Doctor en Farmacología / Kisspeptina es un péptido de 145 aa. el cual juega un rol clave en la secreción de GnRH, participando en conjunto con las catecolaminas en la regulación de la ovulación a nivel hipotalámico. La mayoría de las neuronas kisspeptinérgicas en el núcleo paraventricular del hipotálamo coexpresan mRNA para tirosina hidroxilasa (TH), lo que sugiere una estrecha relación catecolaminérgica-kisspeptinérgica. El hecho que kisspeptina se exprese en el bulbo raquídeo y en las astas dorsales de la medula espinal, sugiere la existencia de un mecanismo de comunicación hacia y desde los órganos periféricos en el cual participe la kisspeptina. A nivel periférico, se ha descrito que kisspeptina y su receptor es sintetizado en células del ovario (siendo las células de la teca una de las que la expresa) y que aumenta su expresión antes de la ovulación, sin establecer aún la función de kisspeptina intraovárica. Estos antecedentes, siguieren que podría existir un control kisspeptinérgico neuronal que llega al ovario a través del sistema simpático (kisspeptina extraovárica) y por otra parte la kisspeptina intraovárica podría estar bajo control simpático, la cual podría ser importante en la regulación de la función ovárica. Con estos antecedentes, se postuló la hipótesis que: “Kisspeptina se expresa en el eje ganglio celíaco-ovario y es activado por el sistema simpático. En el ovario kisspeptina activa la esteroidogénesis y regula la función ovárica tanto en la pubertad como durante la etapa adulta”. Para responder esta hipótesis: se caracterizó la expresión de kisspeptina y su receptor en ganglio celíaco y ovario. Se estudiaron los cambios durante el desarrollo puberal, sobre la apertura vaginal, la ciclicidad estral y la secreción hormonal. Se determinaron los efectos de la estimulación adrenérgica sobre la expresión de kisspeptina en el ovario in vitro y por el estrés por frío crónico de 4 y 8 semanas de duración in vivo. Los resultados obtenidos en esta tesis muestran que: 1.- Kisspeptina se sintetiza en ganglio celíaco y en el ovario, el cual fue determinado por PCR en tiempo real y EIA. Además, se colocaliza con neuronas TH positivas como muestran las inmunohistofluorescencia. Más importante aún es que kisspeptina aumenta en el eje ganglio celiaco-ovario al inicio de la pubertad, participando en la regulación del desarrollo folicular y la ciclicidad estral en ratas adultas. Esto fue confirmado al bloquear la acción de kisspeptina (antagonista p234), en el cual se retrasó la apertura vaginal, sugiriendo que kisspeptina podría jugar un rol protector de la ovulación. 2.- Kisspeptina se expresa tanto en células de la granulosa y de la teca en ovarios de rata. La inmunodetección mostró reactividad positiva desde folículos primarios hasta preovulatorios. 3.- Kisspeptina es regulado por el sistema simpático ya que la activación in vitro de receptores β-adrenérgica aumenta la expresión de la kisspeptina ovárica. Es así como una sobre activación del sistema simpático (eje hipotálamo-ganglio-ovario) mediante un estrés agudo (64 horas a 4°C) o crónico (3 hrs/día a 4°C durante 5 días a la semana por 4 and 8 semanas) altera el sistema kisspeptinérgico periférico (eje GC-O). 4.- Con respecto a la función ovárica, la administración in-vivo de kisspeptina (bomba miniosmótica Alzet) mostró que posee un efecto esteroidogénico, aumentando la concentración plasmática de testosterona y progesterona. Además, favorece la mantención de los cuerpos lúteos, posiblemente inhibiendo la luteólisis. Esto determinado al administrar directamente en el ovario kisspeptina a través de un minibomba osmótica. Por otro lado el bloqueo de la acción de kisspeptina por el antagonista p234 no mostró efectos significativos en la función reproductiva. En conclusión, los resultados presentados en esta tesis han mostrado que kisspeptina es sintetizada en ganglio celíaco (kisspeptina extraovárica), siendo parte de una vía neuronal (eje H-GC-O) que podría contribuir en la regulación de la función ovárica. Por otra parte, la kisspeptina intraovárica presente en todos los folículos en desarrollo estaría participando en el proceso ovulatorio. Los resultados siguieren que participa en el proceso de ovulación, teniendo una función esteroidogénica y protectora de este proceso. / Kisspeptin, is a peptide of 145 aa that has been described as key components in the GnRH secretion playing a complementary role with catecholamines. Studies have shown that most of the kisspeptin neurons in the paraventricular nucleus coexpress the mRNA for tyrosine hydroxylase (TH), suggesting a close kisspeptin-catecholamine relationship. Moreover, kisspeptin is present in other regions in the central nervous system, as the medulla oblongata and the dorsal horn in the bone marrow, suggesting that kisspeptin could be involved in both afferent and efferent pathway. At peripheral level, it has been described that kisspeptin and its receptor GPR54 is