étude suggèrent que : 1) une concentration abaissée d'adiponectine dès le 1er trimestre serait un marqueur précoce et fiable de l'augmentation du risque de développer un DG; 2) des concentrations abaissées d'adiponectine aux 1er et 2e trimestres reflètent le niveau de résistance à l'insuline prédisposant les femmes à développer un DG; et 3) l'augmentation de la résistance à l'insuline caractéristique en grossesse ne serait pas causée par un changement des concentrations d'adiponectine, étant donné le changement négligeable des concentrations d'adiponectine entre le Ier et le 2e trimestres. [symboles non conformes]