expressed in the ovary (especially at the theca cells of the ovarian follicle), and its expression increase before the ovulation without known function in the ovulatory process. Available data suggest that it could exist a neuronal kisspeptinergic network that arrive to the ovary through the sympathetic nervous system (extraovarian kisspeptin) and on the other hand, an intraovarian kisspeptin system without known if they could be controlled by the sympathetic nervous system, and if this control could be important for the ovarian function. Thus, we postulated that: “Kisspeptin is expressed in the celiac ganglion-ovary axis and it is activated by the sympathetic system. In the ovary, kisspeptin activate the steroidogenesis and regulates the ovary function, both during the pubertal and the adult age”. To answer this hypothesis the kisspeptin and GPR54 expression was characterized in the celiac ganglion and the ovary. The changes through the pubertal development, vaginal opening and hormonal secretion, were studied, and the adrenergic stimulation effects over the kisspeptin expression in the ovary in-vitro and the 4 and 8 week of chronic cold stress in-vivo was determined. The results presented in this thesis were the following: 1.- RT-PCR and EIA determinations showed that kisspeptin is synthetized in the celiac ganglion and the ovary. Furthermore, dual labeled immunofluorescence showed that kisspeptin is probably co-expressed within TH neurons. More important the kisspeptin along the celiac ganglion-ovary axis, increased with the puberty start, and thus, it could participate in the regulation of the follicular development and estrous ciclycity in adults rats. This suggestion was confirmed by blocking the in vivo kisspeptin action with the kisspeptin antagonist, p234, resulting in a delay in the vaginal opening, suggesting that kisspeptin could play a protector role in the ovulation process. 2.- Kisspeptin is expressed in both granulosa and theca cells. The immunodetection shows that kisspeptin is present through primary to preovulatory follicles. 3.- Kisspeptin is regulated by the sympathetic system because the in-vitro incubation of the ovaries with isoproterenol, a β-adrenergic agonist, increased the kisspeptin expression and the presence of the B-blocker propranolol eliminated the action of isoproterenol. Therefore, if this neuronal pathway is activated in the presence of a sympathetic stressor like acute (64 hour at 4°C) or chronic stress (3 hrs/day at 4°C during 5 days a week for 4 and 8 weeks) alter the peripheral kisspeptinergic system. 4.- Respect to ovarian function, in-vivo model (Alzet miniosmotic pumps to deliver Kisspeptin), show the capacity of kisspeptin to stimulate the steroidogenesis, increasing the testosterone and progesterone plasma concentration. The increased levels of plasma progesterone could favor the corpus luteum maintenance, possibly due to the decrease in the luteolysis process. Moreover, the kisspeptin antagonist administration (p234) don´t show significant effects in the reproductive function. In conclusion, in this thesis, the results have shown the existence of an extraovarian (neuronal) pathway (H-GC-O axis) that could contribute to the ovarian function regulation, and a intraovarian kisspeptin system (present in all follicles in development), that could participates in the ovulatory process, stimulating the steroidogenesis and hence regulating the ovulation. / Fondecyt

El objetivo del presente estudio fue evaluar la susceptibilidad del cuerpo lúteo al cloprostenol sódico (análogo sintético de la PGF2α) durante el desarrollo de la fase luteal en alpacas inducidas a ovulación con plasma seminal. El plasma seminal se obtuvo de muestras de semen de alpaca colectadas mediante vagina artificial y diluidas en proporción 1:1 en buffer fosfato salino (PBS), luego fueron centrifugadas y conservadas a -20°C hasta su posterior uso. 96 alpacas hembras con un folículo ≥7mm fueron inducidas a ovulación mediante la inyección de plasma seminal (n=48) y GnRH (n=48). Luego fueron seleccionadas aleatoriamente en 6 grupos distintos: un grupo control y animales tratados con PGF2α los dias 4, 5, 6, 7 y 8 post inducción de ovulación. Se colectaron muestras sanguíneas para determinar los perfiles de progesterona sérica al inicio del tratamiento y 24 horas post-tratamiento con cloprostenol sódico. Los resultados muestran que no hubo efecto de la PGF2α en animales tratados el día 4 y 5 (p>0.05). Los animales tratados al día 7 y 8 se vieron que responden con una luteólisis efectiva a las 24 horas post-PGF2α, ya que sus niveles de progesterona fueron <1ng/ml. En el día 6 se confirma que hay una luteólisis a las 48 horas post-PGF2α (p<0.05), por la disminución en el tamaño del diámetro del cuerpo lúteo. Por lo tanto se concluye que el cuerpo lúteo en alpacas inducidas a ovulación con plasmas seminal es susceptible a la luteólisis a partir del dia 6 post-estímulo de ovulación.

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No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Dissertacao Marcio Sergio Vargas.pdf: 889666 bytes, checksum: 09fb7c3fc4a682e771f2cff4f5cd1d02 (MD5) / Objetivou-se neste trabalho comparar a eficiência da indução da luteólise em diferentes momentos após a coleta de embriões, e avaliar a regressão morfológica e funcional em animais superovulados e não superovulados. No primeiro estudo, foi avaliado o momento de aplicação do luteolítico (dia da coleta dos embriões – D7 ou três dias após – D10). Vacas da raça Holandesa (N=40) foram superovuladas pela aplicação de 400 UI de FSH (Pluset®) em doses decrescentes e, após a coleta dos embriões, distribuídas aleatoriamente em dois grupos, que receberam uma aplicação IM de 0,5mg de análogo de PGF2α (Ciosin®) no D7 ou no D10, respectivamente. A luteólise foi monitorada pela concentração plasmática de progesterona analisada por radioimunoensaio em fase sólida, e os valores obtidos comparados por análise de variância. Nas vacas tratadas no D10, ocorreu redução da concentração de progesterona (P<0,05). No grupo tratado no D7, uma parcela dos animais não apresentou redução na concentração plasmática de progesterona a valores abaixo de 1ng/mL (P<0,05). No experimento 2 foi avaliada a luteólise morfológica e funcional em doadoras superovuladas. Vacas da raça Holandesa (N=03) e da raça Brahman (N=03) (Grupo Tratadas – GT) foram superovuladas pela aplicação de 400 UI de FSH (Pluset®) em doses decrescentes e, três dias após a coleta dos embriões (D10), receberam uma aplicação de 0,5mg de cloprostenol sódico (Ciosin®). Vacas mestiças (Grupo Controle – GC) (N=8) foram sincronizadas e receberam a aplicação de luteolítico no momento do ciclo semelhante (D10). A luteólise foi monitorada pela concentração plasmática de progesterona e LH e pelo acompanhamento ultrassonográfico da regressão luteal com aparelho de ultrassonografia (Áquila Vet®) equipado com probe de 8,0 MHz. Os valores de concentração de P4, LH, tamanho médio dos corpos lúteos e área luteal total foram avaliados por análise de variância e diferenças entre médias comparadas pelo teste de Tukey (P<0,05). A concentração de progesterona em ambos os grupos regrediu a valores abaixo de 1ng/mL (P<0,05). A concentração de LH apresentou elevação de seus valores séricos em ambos os grupos. O tamanho médio luteal e a área luteal total apresentaram redução em ambos os grupos. Conclui-se que: a indução da luteólise é mais eficiente com a aplicação de luteolítico no D10; o padrão de regressão morfológica e funcional na luteólise induzida em animais superovulados é semelhante a animais não superovulados; o maior volume de tecido luteal e as conseqüentes elevadas concentrações de progesterona podem retardar o restabelecimento do padrão de liberação de LH e manifestações de estro. / The objectives of this study were to compare the efficiency of luteolysis induction at different times after embryo flushing and to evaluate corpora lutea morphological and functional regression in superovulated and non-superovulated animals. In the first study, we evaluated the moment of luteolysis induction (day embryo flushing – D7 or three days later – 10). Holstein cows (N = 40) were superovulated with 400 IU of FSH (Pluset®) in decreasing doses, and after embryo flushing were randomly allocated into two groups which received 0.5 mg IM cloprostenol of PGF2α analogous (Ciosin®) on D7 or D10, respectively. The luteolysis was monitored by plasmatic progesterone, measured by solid phase radioimmunoassay, and the values were compared by analysis of variance. In cows treated at D10 was reduction in the concentration of Progesterone (P<0.05). In the group treated at D7, a portion of the animals shored no reduction in plasma concentration of progesterone to values below 1 ng/mL (P<0.05). In experiment 2 we assessed the morphological and functional luteolysis in superovulated donors. Holstein cows (n = 03) and Brahman (n = 03) (Treated Group - GT) were superovulated by application of 400 IU of FSH (Pluset®) in decreasing doses, and three days after collection of embryos (D10) received an application of 0.5 mg cloprostenol IM (Ciosin®). Crossbred cows (control group - CG) (N = 8) were synchronized and received the luteolytic agent at the same moment of the cycle (D10). The luteolysis was monitored in samples of plasma progesterone and LH, and ultrasound for monitoring of luteal regression with ultra-sonography equipment (Aquila Vet®) using a 8.0 MHz probe. The values obtained from progesterone and LH concentration, average size of CLs and total luteal area were evaluated by analysis of variance and differences between means compared by Tukey test (P<0.05). The concentration of progesterone in both groups decreased to values below 1ng/mL (P<0.05). LH concentrations showed elevated values in plasmatic concentration in both groups. The medium luteal size and luteal total area were reduced indicating morphological luteolysis. We conclude that: the induction of luteolysis is most effective when luteolytic application is performed on D10; the pattern of morphological and functional regression in induced luteolysis in superovulated animals is similar to animals non-superovulated; the higher volume of luteal tissue and the resulting high concentrations of P4 may delay the resumption of the pattern of LH release and expression of estrus.

El presente trabajo tuvo por objetivo evaluar el efecto de la aplicación por vía intramuscular (IM) de plasma seminal sobre la supervivencia embrionaria en alpacas luego que fueron servidas por monta natural. El estudio fue realizado durante los meses de enero a marzo del 2013, en el departamento de Puno. El plasma seminal se obtuvo de muestras de semen de alpaca, colectadas y diluidas en proporción 1:1 en buffer fosfato salino (PBS), para luego ser centrifugadas y conservadas en congelación hasta su posterior uso. Alpacas hembras vacías (n = 117), fueron seleccionadas de acuerdo a la presencia de un folículo dominante ≥ de 7 mm detectado por ecografía tras rectal; las cuales fueron servidas por monta natural y distribuidas aleatoriamente en 3 grupos de comparación: T1(n=40) a las cuales se les administró 1 ml de plasma seminal diluido en PBS, vía IM; T2(n=39) a las que cuales se les administró 1 ml de un análogo de GnRH (0.0042 mg de acetato de buserelina), vía IM y T3(n=38) sin administración de producto alguno. Posteriormente se evaluaron mediante ecografía tras rectal el día 25 post monta para determinar la gestación y el día 62 para determinar la tasa de supervivencia embrionaria. Todos los animales en estudio fueron alimentados con pastos naturales y recibieron las mismas condiciones de manejo. Los resultados obtenidos muestran una tasa de concepción al día 25 post monta del 67.5%, 51.3% y 55.3% y una tasa de supervivencia embrionaria al día 62 del 92.6%, 80% y 85.7% para los grupos T1, T2 y T3 respectivamente. Los resultados obtenidos sugieren que la aplicación intramuscular de plasma seminal inmediatamente después de la monta determina un incremento porcentual de la supervivencia embrionaria en comparación a la aplicación de GnRH o la monta natural, sin embargo dicha diferencia no es estadísticamente significativa (P˂0.05).

El presente trabajo se realizó con el propósito de evaluar el efecto de la transferencia embrionaria ipsilateral y contralateral a la posición del cuerpo lúteo sobre la tasa de preñez en llamas. Se utilizaron 43 llamas hembras receptoras de 4 a 6 años, distribuidas aleatoriamente en 4 grupos de estudio: G1 (n=10): Cuerpo lúteo en ovario derecho y transferencia ipsilateral, G2 (n=10): Cuerpo lúteo en ovario derecho y transferencia contralateral, G3 (n=15): Cuerpo lúteo en ovario izquierdo y transferencia ipsilateral y G4 (n=8): Cuerpo lúteo en ovario izquierdo y transferencia contralateral. Se utilizaron 10 llamas hembras como donadoras de embriones, las cuales fueron sincronizadas con LH (1ml), superovuladas con 1000 UI de eCG y se provocó luteólisis con prostaglandina (1ml), siendo empadradas posteriormente. El día del empadre las llamas receptoras recibieron tratamiento con LH, con el propósito de sincronizarlas con las donadoras. Siete días post empadre se realizó el lavado uterino para la recolección, evaluación y transferencia de los embriones. La transferencia embrionaria a los grupos experimentales se realizó con embriones frescos el mismo día. Los resultados obtenidos señalan una tasa de preñez de 60% (G1) y 75% (G3) en las hembras con transferencia embrionaria ipsilateral derecha e izquierda respectivamente, mientras que en la transferencia contralateral derecha e izquierda fueron 30% (G2) y 25%(G4) respectivamente. Sin embargo, no se registraron diferencias significativas (p>0.05) entre el grupo G1 con los grupos G2, G3 y G4, además G2 no muestra diferencias significativas (p>0.05) con G4. Mientras que se encontró diferencia (p menor 0.05) entre el grupo G3 con los grupos G2 y G4. Estos resultados indicarían una mayor tasa de sobrevivencia embrionaria en llamas al realizar la transferencia en el cuerno ipsilateral a la posición del cuerpo lúteo ubicado en el ovario izquierdo. / The study was carried out with the objective of to evaluate the embryo survival after the embryo transfer to the uterine horn ipsilateral and contralateral to the corpus luteum (CL) in llamas. Fourtythree llamas recipient females, from 4 to 6 years old were randomly assigned in 4 groups: G1 (n=10): CL in right ovary and ipsilateral embryo transfer, G2 (n=10): CL in right ovary and contralateral transfer, G3 (n=15): CL in left ovary and ipsilateral transfer, and G4 (n=8): CL in left ovary and contralateral transfer. Ten llamas were used as embryo donors, they were synchronized with LH (1ml), then superovulated with 1000 UI eCG and induced to luteolysis with PGF2α; after that, all of them were mated. The same day of mating, the recipients were treated with LH, with the purpose of synchronization with donors. Seven days postmating, the uterine horns were flushed to recover, evaluate and transfer the embryos. The nonsurgical embryo transfer was used the same day with fresh embryos. The results of pregnancy rate were 60% (G1) and 75% (G3) in recipient females with ipsilateral embryo transfer right and left respectively. On the other hand, contralateral embryo transfer right and left were 30% (G2) and 25% (G4) respectively. However, the differences did not reach significance (p>0.05) between G1 with G2, G3 and G4. Furthermore, G2 not differ (p>0.05) from G4. Whereas, there is difference (p less 0.05) between G3 with G2 and G4. These results indicate that pregnancy rate is major in llamas when the embryo transfer was to the uterine horn ipsilateral to the CL in the left ovary.

El presente estudio se realizó para evaluar el efecto de cuatro suplementos de macromoléculas sobre la tasa de maduración nuclear, así como también determinar la tasa división de ovocitos y desarrollo embrionario posterior a la fecundación a las 48 horas y 168 horas (7 días), respectivamente. Los ovarios fueron obtenidos de animales sacrificados, transportándose al laboratorio en un termo conteniendo solución salina al 0.09%, suplementada con antibiótico-antimicótico a 37 °C. Los CCO´s se obtuvieron de la aspiración de folículos de entre 2-6mm; luego de ser observados en un estéreomicroscopio, 692 ovocitos con dos o más capas de células fueron calificados como aptos para ser madurados en medio TCM-99 enriquecido con suplemento de macromolécula: PVP o PVA o BSA o SFB según sea el tratamiento; cultivados a 39°C bajo una atmósfera de 5% de CO2. Cumplido el tiempo de maduración (24 horas), los ovocitos fueron removidos del medio y lavados con PBS suplementado con SFB y 1 mg/ml de hialuronidasa, para ser fijados en una solución de etanol: ácido acético (3:1). Para la evaluación de la maduración nuclear, se colocaron los ovocitos en una lámina portaobjeto y teñidos con 1% de orceína; las mismas fueron observadas bajo un microscopio para ser evaluadas y clasificadas como Vesícula Germinal (VG), Metafase I (MI), Anafase-Telofase, Metafase II (MII) y degenerados. Para la fecundación se usaron 1680 ovocitos, madurados bajo las mismas condiciones y fecundados con espermatozoides obtenidos de pajillas. Para la obtención de los espermatozoides motiles se centrifugo a 300 gravedades durante 10 minutos bajo una gradiente de Percoll (45/90); el sobrenadante fue retirado y el pellet obtenido retirado para ser reconstituido con TL-STOCK. Los ovocitos maduros y espermatozoides fueron co-cultivados durante 18 horas a 39°C con 5% de CO2 en medio de cultivo KSOM-AA; luego de 48 horas las células cocultivadas fueron trasladadas al medio de cultivo SOF. En el experimento 1, en los ovocitos que alcanzaron la maduración nuclear (Metafase II) se encontró diferencia significativa solo entre los suplementos de macromolécula PVA y SFB con 19.3 + 1.8 y 16.3 + 0.8, respectivamente; mientras que en los grupos PVP, PVA, BSA y PVP, BSA, SFB, respectivamente no se encontró diferencia estadística significativa. En el experimento 2, la tasa de división y desarrollo embrionario posterior a la fecundación a las 48 horas y 168 horas, respectivamente no se encontró diferencia estadística significativa. Estos resultados indican que los suplementos de macromoléculas proporcionan condiciones y requerimientos importantes para la progresión desde estadios de metafase I a metafase II. Palabras claves: Maduración In vitro, ovocitos bovinos, fecundación In vitro. / --- The present study was made to evaluate the effect of four macromolecule supplements on the rate of nuclear maturation, as well as to determine the rate division of oocytes and embryonic development subsequent to the fertilization to the 48 hours and 168 hours (7 days), respectively. The ovaries were obtained from sacrificed animals, being transported to the laboratory in a thermos flask containing saline solution to the 0,09%, with antibioticantimycotic at 37 °C. The CCO´s was obtained from the aspiration of follicles of between 2-6mm; after being observed in stereomicroscope, 692 oocytes with two or more layers of cells were described like apt being in the middle matured TCM-99 enriched with macro-molecule supplement: PVP or PVA or BSA or SFB according to are the treatment; cultivated at 39°C under an atmosphere of 5% of CO2. Turned the time of maturation (24 hours), the oocytes were removed of means and washings with PBS supplemented with SFB and 1 mg/ml of hyaluronidase, to be fixed to an ethanol solution: acetic acid (3: 1). For the evaluation of the nuclear maturation, the oocytes on the slide and dyeings with 1% of orceína were placed; the same ones were observed under a microscope to be evaluated and to be classified like germinal vesicle (VG), metaphase I (MI), anaphase-telophase, metaphase II (MII) and degenerated. For the fertilization 1680 oocytes, matured under the same conditions and fertilized were used with obtained spermatozoa of tubules contained it.. For the obtaining of the motile spermatozoa by centrifuge myself to 300 gravities during 10 minutes under a gradient of Percoll (45/90); the supernatant was retired and pellet obtained retired to be reconstituted with TL-STOCK. The mature oocytes and spermatozoa Co-were cultivated during 18 hours to 39°C with 5% of CO2 in the middle of culture KSOM-AA; after 48 hours the Co-cultivated cells were transferred to means of culture SOF. In experiment 1, in the oocytes that reached the nuclear maturation (Metaphase II) was single significant difference between the macromolecule supplements PVA and SFB with 19.3 + 1.8 and 16.3 + 0.8, respectively; whereas in groups PVP, PVA, BSA and PVP, BSA, SFB, respectively was not significant statistical difference. In experiment 2, the rate of division and embryonic development subsequent to the fertilization to the 48 hours and 168 hours, respectively was not significant statistical difference. These results indicate that the macromolecule supplements they provide conditions and important requirements for the progression from stages of metaphase I to metaphase II. Key words: In vitro Maturation, oocytes bovine, In vitro fertilization.

A gonadotrofina coriônica equina (eCG) tem sido utilizada em programas de sincronização para inseminação artificial em tempo fixo e normalmente promove o aumento do volume do corpo lúteo e a da produção de progesterona. Além disso, esta mesma gonadotrofina pode ser utilizada para superovulação. Desse modo, hipóteses relativas aos mecanismos pelos quais gonadotrofinas exógenas alteram as funções celulares nos corpos lúteos resultantes foram formuladas. Para testar tais hipóteses, 18 vacas (Bos indicus) foram divididas em grupos: controle (n=5), estimulado (n=6) e superovulado (n=7) e a ovulação das mesmas foi sincronizada usando um protocolo já estabelecido com dispositivo de progesterona. Os animais estimulados receberam 400 UI de eCG no dia de remoção do dispositivo de progesterona e os animais superovulados 4 dias antes. No dia 7 após injeção de GnRh, os animais foram abatidos para a coleta de CLL e sangue. Análises de peso e volume de CL, concentração de progesterona (P4), bem como da expressão gênica e proteica de fatores angiogênicos e de proteínas esteroidogênicas foram realizadas. Além disso, o transcriptoma foi analisado por microarranjo. Foi observado que o volume do CL foi maior nos animais do grupo estimulado (1177,37 ± 167,07 mm3) e ainda maior nos do superovulado (1495,18 ± 137,01 mm3) quando comparados ao grupo controle (830,33 ± 234,99 mm3; p = 0,03). A concentração média de progesterona por CL nos animais do grupo estimulado foi maior que nos animais do grupo controle (5,95 ± 0,17 vs 3,69 ± 0,72 ng/ml; p = 0,03) e que nos superovulados (4,11 ± 0.73; p = 0,01). Além disso, os tratamentos com eCG aumentaram a expressão do FGFR2 e também da STAR nos animais estimulados e superovulados (p < 0,05). Quanto aos resultados do microarranjo, no total 242 transcritos foram aumentados e 111 foram diminuídos nos animais estimulados e 111 foram aumentados e 113 diminuídos nos animais superovulados em relação aos animais controle (~1,5 vezes, p 0.05). Entre os genes diferencialmente expressos, muitos estavam envolvidos na síntese de lipídios e na produção de progesterona, tais como: PPARG, HMGCR, STAR, receptores de prolactina e folistatina. Estes achados demonstraram que os tratamentos com eCG modularam a expressão gênica diferencialmente, dependendo do tratamento, e que nossos dados contribuem para entender as vias relacionadas ao aumento do volume do CL e da produção de progesterona observada após os tratamentos. Em um segundo experimento, foi realizado análises da influência do FSH na expressão de VEGF no cultivo de células da granulosa. Neste experimento foi possível observar que o FSH aumentou a expressão gênica e proteica do VEGF, colaborando com a ideia de que as gonadotrofinas têm propriedades angiogênicas. / Equine chorionic gonadotropin (eCG) has been widely used in synchronization protocol to artificial insemination program and usually promote corpus luteum (CL) volume increases and stimulates progesterone production. Furthermore the same gonadotropin can be used to superovulation protocols. Thus, hypotheses concerning the mechanisms by which exogenous gonadotropins alter cellular functions in resulting corpora lutea were formulated. To test that hypothesis, 18 (Bos indicus) cows were divided into control (n=5), stimulated (n=6) and superovulated groups (n=7). Ovulation was synchronized using a progesterone device-based protocol. Stimulated animals received 400 IU of eCG of device removal and superovulated animals received 2000 IU of eCG 4 days prior. Corpora lutea (CLL) and blood samples were collected seven days after GnRH administration. Analyses of CL weight and volume, progesterone (P4) concentration, as well as the gene and protein expression of angiogenic and steroidogenic proteins were performed. Furthermore, the transcriptome was evaluated by microarray. The CL volume was higher in superovulated (1495.18 ± 137.01) than in stimulated (1177.37 ± 167.07) cows and higher in stimulated than in the control (830.33 ± 234.99) cows, and the P4 concentration per CL was higher in stimulated (5.95 ± 0.17 ng/ml) animals than in the control (3.69 ± 0.72 ng/ml) and superovulated (4.11 ± 0.73 ng/ml; P = 0.01) animals. Overall, 242 transcripts were up-regulated and 111 transcripts were downregulated in stimulated cows (P 0.05) and 111 were up-regulated and 113 down-regulated in superovulated cows in relation to the control (1.5 fold, P 0.05). Among the differentially expressed genes, many were involved in lipid biosynthesis and progesterone production, as PPARG, HMGCR, STAR, prolactin receptors and follistatin. In conclusion, eCG modulates gene expression differently depending on the treatment. Our data contribute to the understanding of the pathways involved in increased CL volume and progesterone levels observed after eCG treatment. In a second experiment, analyzes were performed about the influence of FSH on the expression of VEGF in the culture of granulosa cells. In this experiment it was observed that FSH increases the expression of the VEGF gene and protein, these finding collaborate with the idea that gonadotrophins have angiogenic properties.

Em programas de transferência de embriões, as perdas embrionárias após a inovulação têm sido relacionadas com uma capacidade reduzida do corpo lúteo (CL) em secretar progesterona (P4), uma vez que este hormônio prepara o endométrio para a implantação e a manutenção da prenhez. Assim, o objetivo deste trabalho foi estudar a eficácia da utilização de dispositivo intravaginal contendo progesterona (CIDR®) por 14 dias em receptoras de embrião, para a indução de folículos persistentes e formação de CLs maiores do que aqueles formados com a utilização de CIDR® por 8 dias. Duzentas e setenta e oito novilhas Bos taurus x Bos indicus foram divididas em 4 grupos. As receptoras do Grupo 1 (G1, n = 70) receberam 2,0 mg de BE + 50 mg de P4 por via intramuscular (IM) no dia da colocação do CIDR® (D0), oito dias depois (D8), o dispositivo foi retirado e foi aplicado um análogo da prostaglandina F2 alfa (PGF2 alfa - 0,53 mg de Cloprostenol Sódico) IM pela manhã. No D9, foi aplicado 0,5 mg de BE IM e o D17 foi o dia da inovulação. Os animais do Grupo 2 (G2, n = 71) receberam 2,0 mg de BE + 50 mg de P4 no dia da colocação do CIDR® (D0), todavia, esses animais receberam 2 aplicações de PGF2 alfa, uma no início do tratamento e outra 5 dias depois. Nestes animais, o CIDR® foi mantido por 14 dias; assim, no D15 foi aplicado 0,5 mg de BE e o dia da inovulação, foi o D23. No Grupo 3 (G3, n = 67), o tratamento foi semelhante ao do G2, no entanto a PGF2 alfa foi aplicada uma única vez, 5 dias após o início do tratamento. No Grupo 4 (G4, n = 70), o tratamento foi semelhante ao do G2, tendo os animais recebido 2 aplicações de PGF2 alfa, uma no dia da colocação do CIDR® e outra no dia da retirada. A avaliação ultrassonográfica dos ovários foi realizada um dia após a retirada do CIDR® e no dia da inovulação, quando foram colhidas amostras de sangue para dosagem de P4. O diâmetro médio do folículo dominante (FD) foi maior nos grupos G2, G3 e G4 quando comparado com o grupo G1. A área do CL, a concentração plasmática de P4 e a taxa de aproveitamento foram maiores nos grupos G2 e G3 que no grupo G1, enquanto o grupo G4 não diferiu estatisticamente dos demais. A taxa de concepção nos grupos G2 e G3 foi inferior àquela do grupo G1, mas não diferiu entre o grupo G4 e os demais. A taxa de prenhez não apresentou diferença estatística entre os grupos. Esses resultados sugerem que a utilização de CIDR® por tempo prolongado, quando associada à aplicação de PGF2 alfa no início do tratamento, é eficaz na formação de folículos persistentes, que resultam em CLs aumentados e com maior capacidade de secretar P4 . No entanto, ao contrário do esperado, a taxa de concepção foi reduzida nos grupos em que o tratamento visava a formação de folículos persistentes. / Embryo losses in cattle embryo transfer programs have been related to a corpus luteum (CL) inability to secrete progesterone (P4), necessary to endometrial preparation for embryo implantation and pregnancy maintenance. Thus the objective of this experiment was to evaluate the efficacy of a treatment with progesterone-releasing intravaginal devices (CIDR®) for a period of 14 days in order to induce the formation of a persistent follicle and a CL of larger diameter than the ones produced during the conventional 8 days CIDR® treatment. Two hundred seventy-eight cross-bred Bos taurus x Bos indicus heifers were randomly allocated in four groups. Heifers in Group 1 (G1, n = 70) received 2.0 mg estradiol benzoate (EB) + 50 mg of P4 at the moment of CIDR® insertion (D0), a 0.53 mg injection of cloprostenol (PGF2 alfa analogous) at the time of CIDR® removal (D8) and 0.5 mg EB on D9. On D17 animals received a frozen/thawed embryo by direct transfer. Heifers in Group 2 (G2, n = 71) received a CIDR® device combined with 2.0 mg of EB + 50 mg of P4 (D0). Animals of this group received 2 injections of PGF2 alfa, one on D0 and the other on D5. The CIDR® was removed on D14. A 0.5 mg injection of EB was administered on D15. The treatment in Group 3 (G3, n = 67) was similar to G2, except by the fact that a single injection of PGF2 alfa was administered on D5. Treatment performed on animals of Group 4 was similar to the one performed on G2. However, animals of this group received two injections of PGF2 alfa, one at the time of CIDR® insertion and the other at the moment of it?s removal. Ovarian ultrasonography was performed on the day after CIDR® removal and at the day of embryo transfer. Blood samples for P4 analysis were also collected on the day of embryo transfer. Mean diameter of the dominant follicle was larger in heifers in G2, G3 and G4 when compared to G1. The CL area, plasma progesterone concentrations and recipient selection rate was greater in G2 and G3 than in G1, but G4 was not different of the other groups. Conception rates were lower in G2 and G3 when compared to G1. No differences between groups were found regarding to the pregnancy rates. These results suggest that a CIDR® long-term treatment, when associated with PGF2 alfa in the beggining of the treatment is efficient to stimulate the formation of a persistent follicle, resulting in a larger CL which provides higher P4 concentration. However, the induction of a persistent follicle had a negative effect on the conception rates which was not expected.

Em programas de transferência de embriões, as perdas embrionárias após a inovulação têm sido relacionadas com uma capacidade reduzida do corpo lúteo (CL) em secretar progesterona (P4), uma vez que este hormônio prepara o endométrio para a implantação e a manutenção da prenhez. Assim, o objetivo deste trabalho foi estudar a eficácia da utilização de dispositivo intravaginal contendo progesterona (CIDR®) por 14 dias em receptoras de embrião, para a indução de folículos persistentes e formação de CLs maiores do que aqueles formados com a utilização de CIDR® por 8 dias. Duzentas e setenta e oito novilhas Bos taurus x Bos indicus foram divididas em 4 grupos. As receptoras do Grupo 1 (G1, n = 70) receberam 2,0 mg de BE + 50 mg de P4 por via intramuscular (IM) no dia da colocação do CIDR® (D0), oito dias depois (D8), o dispositivo foi retirado e foi aplicado um análogo da prostaglandina F2 alfa (PGF2 alfa - 0,53 mg de Cloprostenol Sódico) IM pela manhã. No D9, foi aplicado 0,5 mg de BE IM e o D17 foi o dia da inovulação. Os animais do Grupo 2 (G2, n = 71) receberam 2,0 mg de BE + 50 mg de P4 no dia da colocação do CIDR® (D0), todavia, esses animais receberam 2 aplicações de PGF2 alfa, uma no início do tratamento e outra 5 dias depois. Nestes animais, o CIDR® foi mantido por 14 dias; assim, no D15 foi aplicado 0,5 mg de BE e o dia da inovulação, foi o D23. No Grupo 3 (G3, n = 67), o tratamento foi semelhante ao do G2, no entanto a PGF2 alfa foi aplicada uma única vez, 5 dias após o início do tratamento. No Grupo 4 (G4, n = 70), o tratamento foi semelhante ao do G2, tendo os animais recebido 2 aplicações de PGF2 alfa, uma no dia da colocação do CIDR® e outra no dia da retirada. A avaliação ultrassonográfica dos ovários foi realizada um dia após a retirada do CIDR® e no dia da inovulação, quando foram colhidas amostras de sangue para dosagem de P4. O diâmetro médio do folículo dominante (FD) foi maior nos grupos G2, G3 e G4 quando comparado com o grupo G1. A área do CL, a concentração plasmática de P4 e a taxa de aproveitamento foram maiores nos grupos G2 e G3 que no grupo G1, enquanto o grupo G4 não diferiu estatisticamente dos demais. A taxa de concepção nos grupos G2 e G3 foi inferior àquela do grupo G1, mas não diferiu entre o grupo G4 e os demais. A taxa de prenhez não apresentou diferença estatística entre os grupos. Esses resultados sugerem que a utilização de CIDR® por tempo prolongado, quando associada à aplicação de PGF2 alfa no início do tratamento, é eficaz na formação de folículos persistentes, que resultam em CLs aumentados e com maior capacidade de secretar P4 . No entanto, ao contrário do esperado, a taxa de concepção foi reduzida nos grupos em que o tratamento visava a formação de folículos persistentes. / Embryo losses in cattle embryo transfer programs have been related to a corpus luteum (CL) inability to secrete progesterone (P4), necessary to endometrial preparation for embryo implantation and pregnancy maintenance. Thus the objective of this experiment was to evaluate the efficacy of a treatment with progesterone-releasing intravaginal devices (CIDR®) for a period of 14 days in order to induce the formation of a persistent follicle and a CL of larger diameter than the ones produced during the conventional 8 days CIDR® treatment. Two hundred seventy-eight cross-bred Bos taurus x Bos indicus heifers were randomly allocated in four groups. Heifers in Group 1 (G1, n = 70) received 2.0 mg estradiol benzoate (EB) + 50 mg of P4 at the moment of CIDR® insertion (D0), a 0.53 mg injection of cloprostenol (PGF2 alfa analogous) at the time of CIDR® removal (D8) and 0.5 mg EB on D9. On D17 animals received a frozen/thawed embryo by direct transfer. Heifers in Group 2 (G2, n = 71) received a CIDR® device combined with 2.0 mg of EB + 50 mg of P4 (D0). Animals of this group received 2 injections of PGF2 alfa, one on D0 and the other on D5. The CIDR® was removed on D14. A 0.5 mg injection of EB was administered on D15. The treatment in Group 3 (G3, n = 67) was similar to G2, except by the fact that a single injection of PGF2 alfa was administered on D5. Treatment performed on animals of Group 4 was similar to the one performed on G2. However, animals of this group received two injections of PGF2 alfa, one at the time of CIDR® insertion and the other at the moment of it?s removal. Ovarian ultrasonography was performed on the day after CIDR® removal and at the day of embryo transfer. Blood samples for P4 analysis were also collected on the day of embryo transfer. Mean diameter of the dominant follicle was larger in heifers in G2, G3 and G4 when compared to G1. The CL area, plasma progesterone concentrations and recipient selection rate was greater in G2 and G3 than in G1, but G4 was not different of the other groups. Conception rates were lower in G2 and G3 when compared to G1. No differences between groups were found regarding to the pregnancy rates. These results suggest that a CIDR® long-term treatment, when associated with PGF2 alfa in the beggining of the treatment is efficient to stimulate the formation of a persistent follicle, resulting in a larger CL which provides higher P4 concentration. However, the induction of a persistent follicle had a negative effect on the conception rates which was not expected.

El presente trabajo se realizó con el propósito de evaluar el efecto de la transferencia embrionaria ipsilateral y contralateral a la posición del cuerpo lúteo sobre la tasa de preñez en llamas. Se utilizaron 43 llamas hembras receptoras de 4 a 6 años, distribuidas aleatoriamente en 4 grupos de estudio: G1 (n=10): Cuerpo lúteo en ovario derecho y transferencia ipsilateral, G2 (n=10): Cuerpo lúteo en ovario derecho y transferencia contralateral, G3 (n=15): Cuerpo lúteo en ovario izquierdo y transferencia ipsilateral y G4 (n=8): Cuerpo lúteo en ovario izquierdo y transferencia contralateral. Se utilizaron 10 llamas hembras como donadoras de embriones, las cuales fueron sincronizadas con LH (1ml), superovuladas con 1000 UI de eCG y se provocó luteólisis con prostaglandina (1ml), siendo empadradas posteriormente. El día del empadre las llamas receptoras recibieron tratamiento con LH, con el propósito de sincronizarlas con las donadoras. Siete días post empadre se realizó el lavado uterino para la recolección, evaluación y transferencia de los embriones. La transferencia embrionaria a los grupos experimentales se realizó con embriones frescos el mismo día. Los resultados obtenidos señalan una tasa de preñez de 60% (G1) y 75% (G3) en las hembras con transferencia embrionaria ipsilateral derecha e izquierda respectivamente, mientras que en la transferencia contralateral derecha e izquierda fueron 30% (G2) y 25%(G4) respectivamente. Sin embargo, no se registraron diferencias significativas (p>0.05) entre el grupo G1 con los grupos G2, G3 y G4, además G2 no muestra diferencias significativas (p>0.05) con G4. Mientras que se encontró diferencia (p menor 0.05) entre el grupo G3 con los grupos G2 y G4. Estos resultados indicarían una mayor tasa de sobrevivencia embrionaria en llamas al realizar la transferencia en el cuerno ipsilateral a la posición del cuerpo lúteo ubicado en el ovario izquierdo. / The study was carried out with the objective of to evaluate the embryo survival after the embryo transfer to the uterine horn ipsilateral and contralateral to the corpus luteum (CL) in llamas. Fourtythree llamas recipient females, from 4 to 6 years old were randomly assigned in 4 groups: G1 (n=10): CL in right ovary and ipsilateral embryo transfer, G2 (n=10): CL in right ovary and contralateral transfer, G3 (n=15): CL in left ovary and ipsilateral transfer, and G4 (n=8): CL in left ovary and contralateral transfer. Ten llamas were used as embryo donors, they were synchronized with LH (1ml), then superovulated with 1000 UI eCG and induced to luteolysis with PGF2α; after that, all of them were mated. The same day of mating, the recipients were treated with LH, with the purpose of synchronization with donors. Seven days postmating, the uterine horns were flushed to recover, evaluate and transfer the embryos. The nonsurgical embryo transfer was used the same day with fresh embryos. The results of pregnancy rate were 60% (G1) and 75% (G3) in recipient females with ipsilateral embryo transfer right and left respectively. On the other hand, contralateral embryo transfer right and left were 30% (G2) and 25% (G4) respectively. However, the differences did not reach significance (p>0.05) between G1 with G2, G3 and G4. Furthermore, G2 not differ (p>0.05) from G4. Whereas, there is difference (p less 0.05) between G3 with G2 and G4. These results indicate that pregnancy rate is major in llamas when the embryo transfer was to the uterine horn ipsilateral to the CL in the left ovary.